CN113939592A - 导入了化学修饰核酸的稳定型目标编辑向导rna - Google Patents

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Abstract

本发明为寡核苷酸，其诱导对目标RNA的位点特异性编辑，该寡核苷酸包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、以及连接第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部。第一寡核苷酸包含：目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸。第二寡核苷酸的残基数为5～8，第三寡核苷酸的残基数为5～8。选自由目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基。

Description

导入了化学修饰核酸的稳定型目标编辑向导RNA
技术领域
本发明涉及导入了化学修饰核酸的稳定型目标(靶向)编辑向导RNA。
背景技术
以基因组编辑技术的开发为契机，通过改变作为生物设计图的遗传信息、即细胞内的DNA信息来控制生命现象的方法开始作为疾病治疗方案在医疗和药品开发领域中应用。由于DNA在细胞内是恒定且不变的分子，所以DNA修饰效果永久性地持续保留在对象细胞或对象生物中。另一方面，RNA是转录了DNA信息的核酸分子，不同于DNA，其是反复进行合成/降解的一过性遗传信息分子。因此，RNA信息的修饰可给对象生物带来一时性而非永久性的遗传信息修饰效果。即，RNA修饰技术虽然是与DNA修饰相同的基因修饰技术，但其性质大不相同。
作为RNA修饰技术，例如专利文献1中记载了寡核苷酸构建物，其用于目标RNA序列中的核苷酸的位点特异性编辑，该寡核苷酸构建物包括：目标指向性部分，其包含与一部分目标RNA互补的反义序列；以及征集部分，其存在于细胞内且可与可进行核苷酸编辑的RNA编辑实体结合以进行征集。另外，例如专利文献2中记载了位点特异性RNA突变导入方法，该导入方法是使双链特异性腺苷脱氨酶(ADAR)与目标RNA和目标编辑向导RNA的复合物作用。另外，非专利文献1中记载了：向征集ADAR的反义寡核苷酸中导入修饰核酸。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/097212号；
专利文献2：国际公开第2017/010556号；
非专利文献
非专利文献1：Nature Biotechnology 37, 133-138(2019)。
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1中记载的寡核苷酸构建物除了目标指向性位点之外，还具有作为征集部分的具有特定重复序列的茎环结构，征集部分需要16个以上的寡核苷酸。另外，专利文献2中记载的目标编辑向导RNA除了反义区之外，还需要ADAR结合区，该ADAR结合区具有由40或49个残基的特定序列构成的茎环结构。专利文献1或2中记载的适用于RNA修饰技术的寡核苷酸的任一种除了与目标RNA形成双链的位点之外，还必须具有用于与ADAR结合的具有某种程度的长度的分子内双链区，作为寡核苷酸的全长必然有变长的倾向。
本发明的一个方案的目的在于：提供目标编辑向导RNA，其添加在目标识别位点的核苷酸数少，在生物体内的稳定性优异，可在细胞内诱导位点特异性编辑。
用于解决课题的手段
用于解决上述课题的具体方法如下，本发明包括以下的方案。
(1-1) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、以及连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列(碱基序列)的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区(counter regions，反义区)的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(1-2) (1-1)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(1-3) (1-1)或(1-2)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(1-4) (1-1)～(1-3)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(1-5) (1-1)～(1-4)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸残基。
(1-6) (1-1)～(1-5)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述反区包含硫代磷酸酯键。
(1-7) (1-1)～(1-6)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(1-8) (1-1)～(1-7)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(1-9) (1-1)～(1-8)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的至少一方包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(1-10) (1-1)～(1-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶的酶反应引起的。
(1-11) 药物，该药物含有(1-1)～(1-10)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(1-12) 遗传性疾病治疗药，其含有(1-1)～(1-10)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(1-13) 药物组合物，其含有(1-1)～(1-10)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
(1-14) (1-13)所述的药物组合物，该药物组合物用于遗传性疾病的预防或治疗。
(1-15) (1-14)所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
(1-16) (1-14)所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
(1-17) (1-1)～(1-10)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐在制造用于疾病的预防或治疗的药物中的应用。
(1-18) (1-1)～(1-10)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于在疾病的预防或治疗中使用。
(2-1) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、以及连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(2-2) (2-1)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(2-3) (2-2)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含具有选自GCUAA、UUCG、UACG、UGCG、UCCG、GAAA、GUAA、GCAA、GGAA、GAGA、GUGA、GCGA和GGGA的核苷酸序列的寡核苷酸。
(2-4) (2-1)或(2-3)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含由1～8个亚乙基氧基单元构成的聚亚乙基氧基。
(2-5) (2-4)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含六亚乙基氧基。
(2-6) (2-1)～(2-5)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(2-7) (2-6)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含碳原子数为3～6的亚烷基氧基。
(2-8) (2-6)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含由6个亚乙基氧基单元构成的六亚乙基氧基。
(2-9) (2-1)～(2-8)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(2-10) (2-1)～(2-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(2-11) (2-1)～(2-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-甲基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(2-12) (2-1)～(2-11)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述反区包含硫代磷酸酯键。
(2-13) (2-1)～(2-12)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(2-14) (2-1)～(2-13)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(2-15) (2-1)～(2-14)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的至少一方包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(2-16) (2-15)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸均由2’-O-甲基核糖核苷酸构成。
(2-17) (2-15)或(2-16)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸具有GGGUGG的核苷酸序列，上述第三寡核苷酸具有CCACCU的核苷酸序列。
(2-18) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：
特定目标RNA的第一寡核苷酸；
连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸；
可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸；以及
连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，
上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸均由2’-O-烷基核糖核苷酸构成，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，所有的磷酸二酯键均为硫代磷酸酯键，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(2-19) (2-18)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由2～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(2-20) (2-19)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含具有选自GCUAA、UUCG、UACG、UGCG、UCCG、GAAA、GUAA、GCAA、GGAA、GAGA、GUGA、GCGA和GGGA的核苷酸序列的寡核苷酸。
(2-21) (2-19)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含由1～8个亚乙基氧基单元构成的聚亚乙基氧基。
(2-22) (2-21)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含六亚乙基氧基。
(2-23) (2-18)～(2-22)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(2-24) (2-23)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含碳原子数为3～6的亚烷基氧基。
(2-25) (2-23)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含六亚乙基氧基。
(2-26) (2-18)～(2-25)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基为胞苷残基、尿苷残基、腺苷残基、或它们的衍生物。
(2-27) (2-26)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基为胞苷残基或其衍生物。
(2-28) (2-18)～(2-27)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含：选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(2-29) (2-18)～(2-27)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-甲基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(2-30) (2-18)～(2-29)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(2-31) (2-18)～(2-30)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸具有GGGUGG的核苷酸序列，上述第三寡核苷酸具有CCACCU的核苷酸序列。
(2-32) (2-1)～(2-31)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶的酶反应引起的。
(2-33) 药物，该药物含有(2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(2-34) 遗传性疾病治疗药，其含有(2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(2-35) 药物组合物，其含有(2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
(2-36) (2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐在制造用于疾病的预防或治疗的药物中的应用。
(2-37) (2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于在疾病的预防或治疗中使用。
(2-38) 用于疾病的预防或治疗的方法，该方法是通过对恒温动物给予药理学上有效量的(2-1)～(2-32)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐来进行的。
(2-39) (2-38)所述的方法，其中，恒温动物为人。
(3-1) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、以及连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(3-2) (3-1)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(3-3) (3-1)或(3-2)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(3-4) (3-1)～(3-3)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(3-5) (3-1)～(3-4)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸残基。
(3-6) (3-1)～(3-5)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述反区包含硫代磷酸酯键。
(3-7) (3-1)～(3-6)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(3-8) (3-1)～(3-7)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(3-9) (3-1)～(3-8)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的至少一方包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(3-10) (3-1)～(3-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(3-11) (3-10)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(3-12) (3-1)～(3-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(3-13) (3-12)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基为交联型核苷酸残基。
(3-14) (3-1)～(3-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(3-15) (3-14)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸向5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(3-16) (3-1)～(3-15)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
(3-17) (3-1)～(3-15)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(3-18) (3-1)～(3-17)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸由4～6个残基构成。
(3-19) (3-1)～(3-18)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
(3-20) (3-1)～(3-19)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成。
(3-21) (3-1)～(3-20)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶的酶反应引起的。
(3-22) 药物，该药物含有(3-1)～(3-21)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(3-23) 遗传性疾病治疗药，其含有(3-1)～(3-21)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(3-24) 药物组合物，其含有(3-1)～(3-21)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
(3-25) (3-24)所述的药物组合物，该药物组合物用于遗传性疾病的预防或治疗。
(3-26) (3-25)所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
(3-27) (3-25)所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
(3-28) (3-1)～(3-21)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐在制造用于疾病的预防或治疗的药物中的应用。
(3-29) (3-1)～(3-21)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于在疾病的预防或治疗中使用。
(3-30) 用于疾病的预防或治疗的方法，该方法是通过对恒温动物给予药理学上有效量的(3-1)～(3-29)中任一项所述的寡核苷酸或其药理上可接受的盐来进行的。
(3-31) (3-30)所述的方法，其中，疾病为遗传性疾病。
(3-32) (3-31)所述的方法，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
(3-33) (3-31)所述的方法，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
(3-34) (3-30)～(3-33)中任一项所述的方法，其中，恒温动物为人。
(4-1) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸构成，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(4-2) (4-1)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(4-3) (4-2)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含具有选自GCUAA、UUCG、UACG、UGCG、UCCG、GAAA、GUAA、GCAA、GGAA、GAGA、GUGA、GCGA和GGGA的核苷酸序列的寡核苷酸。
(4-4) (4-1)或(4-3)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含由1～8个亚乙基氧基单元构成的聚亚乙基氧基。
(4-5) (4-4)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含六亚乙基氧基。
(4-6) (4-1)～(4-5)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸和二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(4-7) (4-6)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含碳原子数为3～6的亚烷基氧基。
(4-8) (4-6)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含由6个亚乙基氧基单元构成的六亚乙基氧基。
(4-9) (4-1)～(4-8)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。
(4-10) (4-1)～(4-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(4-11) (4-1)～(4-9)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-甲基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(4-12) (4-1)～(4-11)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述反区包含硫代磷酸酯键。
(4-13) (4-1)～(4-12)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
(4-14) (4-1)～(4-13)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(4-15) (4-1)～(4-14)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的至少一方包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(4-16) (4-15)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸均由2’-O-甲基核糖核苷酸构成。
(4-17) (4-15)或(4-16)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸具有GGGUGG的核苷酸序列，上述第三寡核苷酸具有CCACCU的核苷酸序列。
(4-18) 寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：
特定目标RNA的第一寡核苷酸；
连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸；
可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸；以及
连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，其中，上述第一寡核苷酸包含：上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸均由2’-O-烷基核糖核苷酸构成，选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，所有的磷酸二酯键的修饰均为硫代磷酸酯键，该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
(4-19) (4-18)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由2～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
(4-20) (4-19)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含具有选自GCUAA、UUCG、UACG、UGCG、UCCG、GAAA、GUAA、GCAA、GGAA、GAGA、GUGA、GCGA和GGGA的核苷酸序列的寡核苷酸。
(4-21) (4-19)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含由1～8个亚乙基氧基单元构成的聚亚乙基氧基。
(4-22) (4-21)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含六亚乙基氧基。
(4-23) (4-18)～(4-22)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
(4-24) (4-23)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含碳原子数为3～6的亚烷基氧基。
(4-25) (4-23)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，第二连接部包含六亚乙基氧基。
(4-26) (4-18)～(4-25)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基为胞苷残基、尿苷残基、腺苷残基、或它们的衍生物。
(4-27) (4-26)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基为胞苷残基、或其衍生物。
(4-28) (4-18)～(4-27)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(4-29) (4-18)～(4-27)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-甲基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸。
(4-30) (4-18)～(4-29)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
(4-31) (4-18)～(4-30)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸具有GGGUGG的核苷酸序列，上述第三寡核苷酸具有CCACCU的核苷酸序列。
(4-32) (4-1)～(4-31)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(4-33) (4-32)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(4-34) (4-1)～(4-31)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(4-35) (4-34)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基为交联型核苷酸残基。
(4-36) (4-1)～(4-31)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(4-37) (4-36)所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸残基沿5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
(4-38) (4-1)～(4-37)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
(4-39) (4-1)～(4-37)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
(4-40) (4-1)～(4-39)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸由4～6个残基构成。
(4-41) (4-1)～(4-40)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
(4-42) (4-1)～(4-41)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成。
(4-43) (2-1)～(4-42)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶的酶反应引起的。
(4-45) 药物，该药物含有(4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(4-46) 遗传性疾病治疗药，其含有(4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
(4-47) 药物组合物，其含有(4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
(4-48) (4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐在制造用于疾病的预防或治疗的药物中的应用。
(4-49) (4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于在疾病的预防或治疗中使用。
(4-50) 用于疾病的预防或治疗的方法，该方法是通过对恒温动物给予药理学上有效量的(4-1)～(4-44)中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐来进行的。
(4-51) (4-50)所述的方法，其中，疾病为遗传性疾病。
(4-52) (4-51)所述的方法，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
(4-53) (4-51)所述的方法，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
(4-54) (4-50)～(4-53)中任一项所述的方法，其中，恒温动物为人。
(4-51) (4-50)所述的方法，其中，恒温动物为人。
发明效果
根据本发明的一个方案，可提供目标编辑向导RNA，其添加在目标识别位点的核苷酸数少，在生物体内的稳定性优异，可诱导位点特异性编辑。
附图说明
[图1A]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的色谱图。
[图1B]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图2]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图3A]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的色谱图。
[图3B]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图4A]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的色谱图。
[图4B]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图5A]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的色谱图。
[图5B]是显示寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图6A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图6B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图6C]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图6D]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图7A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图7B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图8A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图8B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图9A]是显示寡核苷酸对ATCB和GAPDH的RNA的编辑比例的色谱图。
[图9B]是显示寡核苷酸对ATCB和GAPDH的RNA的编辑比例的图。
[图10]是显示在hADAR1的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图11A]是显示在ADAR2的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图11B]是显示在ADAR1的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图12A]是显示在ADAR2的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图12B]是显示在ADAR1的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图13A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图13B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图14A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图14B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图15A]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图15B]是显示由细胞中的寡核苷酸的RNA编辑引起的发光强度变化的图。
[图16A]是显示在ADAR2的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图16B]是显示在ADAR1的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图16C]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图17A]是显示在ADAR2的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图17B]是显示在ADAR1的存在下寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
[图18]是显示细胞中的寡核苷酸对目标RNA的编辑比例的图。
具体实施方式
本说明书中，“步骤”这个术语不仅包括独立的步骤，如果在无法与其他步骤明确区别的情况下也可达到该步骤的所期望的目的，则也包含在本术语中。另外，关于组合物中的各成分的含量，在组合物中存在多种与各成分相应的物质的情况下，只要没有特别说明，则是指组合物中存在的该多种物质的总计量。以下，详细地说明本发明的实施方式。然而，以下所示的实施方式示例了用于将本发明的技术思想具体化的寡核苷酸，本发明并不限于以下所示的寡核苷酸。
诱导对目标RNA的位点特异性编辑的寡核苷酸(以下，也称为目标编辑向导RNA)包含：特定目标RNA的第一寡核苷酸、连接于第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸、可与第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸、以及连接第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部。第一寡核苷酸包含：目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸、以及连接于目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸。第二寡核苷酸的残基数为5～8，第三寡核苷酸的残基数为5～8。选自由目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基。
目标编辑向导RNA在特定目标RNA的第一寡核苷酸的3’侧具有第二寡核苷酸、第一连接部和第三寡核苷酸，在反区具有天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，从而在细胞内的稳定性优异，可诱导优异的位点特异性编辑。认为这是由于：例如，催化目标编辑的ADAR在识别由目标RNA和第一寡核苷酸构成的双链区之后不与目标RNA形成双链，通过从目标RNA游离的状态下可存在的第二寡核苷酸、第一连接部和第三寡核苷酸的至少一部分增进其编辑活性。即，认为在目标编辑向导RNA中，第一寡核苷酸作为针对目标RNA的互补区(反义区；ASR)起作用，第二寡核苷酸、第一连接部和第三寡核苷酸的至少一部分作为编辑增进区、ADAR结合区(ADAR征集区；ARR)等起作用。
目标编辑向导RNA例如通过将催化目标编辑的ADAR征集到目标RNA中，诱导对目标RNA的位点特异性编辑。ADAR是通过水解脱氨基化反应将双链RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基的酶，广泛存在于哺乳动物的细胞中。肌苷残基因结构与鸟苷残基类似，故在RNA信息的翻译时被翻译成鸟苷残基，其结果，RNA信息被编辑。若在编码氨基酸的部分发生这样的RNA编辑，则尽管基因组上没有DNA突变，也会发生氨基酸取代等。需要说明的是，在哺乳类的ADAR中，已知有基因不同的ADAR1、ADAR2和ADAR3。目标编辑向导RNA增进这些之中的至少ADAR1或ADAR2的目标编辑活性。
目标编辑向导RNA若被导入到哺乳动物的细胞中，则可将细胞中存在的ADAR征集到目标RNA中，以诱导对目标RNA的位点特异性编辑。
构成目标编辑向导RNA的核苷酸可由天然型核糖核苷酸(RNA)、天然型脱氧核糖核苷酸(DNA)、RNA/DNA的嵌合物、作为它们的修饰体的修饰核苷酸中的任一种构成。构成目标编辑向导RNA的核苷酸可通过与核苷的糖部分的羟基结合的磷酸二酯键相互连接。上述磷酸二酯键可利用糖部分的2’位羟基、3’位羟基或5’位羟基来形成。构成目标编辑向导RNA的核苷酸可形成作为天然型的3’-5’磷酸二酯键。构成目标编辑向导RNA的核苷酸的至少1个可以是修饰核苷酸。作为修饰核苷酸，可示例：糖部分被修饰的核苷酸、磷酸二酯键被修饰的核苷酸、碱基被修饰的核苷酸、以及它们的组合。
作为糖部分被修饰的核苷酸，例如可列举：D-呋喃核糖的2’-O-烷基化核糖核苷酸(例如，2’-O-甲基化、2’-O-氨基乙基化、2’-O-丙基化、2’-O-烯丙基化、2’-O-甲氧基乙基化、2’-O-丁基化、2’-O-戊基化、2’-O-炔丙基化等)；
D-呋喃核糖的2’位和4’位间交联而成的交联型核糖核苷酸(例如，2’-O, 4’-C-亚乙基化、2’-O, 4’-C-亚甲基化、2’-O, 4’-C-亚丙基化、2’-O, 4’-C-四亚甲基化、2’-O,4’-C-五亚甲基化、2’-S, 4’-C-亚甲基化、D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-C, 4’-C-亚甲基氧基亚甲基化体、S-cEt (2’,4’-约束乙基)、AmNA等)；
3’-脱氧-3’-氨基-2’-脱氧-D-呋喃核糖；3’-脱氧-3’-氨基-2’-脱氧-2’-氟-D-呋喃核糖；2’-脱氧-2’-氟-D-呋喃核糖等。
作为磷酸二酯键被修饰的核苷酸，可列举：硫代磷酸酯键(包括来自磷原子不对称的光学活性体)、甲基膦酸酯键、甲硫基膦酸酯键、二硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键等。
作为碱基被修饰的核苷酸，可列举：卤化；甲基化、乙基化、丙基化、异丙基化、环丙基化、丁基化、异丁基化、仲丁基化、叔丁基化、环丁基化等碳原子数为1～6或1～4的烷基化；氢氧化；氨基化；脱氨基化；去甲基化等。具体而言，可列举：胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、N4-甲基化等；胸腺嘧啶的5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化、5-碘化等；腺嘌呤的N6-甲基化、8-溴化等；鸟嘌呤的N2-甲基化、8-溴化等。
目标编辑向导RNA所包含的第一寡核苷酸特定目标RNA。目标RNA只要包含作为编辑对象的腺苷残基即可，没有特别限定，可以是细胞性RNA、病毒性RNA的任一种，通常是编码蛋白的mRNA前体或mRNA。目标RNA中的编辑位点可存在于非翻译区、剪接区、外显子、内含子、或者对RNA的稳定性、结构或功能有影响的任一个区。另外，目标RNA可以是包含应该修正或变更的突变的RNA。或者目标RNA可以是其序列突变成编码不同于天然型的表现型的RNA。
目标RNA优选为编码蛋白的RNA，作为所编码的蛋白，具体而言，可列举：血清素受体、谷氨酸受体、膜电位依赖型钾通道、STAT3、NFkBIA、MAPK14等参与信号传递的磷酸化蛋白等。
目标编辑向导RNA例如可适用于遗传性疾病的治疗。遗传性疾病例如可以是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。另外，遗传性疾病例如可以是以基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。作为遗传性疾病，例如可列举：囊性纤维化、白皮病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL综合征、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth)、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker型肌营养不良、营养不良型大疱性表皮松解症、表皮溶解水疱症、法布里病、莱顿第V因子相关的障碍、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、戈谢病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、血友病、遗传性血色素沉着病、亨特氏综合征、亨廷顿病(亨廷顿舞蹈症)、Hurler综合征、炎性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合征、Lynch综合征(遗传性非息肉性结直肠癌)、马凡氏综合征、粘多糖病、肌营养不良、肌紧张性营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、尼曼-皮克病A型、B型和C型、NY-eso1相关胰腺癌、帕金森病、珀茨-杰格斯综合征、苯酮尿症、庞贝氏症、原发性纤毛运动障碍、凝血酶原G20210A突变等与凝血酶原突变相关的疾病、肺动脉高压、视网膜色素变性、山德霍夫病、重症复合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状红细胞贫血、脊髓性肌萎缩、Stargardt病(眼底黄色斑点症)、戴萨克斯症、Usher综合征(遗传性耳聋)、X连锁免疫缺陷、癌症的各种形态(例如BRCA1和2相关乳癌、卵巢癌等)等。
作为遗传性疾病的具体例子，可列举：瓜氨酸血症I型(ASS1)、瓜氨酸血症II型(SLC25A13)、血友病(Factor V Leiden)、原发性高草酸尿症(AGXT)、远端肌病(GNE)、囊性纤维化：cystic fibrosis (CFCFTR)、高胱氨酸尿症(CBS)、Hurler综合征：粘多糖病(IDUA(SLC26A1))、Alexander病(GFAP)、视网膜色素变性(EYS)、苯酮尿症(PAH)、血色素沉着症(HFE)、Gilbert综合征(UGT1A1)等。需要说明的是，括号内是目标基因名称。
第一寡核苷酸包含：目标RNA中的成为编辑目标的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基、连接于目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与目标RNA的对应的核苷酸序列互补的核苷酸序列的10～30个残基的5’侧寡核苷酸、以及连接于目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与目标RNA的对应的核苷酸序列互补的核苷酸序列的3～6个残基的3’侧寡核苷酸。分别连接于目标对应核苷酸残基的5’侧和3’侧的寡核苷酸与目标RNA形成双链，从而特定目标RNA和目标RNA中的编辑目标位点。以下，为方便起见，有时将由目标对应核苷酸残基、其3’侧的1个残基和5’侧的1个残基这3个残基构成的区域称为反区，将第一寡核苷酸的反区以外称为非反区。
目标对应核苷酸残基是成为编辑目标的腺苷残基所对应的核苷酸残基，例如为胞苷残基、尿苷残基、腺苷残基或它们的衍生物。目标对应核苷酸残基优选为与成为编辑目标的腺苷残基没有形成碱基对的碱基，更优选为胞苷残基或其衍生物，进一步优选为胞苷残基。
连接于目标对应核苷酸残基的5’侧或3’侧的寡核苷酸的核苷酸序列是与目标RNA的对应的核苷酸序列互补的核苷酸序列。从对目标RNA的特异性的观点来看，连接于目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸的残基数例如为10以上、12以上、14以上或15以上，且为26以下、20以下或16以下。从对目标RNA的特异性的观点来看，连接于目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸的残基数可以是10以上且20以下，可以是13以上且20以下、或13以上且15以下。另外，从编辑活性的观点来看，连接于目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸的残基数可以是3，可以是3或4。从ADAR特异性的观点来看，连接于目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸的残基数可以是4～6，可以是4或5、或者5或6。
在目标编辑向导RNA中，选自反区的至少1个残基、至少2个残基、或3个残基可均为天然型核糖核苷酸(RNA)残基以外的核苷酸残基，优选至少1个残基、至少2个残基、或3个残基均为修饰核苷酸残基。反区中的修饰核苷酸残基，其糖部分和磷酸二酯键的至少一方可被修饰，至少糖部分可被修饰、至少磷酸二酯键可被修饰、或者糖部分和磷酸二酯键可被修饰。例如，目标对应核苷酸残基可以是具有硫代磷酸酯键的胞苷残基。另外，例如目标对应核苷酸残基的5’侧或3’侧的各1个残基，其糖部分和磷酸二酯键的至少一方可被修饰，至少糖部分可被修饰、至少磷酸二酯键可被修饰、或者糖部分和磷酸二酯键可被修饰。反区中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化等。
第一寡核苷酸的反区以外的寡核苷酸残基(非反区)内，在至少1个残基、至少3个残基、或全部残基中，糖部分和磷酸二酯键的至少一方可被修饰，至少糖部分可被修饰、至少磷酸二酯键可被修饰、或者糖部分和磷酸二酯键可被修饰。非反区中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化、2’位和4’位间的交联化、2’-脱氧化(DNA化)等。在第一寡核苷酸具有多个修饰核苷酸的情况下，多个修饰核苷酸可连续配置，也可间隔配置。另外，第一寡核苷酸可以是全部的核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而构成。
连接于第一寡核苷酸的目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸可具有选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的2种修饰核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。即，连接于目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸可具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列，也可具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列，还可具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。这里，具有所使用的2种修饰核苷酸残基交替连接的核苷酸序列是指以下两种情况：成为对象的寡核苷酸具有(这里，相对于连接于第一寡核苷酸的目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸) 2种修饰核苷酸残基部分地交替连接而成的核苷酸序列；或者成为对象的寡核苷酸的整体具有2种修饰核苷酸残基交替连接而成的核苷酸序列，在本说明书的以下的说明中也以同样的意义使用。
在连接于第一寡核苷酸的目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的修饰核苷酸残基。而且，在连接于目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的修饰核苷酸残基，也可以是第4位的核苷酸残基不同于第3位的核苷酸残基的修饰核苷酸残基。这里，从目标对应核苷酸残基向5’方向数起第3位的核苷酸残基表示，不包括目标对应核苷酸残基本身，将相邻于目标对应寡核苷酸残基的5’方向的核苷酸残基作为第1位向5’方向数起第3位的核苷酸残基。
在第一寡核苷酸中，连接于目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸可具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。另外，在第一寡核苷酸中，连接于目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸可具有选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的2种交替连接的核苷酸序列，也可具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列，还可具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。而且，关于第一寡核苷酸从ADAR特异性的观点来看，从目标对应核苷酸残基向3’方向数起第2位的核苷酸残基可以是选自2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基、2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基的1种，也可以是交联型核苷酸残基。这里，从目标对应核苷酸残基向3’方向数起第2位的核苷酸残基表示，不包括目标对应核苷酸残基本身，将相邻于目标对应寡核苷酸残基的3’方向的核苷酸残基作为第1位向3’方向数起第2位的核苷酸残基。
第二寡核苷酸和第三寡核苷酸分别由5～8个残基、5～7个残基、或6个残基构成，且具有彼此可形成互补对的核苷酸序列。第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的残基数可以相同也可以不同。作为第二寡核苷酸的核苷酸序列，可列举：包含GGGUGG、GGGUG、GGUGG、GGGU、GGUG、GUGG、GGG、GGU、GUG、UGG、GG、GC、GA、GU、UC、UG、UA、UU、CG、CA、CU、CC、AG、AA、AC、AU等的核苷酸序列。另外，第二寡核苷酸可具有包含选自由下述序列组成的组中的至少1种的核苷酸序列，也可具有包含选自该组中的至少2种或3种的核苷酸序列：由连续的2或3个鸟嘌呤构成的序列(GG或GGG)、由连续的尿嘧啶和鸟嘌呤构成的序列(UG)、以及由连续的鸟嘌呤、尿嘧啶和鸟嘌呤构成的序列(GUG)。另外，第二寡核苷酸可具有与第一连接部结合的由连续的鸟嘌呤、尿嘧啶和鸟嘌呤构成的序列(GUG)、或者由连续的尿嘧啶、鸟嘌呤和鸟嘌呤构成的序列(UGG)。第三寡核苷酸的核苷酸序列只要以可与第二寡核苷酸的核苷酸序列形成互补对的方式选择即可。这里，第二寡核苷酸和第三寡核苷酸可形成互补对是指，不仅包括第二寡核苷酸的全部残基与对应的第三寡核苷酸的全部残基形成Watson-Crick型碱基对，还包括第二寡核苷酸和第三寡核苷酸包含1或2个错配碱基对的情形、以及包含1或2个摆动碱基对的情形。需要说明的是，错配碱基对是指热力学不稳定的碱基对，摆动碱基对例如是指G-U碱基对等热力学稳定的非Watson-Crick型碱基对。摆动碱基对例如可形成于第三寡核苷酸的3’末端。
第二和第三寡核苷酸分别在至少1个残基、至少3个残基、或全部残基中，糖部分和磷酸二酯键的至少一方可被修饰，至少糖部分可被修饰、至少磷酸二酯键可被修饰、或者糖部分和磷酸二酯键可被修饰。第二和第三寡核苷酸中的糖部分的修饰例如可以是2’-O-烷基化、2’-脱氧-2’-氟化、2’-脱氧化(DNA化)等。在第二或第三寡核苷酸具有多个修饰核苷酸的情况下，多个修饰核苷酸可连续配置，也可间隔配置。
第二和第三寡核苷酸可具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。另外，第二和第三寡核苷酸的各自的核苷酸残基均可通过硫代磷酸酯键连接。
第一连接部可包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。第一连接部在第二寡核苷酸的3’侧和第三寡核苷酸的5’侧分别进行磷酸二酯键合或修饰的磷酸二酯键合。即，第一连接部可与第二寡核苷酸的3’末端的糖部分的羟基和第三寡核苷酸的5’末端的糖部分的羟基分别进行磷酸二酯键合或修饰的磷酸二酯键合。由此，可按照第二和第三寡核苷酸形成互补对以形成茎结构、且第一连接部形成环结构的方式构成。
在第一连接部包含4或5个残基的寡核苷酸的情况下，作为其核苷酸序列，具体而言，例如可列举：GCUAA；UUCG、UACG、UGCG、UCCG等UNCG折叠型；GAAA、GUAA、GCAA、GGAA、GAGA、GUGA、GCGA、GGGA等GNRA折叠型；GUCA、GCCA、GGCA、GACA、AUCA、ACCA、AGCA、AACA、GUUA、GCUA、GGUA、GAUA、AUUA、ACUA、AGUA、AAUA等RNYA折叠型；GGUG折叠型；CUUG折叠型；AGUU、AGUC、AGUG、AGUA、AGCU、AGCC、AGCG、AGCA等AGNN折叠型等。关于这些环结构的详情，例如可参照Biophys. J., 113, 257-267, 2017。第一连接部的核苷酸序列可具有GCUAA、UNCG折叠型核苷酸序列、或GNRA折叠型核苷酸序列，也可具有UUCG的核苷酸序列。
在第一连接部包含4或5个残基的寡核苷酸的情况下，构成第一连接部的核苷酸残基的至少1个残基、或至少3个残基可以是修饰核苷酸残基。第一连接部中的修饰核苷酸的糖部分和磷酸二酯键的至少一方可被修饰，至少糖部分可被修饰、至少磷酸二酯键可被修饰、或者糖部分和磷酸二酯键可被修饰。
在第一连接部包含聚亚烷基氧基的情况下，亚烷基氧基单元的碳原子数例如可以是2～4、2～3或2。即，亚烷基氧基单元可以是亚乙基氧基单元、亚丙基氧基单元或亚丁基氧基单元。构成聚亚烷基氧基的亚烷基氧基单元的数目例如可以是1～8、5～7或6。构成聚亚烷基氧基的各亚烷基氧基单元可以相同，或者可以不同。而且，第一连接部可包含单元数为1～8的聚亚乙基氧基，可包含六亚乙基氧基。在第一连接部包含聚亚烷基氧基的情况下，聚亚烷基氧基可经由磷酸二酯键或被修饰的磷酸二酯键连接第二寡核苷酸的3’末端的糖部分的羟基和第三寡核苷酸的5’末端的糖部分的羟基。
第一连接部可仅由寡核苷酸构成，也可包含核苷酸和亚烷基氧基单元而构成，还可仅包含亚烷基氧基单元而构成。目标编辑向导RNA即使在第一连接部具有包含亚烷基氧基单元的环结构的情况下也可显示优异的目标编辑活性。
目标编辑向导RNA可在第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间具有第二连接部。即，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可通过第二连接部连接。第二连接部例如包含亚烷基氧基单元而构成。亚烷基氧基单元的亚烷基部分的碳原子数可以是2～8或2～6。第二连接部可包含1～8个单元或1～6个单元的碳原子数为2或3的亚烷基氧基单元，也可包含聚亚烷基氧基，该聚亚烷基氧基连续包含1～8个单元或1～6个单元的碳原子数为2或3的亚烷基氧基单元，还可包含六亚乙基氧基。另外，第二连接部可包含碳原子数为3～6的亚烷基氧基。构成第二连接部的聚亚烷基氧基可经由磷酸二酯键或修饰的磷酸二酯键连接第一寡核苷酸的3’末端的糖部分的羟基和第二寡核苷酸的5’末端的糖部分的羟基。
目标编辑向导RNA可使用市售的合成仪(例如，PerkinElmer公司的亚磷酰胺法的模型392)等，依据已知文献(例如，参照Nucleic Acids Reserch, 12, 4539 (1984)))中记载的方法进行合成。所用的亚磷酰胺试剂可使用市售的试剂，也可使用依据已知的文献中记载的方法适当合成的试剂。将亚磷酰胺试剂偶联后，使其与硫、二硫化四乙基秋兰姆(TETD、Applied Biosystems公司)、Beaucage试剂(Glen Research公司)、氢化黄原素等试剂进行反应，从而可导入硫代磷酸酯键(例如，参照Tetrahedron Letters, 32, 3005(1991), J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990)、PCT/WO98/54198)。
寡核苷酸(目标编辑向导RNA)可以以药学上可接受的盐的形式使用。“药学上可接受的盐”是指寡核苷酸的盐。作为这样的盐，可列举：如钠盐、钾盐、锂盐等碱金属盐；如钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；如铵盐等无机盐；如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐等有机盐等胺盐；如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等低级烷烃磺酸盐；如苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等芳基磺酸盐；乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等氨基酸盐等。寡核苷酸的药学上可接受的盐的形式优选为寡核苷酸的碱金属盐、更优选为钠盐。这些盐可利用已知的方法制造。
另外，寡核苷酸及其药学上可接受的盐有时也以溶剂合物(例如，水合物)的形式存在，可以是这样的溶剂合物。
寡核苷酸及其药学上可接受的盐中，有时存在来自磷原子不对称的光学活性体，本发明的寡核苷酸中也包含这样的光学活性体。这样的光学活性体可利用已知的方法合成(例如，Org. Lett., 114,967 (2009)、Bioorganic＆Medicinal Chemistry Letters, 8,2359 (1998)等)。
在疾病的治疗中使用寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物的情况下，可将其本身或与适当的药学上可接受的赋形剂、稀释剂等混合，通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂等进行口服给药，或者通过注射剂、栓剂、贴剂或外用剂等进行胃肠外给药。
这些制剂可使用下述的添加剂按照已知的方法制造：赋形剂(例如，如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物；如玉米淀粉、马铃薯淀粉、α淀粉、糊精等淀粉衍生物；如结晶纤维素等纤维素衍生物；阿拉伯树胶；葡聚糖；如普鲁兰多糖等有机类赋形剂；如轻质硅酸酐、合成硅酸铝、硅酸钙、偏硅酸铝镁等硅酸盐衍生物；如磷酸氢钙等磷酸盐；如碳酸钙等碳酸盐；如硫酸钙等硫酸盐等无机类赋形剂等)、润滑剂(例如，硬脂酸；如硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；滑石；胶体二氧化硅；如蜂蜡、鲸蜡等蜡类；硼酸；己二酸；如硫酸钠等硫酸盐；乙二醇；富马酸；苯甲酸钠；DL亮氨酸；如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁等十二烷基硫酸盐：如硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；上述淀粉衍生物等)、粘合剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、与上述赋形剂同样的化合物等)、崩解剂(例如，如低取代度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、内部交联羧甲基纤维素钠等纤维素衍生物；如羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等化学修饰的淀粉/纤维素类等)、乳化剂(例如，如膨润土、硅酸镁铝等胶体性粘土；如氢氧化镁、氢氧化铝等金属氢氧化物；如十二烷基硫酸钠、硬脂酸钙等阴离子表面活性剂；如苯扎氯铵等阳离子表面活性剂；如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等非离子表面活性剂等)、稳定剂(如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等对羟基苯甲酸酯类；如氯丁醇、苄醇、苯乙醇等醇类；如苯扎氯铵；苯酚、甲酚等苯酚类；硫柳汞；脱氢乙酸；山梨酸等)、矫味矫臭剂(例如，通常使用的甜味剂、酸味剂、香料等)、稀释剂等。
包含寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物的治疗药可含有0.1～250μmoles/ml的寡核苷酸，优选含有1～50μmoles/ml。另外，可含有规定量的寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物、0.02～10%w/v的碳水化合物或多元醇和0.01～0.4%w/v的药学上可接受的表面活性剂以构成治疗药。
作为上述碳水化合物，特别优选单糖类和二糖类的至少1种。作为这些碳水化合物和多元醇的例子，可列举：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇。这些可单独使用也可并用。
另外，作为表面活性剂的优选例子，可列举：聚氧乙烯脱水山梨糖醇一酯～三酯、烷基苯基聚氧乙烯、牛磺胆酸钠、胆酸钠和多元醇酯。其中特别优选的是聚氧乙烯脱水山梨糖醇一酯～三酯，这里，作为酯特别优选的是油酸酯、月桂酸酯、硬脂酸酯和棕榈酸酯。这些可单独使用也可并用。
包含寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物的治疗药进一步优选可含有0.03M～0.09M的药学上可接受的中性盐、例如氯化钠、氯化钾和/或氯化钙。
包含寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物的治疗药进一步优选可含有0.002～0.05M的药学上可接受的缓冲剂。作为优选的缓冲剂的例子，可列举：枸橼酸钠、甘氨酸钠、磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷。这些缓冲剂可单独使用也可并用。
而且，上述的治疗药可以以溶液状态供给。然而，由于需要保存一定期间的情况等，为了将寡核苷酸稳定化以防止治疗效果的下降，通常优选预先冷冻干燥，这种情况下，只要在使用时用溶解液(注射用蒸馏水等)进行再构成(reconstruction)、即形成要给药的液体状态使用即可。因此，本发明的治疗药还包括：冷冻干燥状态的治疗药，其用于以各成分达到规定的浓度范围的方式用溶解液进行再构成后使用。为了促进冷冻干燥物的溶解性，可进一步含有白蛋白、甘氨酸等氨基酸。
在对人给予寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂合物的情况下，例如可按成人每天约0.01mg/kg～100mg/kg(体重)、优选0.1mg/kg～20mg/kg(体重)的给药量，1次或分成几次进行皮下注射、点滴静脉注射或静脉注射，但其给药量或给药次数可根据疾病的种类、症状、年龄、给药方法等适当变更。
疾病的处置方法
疾病的处置方法包括：将上述治疗药给予至对象的步骤。说明书中使用的“处置”可以是对疾病施行的任何处置，例如可列举：疾病的治疗、改善、抑制进展(防止恶化)、预防等(适合的是治疗或预防)。处置的对象可以是包括人在内的恒温动物，也可以是非人恒温动物。
目标RNA的位点特异性编辑方法
目标RNA的位点特异性编辑方法包括以下步骤：使目标RNA与对目标RNA诱导位点特异性编辑的寡核苷酸即目标编辑向导RNA在腺苷脱氨酶的存在下接触。目标编辑向导RNA与目标RNA部分性地形成双链，并征集腺苷脱氨酶，从而可将目标RNA所包含的腺苷残基位点特异性地变换成肌苷残基。目标RNA的位点特异性编辑方法可进一步包含：准备目标编辑向导RNA的步骤。
目标RNA的位点特异性编辑方法例如可通过向具有目标RNA的真核细胞中导入上述的目标编辑向导RNA来进行。在向真核细胞中导入目标编辑向导RNA的方法中，可从核酸药物所使用的各种方法中适当选择适用。目标RNA的位点特异性编辑方法可在体外实施，也可在体内实施。
作为本发明的其他方案，还包括：目标编辑向导RNA在制造用于疾病(例如，遗传性疾病)的处置的药物组合物中的应用、目标编辑向导RNA在疾病(例如，遗传性疾病)的处置中的应用、用于疾病(例如，遗传性疾病)的处置的目标编辑向导RNA。
实施例
以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
(参考例1)
利用亚磷酰胺法(例如，参照Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015))对具有表1所示的序列、且均由天然型RNA残基构成的寡核苷酸(以下，也称为del03_01)进行合成。所得的化合物通过负离子ESI质谱来鉴定(实测值：11194.40)。
表1中，下划线部分相当于第一寡核苷酸(ASR)，成为目标的RNA为后述的Rluc_sRNA。认为参考例1的寡核苷酸例如可获取如下所述的茎环结构。
[表1]
Figure 811718DEST_PATH_IMAGE002
[化学式1]
Figure 728859DEST_PATH_IMAGE004
(实施例1～50)
实施例1～46的寡核苷酸化合物是根据参考例1的寡核苷酸的序列如下所示导入修饰核苷酸而得到的。另外，实施例47～50的寡核苷酸化合物具有以下所示的序列的第一寡核苷酸(ASR)，是如下所示导入修饰核苷酸而得到的。这些寡核苷酸化合物与参考例1同样是通过亚磷酰胺法合成的。需要说明的是，序列中，在合成“18”的部分时使用了DMT六甘醇亚磷酰胺(ChemGene、目录号：CLP-9765)。合成“9”的部分时使用了DMT-三乙氧基乙二醇亚磷酰胺(ChemGene、目录号：CLP-1113)。合成“6”的部分时使用了DMT-己二醇亚磷酰胺(ChemGene、目录号：CLP-1120)。合成“3”的部分时使用了DMT-丙二醇亚磷酰胺(ChemGene、目录号：CLP-9908)。“2’-O-甲基核苷”部分使用Nucleic Acids Research 17, 3373(1989)中记载的亚磷酰胺体来合成。“DNA”部分使用Nucleic Acids Research 11, 4539(1984)中记载的亚磷酰胺体来合成。“2’-O, 4’-C-亚甲基核苷”部分使用国际公开第99/14226号中记载的亚磷酰胺体来合成。“2’-脱氧-2’-氟核苷”部分使用J. Med. Chem., 36,831 (1993)中记载的亚磷酰胺体来合成。
[表2]
Figure DEST_PATH_IMAGE005
[表3]
Figure 508596DEST_PATH_IMAGE006
[表4]
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表中的“分子量”表示基于负离子ESI质谱的实测值。表中的“序列”中，大写字母表示RNA，小写字母表示DNA，N(M)表示D-呋喃核糖的2’-O-甲基化，N(F)表示D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-氟化，N(L)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚甲基化，N(E)表示D-呋喃核糖的2’-O,4’-C-亚乙基化。“3”表示-O(CH2)3O-所表示的接头，“6”表示-O(CH2)6O-所表示的接头，“9”表示-O(CH2CH2O)3-所表示的接头，“18”表示-O(CH2CH2O)6-所表示的接头。“＾”表示核苷单元间通过-P(=S)(OH)-结合。在没有特别记载的情况下，表示核苷单元间、或核苷单元与接头通过-P(=O)(OH)-结合。寡核苷酸的5’末端和3’末端为氢原子与化学式中的氧原子结合而成的羟基。以下显示核苷单元的结构。需要说明的是，化学式中的虚线部分表示结合位点。
[化学式2]
Figure 966122DEST_PATH_IMAGE008
[化学式3]
Figure DEST_PATH_IMAGE009
[化学式4]
Figure 780494DEST_PATH_IMAGE010
[化学式5]
Figure DEST_PATH_IMAGE011
[化学式6]
Figure 665274DEST_PATH_IMAGE012
[化学式7]
Figure DEST_PATH_IMAGE013
[化学式8]
Figure 932307DEST_PATH_IMAGE014
(参考例2)
与参考例1同样，通过亚磷酰胺法合成了表5中显示核苷酸序列和化学修饰的状态的寡核苷酸化合物。表中的符号与上述相同。
[表5]
Figure DEST_PATH_IMAGE015
(试验例1) 对Rluc_sRNA的编辑诱导能力的评价
(A) Rluc_sRNA的合成
将由psiCHECKTM-2载体(Promega公司)通过常规方法转录并调制而得的Rluc_WTRNA (SEQ ID NO: 7)调制成0.2nM。加入重组hADAR2 (使用酵母表达系统合成/纯化Macbeth, MR.和Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda, M.等人.Sci. Rep. srep41478 (2017))使终浓度为1μM，在编辑反应缓冲液(20mM的HEPES-KOH(pH7.5)、2mM的MgCl2、100mM的NaCl、0.5mM的DTT、0.01%的TritonX-100、5%的甘油)中、于37℃下培养2小时，从而进行了体外编辑反应。
编辑反应后的Rluc_WT RNA通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。然后，使用Primescript逆转录酶II (TaKaRa)，通过Rluc_WT_BamR01引物(SEQ ID NO: 8)合成cDNA。之后，使用Rluc_WT_EcoF01引物(SEQ ID NO: 9)和Rluc_WT_BamR01引物(SEQ ID NO: 8)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR (30个循环、变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒)扩增cDNA。然后，以所得的cDNA作为插入物DNA，如下操作克隆到pUC19质粒中。使用EcoRI (TaKaRa)和BamHI (TaKaRa)，在37℃下对插入物DNA和pUC19质粒进行1小时的限制酶消化，之后通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀纯化各DNA。以限制酶消化后的pUC19质粒和插入物DNA达到1：3的摩尔比的方式混合，使用DNA连接试剂盒＜Mighty Mix＞(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化成DH5α，使用LB琼脂板在37℃下培养一夜，之后使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。进行所得质粒DNA的核苷酸序列分析，得到了Rluc_WT的A122突变成了G的序列(Rluc_K41R)和克隆有Rluc_K41R的质粒DNA (pUC19-Rluc_K41R)。
以pUC19-Rluc_K41R为模板，对于5’侧片段使用Rluc_NheF01引物(SEQ ID NO:10)和RL_W104X_RV引物(SEQ ID NO: 11)、对于3’侧片段使用Rluc_XhoR01引物(SEQ IDNO: 12)和RL_W104X_FW引物(SEQ ID NO: 13)，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第1次PCR (30个循环、变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、40秒)。接下来，将各PCR产物稀释100倍，使用Rluc_NheF01引物和Rluc_XhoR01引物，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)进行第2次PCR (30个循环、变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒)，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到了具有Rluc_K41R的G311突变成了A的序列的DNA (Rluc_K41R_W104X) (SEQ ID NO: 16)。
使用NheI (TaKaRa)和XhoI (TaKaRa)，在37℃下对所得的DNA (Rluc_K41R_W104X)和psiCHECKTM-2载体(promega)进行1小时的限制酶消化，之后通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀纯化各DNA。混合限制酶消化后的Rluc_K41R_W104X和psiCHECKTM-2载体使达到3：1的摩尔比，使用DNA连接试剂盒＜Mighty Mix＞(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化成DH5α，使用LB琼脂板在37℃下培养一夜。将所挑选的集落在LB液体培养基中、于37℃下培养一夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。之后，通过核苷酸序列分析确认了所得质粒的序列。
以确认了序列的质粒为模板，使用T7_Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO: 14)和Rluc_sRNA_R01引物(SEQ ID NO: 15)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR (30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒))扩增体外转录反应用的模板DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(EpicentreBiotechnologies)进行体外转录，得到了Rluc_sRNA (SEQ ID NO: 17)。对于合成后的Rluc_sRNA，使用含有8M尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶并切取，进行纯化，用于以后的试验。
以下，显示Rluc_WT_RNA、Rluc_K41R_W104X和Rluc_sRNA的序列、以及上述使用的引物的序列。需要说明的是，表中的下划线表示编辑目标的腺苷残基。
[表6]
Figure 692059DEST_PATH_IMAGE016
[表7]
Figure DEST_PATH_IMAGE017
[表8]
Figure 360938DEST_PATH_IMAGE018
(B) 退火反应
将0.3μM的Rluc_sRNA和0.9μM的实施例和参考例的化合物(以下，有时记作gRNA)在退火缓冲液(10mM的Tri-HCl (pH7.6)、150mM的NaCl)中、于80℃下加热3分钟，用15分钟冷却至25℃。
(C) 体外编辑反应
假设通过退火反应Rluc_sRNA与gRNA完全形成了复合物，计算以下的Rluc_sRNA-gRNA复合物浓度。编辑反应通过如下操作来进行：在编辑反应缓冲液(20mM的HEPES-KOH(pH7.5)、2mM的MgCl2、100mM的NaCl、0.5mM的DTT、0.01%的TritonX-100、5%甘油)中，相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入12.5nM或6.25nM的重组hADAR2，在37℃下培养1小时。
(D) 编辑分析方法
将编辑反应后的Rluc_sRNA通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，使用Primescript逆转录酶II (TaKaRa)，通过Rluc_sRNA_R01引物(SEQ ID NO: 18)合成cDNA。之后，使用Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO: 18)和Rluc_sRNA_R01引物(SEQ ID NO: 15)、以及PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR (变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)扩增cDNA。所得的cDNA的序列分析是使用Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO:18)、Big Dye终止子3.1版循环序列试剂盒进行测序反应，通过Applied Biosystem 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由目标位点(A311)的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(%)。
[表9]
Figure 354302DEST_PATH_IMAGE020
(E) 编辑分析的结果
使用了参考例1的化合物和实施例的化合物的情况下的编辑比例(%)见图1A和图1B。在参考例1的化合物中显示超过90%的编辑比例。即使在如实施例的化合物(del03_02～del03_07)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示编辑诱导活性。另外，向与目标编辑位点形成对的C中导入硫代磷酸酯键而得的化合物(del03_08)、将ADAR诱导区的环置换成由六甘醇构成的接头而得的化合物(del03_09)也显示与参考例1的化合物同等程度的编辑诱导活性。
如图2所示，即使在如实施例的化合物(del03_10～del03_21)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示编辑诱导活性。
另外，参考例2的化合物(del03_22)是具有Z型DNA的茎环序列、且将WO2016/097212中记载的gRNA的设计方法与Rluc_sRNA序列结合适应而得的化合物。可知：del03_22与具有相同的Z型DNA的茎序列的实施例的化合物(del03_21)相比编辑诱导活性弱。另一方面，即使在如实施例的化合物(del03_Am1～del03_Am7)那样导入了修饰核酸的情况下，也显示与参考例1的化合物同等程度的编辑诱导活性。
如图3A和图3B所示，即使在如实施例的化合物(del03_23～del03_29)那样导入了修饰核酸的情况下，也显示与参考例1的化合物同样的编辑诱导活性。
如图4A和图4B所示，即使在如实施例的化合物(del03_26、del03_30～del03_32)那样导入了修饰核酸的情况下，也显示与参考例1的化合物同样的编辑诱导活性。
如图5A和图5B所示，即使在如实施例的化合物(del03_26、del03_34～del03_41)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示编辑诱导活性。
(试验例2) 培养细胞内的编辑诱导能力的评价
(A) 细胞培养
将HeLa细胞在24-孔板上进行传代使达到5.0×105个细胞/孔，培养48小时。使用Lipofectamine 3000 (Thermo)转染50ng的psiCHECK2TM_Rluc_ K41R_W104X、350ng的pcDNA3.1(-) Hygro_ADAR2、10nM的实施例或参考例的化合物即gRNA。作为对照，转染100ng表达gRNA的质粒(记载于日本特愿2017-234341号的参考例2)进行使用。
(B) 编辑分析方法
使用Sepasol RNA I Super G (Nacalai)从用24-孔板培养的细胞中提取总RNA，使用重组DNase I (TaKaRa)进行DNase处理后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用PrimeScript II逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg总RNA、0.25μM Oligo(dT)17 (SEQ ID NO:19)进行逆转录反应，扩增cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(SEQ ID NO: 20)、3’-Adp引物(SEQ ID NO: 21)进行第1次PCR (30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒))。以将第1次PCR产物稀释200倍而得的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(SEQ ID NO: 20)、Rluc_R01引物(SEQ ID NO: 22)进行第2次PCR(30个循环(变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、60秒))，扩增Rluc片段。使用Big Dye终止子3.1版循环序列试剂盒(Thermo FisherScientific)、0.165μM Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO: 18)进行测序反应，利用AppliedBiosystems 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。根据通过测序而得到的色谱图，由目标位点(A311)的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(%)。
[表10]
Figure DEST_PATH_IMAGE021
(C) 荧光素酶报告基因分析方法
使用双荧光素酶报告基因分析系统(Promega)。对用24-孔板培养的细胞使用100μL的被动裂解缓冲液(Promega)，得到了细胞提取液。在所得的20μL细胞提取液中添加100μLLARII，60秒后通过GloMax(R)20/20光度计(Promega)测定萤火虫荧光素酶(Fluc)的发光强度。之后立即添加100μL Stop＆Glo试剂，60秒后测定海肾荧光素酶(Rluc)的发光强度。发光强度通过Fluc进行标准化。
(D) 编辑分析和荧光素酶报告基因分析的结果
使用了实施例的化合物(del03_24～del03_26)的情况下的编辑比例(%)见图6A。在转染质粒的情况下显示10～20%左右的编辑比例。在转染如实施例的化合物(del03_25和del03_26)这样的硫代磷酸酯键数增加的修饰核酸的情况下，观察到编辑诱导活性，其比例较转染质粒的情形高。
使用了实施例的化合物(del03_24～del03_26)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图6B。在使用实施例的化合物(del03_25和del03_26)的情况下，观察到与转染质粒的情形同等以上的高的荧光素酶活性。
使用了参考例1的化合物(del03_01)和实施例的化合物(del03_26)的情况下的编辑比例(%)见图6C。在转染质粒的情况下显示20%左右的编辑比例。在转染参考例1的化合物(del03_01)的情况下，没有观察到编辑诱导活性。然而，在转染实施例的化合物(del03_26)的情况下，观察到高的编辑诱导活性。使用了参考例1的化合物(del03_01)和实施例的化合物(del03_26)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图6D。在使用参考例的化合物(del03_01)的情况下，没有观察到荧光素酶活性，但在使用实施例的化合物(del03_26)的情况下，观察到与转染质粒的情形相比非常高的荧光素酶活性。
使用了实施例的化合物(del03_26、del03_30～del03_33)的情况下的编辑比例(%)见图7A。在转染实施例的化合物(del03_30～del03_32)的情况下，观察到与转染上述实施例的化合物(del03_26)的情形同等程度的编辑诱导活性。另外，使用了实施例的化合物(del03_26、del03_30～del03_33)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图7B。在转染实施例的化合物(del03_30～del03_32)的情况下，观察到与转染上述实施例的化合物(del03_26)的情形同等程度的高的荧光素酶活性。
使用了实施例的化合物(del03_26、del03_34～del03_41)的情况下的编辑比例(%)见图8A。在转染实施例的化合物(del03_34～del03_41)的情况下，观察到与转染上述实施例的化合物(del03_26)的情形同等以上的编辑诱导活性。另外，使用了实施例的化合物(del03_26、del03_30～del03_33)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图8B。在转染实施例的化合物((del03_34～del03_41)的情况下，观察到与转染上述实施例的化合物(del03_26)的情形同等程度的高荧光素酶活性。
(试验例3) 对具有β-肌动蛋白基因序列的RNA的编辑诱导能力的评价
(A) RNA的合成
使用ACTB_FW (SEQ ID NO: 23)、ACTB_RV (SEQ ID NO: 24)的寡DNA和NEBuffer2 (NEB)进行退火反应(在80℃下加热3分钟，用15分钟冷却至25℃)，制作了插入物。使用EcoRI (TaKaRa)和HindIII (TaKaRa)在37℃下与pUC19进行1小时的反应，之后通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。以插入物：质粒达到3：1的摩尔比的方式加入，使用DNA连接试剂盒＜Mighty Mix＞(TaKaRa)进行连接反应。将所得的连接样品转化成DH5α，使用LB琼脂板在37℃下培养一夜。将所挑选的集落使用LB液体培养基在37℃下培养一夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取质粒。使用Big Dye终止子3.1版循环序列试剂盒(Thermo Fisher Scientific)、0.165μM的pUC19_seqFW引物(SEQ ID NO: 25)和0.165μM的pUC19_seqRV引物(SEQ ID NO: 26)对所得的100ng质粒进行连接反应，利用AppliedBiosystems 3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行序列分析。以正确制作的质粒为模板，使用T7_pUC19_FW(SEQ ID NO: 27)和M13_RV引物(SEQ ID NO: 28)、PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR (变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)制作模板DNA，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(Epicentre Biotechnologies)进行体外转录，使用含有8M尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶并切取，进行纯化。
[表11]
Figure 170948DEST_PATH_IMAGE022
[表12]
Figure DEST_PATH_IMAGE023
(B) 编辑诱导能力的评价及其结果
实施例化合物(ACTB_26)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例1的(B)-(D)同样的方法。其中，引物使用以下记载的引物。使用了实施例的化合物(ACTB_26)的情况下的编辑比例(%)见图9A和图9B。其结果，实施例的化合物(ACTB_26)显示50%左右的编辑比例。
[表13]
Figure 907960DEST_PATH_IMAGE024
(试验例4) 对具有GAPDH基因序列的RNA的编辑诱导能力的评价
(A) RNA的合成
与试验例3的(A) RNA的合成中记载的方法同样地进行操作。其中，寡DNA使用以下记载的物质。
[表14]
Figure DEST_PATH_IMAGE025
(B) 编辑诱导能力的评价及其结果
实施例化合物(GAPDH_26)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例3的“(B)编辑诱导能力的评价及其结果”同样的方法。使用了实施例的化合物(GAPDH_26)的情况下的编辑比例(%)见图9A和图9B。其结果，实施例的化合物(GAPDH_26)显示90%左右的编辑比例。
(试验例5) 对具有GFAP基因序列的RNA的编辑诱导能力的评价
(A) 目标RNA的合成
与试验例3的(A)RNA的合成中记载的方法同样地进行操作。其中，寡DNA使用以下记载的物质。
[表15]
Figure 493662DEST_PATH_IMAGE026
(B) 目标编辑向导RNA (gRNA)的合成
对于GFAP_del03 (SEQ ID NO: 38)，使用GFAP_del03_RV (SEQ ID NO: 34)和T7proGGG (SEQ ID NO: 29)的寡DNA进行退火反应(在退火缓冲液(10mM的Tri-HCl(pH7.6)、150mM的NaCl)中、于80℃下加热3分钟，用15分钟冷却至25℃)，从而制作了体外转录的模板DNA。对于5’AS_GFAP_gRNA (SEQ ID NO: 37)，使用5’AS_GFAP_FW (SEQ ID NO:35)、5’AS_ADg_RV寡DNA (SEQ ID NO: 36)和DNA聚合酶I、大(Klenow)片段(NEB)在25℃下反应30分钟，制作了模板DNA。之后，通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化。使用1.0μg的各模板DNA和AmpliScribe T7试剂盒(Epicentre Biotechnologies)进行体外转录，使用含有8M尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶并切取，进行纯化。
[表16]
Figure DEST_PATH_IMAGE027
[表17]
Figure 923506DEST_PATH_IMAGE028
(C) 编辑诱导能力的评价
实施例化合物(GFAP_26)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例3的“(B)编辑诱导能力的评价及其结果”同样的方法进行。
(试验例6) hADAR1 p110对Rluc_sRNA的编辑诱导能力的评价
(A) 退火反应
将0.3μM的Rluc_sRNA和0.9μM的实施例和参考例的化合物(gRNA)在退火缓冲液(10mM的Tri-HCl (pH7.6)、150mM的NaCl)中、于80℃下加热3分钟，用15分钟冷却至25℃。
(B) 体外编辑反应
假设通过退火反应Rluc_sRNA与gRNA完全形成了复合物，计算以下的Rluc_sRNA-gRNA复合物浓度。编辑反应通过如下操作来进行：在编辑反应缓冲液(20mM的HEPES-KOH(pH7.5)、2mM的MgCl2、100mM的NaCl、0.5mM的DTT、0.01%的TritonX-100、5%的甘油)中，相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入重组hADAR1 p110 (使用酵母表达系统进行合成/纯化。参照Macbeth, MR.和Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda,M.等人，Sci. Rep. srep41478 (2017))使终浓度达到250nM，在37℃下培养30分钟。
(C) 编辑分析方法
编辑反应后的Rluc_sRNA通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，使用Primescript逆转录酶II (TaKaRa)，通过Rluc_sRNA_R01引物合成cDNA。之后，使用Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO: 18)和Rluc_sRNA_R01引物(SEQ ID NO: 15)、PrimeStar GXLDNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR (变性：98℃、10秒，退火：55℃、15秒，延伸：68℃、20秒)扩增cDNA。所得的cDNA的序列分析是使用Rluc_sRNA_F01引物(SEQ ID NO: 18)、Big Dye终止子3.1版循环序列试剂盒进行连接反应，利用Applied Biosystem 3500基因分析仪进行分析。根据通过测序得到的色谱图，由目标位点(A311)的峰高比(G/(G+A))算出编辑比例(%)。
(D) 编辑分析的结果
使用了实施例的化合物(del03_21、del03_26和del03_32)的情况下的编辑比例(%)见图10。图中，ADg(-)表示未加入gRNA的情形。实施例的化合物(del03_21)显示与参考例1 (del03_01)的化合物和参考例2的化合物(del03_22)同等程度的hADAR1 p110的编辑诱导活性。另外，即使在如实施例的化合物(del03_26和del03_32)那样导入了修饰核酸的情况下，也显示hADAR1 p110的编辑诱导活性。
(实施例51～66)
实施例51～57的寡核苷酸化合物是根据参考例1的寡核苷酸的序列，如下所示导入修饰核苷酸而得的化合物。另外，实施例58～63的寡核苷酸化合物具有与hGAPDH对应的各种长度的第一寡核苷酸(ASR)，是如下所示导入修饰核苷酸而得的化合物。实施例64～66的寡核苷酸化合物具有以下所示的序列的第一寡核苷酸(ASR)，是如下所示导入修饰核苷酸而得的化合物。这些寡核苷酸化合物与实施例1～50同样通过亚磷酰胺法合成。
[表18]
Figure DEST_PATH_IMAGE029
表中的“分子量”表示基于负离子ESI质谱的实测值。表中的“序列”中，大写字母表示RNA，小写字母表示DNA，N(M)表示D-呋喃核糖的2’-O-甲基化，N(F)表示D-呋喃核糖的2’-脱氧-2’-氟化，N(L)表示D-呋喃核糖的2’-O, 4’-C-亚甲基化，N(E)表示D-呋喃核糖的2’-O, 4’-C-亚乙基化。“9”表示-O(CH2CH2O)3-所表示的接头，“18”表示-O(CH2CH2O)6-所表示的接头。“＾”表示核苷单元间通过-P(=S)(OH)-结合。在没有特别记载的情况下，表示核苷单元间、或核苷单元与接头通过-P(=O)(OH)-结合。寡核苷酸的5’末端和3’末端为氢原子与化学式中的氧原子结合而成的羟基。
(试验例7) 对Rluc_sRNA的编辑诱导能力的评价(2)
(A) 退火反应、体外编辑反应和编辑分析方法
与试验例1或试验例6同样地进行。这里，在hADAR2的情况下，通过相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入重组hADAR2使达到12.5nM，并在37℃下培养1小时来进行。另外，在hADAR1 p110的情况下，通过相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入重组hADAR1p110使达到250nM，并在37℃下培养30分钟来进行。
(B) 编辑分析的结果
图11A和图12A中显示hADAR2的结果，图11B和图12B中显示hADAR1 p110的结果。如图11A所示，即使在如实施例的化合物(del03_32、39、42、43、44和45)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示ADAR2的编辑诱导活性。另外，如图11B所示，即使在如实施例的化合物(del03_32、39、43和45)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示ADAR1 p110的编辑诱导活性。另一方面，在如实施例的化合物(del03_42和44)那样导入了修饰核酸的情况下，与参考例1的化合物相比，ADAR1 p110的编辑诱导活性显著降低。由上述可知：实施例的化合物(del03_42和44)选择性地与ADAR2作用。
如图12A所示，即使在如实施例的化合物(del03_26和del03_46～del03_48)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示ADAR2的编辑诱导活性。另外，如图12B所示，即使在如实施例的化合物del03_26、del03_46和del03_47)那样导入了修饰核酸的情况下，也和参考例1的化合物同样显示ADAR1 p110的编辑诱导活性。另一方面，在如实施例的化合物(del03_48)那样导入了修饰核酸的情况下，与参考例1的化合物相比，ADAR1 p110的编辑诱导活性显著降低。由上述可知：在第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间具有接头的实施例的化合物(del03_48)选择性地与ADAR2作用。
(试验例8) 培养细胞内的编辑诱导能力的评价(2)
(A) 细胞培养
将HeLa细胞在24-孔板上传代使达到5.0×105个细胞/孔，培养48小时。使用Lipofectamine 3000 (Thermo)转染50ng的psiCHECK2TM_Rluc_ K41R_W104X、350ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_ ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1 p110、或pcDNA3.1(-)Hygro_ ADAR1 p150)、20nM的实施例或参考例的化合物即gRNA。作为对照，使用转染pSuper_neo以代替实施例或参考例的化合物即gRNA而得的培养细胞。
(B) 编辑分析方法和荧光素酶报告基因分析方法
与试验例2同样地进行。
(C) 编辑分析和荧光素酶报告基因分析的结果
使用了实施例的化合物(del03_26和del03_34～del03_40)的情况下的编辑比例(%)见图13A。在转染表达ADAR1 p110或ADAR1 p150的质粒的情况下显示10%～40%左右的编辑比例，其比例明显高于仅转染ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情形。
使用了实施例的化合物(del03_26和del03_34～del03_40)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图13B。与使用实施例的化合物(del03_26和del03_38～del03_40)的情形、仅转染ADAR2、ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情形相比，观察到明显高的荧光素酶活性。另外，在使用实施例的化合物(del03_34～del03_37)的情况下观察到明显高于仅转染ADAR2质粒的情形的荧光素酶活性。然而，转染ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情况下的荧光素酶活性非常弱。由以上可知：在第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间具有接头的实施例的化合物(del03_34～del03_37)对ADAR2呈特异性。
使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_32、39、43和45)的情况下的编辑比例(%)见图14A。在转染表达ADAR2的质粒的情况下显示60%左右的编辑比例，其比例明显高于仅转染ADAR2质粒的情形。在转染表达ADAR1 p110或ADAR1 p150的质粒的情况下显示10%～40%左右的编辑比例，其比例明显高于仅转染ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情形。
使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_32、39、43和45)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图14B。在使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_32、39、43和45)的情况下，观察到明显高于仅转染ADAR2、ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情形的荧光素酶活性。
使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_42、44、46、47和48)的情况下的编辑比例(%)见图15A。在转染表达ADAR2的质粒的情况下显示30%～60%左右的编辑比例，其比例明显高于仅转染ADAR2质粒的情形。在使用实施例的化合物(del03_26、46和47)转染表达ADAR1 p110或ADAR1 p150的质粒的情况下显示10%～30%左右的编辑比例，其比例明显高于仅转染ADAR1 p110或p150质粒的情形。另一方面，在使用实施例的化合物(del03_42、44和48)转染表达ADAR1 p110或ADAR1 p150的质粒的情况下，其比例与仅转染ADAR1 p110或ADAR1p150质粒的情形为同等程度，几乎没有观察到编辑活性。
使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_42、44、46、47和48)的情况下的荧光素酶报告基因分析的结果见图15B。在使用了实施例的化合物(del03_26、以及del03_46和47)的情况下，观察到明显高于仅转染ADAR2、ADAR1 p110或p150质粒的情形的荧光素酶活性。另一方面，在使用实施例的化合物(del03_42、44和48)转染表达ADAR1 p110或ADAR1p150的质粒的情况下，其比例与仅转染ADAR1 p110或ADAR1 p150质粒的情形为同等程度，几乎没有观察到荧光素酶活性。由上述可知：实施例的化合物(del03_42、44)、和在第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间具有接头的实施例的化合物(del03_48)选择性地与ADAR2作用。
(试验例9) 对具有GAPDH基因序列的RNA的编辑诱导能力的评价(2)
(A) RNA的合成和编辑诱导能力的评价
除hADAR2之外还使用了试验例6中记载的hADAR1 p110，除此以外，与试验例4同样地进行。这里，在hADAR2的情况下，通过相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入重组hADAR2使达到12.5nM，并在37℃下培养1小时来进行。另外，在hADAR1 p110的情况下，通过相对于5nM的Rluc_sRNA-gRNA复合物加入重组hADAR1 p110使达到250nM，并在37℃下培养30分钟来进行。
(B) 编辑诱导能力的评价结果
实施例化合物(GAPDH_26、和GAPDH_49～51)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例4记载的(B)编辑诱导能力的评价及其结果同样的方法。使用了实施例的化合物(GAPDH_26和GAPDH_49～51)的情况下的编辑比例(%)见图16A和图16B。其结果，实施例的化合物(GAPDH_26和GAPDH_49～51)在使用了hADAR2和hADAR1 p110的情况下显示高的编辑比例。
实施例化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例4记载的(B)编辑诱导能力的评价及其结果同样的方法。使用了实施例的化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)的情况下的编辑比例(%)见图17A和图17B。其结果，实施例的化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)在使用了hADAR2和hADAR1 p110的情况下与未添加gRNA的情形相比显示高的编辑比例。
(试验例10) 培养细胞内的对具有GAPDH基因序列的RNA的编辑诱导能力的评价
(A) 细胞培养
将HEK293细胞在24-孔板上传代使达到5.0×104个细胞/孔，培养48小时。使用Lipofectamine 3000 (Thermo)转染500ng的表达ADAR的质粒(pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2、pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1 p110、或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1 p150)、50nM的实施例或参考例的化合物即gRNA。作为对照，使用未转染实施例或参考例的化合物即gRNA的培养细胞。
(B) 编辑诱导能力的评价及其结果
实施例化合物(GAPDH_26、和GAPDH_49～51)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例4的(B)编辑诱导能力的评价及其结果同样的方法。使用了实施例的化合物(GAPDH_26、和GAPDH_49～51)的情况下的编辑比例(%)见图16C。其结果，实施例的化合物(GAPDH_26、和GAPDH_49～51)在使用hADAR2、hADAR1 p110和hADAR1 p150的情况下显示高的编辑比例。
实施例化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)的编辑诱导能力的评价方法采用与试验例4的(B)编辑诱导能力的评价及其结果同样的方法。使用了实施例的化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)的情况下的编辑比例(%)见图18。其结果，实施例的化合物(GAPDH_26、以及GAPDH_39、52和53)在使用了hADAR2、hADAR1 p110和hADAR1 p150的情况下，与未添加gRNA的情形相比显示高的编辑比例。
Figure IDA0003391098790000011
Figure IDA0003391098790000021
Figure IDA0003391098790000031
Figure IDA0003391098790000041
Figure IDA0003391098790000051
Figure IDA0003391098790000061
Figure IDA0003391098790000071
Figure IDA0003391098790000081
Figure IDA0003391098790000091
Figure IDA0003391098790000101
Figure IDA0003391098790000111
Figure IDA0003391098790000121
Figure IDA0003391098790000131
Figure IDA0003391098790000141

Claims (34)

1.寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含：
特定目标RNA的第一寡核苷酸；
连接于上述第一寡核苷酸的3’侧的第二寡核苷酸；
可与上述第二寡核苷酸形成互补对的第三寡核苷酸；以及
连接上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的第一连接部，
其中，上述第一寡核苷酸包含：
上述目标RNA中的腺苷残基所对应的目标对应核苷酸残基；
连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的10～30个残基的寡核苷酸；以及
连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧且具有与上述目标RNA互补的核苷酸序列的3～6个残基的寡核苷酸，
上述第二寡核苷酸的残基数为5～8，
上述第三寡核苷酸的残基数为5～8，
选自由上述目标对应核苷酸残基、以及其3’侧和5’侧的各1个残基构成的反区的至少1个残基为天然型核糖核苷酸残基以外的核苷酸残基，
该寡核苷酸或其药学上可接受的盐诱导对上述目标RNA的位点特异性编辑。
2.权利要求1所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一连接部包含选自4或5个残基的寡核苷酸、和由1～8个亚烷基氧基单元构成的聚亚烷基氧基的至少1种。
3.权利要求1或2所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间含有包含亚烷基氧基单元的第二连接部。
4.权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。
5.权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基、交联型核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸的至少1种修饰核苷酸残基。
6.权利要求1～5中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述反区包含硫代磷酸酯键。
7.权利要求1～6中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基包含硫代磷酸酯键。
8.权利要求1～7中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述目标对应核苷酸残基的3’侧和5’侧的各1个残基中的至少1个残基为选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基和2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
9.权利要求1～8中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的至少一方包含选自2’-O-烷基核糖核苷酸残基、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸残基和2’-脱氧核糖核苷酸残基的至少1种修饰核苷酸残基。
10.权利要求1～9中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
11.权利要求10所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸向5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
12.权利要求1～9中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有交联型核苷酸残基和2’-O-烷基核糖核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
13.权利要求12所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸向5’方向数起第3位的核苷酸残基为交联型核苷酸残基。
14.权利要求1～9中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸具有2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
15.权利要求14所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在连接于上述目标对应核苷酸残基的5’侧的寡核苷酸中，从上述目标对应核苷酸向5’方向数起第3位的核苷酸残基为2’-脱氧-2’-氟核苷酸残基。
16.权利要求1～15中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
17.权利要求1～15中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸具有2’-O-烷基核糖核苷酸残基和交联型核苷酸残基交替连接的核苷酸序列。
18.权利要求1～17中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，在上述第一寡核苷酸中，连接于上述目标对应核苷酸残基的3’侧的寡核苷酸由4～6个残基构成。
19.权利要求1～18中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸具有连接2’-O-烷基核糖核苷酸残基的核苷酸序列。
20.权利要求1～19中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸分别是核苷酸残基通过硫代磷酸酯键连接而成。
21.权利要求1～20中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中，上述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶的酶反应引起的。
22.药物，该药物含有权利要求1～21中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
23.遗传性疾病治疗药，其含有权利要求1～21中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。
24.药物组合物，其含有权利要求1～21中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。
25.权利要求24所述的药物组合物，该药物组合物用于遗传性疾病的预防或治疗。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
27.权利要求25所述的药物组合物，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
28.权利要求1～21中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐在制造用于疾病的预防或治疗的药物中的应用。
29.权利要求1～21中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其用于在疾病的预防或治疗中使用。
30.用于疾病的预防或治疗的方法，该方法是通过对恒温动物给予药理学上有效量的权利要求1～29中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐来进行的。
31.权利要求30所述的方法，其中，疾病为遗传性疾病。
32.权利要求31所述的方法，其中，遗传性疾病是可通过将目标RNA中的腺苷残基变换成肌苷残基来治疗的疾病。
33.权利要求31所述的方法，其中，遗传性疾病是以从基因中的鸟苷残基突变成腺苷残基为原因的遗传性疾病。
34.权利要求30～33中任一项所述的方法，其中，恒温动物为人。
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