CN114075553A - 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法。解决目前新冠抗病毒研究中进行中和抗体效应评价采用新冠活病毒所存在的生物安全隐患问题，以及新冠核酸检测用假病毒核酸标准物制备中可能存在的病毒复制等安全隐患问题的不足之处。该假病毒颗粒以慢病毒为框架；其外膜蛋白是VSV‑G蛋白与新冠病毒S蛋白受体结合基序融合的外膜蛋白；其核心基因为SARS‑CoV‑2病毒基因片段；所述SARS‑CoV‑2病毒基因片段为该病毒7个RNA片段的串联体；所述7个RNA片段分别为该病毒基因的13340‑13462位碱基、15430‑15530位碱基、22721‑22861位碱基、26269‑26382位碱基、28706‑28834位碱基、28880‑28981位碱基、29741‑29890位碱基。

Description

一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准 物的假病毒颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于标准化技术领域、病毒治疗研究领域和基因检测诊断技术领 域，具体涉及一种新冠病毒(SARS-CoV-2)抗体的中和活性评价、抗病毒 药物活性评价以及核酸检测中定性与定量标准品的假病毒颗粒构建与制备。

背景技术

新冠病毒是一种具有包膜的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆 形，直径约80～120nm，属于网巢病毒目冠状病毒科，包含29903个碱基， 编码约9860个氨基酸(其中S-RBD片段长669bp)；其包含两个侧翼非翻译 区(UTRs)、一个5'端长的开放阅读框(ORF1a/b)以及几个编码结构蛋白的开放 阅读框。ORF1a/b编码病毒复制相关的非结构蛋白(NSPs)，占整个基因组开 放阅读框的三分之二，其编码产生的复制酶复合体能够被木瓜样蛋白酶(PLpro)和3C样蛋白酶(3CLpro)水解，产生16个非结构蛋白。3'端的开放阅 读框包含9个头端保守的小向导RNA(sgRNA)、9个转录调控序列 (TRS)、2个末端UTR，主要编码病毒结构蛋白：刺突蛋白(spike protein， S)、包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membraneprotein,M)和核衣壳蛋 白(nucleocapsid protein,N)，占整个基因组开放阅读框的三分之一。其中S蛋 白介导病毒识别宿主细胞受体，促进膜融合，并诱导免疫反应产生中和抗体。

S蛋白包含S1、S2两个亚基，病毒感染细胞时，两个亚基之间的多碱 基剪切位点被组织蛋白酶L和跨膜丝氨酸蛋白酶2通过酶切作用剪切后，位 于S1亚基上受体结合域(RBD)的受体结合基序(RBM)与细胞膜上的血 管紧张素转化酶(AngiotensinⅠ-convertingenzyme 2，ACE2)受体结合，介导 病毒识别宿主细胞。研究表明，与SARS相比，SARS-CoV-2的RBM与 ACE2的亲和力约高出10～20倍，结合能力也显著增强。因此，S区基因的 变异也是目前最受关注的，尤其是S区的RBM区域更是备受关注。

在抗病毒治疗和疫苗评价中，RBM是抗病毒免疫的最主要靶点。阻断 病毒与宿主细胞结合的抗病毒研究中，通常需要采用活病毒进行体外细胞实 验。由于新冠病毒属于烈性传染病，涉及病原的相关研究受到严格的管控， 以至于该研究受到了极大的限制。因此，在抗病毒研究，尤其是以阻断病毒 吸附宿主细胞的抗病毒研究急需一种既能识别并结合宿主细胞上ACE2受 体，又不具感染性的安全替代品--假病毒颗粒。

此外，新冠病毒感染人体之后，首先在呼吸道系统进行繁殖，因此可以 通过检测痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判断人体是否感染病毒。与抗体检测 相比，核酸检测更加灵敏，也是实验室检测的“金标准”。新冠病毒为有胞 膜的单股正链RNA病毒，在核酸检测时需要先裂解病毒颗粒再提取病毒 RNA基因，随后再进行逆转录，在完成以上三个步骤后才能进入最后的 PCR扩增环节。三个前期准备步骤中根据不同的提取试剂盒质量和操作者提取手法，收获的病毒cDNA量千差万别，严重时可出现大量的假阴性结果。 因此，在核酸检测过程中提供一种标准浓度的病毒颗粒标准品，不但可以作 为阳性对照，更为重要的是可以为试剂盒与人员操作各环节是否精确与可靠 提供指示。包含有PCR扩增靶基因的假病毒颗粒构建是提供核酸标准品的理 想方法。目前，有关新冠病毒假病毒构建的核酸标准品通常是以大片段的新 冠病毒基因克隆在慢病毒载体中而构建的，有些甚至是把几乎完整的新冠病 毒基因克隆至慢病毒载体中。由于新冠病毒是单股正链RNA病毒，其全长 的RNA进入细胞即可复制出有感染性的病毒颗粒。因此，完整片段的新冠 病毒基因克隆或几个大片段基因克隆存在着严重的潜在安全隐患。

因此，有必要针对新冠抗病毒研究以及核酸检测进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于解决目前新冠抗病毒研究中进行中和抗体效应评价采 用新冠活病毒所存在的生物安全隐患问题，以及新冠核酸检测用假病毒核酸 标准物制备中可能存在的病毒复制等安全隐患问题的不足之处，提供了一种 可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其 制备方法。

为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：

一种假病毒颗粒，其特征在于：

以慢病毒为框架；

其外膜蛋白是VSV-G蛋白与新冠病毒S蛋白受体结合基序(即RBM) 融合的外膜蛋白；

其核心基因为SARS-CoV-2病毒基因片段；

所述SARS-CoV-2病毒基因片段为该病毒7个RNA片段的串联体；

所述7个RNA片段分别为该病毒基因的13340-13462位碱基、15430- 15530位碱基、22721-22861位碱基、26269-26382位碱基、28706-28834位碱 基、28880-28981位碱基、29741-29890位碱基。

进一步地，所述新冠病毒S蛋白受体结合基序是新冠病毒S蛋白的437- 508位氨基酸。

进一步地，所述假病毒颗粒以HIV-LTR为包装信号、以Gag/Pol为整合 与复制框架。

本发明还提供了上述假病毒颗粒的制备方法，其特殊之处在于，包括以 下步骤：

1)构建VSV-G与新冠病毒S蛋白受体结合基序(RBM)融合表达载体

1.1)对pMD2.G载体上VSV基因，回收载体大片段DNA；例如：使用 EcoR I限制性内切酶对基因两侧的EcoR I位点进行酶切；

1.2)处理步骤1.1)回收的载体大片段DNA，防止载体自连；

1.3)合成SEQ ID No.1 DNA，该序列包含了去除终止码的VSV-G编码 DNA和含终止码的RBM DNA，并在两端引入酶切位点；例如：引入EcoR I 酶切位点；

1.4)以内切酶处理步骤1.3)合成的SEQ ID No.1 DNA，回收SEQ ID No.1 DNA；例如：EcoR I限制性内切酶；

1.5)将步骤1.2)处理过的载体大片段DNA与步骤1.4)回收的SEQ ID No.1 DNA混合，进行酶连，得到连接产物；

1.6)将步骤1.5)得到的连接产物进行转化，并筛选阳性克隆，得到 VSV-G与RBM融合表达载体；上述转化时一般转化至大肠杆菌DH5α；

为了验证得到的载体，还会对步骤1.6)VSV-G与RBM融合表达载体进 行DNA测序确认。

在步骤1.1)和步骤1.4)中，可采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行回收。

2)构建包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体

2.1)合成SEQ ID No.2 DNA，该序列包含了六段国内外权威机构指定的 新冠病毒核酸检测扩增区域及一段包含poly-A的3’非编码区域，并在两端引 入酶切位点；例如：在5’端引入EcoR I酶切位点，3’端引入BamH I酶切位 点；

2.2)将步骤2.1)合成的SEQ ID No.2 DNA克隆至慢病毒表达载体，得 到包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体；

3)转染技术包装得到假病毒颗粒

利用步骤1)得到的VSV-G与RBM融合表达载体和步骤2)得到包含 新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体，转染包装得到假病毒颗 粒。

进一步地，步骤1.2)中，采用碱性磷酸酶处理步骤1.1)回收的载体大 片段DNA；

步骤1.5)中，采用T4连接酶进行酶连，16℃连接30分钟下便可达到 要求。

进一步地，为了便于观察，步骤2)中，慢病毒表达载体为FT102 CMV-MCS-EF1-copGFP。

进一步地，步骤3)的具体步骤为：

3.1)用DMEM高糖培养基培养293T细胞，置于37℃的CO₂恒温细胞 培养箱培养；DMEM高糖培养基含体积分数为10％的胎牛血清，1％的双抗 溶液；由于293T细胞为贴壁细胞，处理时先用胰蛋白酶消化；

3.2)接种293T细胞于孔板中，使细胞达到70-90％汇合度时再进行转 染；例如，采用6孔板时，贴壁细胞数量一般约达到0.25-1×10⁶个时即可；

3.3)按照四质粒系统包装病毒颗粒；

转染时要求按照慢病毒表达载体质粒、pMD2.G质粒、pMDLg/pRRE质 粒、pRES rev质粒质量比为7:5:5:2～5的量制备DNA预混液，与已稀释的转 染试剂形成DNA-脂质复合物，将其加入步骤3.2)的细胞后，37℃孵育。

3.4)分别于转染后第24h、48h收集细胞上清液，将其合并后超滤浓 缩。

进一步地，步骤3.2)中，所述转染试剂为Lipofectamine^TM 3000，对于 本发明假病毒颗粒的制备，该转染试剂的转染效率较高。

步骤3.3)中，慢病毒表达载体质粒、pMD2.G质粒(即VSV-G-RBM包 膜蛋白表达质粒)、pMDLg/pRRE质粒、pRES rev质粒质量比为7:5:5:3，比 如：转染时要求总质粒DNA量为2500ng，按照慢病毒表达载体质粒 875ng、pMD2.G质粒625ng、pMDLg/pRRE质粒625ng、pRESrev质粒 375ng的量制备DNA预混液；采用Opti-MEM^TM培养基对Lipofectamine^TM 3000进行稀释；

步骤3.4)中，超滤浓缩的条件是：4℃，不超过5000g，20-40min离 心。

上述假病毒颗粒在新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物中 的应用。

鉴于上述应用，本发明提供了一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和 新冠病毒核酸检测的试剂盒，其特殊之处在于，包含上述假病毒颗粒。

上述假病毒颗粒的定量方法，其特征之处在于：采用数字微滴PCR方法 进行定量。

对于上述制备的假病毒颗粒，还按照如下步骤进行了鉴定和定量

S1.直接用Tizol提取浓缩后上清液的RNA，琼脂糖凝胶电泳，利用电泳 原理初步鉴定假病毒颗粒是否包装成功。

S2.将收集的上清液加入293T细胞后，由于使用FT102 CMV-MCS-EF1- copGFP慢病毒载体在荧光显微镜下能看到大量带有绿色荧光蛋白的293T细 胞，表明假病毒颗粒包装成功。

S3.以反转录PCR后的cDNA为模板，分别将模板原液2倍系列倍比稀 释后的样品进行ddPCR，检测目的片段拷贝数，即得到假病毒颗粒数目。

假病毒颗粒的制备及包装属于一种常规通用技术，由4种质粒载体和一 种包装细胞-293T细胞组成。本发明首先对4质粒载体中表达外膜蛋白VSV- G的质粒载体进行修饰，将新冠病毒RBM基因与VSV-G基因融合，在4质 粒转染293T细胞后包装出外膜蛋白含有RBM的假病毒颗粒。这种假病毒颗 粒在抗病毒研究中，尤其是以阻断病毒吸附宿主细胞的抗病毒研究中，可以 替代具有传染性的活新冠病毒，具有重要的应用价值。此外，在“实时荧光定量RT-PCR”检测新冠病毒核酸中，扩增区域的选择至关重要。目前， WHO(世界卫生组织)和我国CDC(疾控中心)发布的病毒基因扩增引物 及其涵盖的区域并不一致。因此，本发明在构建假病毒颗粒中将WHO和 CDC的扩增区域予以集合，使包装的假病毒颗粒包含了完整的WHO和CDC 建议的扩增片段。本发明把6个被指定为核酸检测片段的新冠病毒基因以及 1个带有Poly A尾可与逆转录引物结合的新冠病毒3’端基因整合为一体，7 个新冠病毒基因片段串联后克隆在4质粒中的核心基因表达载体中。病毒颗 粒可作为新冠病毒核酸检测中从病毒颗粒的裂解、RNA提取、逆转录及 PCR扩增全过程的质控指示及定量标准。

本发明的优点：

1.本发明假病毒颗粒不仅能够识别新冠病毒受体还可作为新冠病毒核酸 检测标准物；解决了抗新冠病毒研究中采用具有感染性的活病毒作为抗体及 其它抗病毒药物进行效应评价所存在的生物安全隐患问题，以及目前假病毒 核酸标准物制备中截取完整的新冠病毒基因或大片段的新冠病毒基因可能存 在的病毒复制等安全隐患问题、目前假病毒核酸标准物制备中截取片段不够 全面、不能涵盖国内外在新冠病毒核酸检测中所指定的所有区域的问题。

2.本发明对4质粒载体中的2个质粒载体进行修饰改造，另2种质粒保 持原样。此4质粒载体转染293T细胞后包装出的假病毒颗粒具有以下特 点：

1)假病毒颗粒可识别宿主细胞的ACE2受体并与之结合；

2)假病毒颗粒为含7个新冠病毒基因片段的、有胞膜、无传染性的正 链RNA病毒颗粒；

3)串联体7个基因的最后一个基因片段含有Poly A尾，适用于逆转录 通用引物，普适性更强；

4)采用RBM基因与VSV-G基因融合，由于RBM基因较短，包装成功 率更高，且制作成本也会下降，有利于应用。

5)假病毒颗粒的定量是采用目前最为精确的核酸拷贝数绝对定量方法 —ddPCR方法。

附图说明

图1为FT102 CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体示意图；

图2为VSV-G-RBM包膜蛋白表达载体质粒示意图；

图3为pMDLg/pRRE和pRSV rev质粒示意图；

图4为上清中假病毒颗粒感染293T细胞后24小时的荧光照片；

图5为新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)的成分 图；

图6为保存液表格；

图7为推荐的循环参数图；

图8为慢病毒载体质粒与辅助质粒比例的优化结果(a低浓度组，b中浓 度组，c高浓度组)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：非特 殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品,本发明实施例采用的数据库 均为公开的在线数据库。

本发明提供了一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标 准物的假病毒颗粒制备技术，实施如下：

1.本发明制备的假病毒颗粒特性；

2.抗RBM抗体对假病毒颗粒感染Vero细胞的阻断作用；

3.假病毒颗粒的qPCR和ddPCR定量；

4.ddPCR定量的标准物全程用于新冠病毒检测试剂盒的应用。

实施例1本发明制备的假病毒颗粒特性

步骤S011：六孔培养板，每孔接种293T细胞，生长至70％的单层密度；

步骤S012：将本发明的VSV-G-RBM包膜蛋白表达质粒、新冠病毒7片段核 心表达质粒以及pMDLg/pRRE和pRSV rev质粒与脂质体混合，转染293T细 胞；

步骤S013：转染48小时后，收取细胞上清；

步骤S014：另准备六孔细胞培养板，接种293T细胞，生长至80％的单层密 度；

步骤S015：步骤S014细胞每孔接种2ml步骤S013收获的上清，继续培养；

步骤S016：48小时后在荧光显微镜下观察发出荧光细胞的比例；

步骤S017：可以看到约有60％的细胞能发出绿色荧光；

步骤S018：刮取细胞，提取RNA，RT-PCR扩增；

步骤S019：获得一个861个碱基长的扩增片段，DNA测序表明这个扩增片 段为新冠病毒的7个核酸片段，证明假病毒构建成功。

其中，在进行步骤S012时，对于慢病毒载体质粒与辅助质粒比例进行 最优条件的筛选，具体如下：

慢病毒表达载体质粒和pMDLg/pRRE、pMD2.G辅助质粒的用量目前多采用 1.75ug,1.25ug,1.25ug(以六孔板为例)，本实验研究了六孔板中不同用量的 pRES rev辅助质粒对慢病毒包装效率的影响，分别设置pRES rev为低浓度组 (0.5ug)、中浓度组(0.75ug)、高浓度组(1.25ug)(如表1所示)，所得 慢病毒载体质粒、pMDLg/pRRE质粒、pMD2.G质粒、pRESrev质粒的比例分别 为7:5:5:2(a，低浓度组)、7:5:5:3(b，中浓度组)、7:5:5:5(c，高浓度组)。将不同组别的慢病毒质粒用于慢病毒包装，经荧光显微镜下观察(如图 8所示)，结果显示b组(中浓度组)，即慢病毒载体质粒、pMDLg/pRRE质 粒、pMD2.G质粒、pRES rev质粒的比例分别为7:5:5:3时，荧光信号最强， 而非pRES rev质粒浓度越高包装效率越高。

表1

实施例2抗RBM抗体对假病毒颗粒感染Vero细胞的阻断作用

步骤S021：BALB/c小鼠6只，其中3只对照，另3只腹腔免疫新冠病毒S 蛋白，200ug/只/次，共4次，每次间隔一周。第4次免疫后一周采集血清备 用。

步骤S022：96孔细胞培养板，接种Vero细胞，生长至80％的单层密度；

步骤S023：A1，A2孔，每孔加入小鼠免疫血清10ul；B1，B2孔，每孔加 入正常小鼠血清10ul；C1，C2孔，每孔加入生理盐水10ul；

步骤S024：A1，A2，B1，B2，C1，C2，每孔加入20ul实施例1步骤S013 收获的假病毒颗粒，继续培养；

步骤S025：48小时后在荧光显微镜下观察各孔荧光细胞数；

步骤S026：A1，A2孔，平均每孔荧光细胞数16个；B1，B2孔，平均每孔 荧光细胞数130个；C1，C2孔，平均每孔荧光细胞数140个；本实验表 明，小鼠免疫血清中的抗RBM抗体能阻断假病毒颗粒感染Vero细胞，证明 假病毒颗粒包膜上有RBM蛋白。

实施例3假病毒颗粒的qPCR和ddPCR定量

步骤S031：按照新冠病毒核酸检测流程提取上清液中病毒颗粒RNA；

步骤S032：采用Oligo dT(16t)作为引物进行逆转录得到cDNA；

步骤S032：将含新冠病毒861个碱基RNA的假病毒颗粒cDNA进行2倍系 列倍比稀释后分别应用实时荧光定量PCR(qPCR)及数字微滴PCR (ddPCR)进行定量。定量过程中以SYBER GREEN为荧光指示，用针对不 同片段的特异性引物平行进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增和数字微滴 PCR(ddPCR)扩增与定量。

结果表明，qPCR很难区分2倍稀释的新冠病毒基因模板，ct值变化缺 乏规律与倍比稀释无法对应，对核酸的定量精确度差。ddPCR则可以比较精 确定量出2倍稀释的新冠病毒基因模板，检测出的拷贝数符合倍比稀释的特 征。由于ddPCR是绝对的核酸定量方法，且7个新冠病毒基因片段在每个假 病毒颗粒里均各为1个拷贝，因此，ddPCR测定的拷贝数也代表假病毒的颗 粒数。

片段1特异引物扩增结果：

片段2特异引物扩增结果：

片段3特异引物扩增结果：

片段4特异引物扩增结果：

片段5特异引物扩增结果：

片段6特异引物扩增结果：

片段7特异引物扩增结果：

用于qPCR扩增及ddPCR扩增的引物如下：

片段1：

Pf1:5’gaccctgtgggttttacacttaaaaacac 3’

Pr1:5’aaacgattgtgcatcagctgac 3’

片段2：

Pf2:5’agtgaaatggtcatgtgtggc 3’

Pr2:5’acaaatgttaaaaacactattagc 3’

片段3：

Pf3:5’ttaaatgatctctgctttactaatgtc 3’

Pr3:5’aacgcagcctgtaaaatcatctgg 3’

片段4：

Pf4:5’acaggtacgttaatagttaatagcg 3’

Pr4:5’aatattgcagcagtacgcacac 3’

片段5：

Pf5:5’cacattggcacccgcaatcct 3’

Pr5:5’tgaggaacgagaagaggcttgac 3’

片段6:

Pf6:5’aggggaacttctcctgctagaatg 3’

Pr6:5’accagacattttgctctcaagc 3’

片段7：

Pf7:5’cgcggagtacgatcgagtgta 3’

Pr7:5’gtcattctcctaagaagctat 3’

实施例4 ddPCR定量的标准物全程用于新冠病毒检测试剂盒的应用

以新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)为例，试 剂盒主要组分成分如图4；

适用仪器：SLAN-96P全自动医用PCR分析系统、ABI7500荧光PCR 仪、LifeTechnologies QuantStudio^TM5荧光PCR仪、Roche Light Cycler480荧 光定量PCR仪、雅睿MA-6000荧光PCR仪。

样本要求：

1.适用样本类型:咽拭子、肺泡灌洗液。

2.样本采集:推荐按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》“标本 采集方法”相关规定执行。经验证，可选择尼龙采样头+ABS采样杆材质的采 样拭子进行样本采集。样本采集后，可置入图5所示保存液进行保存；

经验证，生理盐水、TE缓冲液、2-M含胍盐(如盐酸胍)等的保存液亦 可作为样本保存液进行样本保存。含胍盐组分的保存液无法适配本公司样本 释放剂进行核酸提取，可使用本公司核酸提取或纯化试剂进行核酸提取。

3.样本保存和运送:待测样本可立即用于处理，能在24小时内检测的标 本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存(如 无-70℃保存条件，待测样本可于-20℃保存9个月，核酸样本-20±5℃保存9 个月)。应避免反复冻融。样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运 输。样本经56℃30min的灭活不会对本试剂盒的检测产生影响。

具体步骤如下：

步骤S041：试剂准备(在试剂准备区进行)

步骤S0411：取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温 后，混匀后备用；

步骤S0412：根据待测样本数量，阳性对照和阴性对照数量，按比例 (2019-nCoV-PCR反应液26μl/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4μl/人份)取 相应量的组分，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用；

步骤S0413：将上述准备好的试剂转移至样本处理区待用。

步骤S042：样本处理(在样本处理区进行)

步骤S0421：使用样本释放剂或者核酸提取或纯化试剂按其说明书操作 进行核酸提取。

步骤S0422：将30μl配制好的PCR-混合液加入到装有20μl上述处理后 的样本PCR扩增管中，在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR的检测。在 PCR扩增前，可使用15μl的石蜡油对荧光PCR管进行封盖处理。

步骤S043：PCR扩增(在扩增与分析区进行)(请参照仪器使用说明书 进行设置)

步骤S0431：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阳性对 照(即本发明包装所得新冠病毒假病毒颗粒)、阴性对照及待测样本，并设 置样本名称。

步骤S0432：选择FAM(ORF-1ab区域)和ROX(N基因)通道检测2019-nCoV病毒核酸；选择HEX通道检测内标。

步骤S0433：推荐的循环参数设定如图7所示：

设置完毕，保存文件，运行反应程序。

步骤S044：结果分析(请参照仪器使用说明书进行设置)

反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分 析。根据分析后图像调节Baeline的Start值、End值以及Threshold值(用户 可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～2O0，调整 阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各 项参数符合下述“步骤S045：质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录 定性结果。

步骤S045：质量控制

2019-nCoV-PCR-阴性对照:FAM、ROX通道及内标(HEX)通道均无Ct值 或Ct>40；

2019-nCoV-PCR-阳性对照:FAM、ROX及内标(HEX)通道均Ct<35；

以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效，需重新进 行。

阳性判断值：通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值 为40，内标Ct的参考值为40。

综上，本发明提供了一种在抗新冠病毒研究中可用于中和抗体活性测定 与抗病毒药物评价，以及在新冠病毒核酸检测中可作为新冠病毒核酸定性与 定量检测标准品的假病毒颗粒及其制备方法。

一：新冠病毒S蛋白的RBM(受体结合基序)是病毒结合受体、进入宿主 细胞的关键结构域。本发明基于慢病毒包装系统，将RBM蛋白呈现于假病 毒颗粒的表面，包装出可结合新冠病毒受体的假病毒颗粒，用以替代抗病毒 研究中使用具有感染性活病毒所带来的生物安全隐患。

二：新冠病毒核酸检测是其诊断的金标准，也是抗病毒研究中病毒载量 评估不可或缺的方法。在核酸检测中，一种标准浓度的病毒颗粒标准品，不 仅可作为定性、定量的对照，也可为核酸检测全过程中各环节准确与否提供 指示。包含有被检核酸片段的假病毒颗粒构建是提供核酸标准品的理想方 法。本发明基于慢病毒包装系统，通过整合6个国内外权威机构指定的新冠 病毒核酸检测扩增区域以及一个包含poly-A的3’非编码区域，将此7个区域 RNA作为串体，构成假病毒颗粒的核心基因，包装出具有RBM包膜和7段 RNA核心的病毒样颗粒，避免整段新冠病毒基因作为假病毒颗粒核心基因可 能复制出有感染性病毒颗粒的潜在危险。

包装好的假病毒颗粒为外膜有RBM蛋白，核心有新冠病毒7个片段 RNA串体的病毒样颗粒。最后采用具有绝对定量的数字微滴PCR(ddPCR) 方法对假病毒颗粒数进行标定，制备出含有精确拷贝数(假病毒颗粒数)的 新冠病毒核酸标准物。

SEQ ID No.1

gaattcaacagagatcgatctgtttccttgacactatgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaa gttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctca gatttaaattggcataatgacttaataggcacagccatacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcag acggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacagtccat ccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccagg cttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgc tggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtc cataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttctt ctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactgg aggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctga taaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtgg atgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggt cttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggta ccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtg gaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctg aggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggc tcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggc tatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggtt aatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttata cagacatagagatgaaccgacttggaaagaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatag attgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaat ggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacTA Actcaaatcctgcacaacagattcttcatgtttggaccaaatcaacttgtgataccatgctcaaagaggcctcaattatatttgagtttttaatttttatggaattc

SEQ ID No.2

gaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaa ctccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtttagtgaaatggtcatgtgtggcggttcactatatgttaaa ccaggtggaacctcatcaggagatgccacaactgcttatgctaatagtgtttttaacatttgtttaaatgatctctgctttact aatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctga ttataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttacaggtacgttaatagttaatagcgtacttctttttcttgctttcgt ggtattcttgctagttacactagccatccttactgcgcttcgattgtgtgcgtactgctgcaatattcacattggcacccgca atcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggag cagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcaaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgct gctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtcgcggagtacgatcgagtgtaca gtgaacaatgctagggagagctgcctatatggaagagccctaatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtga ttttaatagcttcttaggagaatgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Claims (10)

1.一种假病毒颗粒，其特征在于：

以慢病毒为框架；

其外膜蛋白是VSV-G蛋白与新冠病毒S蛋白受体结合基序融合的外膜蛋白；

其核心基因为SARS-CoV-2病毒基因片段；

所述SARS-CoV-2病毒基因片段为该病毒7个RNA片段的串联体；

所述7个RNA片段分别为该病毒基因的13340-13462位碱基、15430-15530位碱基、22721-22861位碱基、26269-26382位碱基、28706-28834位碱基、28880-28981位碱基、29741-29890位碱基。

2.根据权利要求1所述假病毒颗粒，其特征在于：

所述新冠病毒S蛋白受体结合基序是新冠病毒S蛋白的437-508位氨基酸。

3.权利要求1或2所述假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建VSV-G与新冠病毒S蛋白受体结合基序融合表达载体

1.1)对pMD2.G载体上VSV基因进行酶切，回收载体大片段DNA；

1.2)处理步骤1.1)回收的载体大片段DNA，防止载体自连；

1.3)合成SEQ ID No.1DNA，该序列包含了去除终止码的VSV-G编码DNA和含终止码的RBM DNA，并在两端引入酶切位点；

1.4)以内切酶处理步骤1.3)合成的SEQ ID No.1DNA，回收SEQ ID No.1DNA；

1.5)将步骤1.2)处理过的载体大片段DNA与步骤1.4)回收的SEQ ID No.1DNA混合，进行酶连，得到连接产物；

1.6)将步骤1.5)得到的连接产物进行转化，并筛选阳性克隆，得到VSV-G与RBM融合表达载体；

2)构建包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体

2.1)合成SEQ ID No.2DNA，该序列包含了六段国内外权威机构指定的新冠病毒核酸检测扩增区域及一段包含poly-A的3’非编码区域，并在两端引入酶切位点；

2.2)将步骤2.1)合成的SEQ ID No.2DNA克隆至慢病毒表达载体，得到包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体；

3)转染技术包装得到假病毒颗粒

利用步骤1)得到的VSV-G与RBM融合表达载体和步骤2)得到的包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体，转染包装得到假病毒颗粒。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：

步骤1.2)中，采用碱性磷酸酶处理步骤1.1)回收的载体大片段DNA；

步骤1.5)中，采用T4连接酶进行酶连。

5.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于：

步骤2)中，慢病毒表达载体为FT102 CMV-MCS-EF1-copGFP。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：步骤3)的具体步骤为：

3.1)用DMEM高糖培养基培养293T细胞，置于37℃的CO₂恒温细胞培养箱培养；

3.2)接种293T细胞于孔板中，使细胞达到70-90％汇合度；

3.3)按照四质粒系统包装病毒颗粒；

转染时要求按照慢病毒表达载体质粒、pMD2.G质粒、pMDLg/pRRE质粒、pRES rev质粒质量比为7:5:5:2～5的量制备DNA预混液，与已稀释的转染试剂形成DNA-脂质复合物，将其加入步骤3.2)的细胞后，37℃孵育；

3.4)分别于转染后第24h、48h收集细胞上清液，将其合并后超滤浓缩。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于：

步骤3.2)中，所述转染试剂为Lipofectamine^TM 3000；

步骤3.3)中，慢病毒表达载体质粒、pMD2.G质粒、pMDLg/pRRE质粒、pRES rev质粒质量比为7:5:5:3；采用Opti-MEM^TM培养基对Lipofectamine^TM 3000进行稀释；

步骤3.4)中，超滤浓缩的条件是：4℃，不超过5000g，20-40min离心。

8.权利要求1所述假病毒颗粒在新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物中的应用。

9.一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和新冠病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述假病毒颗粒。

10.权利要求1所述假病毒颗粒的定量方法，其特征在于：采用数字微滴PCR方法进行定量。

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