JP2022536173A - シチジンアナログを含むアンチセンスｒｎａ編集オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンを脱アミノ化するために標的ＲＮＡ分子に結合させ、細胞、好ましくはヒト細胞においてＡＤＡＲ２酵素を動員して標的ＲＮＡ分子の少なくとも１個の標的アデノシンを脱アミノ化するための、一本鎖ＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。本発明によるＡＯＮは、標的アデノシンと対向する位置にシチジンアナログを含み、シチジンアナログは、より効率的なＲＮＡ編集のために、Ｎ３部位でＨ結合供与体として機能する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８６０，８４３号明細書の優先権を主張するものであり、上記特許出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年６月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、００３２ＷＯ０１ＯＲＤ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、２，９３１バイトのサイズである。

本発明は、医学の分野に関する。具体的には、本発明は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が細胞のＲＮＡ分子を標的として、標的ＲＮＡ分子に存在する標的ヌクレオチドを特異的に変化させる、ＲＮＡ編集の分野に関する。より具体的には、本発明は、そのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ編集効果を改善するために修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡ編集ＡＯＮに関する。

ＲＮＡ編集とは、真核細胞が多くの場合部位特異的で正確な方法でそのＲＮＡ分子の配列を変更する、天然のプロセスであり、これによって、ＲＮＡにコードされたゲノムのレパートリーが数桁も増加する。ＲＮＡ編集酵素は、動物界および植物界全体を通して真核生物種について記載されてきたが、そういったプロセスは、最も単純な生命体（例えば、エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans））からヒトに至る後生動物での細胞の恒常性を管理する上で、重要な役割を果たす。ＲＮＡ編集の例とは、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換、およびシチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への変換であり、こういった変換は、それぞれ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）およびＡＰＯＢＥＣ／ＡＩＤ（ＲＮＡに作用するシチジンデアミナーゼ）と呼ばれる酵素を通して起こる。

ＡＤＡＲは、触媒ドメイン、および、２～３の二本鎖ＲＮＡ認識ドメインを含むマルチドメインタンパク質であり、問題とする酵素次第である。各認識ドメインは、特異的二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列および／または立体構造を認識する。触媒ドメインは、ｄｓＲＮＡヘリックスの一部を認識および結合する上で、ある役割も果たすが、触媒ドメインの重要な機能とは、核酸塩基の脱アミノ化によって、標的ＲＮＡの近傍の、あらまし所定の位置で、ＡをＩへと変換することである。イノシンは、細胞の翻訳機構によってグアノシンとして読み取られるが、これが意味するところは、編集されたアデノシンは、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コードすることができる、ということである。ＡからＩへの変換は、当初の開始部位の上流に新規の翻訳開始部位を創り出し、このことによりＮ末端で拡張されたタンパク質がもたらされる、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列においても、または、ＲＮＡのプロセッシングおよび／もしくは安定性に影響を与えることができる３’ＵＴＲもしくは転写の他の非コード部分においても、起こることができる。加えて、ＡからＩへの変換は、プレｍＲＮＡのイントロンまたはエクソンのスプライスエレメントで起こり、これによって、スプライシングのパターンを変更することができる。その結果として、エクソンは、含まれる場合もありスキップされる場合もある。アデノシン脱アミノ化を触媒する酵素は、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２、さらにはｈＡＤＡＲ３が含まれる、ＡＤＡＲの酵素ファミリー内にある。しかし、ｈＡＤＡＲ３については、デアミナーゼ活性はまだ示されていない。

アデノシンデアミナーゼを適用して標的ＲＮＡを編集するオリゴヌクレオチドの使用が記載されてきた（例えば、Woolf et al. 1995. PNAS 92:8298-8302; Montiel-Gonzalez et al. PNAS 2013, 110(45):18285-18290; Vogel et al. 2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271）。Montiel-Gonzalez et al. (2013)により記載された方法の欠点とは、バクテリオファージラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインからなる融合タンパク質の必要性であり、これは、短縮型天然ＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝子的に融合している。これには、標的細胞に融合タンパク質を形質導入するか、これは主たるハードルであるが、または、標的細胞に、発現用に操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物をトランスフェクトするか、のいずれかが必要である。Vogel et al. (2014)により記載されたシステムは、まずＡＤＡＲを遺伝子的に改変する必要無しでシステムを適用し、続いて標的ＲＮＡを宿す細胞にトランスフェクトするまたは形質導入して、この遺伝子操作されたタンパク質を細胞に供給する方法が明確ではないという点で、同様の難点がある。明らかに、そういったシステムは、ヒトにおける（例えば治療状況での）使用のためには適用可能であるとは言い難い。標的ＲＮＡ配列と１００％相補的であったWoolf et al. (1995)のオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物においてまたはマイクロインジェクションによるアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞においてのみ機能するように見え、特異性に関する重度の欠如で難儀した：アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的であった標的ＲＮＡ鎖中のほぼすべてのアデノシンが編集された。各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾を保有する、長さ３４個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが試験され、不活性であることがWoolf et al. (1995)で示された。ヌクレアーゼに対する安定性をもたらすために、５’および３’末端の５個のヌクレオチドにて２’－ＯＭｅで修飾されかつホスホロチオエート（ＰＳ）結合で修飾された、３４－ｍｅｒ ＲＮＡについても試験した。このオリゴヌクレオチドの中央非修飾領域は、内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができるが、この場合、上記末端修飾がエキソヌクレアーゼ分解に対する保護をもたらすこと、が示された。しかし、このシステムは、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンの脱アミノ化を示さなかった。述べたように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非修飾ヌクレオチドと対向するほぼすべてのアデノシンが編集された（したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’および３’末端の５個のヌクレオチドが修飾されていた場合は、中央非修飾領域のヌクレオチドと対向するほぼすべてのアデノシン、またはヌクレオチドが修飾されていなかった場合は、標的ＲＮＡ鎖中のほぼすべてのアデノシン）。

ＡＤＡＲは任意のｄｓＲＮＡに作用することができることが当技術分野で公知である。「多塩基置換型編集」と呼ばれることもあるプロセスを通して、酵素はｄｓＲＮＡの複数のＡを編集することになる。したがって、そのような多塩基置換型編集を回避し、標的ＲＮＡ分子の特定のアデノシンのみを標的として、治療上適用可能となる方法および手段が必要である。Vogel et al. (2014)は、編集する必要がないアデノシンと対向する位置でのオリゴヌクレオチドに２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを使用することによって、そのようなオフターゲット編集を抑制することができることを示した。そして、Vogel et al. (2014)は、標的ＲＮＡ上の特異的に標的化されるアデノシンと真向かいに非修飾ヌクレオチドを使用した。しかし、ＡＯＮと共有結合を有する組換えＡＤＡＲ酵素を使用することなく、標的ヌクレオチドにて特定の編集効果が起こることは示されなかった。

国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットでは、ＲＮＡの標的化編集用のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が開示されているが、この場合、ＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列と相補的である配列によって（そこでは「ターゲティング部分」と呼ばれる）、および標的ＲＮＡと好ましくは非相補的であるステム－ループ構造（そこでは「動員部分」と呼ばれる）の存在によって、特徴付けられる。かかるオリゴヌクレオチドは、「自己ルーピングＡＯＮ」と呼ばれる。標的配列とターゲティング部分とのハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡへと、細胞に存在する天然ＡＤＡＲ酵素を動員する際に、動員部分は働く。動員部分に起因して、コンジュゲート主体または修飾組換えＡＤＡＲ酵素の存在は必要ない。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットでは、ＡＤＡＲ酵素の、天然基質（例えば、ＧｌｕＢ受容体）またはｄｓＲＮＡ結合ドメインもしくはＺ－ＤＮＡ結合ドメインによって認識されることが公知であるＺ－ＤＮＡ構造、のいずれかを模倣するステム－ループ構造である動員部分が、記載されている。ステムループ構造は、別々の２つの核酸鎖によって形成された分子間ステムループ構造であってもよく、単一の核酸鎖内に形成された分子内ステムループ構造であってもよい。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載の動員部分のステム－ループ構造は、分子内ステム－ループ構造であり、ＡＯＮ自体内で形成され、ＡＤＡＲを誘引することができる。

国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレットおよび国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレットでは、かかるステムループ構造を含まないが、１個または複数のミスマッチヌクレオチド、いわゆる「ゆらぎ」もしくは「バルジ」を除いて、標的領域と（ほぼ完全に）相補的であるＡＯＮが記載されている。唯一のミスマッチは、標的アデノシンと対向するヌクレオチドの部位にあるとすることができるが、他の実施形態では、ＡＯＮは、標的配列領域に付着した場合、多重のバルジおよび／またはゆらぎを伴って記載された。ＡＯＮの配列は、ＡＤＡＲを誘引することができるように注意深く選択された場合、ステムループ構造を欠くＡＯＮで、および内因性ＡＤＡＲ酵素で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏのＲＮＡ編集を行うことが可能であると思われた。「オーファンヌクレオチド」は、標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンの真向かいに位置するＡＯＮのヌクレオチドとして定義されるが、２’－ＯＭｅ修飾を保有しなかった。オーファンヌクレオチドはまた、ＤＮＡヌクレオチド（２’修飾を保有しない糖主体である）とすることもでき、この場合、ＡＯＮの残部は、糖主体に２’－Ｏ－アルキル修飾（例えば２’－ＯＭｅ）を保有したが、あるいは、オーファンヌクレオチドを直接囲んでいるヌクレオチドは、ＲＮＡ編集の効率性をさらに改善しおよび／もしくはヌクレアーゼに対する耐性をさらに高める、特定の化学修飾を含有した（またはＤＮＡであった）。かかる効果は、分解に対してＡＯＮを「保護する」センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）を使用することによって、さらにもっと改善することができた（国際公開第２０１８／１３４３０１号パンフレットに記載）。

上で概説した成果にもかかわらず、（内因性）細胞経路およびデアミナーゼ活性を備える酵素、例えば、天然に発現されるＡＤＡＲ酵素を利用して、哺乳動物細胞において、生物全体においても、内因性核酸をより特異的にかつより効果的に編集し、その結果疾患を緩和することができる、改善された化合物のニーズが依然としてある。

本発明は、標的ＲＮＡ分子と二本鎖核酸複合体を形成することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、二本鎖核酸複合体は、標的ＲＮＡ分子の少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のためにＡＤＡＲ酵素を動員することができ、標的アデノシンの真向かいにあるＡＯＮのヌクレオチドは、Ｎ３部位でＨ結合供与体として機能するシチジンアナログである、ＡＯＮに関する。本発明のＡＯＮで使用される好ましいシチジンアナログは、シュードイソシチジン（ｐｉＣ）およびベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）である。本明細書に開示の教示に従って使用することができる他の好ましいシチジンアナログは、５－ヒドロキシＣ－Ｈ＋、５－アミノＣ－Ｈ＋および８－オキソＡ（ｓｙｎ）である。好ましくは、シチジンアナログは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を保有しない。好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、リボースの２’位に置換を含む１個または複数のヌクレオチドをさらに含み、ここで、置換は：－ＯＨ；－Ｆ；１個または複数のヘテロ原子によって中断されていてもよい、置換もしくは非置換、直鎖状もしくは分枝状の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アリル；－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシ、からなる群から選択される。別の好ましい態様では、動員されるＡＤＡＲ酵素は、内因性酵素、好ましくは内因性ＡＤＡＲ２酵素である。

別の実施形態では、本発明は、本発明によるＡＯＮおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。

さらに別の実施形態では、本発明は、遺伝障害であって：嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、（常染色体優性型）網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ－サックス病、アッシャー症候群（例えばアッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝障害の処置または予防における使用のための、本発明によるＡＯＮまたは本発明による医薬組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、細胞の標的ＲＮＡ分子に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明によるＡＯＮまたは本発明による医薬組成物を細胞に供給するステップと；ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、細胞の内因性ＡＤＡＲ酵素を動員することができる二本鎖核酸複合体を形成するステップと；ＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；必要に応じて、標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップとを含む方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明によるＡＯＮを用意するステップと；ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、二本鎖核酸複合体を形成するステップと；哺乳動物のＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；必要に応じて、標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップとを含む方法に関する。

次に、本発明の１つまたは複数の実施形態を、添付の図面を参照することにより、単なる例示として説明する。

ｄｓＲＮＡに結合したＡＤＡＲ２ Ｅ４８８Ｑ変異型の結晶構造および４８８位のグルタミン（Ｇｌｎ）とオーファンシチジンとの接触を示す、図である。 ４８８位にグルタミン酸（Ｇｌｕ）を有する野生型ＡＤＡＲ２とオーファンシチジンの間のプロトン化依存性接触を示す、図である。 （左側に）４８８位にグルタミン酸（Ｇｌｕ）を有する野生型ＡＤＡＲ２と、Ｎ３に水素結合供与を提供してグルタミン酸残基と相互作用するシチジンアナログ「シュードイソシチジン」（ｐｉＣ）との間の相互作用を示す、図である。右側に、シチジンアナログｐｉＣとベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）の構造を示すが、これは、Ｎ３での水素の存在を指示する（正常なシチジンには存在しない）。 本明細書で概説のシチジンアナログを模倣する、２つのシチジンアナログ、５－ヒドロキシシチジン－Ｈ＋（左）および５－アミノシチジン－Ｈ＋（中央）ならびにアデノシンアナログ８－オキソアデノシン（右）を示す、図である。 わずかに上方にある標的アデノシンを有する標的マウスＩｄｕａ ＲＮＡ配列（５’から３’まで；配列番号２）を示す、図である。標的配列の下に、２９ｎｔのガイドＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（３’から５’まで；配列番号１）を与える。Ｎは、オーファンヌクレオチド（標的アデノシンと対向する）を表し、これは、正常の（デオキシ－）シチジンであっても、ｐｉＣやｄＺなどの本明細書で概説のシチジンアナログであってもよい。 標的アデノシンと対向する正常のシチジン（「Ｃ」）を保有するＡＯＮと、標的アデノシンと対向するシュードイソシチジン（ｐｉＣ）を保有するＡＯＮを比較した速度論的解析の結果を示す、図である。 標的アデノシンと対向する正常のシチジン（デオキシ－Ｃ、またはここでは：「ｄＣ」）を保有するＡＯＮと、標的アデノシンと対向するベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）を保有するＡＯＮを比較した速度論的解析の結果を示す、図である。 ３種のＡＯＮを比較した速度論的解析の結果を示す、図である：標的アデノシンと対向する正常のシチジン（デオキシ－Ｃ、またはここでは：「ｄＣ」）を保有するもの、標的アデノシンと対向するシチジンアナログとしてベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）を保有するＡＯＮのもの、および標的アデノシンと対向するシチジンアナログとしてデオキシ－シュードイソシチジン（ｄｐｉＣ）を保有するもの。 （Ａ）編集されるＡヌクレオチドが太字である、ＡＯＮを標的としたＡからＩへの編集をうける、マウスｍＲＮＡ Ｉｄｕａ配列（下の鎖；５’から３’まで；配列番号６）を示す、図である。上の鎖は、ＲＮＡ編集ＡＯＮ配列（配列番号７）を、３’から５’まで示す。編集されるＡに対抗するＣヌクレオチドは太字であり下線が引かれている。（Ｂ）試験された２種のＡＯＮを示す図であり、ここでは５’から３’までである（（Ａ）と同じ配列）。小文字のヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾ＲＮＡヌクレオチドである。大文字のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。アスタリスク（^＊）は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を指示する。ＩＤＵＡ２８７の正常のデオキシシチジン（ｄＣ）ヌクレオチドおよびＩＤＵＡ２９４のシチジンアナログベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）ヌクレオチドは、太字で与えられかつ下線が引かれている。 初代マウス肝線維芽細胞アッセイにおける、トランスフェクション後（内因性ＡＤＡＲを適用）にＡＯＮのＩＤＵＡ２８７およびＩＤＵＡ２９４を使用した編集パーセンテージのｄｄＰＣＲ解析の結果を示す、図である。

標的ＲＮＡの標的アデノシンの編集効率に悪影響を及ぼすことなく、ＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ、「編集オリゴヌクレオチド」または「ＥＯＮ」と呼ばれる場合もある）の薬物動態特性を改善するニーズが絶えずある。多くの化学修飾が、ＡＯＮの生成にあたって存在するが、その特性は、効率的なＲＮＡ編集を達成するという願望と常に適合しているとは限らない。より良好な薬物動態特性に関する探索において、すべてではないが一部のヌクレオチドのリボースの２’－Ｏ－メトキシエチル（または２’－メトキシエトキシ；または２’－ＭＯＥ）修飾が、驚くべきことに、効率的なＡＤＡＲの関与および編集に適合していると思えることが、先にわかっていた（国際公開第２０１９／１５４８４７５号パンフレット）。

ヒトＡＤＡＲ２の変異誘発研究が明らかにしたことは、グルタミン酸からグルタミンへの残基４８８（Ｅ４８８Ｑ）での単一の変異により、野生型酵素と比較した場合、脱アミノ化の速度定数に６０倍上昇が得られたことである（Kuttan and Bass. Proc Natl Acad Sci USA 2012. 109(48):E3295-3304）。脱アミノ化反応過程では、ＡＤＡＲは編集した塩基をそのＲＮＡ二重鎖から酵素活性部位へと外側に引き出す（Matthews et al. Nat Struct Mol Biol 2016. 23(5):426-433）。ＡＤＡＲ２が好ましい状況でアデノシンを編集する場合（Ａ：Ｃミスマッチ）、標的アデノシンと対向するヌクレオチドは「オーファンシチジン」と、多くの場合呼ばれる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に結合したＡＤＡＲ２ Ｅ４８８Ｑの結晶構造が明らかにしたことは、４８８位のグルタミン（Ｇｌｎ）側鎖が、ＡＤＡＲ２ Ｅ４８８Ｑの触媒速度の上昇を招くＨ結合を、オーファンシチジンのＮ３位に（図１）、供与することができることである（Kuttan and Bass. 2012）。グルタミン（Ｇｌｎ）の代わりにグルタミン酸（Ｇｌｕ）が４８８位に存在する野生型酵素では、グルタミンのアミド基は存在しておらず、代わりにカルボン酸である。オーファンシチジンとＥ４８８Ｑ変異型との同じ接触を獲得することには、次に、野生型の状況にとって、そういった接触が起こるためのプロトン化が必要であると思われる（図２）。内因的に発現されたＡＤＡＲ２を利用して、疾患に関連する変異を矯正するためには（過剰発現と外因性投与が必要とされ得る変異型ＡＤＡＲ２バージョンではない）、細胞に存在する野生型ＡＤＡＲ２酵素の編集効率を最大化することが必須である。酵素変異型を使用することに代えて、本発明の発明者らは、特にオーファンシチジンの位置で修飾ＲＮＡ塩基を有するＡＯＮを使用して、Ｅ４８８Ｑ ＡＤＡＲ２変異型によって観察される水素結合パターンを模倣することを目的とした。ＡＯＮの標的アデノシンと対向するヌクレオチドを、Ｎ３でＨ結合供与体として機能すると思われる特定のシチジンアナログで置き換えることによって、変異型酵素に関して触媒速度の上昇をもたらすと思われる同じ接触を安定化することが可能であろうと想定された。図３に、２種のシチジンアナログを示す：シュードイソシチジン（「ｐｉＣ」とも呼ばれる；Lu et al. J Org Chem 2009. 74(21):8021-8030; Burchenal et al. (1976) Cancer Res 36:1520-1523）およびベンナーの塩基Ｚ（「ｄＺ」とも呼ばれる；Yang et al. Nucl Acid Res 2006. 34(21):6095-6101）。これらは、核酸塩基の形状に対して最小限の撹乱を持ってＮ３での水素結合の供与を与えてくれるので、最初に選択されたものである。図４に、同じ目的に適用することができるさらなる非限定的核酸塩基アナログを示す。添付の例に、標的アデノシンと対向するヌクレオチドとしてｐｉＣを有するＡＯＮを適用した後に実行した、ＡＤＡＲ２の速度論的解析を、当該位置に正常のシチジンを保有するＡＯＮと比較して、示す。これらの実験が明らかにしたところは、ｐｉＣオーファンヌクレオシドを使用する場合の脱アミノ化速度は、同じ位置に正常のシチジンを保有したＡＯＮを使用した場合よりも概ね１．８倍高いことであった（図６および８）。また、標的アデノシンと対向する正常のシチジン（デオキシ－Ｃ、またはｄＣ）を保有するＡＯＮを、同じセットアップで標的アデノシンと対向するベンナーの塩基Ｚアナログ（ｄＺ）を保有するＡＯＮと比較したところ、ＲＮＡ編集も改善されることもわかった（図７および８）。初代マウス線維芽細胞でトランスフェクションセットアップを使用すると、ＡＯＮのさらに同一の環境でデオキシ－ＣをｄＺと比較した場合、ＲＮＡ編集も向上した（図１０）。これらの結果が示すところは、本発明者らは、オーファンヌクレオシド位置にヌクレオシドアナログを保有するＡＯＮを使用することによって脱アミノ化効率を高めることが実際にできたが、この場合、アナログのＮ３部位がＨ結合供与体部位として機能する、ということである。

本発明のＡＯＮにおけるシチジンアナログの存在はまた、リボース２’基への修飾に加えて存在することができる。ＡＯＮのリボース２’基は、２’－Ｈ（すなわち、ＤＮＡ）、２’－ＯＨ（すなわち、ＲＮＡ）、２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、２’－Ｆ、または２’－４’－連結のもの（すなわち、ロック核酸またはＬＮＡ）、またはその他の２’置換から独立して選択することができる。様々な２’の修飾については、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレット、国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレット、国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレット、および国際公開第２０１８／１３４３０１号パンフレットでさらに詳しく論議されている。２’－４’結合は、メチレンリンカーや拘束エチルリンカーなどの当技術分野で公知のリンカーから選択することができる。すべての場合において、修飾は、オリゴヌクレオチドがＲＮＡ編集ＡＯＮとしてのその役割を満たすような編集と、適合している必要がある。ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素の編集活性と非対応ではない位置に少なくとも１つのアンロック核酸（ＵＮＡ）リボース修飾を生成することによって、ヌクレオチド脱アミノ化活性を備える酵素への結合向けに、ＡＯＮをさらに最適化することができる（ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０５３２８３に記載のように、未公開）。ＵＮＡの修飾では、リボースの２’と３’の炭素原子の間に炭素－炭素結合はない。したがって、ＵＮＡリボース修飾によってオリゴヌクレオチドの局所的な柔軟性が高まる。ＵＮＡによって、分解に対する耐性の向上を通して、薬物動態特性の向上などの効果を招くことができる。ＵＮＡはまた、毒性を低下させることもでき、オフターゲット効果の低減に関与する場合もある。好ましくは、ＡＯＮとは、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ編集一本鎖ＡＯＮであり、ここで、標的ヌクレオチドは標的ＲＮＡのアデノシンであり、ここで、アデノシンは、翻訳機構によってグアノシンとして読み取られているイノシンへ脱アミノ化される。好ましくは、アデノシンは、ＵＧＡまたはＵＡＧストップコドンに存在し、これは、ＵＧＧコドンに編集される；または、ここで、２個の標的ヌクレオチドはＵＡＡストップコドンの２個のアデノシンであり、このコドンは、両方の標的アデノシンの脱アミノ化を通してＵＧＧコドンに編集され、ここで、オリゴヌクレオチドの２個のヌクレオチドが標的核酸とミスマッチする。

本発明によるＡＯＮは、ヌクレオシド間結合修飾を含んでもよい。一実施形態では、かかる他のヌクレオシド間結合の１つは、ホスホノアセテート、ホスホロチオエート（ＰＳ）またはメチルホスホネート（ＭＰ）修飾結合とすることができる。好ましい結合はＰＳ結合である。ＭＰ結合の好ましい位置は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０５９３６９（未公開）に記載されている。別の実施形態では、ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステルのＯＨ基がアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、－ＮＲ１Ｒ１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、－Ｓ－Ｚ＋、－Ｓｅ－Ｚ＋、または－ＢＨ３－Ｚ＋によって置き換えられたホスホジエステルとすることができる（式中、Ｒ１は、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり、かつＺ＋はアンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、もしくは複素環式イミニウムイオンであり、そのいずれもが第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、またはＺは一価金属イオンであり、ＰＳ結合であるのが好ましい）。

本発明のＡＯＮでは、オーファンヌクレオチド（標的アデノシンの真向かいのヌクレオチド）は一般に、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、好ましくは、２’－ＯＭｅ修飾を保有するリボースを含まない。さらに、本発明のＡＯＮは一般に、オーファンヌクレオチドに対してある特定の位置に２’－ＭＯＥ修飾を含まず、さらに、ＡＯＮ内の他の位置に２’－ＭＯＥ修飾を含むことができる。

本発明は、細胞の標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明の第１の態様によるＡＯＮまたは本発明の第２の態様による組成物を細胞に供給するステップと、ＡＯＮの細胞による取り込みを可能にするステップと、ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせるステップと、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する哺乳動物酵素によって標的ＲＮＡ分子の標的ヌクレオチドを脱アミノ化させるステップと、必要に応じて、標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化ヌクレオチドの存在を特定するステップとを含む方法に関する。好ましくは、標的ＲＮＡ分子の存在は、以下のいずれかによって検出される、（ｉ）標的配列を配列決定するステップ、（ｉｉ）標的アデノシンが、脱アミノ化を通してＵＧＧコドンに編集されるＵＧＡまたはＵＡＧのストップコドンに位置する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ、（ｉｉｉ）２個の標的アデノシンが、両方の標的アデノシンの脱アミノ化を通してＵＧＧコドンに編集されるＵＡＡストップコドンに位置する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ、（ｉｖ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変更されたか否かを評価するステップ；または（ｖ）機能的読出し情報を使用するステップであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能的で、全長の、伸長されたおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ。したがって、本発明はまた、（プレ）ｍＲＮＡに存在する未成熟終止ストップコドン（ＰＴＣ）を標的にして、停止コドンに存在するアデノシンをイノシン（Ｇとして読み取る）に変更する、ＡＯＮであって、次いで、翻訳過程でのリードスルーおよび完全長の機能的タンパク質をもたらす、ＡＯＮに関する。本発明の教示は、本明細書に概説のように、ＡＯＮを用いて標的とすることができるかつＲＮＡ編集を通して処置することができる、すべての遺伝病に適用可能である。

好ましい実施形態では、本発明によるＡＯＮは、相補的な標的ＲＮＡ領域との２、３、４、５、６、７、８、９または１０のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含む。標的アデノシンと対向するヌクレオチドがシチジンアナログである場合、ＡＯＮは標的ＲＮＡ分子と少なくとも１回ミスマッチする。しかし、好ましい態様では、１つまたは複数のさらなるミスマッチヌクレオチド、ゆらぎおよび／またはバルジが、ＡＯＮと標的ＲＮＡとの間に存在する。このようなことは、標的アデノシンの位置で、細胞に存在するＡＤＡＲによるＲＮＡ編集効率に加えるべきである。当業者であれば、生理学的条件下でハイブリダイゼーションがなおも起こるか否かを判定することができる。本発明のＡＯＮは、細胞に存在する哺乳動物ＡＤＡＲ酵素を動員（関与）することができ、ここで、ＡＤＡＲ酵素は、野生型酵素に見られるようにその天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む。本発明によるＡＯＮは、内因性細胞経路および天然に利用可能なＡＤＡＲ酵素、またはＡＤＡＲ活性を備える酵素（これはまだ未同定のＡＤＡＲ様酵素であってもよいが）を利用して、標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンを特異的に編集することができる。本明細書に開示のように、本発明の一本鎖ＡＯＮは、標的ＲＮＡ分子のアデノシンなどの特定の標的の脱アミノ化を行うことができる。理想的には、少なくとも１個の標的ヌクレオチドが脱アミノ化される。あるいは、さらなる１、２、または３個のヌクレオチドが脱アミノ化される。本発明のＡＯＮの特徴をまとめると、改変された組換えＡＤＡＲ発現の必要がなく、ＡＯＮに付着したコンジュゲート主体、または、標的ＲＮＡ配列と相補的ではない長い動員部分の存在の必要がない。そればかりか、本発明のＡＯＮによって、ＲＮＡ／ＡＯＮ複合体の他の場所での多塩基置換型編集のリスクなく野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む天然のヌクレオチドデアミナーゼ酵素による標的ＲＮＡ分子に存在する標的ヌクレオチドの特異的脱アミノ化が、可能になる。

本発明は、標的ＲＮＡ分子と二本鎖核酸複合体を形成することができる、ＡＯＮであって、二本鎖核酸複合体は、標的ＲＮＡ分子の少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のためにＡＤＡＲ酵素を動員することができ、少なくとも１個の標的アデノシンの真向かいにあるＡＯＮのヌクレオチドは、Ｎ３部位でＨ結合供与体として機能するシチジンアナログである、ＡＯＮに関する。好ましくは、シチジンアナログは、シュードイソシチジン（ｐｉＣ）またはベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）である。これらのシチジンアナログヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡフォーマットに、または本明細書でさらに概説の２’位で潜在的に修飾されたフォーマットに、なることができる。本発明のＡＯＮで使用することができる他の好ましいシチジンアナログは、５－ヒドロキシＣ－Ｈ＋、５－アミノＣ－Ｈ＋および８－オキソＡ（ｓｙｎ）である。本発明によるオリゴヌクレオチドでまた使用することができる他のシチジンアナログは、シチジンＣ５メチル、エチル、プロピル等などのシュードイソシチジン（ｐｉＣ）、ベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）、５－ヒドロキシＣ－Ｈ＋、５－アミノＣ－Ｈ＋および８－オキソＡ（ｓｙｎ）の誘導体、ニトロとは異なる置換基（例えば、アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ等）を有するベンナーの塩基ＺのバリアントおよびＣ２で置換された８－オキソＡのバリアント（メチル、エチル、プロピル、ハロゲン等）、である。好ましい一態様では、シチジンアナログは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を保有しない。別の好ましい態様では、本発明によるＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホノアセテートおよび／またはメチルホスホネート（ＭＰ）のヌクレオチド間結合を含む。好ましい態様では、二本鎖核酸複合体は、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員することができ、好ましくは、ここで、ＡＤＡＲ酵素は内因性ＡＤＡＲ２酵素である。別の好ましい態様では、ＡＯＮは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個のヌクレオチドを含み、最大で１００ヌクレオチド長、好ましくは最大で６０ヌクレオチド長である。

本発明はまた、本発明によるＡＯＮおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物にも関する。かかる薬学的に許容される担体または希釈剤は、当業者に周知である。

別の実施形態では、本発明は、遺伝障害であって：嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、（常染色体優性型）網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ－サックス病、アッシャー症候群（例えばアッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝障害の処置または予防における使用のための、本発明によるＡＯＮまたは本発明による医薬組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、細胞の標的ＲＮＡ分子に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明によるＡＯＮまたは本発明による医薬組成物を細胞に供給するステップと；ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、細胞の内因性ＡＤＡＲ酵素を動員することができる二本鎖核酸複合体を形成するステップと；ＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；必要に応じて、標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップとを含む方法に関する。脱アミノ化アデノシンの存在を特定する上での必要に応じたステップは、脱アミノ化標的アデノシンを含む、標的ＲＮＡ分子の領域を配列決定するステップ；標的アデノシンがＵＧＡまたはＵＡＧのストップコドンに存在する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；２個の標的アデノシンがＵＡＡストップコドンに存在する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；標的ＲＮＡ分子がプレｍＲＮＡである場合、プレｍＲＮＡのスプライシングは脱アミノ化によって変更されたか否かを評価するステップ；または機能的読出し情報を使用するステップであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡ分子が、機能的で、全長の、伸長されたおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップによって実行される。

さらに別の実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明によるＡＯＮを用意するステップと；ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、二本鎖核酸複合体を形成するステップと；哺乳動物のＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；必要に応じて、標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップとを含む方法に関する。

二本鎖ＡＯＮ／標的ＲＮＡ分子複合体は、ワトソン－クリック塩基対を通して相互作用する。当業者であれば、当技術分野で利用可能な教示に基づいて、ＲＮＡ編集を行う能力のレベルを判定し、これを特定の糖および／または結合修飾の指定された位置を欠くＡＯＮと比較することができる。別の好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、リボースの２’位に置換を含む１個または複数のヌクレオチドをさらに含み、ここで、置換は：－ＯＨ；－Ｆ；１個または複数のヘテロ原子によって中断されていてもよい、置換もしくは非置換、直鎖状もしくは分枝状の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アリル；－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択される。

標的ヌクレオチドの真向かいにあるＡＯＮのヌクレオチドは、本明細書では「オーファンヌクレオチド」として定義される。好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を含む少なくとも１個のヌクレオチドを含み、オーファンヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を保有しない。

本発明によるＡＯＮは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヌクレオチド長であるのが好ましい。ＡＯＮの長さは、存在する構造に応じて変化することができる（ヘアピン構造のＡＯＮは一般により長いが、ヘアピン構造が存在しない場合、ＡＯＮは比較的「短い」とすることができ、好ましくは１５～２５個のヌクレオチドを含む）。本発明のＡＯＮは、必ずしもＡＤＡＲを誘引するための動員部分（ステムループ構造）を保有するとは限らないが、動員部分は除外されない。いずれの場合でも、本明細書に概説のシチジンアナログは、様々な異なるＲＮＡ編集ＡＯＮにおいて適用することができる。また、好ましくは、ＡＯＮは１００個のヌクレオチドよりも短く、より好ましくは６０個のヌクレオチドよりも短い。

別の実施形態では、本発明は、遺伝障害であって：嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、（常染色体優性型）網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ－サックス病、アッシャー症候群（例えばアッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝障害の処置のための医薬の製造における、本発明によるＡＯＮの使用に関する。

本発明によるＡＯＮの使用を通して関与するヌクレオチドデアミナーゼ活性を備える哺乳動物酵素は、好ましくはアデノシンデアミナーゼ酵素、より好ましくはＡＤＡＲ２、さらにより好ましくは細胞に存在する内因性ＡＤＡＲ２酵素であるとともに、標的ＲＮＡ分子の標的ヌクレオチドを変更させることができ、その標的ヌクレオチドはその場合、イノシンへ脱アミノ化されるアデノシンであるのが好ましい。

別の実施形態では、本発明は、対象、好ましくはそれを必要とするヒト対象を処置する、方法であって、対象は、アデノシンの出現（例をあげるとＰＴＣで）を伴う変異によって引き起こされる遺伝障害に罹患しており、ここで、標的アデノシンのイノシンへの脱アミノ化によって、疾患が緩和、予防、または改善されると思われ、本発明によるＡＯＮまたは医薬組成物を対象に投与して、対象の細胞においてＡＯＮがこの特定の相補的標的核酸と二本鎖核酸複合体を形成することを可能にするステップと；内因性で存在するｈＡＤＡＲ２の関与を可能にするステップと；酵素が標的核酸の標的分子の標的アデノシンをイノシンへ脱アミノ化することを可能にして、それによって、遺伝病を緩和、予防または改善するステップとを含む、方法に関する。本方法により処置することができる遺伝病は、それらに限定されないが、本明細書に列記の遺伝病であるのが好ましい（上を参照されたい）。

当業者であれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは一般に繰り返しモノマーからなることを知っている。かかるモノマーは、ほとんどの場合、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ＲＮＡの最も共通の天然に存在するヌクレオチドは、アデノシン一リン酸（Ａ）、シチジン一リン酸（Ｃ）、グアノシン一リン酸（Ｇ）、およびウリジン一リン酸（Ｕ）である。これらは、五炭糖、リボース、リン酸エステルを介して連結している５’連結リン酸基、および１’－連結塩基からなる。糖は、塩基とリン酸を接続し、したがって、ヌクレオチドの「足場」と呼ばれることが多い。それゆえ、五炭糖における修飾は「足場修飾」と呼ばれることが多い。重度の修飾の場合、当初の五炭糖を、塩基とリン酸を同様に接続する別の部分で全体として置き換えることが可能かもしれない。したがって、五炭糖は足場であることが多いが、一方、足場は必ずしも五炭糖であるとは限らないことが理解される。核酸塩基と呼ばれることもある塩基は一般に、アデニン、シトシン、グアニン、チミンもしくはウラシル、またはそれらの誘導体である。シトシン、チミン、およびウラシルはピリミジン塩基であり、一般にそれらの１－窒素を通して足場に連結している。アデニンおよびグアニンはプリン塩基であり、一般にそれらの９－窒素を通して足場に連結している。

ヌクレオチドは一般に、その５’－リン酸部分が隣接ヌクレオチドモノマーの３’－ヒドロキシル部分に縮合することを通して、隣接ヌクレオチドに接続されている。同様に、その３’－ヒドロキシル部分は一般に、隣接ヌクレオチドモノマーの５’－リン酸に接続されている。これにより、ホスホジエステル結合が形成される。ホスホジエステルと足場は交互コポリマーを形成する。塩基はこのコポリマー上に、すなわち足場部分にグラフトされる。この特徴により、オリゴヌクレオチドの連結モノマーによって形成される交互コポリマーは、オリゴヌクレオチドの「主鎖」と呼ばれることが多い。ホスホジエステル結合は隣接モノマーどうしを互いに接続するので、「主鎖結合」と呼ばれることが多い。リン酸基は、修飾され、その結果、かわりにホスホロチオエート（ＰＳ）などのアナログ部分である場合、かかる部分は依然としてモノマーの主鎖結合と呼ばれることが理解される。これは「主鎖結合の修飾」と呼ばれる。一般論として、オリゴヌクレオチドの主鎖は、交互足場および主鎖結合を含む。

本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルとすることができる。核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシルの修飾型とすることができる。修飾核酸塩基は、ヒポキサンチン（イノシンの核酸塩基）、シュードウラシル、シュードシトシン、１－メチルシュードウラシル、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ハロウラシル、５－ハロメチルウラシル、５－トリフルオロメチルウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－アミノメチルウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルウラシル、５－アミノメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、シュードイソシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ２－シクロペンチルグアニン、Ｎ２－シクロペンチル－２－アミノプリン、Ｎ２－プロピル－２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、Ｇ－クランプ、スーパーＡ、スーパーＴ、スーパーＧ、アミノ修飾核酸塩基またはそれらの誘導体；および、縮重またはユニバーサル塩基、２，６－ジフルオロトルエンなど、または非存在、脱塩基部位など（例えば、１－デオキシリボース、１，２－ジデオキシリボース、１－デオキシ－２－Ｏ－メチルリボース、アザリボース）、とすることができる。本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基それ自体を指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に連結した核酸塩基を指す。

本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）リボース修飾を保有する１個または複数のヌクレオチドを含むことができる。また、ＡＯＮは、２’－ＭＯＥリボース修飾を保有しない１個または複数のヌクレオチドを好ましくは含み、ここで、２’－ＭＯＥリボース修飾は、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を備える酵素が標的ヌクレオチドを脱アミノ化することを妨げない位置にある。そして、別の好ましい態様では、ＡＯＮは、２’－ＭＯＥリボース修飾を含まない位置に２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含み、および／またはここで、オリゴヌクレオチドは、２’－ＭＯＥリボース修飾を含まない位置にデオキシヌクレオチドを含む。ＡＯＮは、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、２’－ＯＨ、２’－デオキシ、２’－Ｆ、または２’－４’－結合を含む２’位を含む１個または複数のヌクレオチドを含むことができる（すなわち、ロック核酸またはＬＮＡ）。２’－４’結合は、メチレンリンカーや拘束エチルリンカーなどの当技術分野で公知のリンカーから選択することができる。様々な２’修飾については、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレット、国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレット、国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレット、国際公開第２０１８／１３４３０１号パンフレット、国際公開第２０１９／２１９５８１号パンフレット、および国際公開第２０１９／１５８４７５号パンフレットにおいて、さらに詳細に論じられている。すべての場合において、オリゴヌクレオチドが編集オリゴヌクレオチドとしてのその役割を満たすように、修飾は編集と適合している必要がある。位置がＵＮＡリボース修飾を含む場合、当該位置は、上で論議と同じ修飾を含む２’位、すなわち、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、２’－ＯＨ、２’－デオキシ、２’－Ｆ、または２’－４’－結合（すなわち、ロック核酸またはＬＮＡ）を有することができる。ここでも、すべての場合において、オリゴヌクレオチドが編集オリゴヌクレオチドとしてのその役割を満たすように、修飾は編集と適合している必要がある。本発明のすべての態様では、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を備える酵素は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２であることが好ましい。高度に好ましい実施形態では、ＡＯＮは、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドであり、ここで、標的ヌクレオチドは、標的ＲＮＡのアデノシンであり、ここで、アデノシンは、翻訳機構によってグアノシンとして読み取られているイノシンへ脱アミノ化される。さらに好ましい実施形態では、アデノシンは、ＵＧＡまたはＵＡＧのストップコドンに位置し、これは、ＵＧＧコドンに編集される；または、ここで、２個の標的ヌクレオチドはＵＡＡストップコドンの２個のアデノシンであり、このコドンは、両方の標的アデノシンの脱アミノ化を通してＵＧＧコドンに編集され、ここで、オリゴヌクレオチドの２個のヌクレオチドは標的核酸とミスマッチする。本発明はまた、本明細書で特徴付けられるようなＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。

「シチジンアナログ」という用語は、Ｎ３でＨ結合供与体として機能してＡＤＡＲ２と相互作用する任意の核酸塩基を指す。かかるシチジンアナログの非限定的な例は、シュードイソシチジン（ｐｉＣ）、ベンナーのＺ（ｄＺ）、５－ヒドロキシＣ－Ｈ＋、５－アミノＣ－Ｈ＋および８－オキソＡ（ｓｙｎ）である。当業者であれば、Ｎ３でＨ結合供与体として機能してｈＡＤＡＲ２と相互作用するとともに標的アデノシンの脱アミノ化を可能にする任意の核酸塩基は、本明細書で使用されるシチジンアナログの定義の範囲内であることを、本開示に基づいて知るであろう。「ヌクレオシド」という用語は、リン酸基が無い状態で、（デオキシ）リボシル糖に連結した核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドと１個または複数のリン酸基から構成される。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－（デオキシ）リボシル－ホスホリンカーも、リボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾も指す。したがって、この用語には、ロックリボシル部分（メチレン基または他の任意の基を含む２’－４’ブリッジを含む）を含むヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、ホスホジエステル、ホスホノアセテート、ホスホトリエステル、ＰＳ、ホスホロ（ジ）チオエート、ＭＰを含むリンカー、ホスホロアミデートリンカー等を含むヌクレオチドが含まれることとなろう。しばしば、アデノシンとアデニン、グアノシンとグアニン、シチジンとシトシン、ウラシルとウリジン、チミンとチミジン／ウリジン、イノシンとハイポキサンチンという用語は、一方では対応する核酸塩基、および他方ではヌクレオシドまたはヌクレオチド、を指すのに互換的に使用される。しばしば、核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は、例をあげると、ヌクレオシドが隣接ヌクレオシドに連結し、これらのヌクレオシド間の結合が修飾されている場合、文脈上異なることを明らかに必要としない限り、互換的に使用される。上述のように、ヌクレオチドとは、ヌクレオシド＋１個または複数のリン酸基である。「リボヌクレオシド」および「デオキシリボヌクレオシド」、または「リボース」および「デオキシリボース」という用語は、当技術分野で使用される通りである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「ＡＯＮ」に言及する場合はいつでも、文脈上別段の指示がない限り、オリゴリボヌクレオチドおよびデオキシオリゴリボヌクレオチドの両方を意味する。「オリゴリボヌクレオチド」に言及する場合はいつでも、これは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＩを含むことができる。「デオキシオリゴリボヌクレオチド」に言及する場合はいつでも、これは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＩを含むことができる。

好ましい態様では、本発明のＡＯＮとは、化学修飾を含み、ある特定の指定された位置にデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を含むことができる、オリゴリボヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド、オリゴ、ＯＮ、オリゴヌクレオチド組成物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＯＮ、（ＲＮＡ）編集オリゴヌクレオチド、ＥＯＮ、およびＲＮＡ（アンチセンス）オリゴヌクレオチドなどの用語は、本明細書では互換的に使用することができる。シトシンなどのオリゴヌクレオチド構築物中のヌクレオチドに言及する場合はいつでも、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンおよびβ－Ｄ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシンが含まれる；アデニンに言及する場合はいつでも、Ｎ６－メチルアデニンおよび７－メチルアデニンが含まれる；ウラシルについて言及する場合、ジヒドロウラシル、４－チオウラシルおよび５－ヒドロキシメチルウラシルが含まれる；グアニンに言及する場合、１－メチルグアニンが含まれる。ヌクレオシドまたはヌクレオチドに言及する場合はいつでも、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシなどのリボフラノース誘導体、および２’－Ｏ－メチルなどの２’－Ｏ－置換バリアントが含まれ、同様に、２’－４’ブリッジバリアントを含めて、他の修飾も含まれる。オリゴヌクレオチドに言及する場合はいつでも、２つのモノヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結合ならびにそれらの修飾物とすることができ、これにはホスホノアセテート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ＰＳ、ホスホロ（ジ）チオエート、ＭＰ、ホスホロアミデートリンカー等が含まれる。

「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting）」を包含する、例えば、「Ｘを含む」組成物は、Ｘのみからなってもよく、またはさらなる何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。数値ｘに関して「約」という用語は必要に応じたものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合がある。適切な場合には、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略されることがある。

本明細書で使用される「相補的」という用語は、生理学的条件下でＡＯＮが標的配列にハイブリダイズするという事実を指す。この用語は、ＡＯＮのそれぞれのおよびあらゆるヌクレオチドが標的配列のその対向するヌクレオチドと完全な対合を有することを意味しない。言い換えれば、ＡＯＮは標的配列と相補的とすることができるが、ＡＯＮと標的配列との間にはミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジがあってもよく、その一方で生理学的条件下で当該ＡＯＮは標的配列になおもハイブリダイズし、その結果、細胞のＲＮＡ編集酵素は標的アデノシンを編集することができる。したがって、「実質的に相補的」という用語はまた、ミスマッチ、ゆらぎ、および／またはバルジの存在にもかかわらず、生理学的条件下でＡＯＮが標的ＲＮＡにハイブリダイズするという、ＡＯＮと標的配列との間に十分なマッチングヌクレオチドをＡＯＮが有することを意味する。本明細書に示すように、ＡＯＮは相補的とすることができるが、生理学的条件下でＡＯＮがその標的にハイブリダイズすることができる場合、標的配列との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジも含むことができる。

核酸配列に関して「下流」という用語は、さらに３’方向に配列に沿うことを意味し；「上流」という用語はその逆を意味する。したがって、ポリペプチドをコードする任意の配列において、スタートコドンは、センス鎖ではストップコドンの上流にあるが、アンチセンス鎖ではストップコドンの下流にある。

「ハイブリダイゼーション」への言及は典型的には特異的ハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。プローブと標的との間の安定な相互作用の大部分が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性をプローブと標的とが有する場合であることを確保するように、当技術分野で周知の技法を使用して、指定の実験条件下で特異的ハイブリダイゼーションを行うことができる。「ミスマッチ」という用語は、ワトソン－クリック型塩基対合則に従って完全な塩基対を形成しない、二本鎖ＲＮＡ複合体中の対向するヌクレオチドを指すために本明細書中で使用される。ミスマッチヌクレオチドとは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ対である。一部の実施形態では、本発明のＡＯＮは、４未満のミスマッチ、例えば、０、１または２のミスマッチを含む。ゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、およびＩ－Ｃ塩基対である。

「スプライス変異」という用語は、エクソンからのイントロンのスプライシングが妨げられ、異常なスプライシングに起因して、その後の翻訳が、フレームから外れて、コードされたタンパク質の未成熟終止をもたらすという意味において、スプライシング機構が機能不全である、プレｍＲＮＡをコードする遺伝子における変異に関する。多くの場合、このような短縮タンパク質は、迅速に分解され、本明細書で論議のように、機能的活性をなんら有さない。正確な変異は、ＲＮＡ編集に対する標的である必要はない；スプライス変異の近接または近傍アデノシンが標的ヌクレオチドであり、このアデノシンのＩへの変換により、スプライス変異が正常状態へと修復される可能性がある。当業者であれば、スプライス変異の部位または領域内のアデノシンのＲＮＡ編集の後、正常なスプライシングが復元されるか否かを判定する方法を知っている。

本発明によるＡＯＮは、例えば、２’－Ｏ－メチル化糖部分（２’－ＯＭｅ）を、および／または２’－Ｏ－メトキシエチル糖部分（２’－ＭＯＥ）をヌクレオチドにもたらすことによって、ほとんど全体として化学的に修飾することができる。しかし、オーファンヌクレオチドはシチジンアナログであり、好ましくは２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥの修飾を含まず、ならびに、さらに好ましい態様では、標的アデノシンに対向する各ヌクレオチドに隣接する少なくとも１個の近接ヌクレオチドが、および好ましい態様では、標的アデノシンに対向する各ヌクレオチドに隣接する２個の近接ヌクレオチドの両方が、２’－ＯＭｅ修飾をさらに含まない。ＡＯＮのすべてのヌクレオチドが２’－ＯＭｅ修飾を保持するという完全な修飾は、ＲＮＡ編集が進行する限り、非機能的オリゴヌクレオチドをもたらすが（当技術分野で公知である）、その理由は、おそらく、標的化された位置でＡＤＡＲ活性を妨害するからである。一般に、標的ＲＮＡのアデノシンは、２’－ＯＭｅ基を含む対向するヌクレオチドを提供することによって、または、対向する塩基としてグアニンもしくはアデニンを提供することによって編集から保護することができ、これはこれら２つの核酸塩基はまた、対向するアデノシンの編集を低減することができるからである。本発明に従って容易に使用することができるオリゴヌクレオチドの分野において、種々の化学物質および修飾が公知である。ヌクレオチド間の定型的ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合のモノまたはジチオ化によって変更されて、それぞれホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルを生じることができる。アミド化およびペプチドリンカーを含めて、ヌクレオシド間結合の他の修飾が可能である。好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個のヌクレオチドを含む。

ＲＮＡ編集主体（例えばヒトＡＤＡＲ酵素）は、いくつかの要因に応じて、種々の特異性を持ってｄｓＲＮＡ構造を編集することは当技術分野で公知である。重要な一要因とは、ｄｓＲＮＡ配列を作り上げる２つの鎖の相補性の程度である。２つの鎖の完全な相補性によって通常、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインは、遭遇する任意のアデノシンと多かれ少なかれ反応して、非差別的にアデノシンを脱アミノ化する。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性を、化学修飾を導入することおよび／またはｄｓＲＮＡにいくつかのミスマッチを確保することによって向上することができるが、このことは、まだ明確に定義されていない形でｄｓＲＮＡ連結ドメインを配置するのに役立つと推定される。加えて、脱アミノ化反応自体は、編集するアデノシンと対向するミスマッチを含むＡＯＮを提供することによって増強することができる。本明細書に開示のミスマッチは、編集するアデノシンと対向するシチジンアナログを有するターゲティング部分を提供することによって創り出される。本出願の指示により、当業者であれば、それらの必要性に応じてオリゴヌクレオチドの相補部分を設計することができるであろう。

本発明のＡＯＮと共に使用される、最も興味深い、細胞に存在するＲＮＡ編集タンパク質は、ヒトＡＤＡＲ２である。細胞内部の編集主体が他の標的部位にリダイレクトされる程度は、編集分子の認識ドメインに対する本発明によるＡＯＮの親和性を変化させることによって調節することができることは、当業者であれば理解するであろう。正確な修飾は、いくらかの試行錯誤によって、および／またはＡＯＮと編集分子の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づくコンピューター計算方法によって決定することができる。加えて、あるいは代替的に、細胞に常在性の編集主体を動員およびリダイレクトする程度は、ＡＯＮの投薬および投薬レジメンによって調節することができる。これは実験者（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または臨床医によって、通常は第Ｉ相および／または第ＩＩ相治験で決定されるものである。

本発明は真核生物、好ましくは後生動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの各細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関係する。本発明は任意の臓器、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液等由来の細胞と共に使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の罹患状態に関与する細胞、組織または臓器において配列を修飾するのに特に適している。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで存在することができる。本発明の一利点とは、本発明は、生体のｉｎ ｓｉｔｕの細胞と共に使用できることであるが、培養中の細胞と共に使用できることでもある。一部の実施形態では、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで処理され、次いで、生体に導入される（例えば、細胞が元々由来した生物に再導入される）。本発明はまた、いわゆるオルガノイド内の細胞において標的ＲＮＡ配列を編集するのに使用することもできる。オルガノイドは、三次元のｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の組織であると考えることができるが、特定の条件を使用して駆動されて個々の分離された組織を生成する（例えば、Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125を参照されたい）。治療状況では、オルガノイドは、患者の細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することができるので有用であり、次いで、オルガノイドは、通常の移植片よりも拒絶される可能性が低い自家材料として患者に再導入することができる。処置される細胞は一般に遺伝的変異を有することになる。変異はヘテロ接合であってもホモ接合であってもよい。本発明は、典型的には、ＮからＡへの変異（式中、ＮはＧ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）とすることができる）、好ましくはＧからＡへの変異、またはＮからＣへの変異（式中、ＮはＡ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）とすることができる）、好ましくはＵからＣへの変異などの、点変異を改変するために使用されることになる。

理論に拘束されることを望むものではないが、ｈＡＤＡＲ２を通してのＲＮＡ編集は、例えば成熟ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡを編集することができる、転写またはスプライシング過程で、核内において、または細胞質内において、一次転写物で起こると考えられる。

多くの遺伝病がＧからＡへの変異によって引き起こされ、変異した標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化は、機能的で、全長のおよび／または野生型のタンパク質をもたらすコドンに当該変異を元に戻すことになるので、特に変異がＰＴＣに関係する場合、上記の多くの遺伝病は優先される標的疾患である。本発明によるオリゴヌクレオチドで予防および／または処置することができる遺伝病の優先される例は、標的ＲＮＡの１個または複数のアデノシンの修飾によって（潜在的に）有益な変化がもたらされることになる、任意の疾患である。特に優先されるのは、アッシャー症候群およびＣＦであり、より具体的には、ＣＦＴＲ ＲＮＡの疾患誘導性ＰＴＣにおけるアデノシンのＲＮＡ編集が優先される。ＣＦ変異に関する当業者であれば、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、Ｙ１２２Ｘ、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、Ｗ４０１Ｘ、６２１＋１Ｇ＞Ｔまたは１７１７－１Ｇ＞Ａを含めて、１０００から２０００の間の変異がＣＦＴＲ遺伝子において公知であることを理解している。

本発明による標的化編集は、それが所与の配列における変異したヌクレオチドであろうと野生型ヌクレオチドであろうと、任意のアデノシンに適用できることは自明である。例えば、編集を使用して、様々な特性を備えるＲＮＡ配列を創り出すことができる。そのような特性とは、コーディング特性（様々な配列または長さを備えるタンパク質を創り出し、その結果、タンパク質の特性または機能の変更を招く）、または結合特性（ＲＮＡ自体または標的または結合パートナーの阻害または過剰発現を引き起こす；ｍｉＲＮＡまたはそれらの同族配列を標的ＲＮＡに再コード化することによって、発現経路全体を変更することができる）とすることができる。タンパク質の機能または局在化は、それらに限定されないが、シグナル配列、ターゲティングまたは局在化のシグナル、タンパク質分解切断または同時翻訳修飾もしくは翻訳後修飾向けの認識部位、酵素の触媒部位、結合パートナーの結合部位、分解または活性化向けのシグナル等を含めて、機能的ドメインまたは認識モチーフによって、自由に変化させることができる。これらならびに他の形態のＲＮＡおよびタンパク質の「工学」は、疾患を予防、遅延または処置するかどうかにかかわらず、あるいは、診断、予防、治療、研究のツールまたはそれ以外として、医学またはバイオテクノロジーにおいて、他の任意の目的であれ、本発明によって包含される。

投与されるＡＯＮの量、用量および投薬レジメンは、細胞のタイプごとに、処置される疾患、標的集団、投与の様式（例えば、全身対局所）、疾患の重度、および副次的活性の許容可能レベルで異なることができるが、これらは、前治験および治験でのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の過程で試行錯誤によって評価することができかつそうするする必要がある。修飾配列が、容易に検出される表現型の変化を招く場合、治験は特に簡単である。より高用量のＡＯＮは、細胞内のＡＤＡＲへの結合について競合し、それによってＲＮＡ編集に自由に参加することができる主体の量が枯渇する可能性があるが、ルーチンでの投薬を試みることにより、所与のＡＯＮおよび所与の標的に対する任意のかかる効果が明らかとなるであろう。

ある適切な試験技法は、ＡＯＮを細胞株または試験生物に送達すること、次いで、その後の種々の時点で生検試料を採取することを含む。標的ＲＮＡの配列を生検試料において評価することができ、修飾を有する細胞の割合を容易にフォローすることができる。こういった試験を一度実行した後は、次にその知識が保持され、生検試料を採取する必要なく今後の送達を実行することができる。したがって、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列における所望の変化の存在を特定するステップ、それによって標的ＲＮＡ配列が修飾されたことを検証するステップを含むことができる。本ステップは、典型的には、上で論議のように、標的ＲＮＡの関連部分、またはそのｃＤＮＡコピー（または標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合は、そのスプライシング産物のｃＤＮＡコピー）の配列決定ステップを含むことになり、したがって、配列の変化を容易に検証することができる。あるいは、変化を、タンパク質のレベル（長さ、グリコシル化、機能等）で評価してもよいし、または何らかの機能的読出し情報、例えば標的ＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質がイオンチャネルである場合は、（誘導性）電流によって評価してもよい。

細胞でＲＮＡ編集が行われた後、例えば細胞分裂、編集されたＲＮＡの限定された半減期等に起因して、修飾されたＲＮＡは経時的に希釈されることになる場合がある。したがって、実際の治療期間中、本発明の方法は、十分な標的ＲＮＡが修飾されて患者に有形の効果をもたらすまでおよび／または経時的に効果を維持するまで、ＡＯＮの反復送達を含むことができる。

本発明のＡＯＮは治療用途に特に適しており、したがって、本発明は、本発明のＡＯＮおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は単に生理食塩水とすることができる。これは、特に肺送達向けには、有用に等張性であっても低張性であってもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む送達装置（例えば注射器、吸入器、ネブライザー）も提供する。

本発明はまた、本明細書に記載のように、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞において標的ＲＮＡ配列に変化を加える方法における使用のための本発明のＡＯＮを提供する。同様に、本発明は、本明細書に記載のように、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞において標的ＲＮＡ配列に変化を加える医薬の製造における本発明のＡＯＮの使用を提供する。

本発明はまた、細胞の標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の特異的標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、本発明によるＡＯＮを細胞に供給するステップと；ＡＯＮの細胞による取り込みを可能にするステップと；ＡＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせるステップと；野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物ＡＤＡＲ酵素が、標的ＲＮＡ分子の標的アデノシンをイノシンへ脱アミノ化することを可能にするステップと；必要に応じて、ＲＮＡ配列においてイノシンの存在を特定するステップとを含む方法に関する。

好ましい態様では、ＡからＩへの変換の最終的な脱アミノ化効果に応じて、特定ステップは：標的ＲＮＡを配列決定するステップ；機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変更されたか否かを評価するステップ；または機能的読出し情報を使用するステップであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能的で、全長の、伸長されたおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップを含む。アデノシンのイノシンへの脱アミノ化は、標的位置での変異したＡにもはや悩まされないタンパク質をもたらすことができるので、イノシンへの脱アミノ化の特定はまた、機能的な読出し情報、例をあげると、機能的タンパク質が存在するか否かに関する評価、または、さらにアデノシンの存在によって引き起こされる疾患が（部分的に）元に戻っているという評価、とすることができる。本明細書で言及の疾患それぞれの機能的評価は一般に、当業者に公知の方法によることになる。標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を特定するための極めて適切な様式とは、当業者に周知の方法を使用して、当然ながらＲＴ－ＰＣＲおよび配列決定である。

本発明によるＡＯＮは、薬学的使用に適合する、添加剤、賦形剤、およびその他の成分を必要に応じて含む、水溶液、例えば、生理食塩水で、または、懸濁液で、１ｎｇ／ｍｌ～１ｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、適切に投与される。投薬量は、適切には、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの間の範囲とすることができる。投与は、吸入（例えば、ネブライザーを通して）によって、鼻腔内に、経口に、注射もしくは注入によって、静脈内に、皮下に、皮内に、頭蓋内に、硝子体内に、筋肉内に、気管内に、腹腔内に、直腸内に等とすることができる。投与は、固体形態、散剤、丸剤、ゲル剤、点眼剤の形態、または、ヒトの医薬使用に適合する他の任意の形態とすることができる。

[実施例１]
標的アデノシンと対向する位置にシュードイソシチジン（ｐｉＣ）を含有するＲＮＡ編集ガイドアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成。
すべての試薬は、Ｃｏｍｂｉ－ｂｌｏｃｋｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、またはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、特に記載がない限り、さらなる精製はせずに使用した。無水条件を要する反応は、乾燥アルゴンの雰囲気下で実施した。液体試薬は、プラスチック製ディスポーザブル注射器またはオーブン乾燥ガラス製マイクロシリンジのいずれかで導入した。ピリジンおよびＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンをＣａＨ_２から蒸留し、活性化３Åモレキュラーシーブで保存した。テトラヒドロフランおよび１－メチルイミダゾールを３Åモレキュラーシーブで１６時間乾燥させた。ジクロロメタンは、Ｐｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの溶媒精製システムから直接使用した。無水条件を要する反応の出発材料は、無水アセトニトリル、次にジクロロメタンの１０％（ｖ／ｖ）無水ピリジンと共蒸発させることにより乾燥した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ_２５４プレコートＴＬＣプレートで実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒａｄｅ ６０（２３０～４００メッシュ）シリカゲルで実施した。^１Ｈ、^１３Ｃ、および^３１Ｐ ＮＭＲを、Ｂｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ ＮＭＲで実施した。ｐｉＣビルディングブロックの中間体：
ｉ） ６－Ｎ－（ジメチルホルムアミジノ）シュードイソシチジン；
ｉｉ） ５’－Ｏ－（４，４－ジメトキシトリチル）－６－Ｎ－（ジメチルホルムアミジノ）シュードイソシチジン；
ｉｉｉ） ２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）ジメチルシリル－５’－Ｏ－（４，４－ジメトキシトリチル）－６Ｎ（ジメチルホルムアミジノ）シュードイソシチジン；および
ｉｖ） ３－［２’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチル）ジメチルシリル－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルホスフィノ）－５’－Ｏ－（４，４－ジメトキシトリチル）－β－Ｄ－リボフラノシル］－６－Ｎ－（ジメチルホルムアミジノ）シュードイソシチジン
はすべて、当業者に公知の方法を使用して、文献の手順に従って合成した。

ｐｉＣシチジンアナログを含有するＡＯＮを、当業者に公知の方法を使用して生成した。ＡＯＮの修飾を、図の凡例に示す。ｄＺシチジンアナログを含有するＡＯＮを、当業者に公知の方法に従って製造することができる。このＡＯＮは、ｐｉＣを含有するＡＯＮと同じ修飾を含有した。

[実施例２]
ＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチドのオーファンヌクレオチドとしての正常のシチジン（Ｃ）およびシュードイソシチジン（ｐｉＣ）を比較する速度論的ＡＤＡＲアッセイ。
すべての水性反応および希釈には、蒸留脱イオン水を使用した。ベンナーの塩基Ｚを、デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイトとして、ＦｉｒｅＢｉｒｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣから購入した。分子生物学グレードのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＲＮａｓｅ阻害剤を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ９４００ Ｔｙｐｈｏｎホスホイメージャーで視覚化した。データを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ５．２ソフトウェアで解析した。すべてのＭＡＬＤＩ分析を、Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａＦｌｅｘｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｄａｖｉｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓで、行った。オリゴヌクレオチドの質量を、Ｍｏｎｇｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ｖ２．０８で決定した。特に明記されていない限り、未修飾オリゴヌクレオチドは、ＤｈａｒｍａｃｏｎまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのいずれかから購入した。

シチジンアナログ含有ＡＯＮ向けのＲＮＡ化学合成を、ＡＢＩ ３９４シンセサイザーを使用してＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈで行った。ヌクレオシドを適当なサイクル過程で組み込んだ。ＡＯＮの配列は、５’－ＵＵＵ ＧＡＧ ＡＣＣ ＵＣＵ ＧＵＣ Ｃ^＊ＡＧ ＡＧＵ ＵＧＵ ＵＣＵ ＣＣ－３’（配列番号１、ここでＣ^＊はｐｉＣまたはｄＺであり、図５にＮとして示した）とした。一本鎖ＡＯＮを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、ＵＶシャドウイングによって視覚化した。バンドをゲルから切り取り、圧搾し、０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡに４℃で一晩、浸漬した。ポリアクリルアミド断片を０．２μｍフィルターで除去し、ＲＮＡを７５％ ＥｔＯＨの溶液から－７０℃で４時間沈殿させた。溶液を１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。ＲＮＡ溶液を凍結乾燥して乾燥し、ヌクレアーゼフリーの水に再懸濁し、２６０ｎｍでの吸光度によって定量化した。オリゴヌクレオチド質量を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦによって確認した。精製した上部および下部の鎖をハイブリダイゼーション緩衝剤（１８０ｎＭ編集鎖、１．８μＭガイド鎖、１×ＴＥ緩衝剤、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に１０：１の比で添加し、９５℃に５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した。

野生型ｈＡＤＡＲ２を先に記載のように（Matthews et al. 2016; MacBeth and Bass. Methods Enzymol. 2007. 15(424):319-331）発現させた。フレンチプレスを使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、５％グリセロール、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、および０．０１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０を含有する緩衝剤で細胞を溶解することにより、ｈＡＤＡＲ２の精製を行った。細胞溶解物を遠心分離（１９，０００ｒｐｍで１時間）により清澄化した。溶解物を３ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡカラムに通し、これを次いで２０ｍＬ溶解緩衝剤、洗浄Ｉ緩衝剤（２０ｎＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５％グリセロール、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、０．０１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）、洗浄ＩＩ緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５％グリセロール、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、３５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ）による３段階で洗浄し、そして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５％グリセロール、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、４００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。生化学的アッセイにおける使用のために、標的タンパク質を含有する画分をプールし、３０～８０μＭに濃縮した。タンパク質濃度を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルのＳＹＰＲＯオレンジ染色により視覚化したＢＳＡ標準物質を使用して決定した。精製ｈＡＤＡＲ２ ｗｔを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロールおよび１ｍＭ ２－メルカプトエタノールに－７０℃で保存した。

標的ＲＮＡを、ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＤＮＡテンプレートから転写した。ＤＮＡ消化を、ＲＱ１ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡ産物を上記のように精製した。

ＤＮＡテンプレート配列：

イタリック体の領域を用いてＴ７プロモーターを表し、太字の大きなＡを用いて標的のアデノシンを表し、ｇｇａｔｃｃを用いて制限部位（ＢａｍＨＩ）、および下線付きの領域を用いて図５に示す標的配列を表す。

「標的ＦＷＤ」：５’－ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＧＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＧ Ｔ－３’（配列番号４）および「標的ＲＶＳ」：５’－ＣＧＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＡＣ Ｔ－３’（配列番号５）を、ＲＴ－ＰＣＲ用のプライマーとした。

脱アミノ化アッセイを、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３％グリセロール、６０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００３％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１６０Ｕ／ｍＬ ＲＮＡｓｉｎ、１．０μｇ／ｍＬ、０．８ｎＭ ＲＮＡ、および２ｎＭ ＡＤＡＲ２ ｗｔ酵素で、シングルターンオーバー条件下で実施した。各反応溶液を３０℃で３０分間インキュベートし、その後に酵素を添加し、そして３０℃で種々の時間の間インキュベーションを行い、その後に９５℃の水１９０μＬで停止し、９５℃で５分間加熱した。ＲＴ－ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、脱アミノ化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。

結果として生じるｃＤＮＡを、Ｚｙｍｏ製ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを使用して精製し、ＵＣ Ｄａｖｉｓ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦａｃｉｌｉｔｙでＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、フォワードＰＣＲプライマーを用いてＳａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに供した。配列決定のピーク高さを、４Ｐｅａｋｓ ｖ１．８で定量化した。各実験は３回重複で実施した。対応するゼロ時点の編集レベルを、背景差分として各データポイントから減算した。

速度論的解析の結果を図６に示すが、結果が明確に実証するところは、シチジンアナログｐｉＣは、ＡＯＮのオーファン塩基位置に存在する場合、標的Ａでの編集速度を増強することができることである。

[実施例３]
ＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチドのオーファンヌクレオチドとしての正常なシチジン（デオキシ－Ｃ；ｄＣ）とベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）とを比較する速度論的ＡＤＡＲアッセイ。
かかるシチジンアナログを保有しないＡＯＮ（デオキシ－Ｃ、またはｄＣ、これは先の実施例のＣとは異なる）と比較して、標的アデノシンと対向するシチジンアナログとしてベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）を保有するＡＯＮを使用して、同一実験を行った。この速度論的解析の結果を図７に示すが、結果が指示するところは、ｐｉＣとｄＺの間の脱アミノ化速度は同等であるが（図６も参照されたい；シチジンアナログを含む両方のＡＯＮは、当該位置にシチジンアナログを含まないＡＯＮよりも２倍高い速度を呈する）、ｄＺ保有のＡＯＮの終点は、ｄＣで見られたものよりも幾分か低いことである。速度上昇の重要性とは、細胞において、オリゴヌクレオチド（およびＡＤＡＲ）はいくつかの様々なＲＮＡプロセシング因子（例えばスプライシング因子）と競合する必要があり、したがって、競合因子がＲＮＡからＡＯＮおよびＡＤＡＲを除去する機会を有する以前に脱アミノ化反応を実行し得ることを確保する上で、速度がより速いことは極めて重要であるという結果になり得る、ということである。

[実施例４]
ＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチドのオーファンヌクレオチドとしてのベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）およびデオキシ－シュードイソシチジン（ｄｐｉＣ）と、正常のシチジン（デオキシ－Ｃ；ｄＣ）を、比較する速度論的ＡＤＡＲアッセイ。
かかるシチジンアナログを保有しないＡＯＮ（デオキシ－Ｃ；ここではｄＣ）と比較して、標的アデノシンと対向するシチジンアナログとして、ベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）またはデオキシ－シュードイソシチジン（ｄｐｉＣ）のいずれかを保有するＡＯＮを使用して、上と同一の実験を実行した。この速度論的解析の結果を図８に示すが、この結果が示すところは、エンドポイントがｄＣと比較してｄＺとｄｐｉＣの両方でより高いことである。本実験向けに合成したＡＯＮは先の実施例とは異なっていたことに留意されたい。重要なことに、オーファンヌクレオチドとしてｄＺを保有するＡＯＮはｄＣよりも速い動態を有し、このようなことは図７でも見ることができた。また、オーファンヌクレオチドとしてｄｐｉＣを保有するＡＯＮは、標的アデノシンと対向して、オーファンヌクレオチドとしてｄＣを保有するＡＯＮよりも速い動態を有する。

[実施例５]
オーファンヌクレオチドとしてｄＣおよびｄＺを保有するＡＯＮのトランスフェクション後の細胞におけるＲＮＡ編集の判定。
次に、本発明者らは、オーファンヌクレオチドとしてシチジンアナログベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）を含有するＡＯＮが、細胞において、デオキシ－Ｃ（ｄＣ）を保有する同一のＡＯＮよりもＲＮＡ編集において効率的となるか否かについて、内因性ＡＤＡＲを使用して、調査した。上記のように、マウスＩｄｕａ ｍＲＮＡの同じアデノシンの特定の編集について試験した。標的の配列および相補的なターゲティングＡＯＮ（図５におけるよりも幾分か長い）を図９に与える。

選択した細胞は、Ｉｄｕａ遺伝子にＧからＡへの変異を担持するマウス系統から由来する初代マウス肝線維芽細胞としたが、これにより未成熟ストップコドン（Ｗ３９２Ｘ）の形成がもたらされる。トランスフェクションの２４時間前に、３００，０００個の細胞を播種した。製造業者の取扱説明書に従って（ＡＯＮ １μｇに対するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ２μｌの比で）１００ｎＭ ＡＯＮおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＡＯＮをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、製造業者の取扱説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）キットを使用してＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーとオリゴｄＴプライマーの組合せを用いて、製造業者の取扱説明書に従ってＭａｘｉｍａ逆転写酵素キット２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを３×で希釈し、この希釈液１μＬを、合計インプット５ｎｇ ＲＮＡで、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のテンプレートとして使用した。

核酸標的配列の絶対定量化のためのｄｄＰＣＲアッセイを、ＢｉｏＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを使用して行った。プローブ用ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ｄＵＴＰ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、Ｔａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイを含む、反応ミックス２０μｌの総混合物中で、ＲＴ ｃＤＮＡ合成反応から得た希釈ｃＤＮＡ １μｌを、以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせた以下のフォワードおよびリバースプライマーと共に、使用した：フォワードプライマー：５’－ＣＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＴＣ－３’（配列番号８、リバースプライマー：５’－ＣＡＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ Ｃ－３’（配列番号９）、野生型プローブ（ＦＡＭ ＮＦＱ標識）：５’－ＡＧＡ ＡＣＡ ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＣＴＣ Ａ －３’（配列番号１０）、および変異型プローブ（ＨＥＸ ＮＦＱ標識）：５’－ＡＧＡ ＡＣＡ ＡＣＴ ＣＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＣＴＣ Ａ－３’（配列番号１１）。ｃＤＮＡを含むＰＣＲミックス２０μｌを、ｄｄＰＣＲカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）の中央の列に充填した。レプリケートを２つのカートリッジで分けた。下の列を、プローブ用のドロップレット生成オイル（ＢｉｏＲａｄ）７０μｌで充填した。ドロップレットをＱＸ２００ドロップレット発生器で生成した。カートリッジの上列からのオイルエマルジョン４０μｌを９６ウェルＰＣＲプレートに移した。ＰＣＲ ２０プレートをスズ箔でシールし、ＰＸ１プレートシーラーを使用して１７０℃で４秒間保持し、これに続いて以下のＰＣＲプログラムを行った：９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で３０秒間の４０サイクル、６３．８℃で１分、９８℃で１０分、これに続いて８℃で保存した。プレートを読み取り、ＱＸ２００ドロップレットリーダーで解析した。

結果を図１０に与えるが、この結果が実証するところは、標的アデノシンと対向するベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）を保有するＡＯＮは、 － 唯一の差異として － 標的アデノシンと対向するデオキシシチジン（ｄＣ）を保有する同一のＡＯＮと比較して、有意により高いＲＮＡ編集パーセンテージを与えることである。

これらの結果が示すところは、標的アデノシンの真向かいにあるＡＯＮのヌクレオチドが、Ｎ３部位で、Ｈ結合供与体として機能するシチジンアナログである場合、本発明者らは、初代マウス線維芽細胞におけるＲＮＡ編集の効率の向上も示すことができたということである。

Claims (12)

1. 標的ＲＮＡ分子と二本鎖核酸複合体を形成することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記二本鎖核酸複合体は、前記標的ＲＮＡ分子の少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のためにＡＤＡＲ酵素を動員することができ、前記少なくとも１個の標的アデノシンの真向かいにある前記ＡＯＮのヌクレオチドは、Ｎ３部位でＨ結合供与体として機能するシチジンアナログである、ＡＯＮ。
2. 前記シチジンアナログは、シュードイソシチジン（ｐｉＣ）またはベンナーの塩基Ｚ（ｄＺ）である、請求項１に記載のＡＯＮ。
3. 前記シチジンアナログは２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を保有しない、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
4. 少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホノアセテートおよび／またはメチルホスホネート（ＭＰ）のヌクレオチド間結合を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
5. リボースの２’位に置換を含む１個または複数のヌクレオチドをさらに含み、前記置換は：－ＯＨ；－Ｆ；１個または複数のヘテロ原子によって中断されていてもよい、置換もしくは非置換の直鎖状もしくは分枝状の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アリル；－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
6. 前記二本鎖核酸複合体は、内因性ＡＤＡＲ酵素、好ましくは内因性ＡＤＡＲ２酵素を動員することができる、請求項１から５のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
7. 少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６個のヌクレオチドを含み、最大で１００ヌクレオチド長、好ましくは最大で６０ヌクレオチド長である、
   請求項１から６のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＯＮ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
9. 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺高血圧症、（常染色体優性型）網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ－サックス病、アッシャー症候群（例えばアッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびにがんからなる群から好ましくは選択される遺伝障害の処置または予防における使用のための、請求項１から７のいずれかに記載のＡＯＮまたは請求項８に記載の医薬組成物。
10. 細胞の標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、
    （ｉ）請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＯＮまたは請求項８に記載の医薬組成物を細胞に供給するステップと；
    （ｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、前記細胞の内因性ＡＤＡＲ酵素を動員することができる二本鎖核酸複合体を形成するステップと；
    （ｉｉｉ）前記ＡＤＡＲ酵素によって前記標的ＲＮＡ分子の前記標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；
    （ｉｖ）必要に応じて、前記標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップと
    を含む方法。
11. 工程（ｉｖ）は、
    ａ）前記脱アミノ化標的アデノシンを含む、前記標的ＲＮＡ分子の領域を配列決定するステップ；
    ｂ）前記標的アデノシンがＵＧＡまたはＵＡＧのストップコドンに存在する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
    ｃ）２個の標的アデノシンがＵＡＡストップコドンに存在する場合、機能的で、伸長された、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
    ｄ）前記標的ＲＮＡ分子がプレｍＲＮＡである場合、前記プレｍＲＮＡのスプライシングは前記脱アミノ化によって変更されたか否かを評価するステップ；または
    ｅ）機能的読出し情報を使用するステップであって、前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡ分子が、機能的で、全長の、伸長されたおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ、
    を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、
    （ｉ）請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＯＮまたは請求項８に記載の医薬組成物を用意するステップと；
    （ｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせて、二本鎖核酸複合体を形成するステップと；
    （ｉｉｉ）哺乳動物のＡＤＡＲ酵素によって前記標的ＲＮＡ分子の前記標的アデノシンを脱アミノ化するステップと；
    （ｉｖ）必要に応じて、前記標的ＲＮＡ分子において脱アミノ化アデノシンの存在を特定するステップと
    を含む方法。
    

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