JP2021515570A - 癌におけるおよび免疫抑制のための抑制性エキソソーム - Google Patents

Abstract

PD-L1含有エキソソームなどの抑制性の細胞外小胞（EV）は癌細胞によって生産されて免疫系の全身抑制を促進し、腫瘍が免疫監視を免れることを可能にする。抑制性EVの阻害剤を、抑制性EVの抑制活性および／または生産を低減させ、全身性免疫抑制を軽減し、同時投与される免疫療法の有効性を増加させるために使用してよい。さらに、PD-L1含有エキソソームを生産する能力が正常に機能しない操作された癌細胞を投与して、常在腫瘍に対して免疫系をプライミングし、癌細胞による免疫系の全身抑制を克服することができる。また、免疫関連状態を治療するために、または治療的免疫抑制を促進するために、外因的に生産されたPD-L1含有エキソソームを対象に投与してよい。

Description

関連出願の相互参照：この出願は、2018年3月14日に出願された「癌由来免疫抑制性エキソソームの阻害」と題された米国仮出願第62/643,163号および2019年1月9日に出願された「癌および免疫抑制治療におけるエキソソーム」と題された米国仮特許出願第62/790,464号に優先権の恩典を主張しており、それらの出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する陳述：本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号U19 CA179512の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。

本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2019年3月13日に作成された上記のASCIIコピーは、UCSF058PCT_SL.txtという名前で、サイズは3,601バイトである。

序論
免疫療法は癌療法に革命をもたらした。PD-L1およびPD-1に対する抗体などの免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、黒色腫、非小細胞肺癌、および腎癌を含む多数の癌の種類に対して効き目を示している。この反応には、以前に他の複数の治療戦略で失敗した多くの患者における長期寛解が含まれる。しかしながら、これらの癌においてさえ、患者の10〜30パーセントだけしか抗PD-L1/PD-1療法に反応しない。前立腺癌などの他の癌では、反応はまれである。患者間および癌間の治療の成功における差異の理由は、依然としてほとんど不明である。

PD-L1は、多くの細胞型の細胞表面上に見出され、炎症の状況において、または多数の発癌性病変によって上方制御される膜結合リガンドである。それは免疫T細胞上のPD-1受容体に結合してT細胞の抗原駆動による活性化の抑制につながり、炎症反応を牽制する。しかしながら、腫瘍細胞はこの機構を勝手に利用して免疫破壊を回避できる。PD-L1およびPD-1への治療抗体はこの相互作用を遮断し、次に抗腫瘍免疫反応を向上させることができる。

一般的に、免疫系のPD-L1腫瘍抑制は腫瘍床内で機能し、そこでは細胞表面PD-L1が腫瘍浸潤エフェクターT細胞の表面上のPD-1と直接相互作用していると考えられている。しかしながら、PD-L1は細胞外小胞（EV）の表面上にも見出すことができる。さらに、EV PD-L1レベルは、様々な観点から腫瘍の進行と関連している。例えば、Theodoraki et al., 2018, Clinical significance of PD-L1⁺ exosomes in plasma of Head and Neck Cancer patients, Clin Cancer Res 24:896-905（非特許文献1）は、エキソソームPD-L1レベルが頭頸部癌患者の疾患の進行と相関していることを実証し、循環エキソソームPD-L1が癌患者における疾患の予後および免疫活性の指標として作用し得ることを示唆した。Yang et al., 2018, Exosomal PD-L1 harbors active defense function to suppress T cell killing of breast cancer cells and promote tumor growth Cell Res 28:862-864（非特許文献2）は、エキソソームPD-L1が乳癌細胞のT細胞殺傷を抑制することを示唆した。Chen et al., 2018, Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature 560, 382-386（非特許文献3）は、転移性黒色腫がPD-L1エキソソームを放出し、そのようなエキソソームの存在量が抗PD-1療法の有効性を予測することを示し、PD-L1エキソソームが免疫系を全身的に抑制できることを示唆した。Ricklefs, et al., 2018, Immune evasion mediated by PD-L1 on glioblastoma-derived extracellular vesicles. Sci Adv 4, eaar2766（非特許文献4）は、神経膠芽腫のPD-L1 EVがT細胞活性化および増殖を遮断すること、ならびに抗PD-1受容体遮断抗体がT細胞活性化のPD-L1 EV媒介性遮断を有意に覆したことを示した。

これらのデータは、PD-L1の役割が細胞間相互作用にも腫瘍微小環境にも限定されないことを示す。したがって、癌における抑制性EVの役割の理解を向上させることが当技術分野において依然として必要とされている。PD-L1含有エキソソームおよび他の抑制性EVの抑制効果を克服できる新規の癌療法についても当技術分野において依然として必要とされている。

関連して、そのような免疫抑制を軽減するための適した治療がそのような対象を対象としてもいいように、抑制性EVによる実質的な全身性免疫抑制を有する対象を同定することが当技術分野において必要である。

関連して、癌生物学および免疫学における循環抑制性EVの重要性を考慮すると、抑制性エキソソーム放出を定量化する容易な方法が当技術分野において必要である。

関連して、PD-L1含有エキソソームの抑制力を考慮すると、免疫系を治療的に抑制するためのそのようなEVの新規の適用が当技術分野において必要である。

Theodoraki et al., 2018, Clinical significance of PD-L1+ exosomes in plasma of Head and Neck Cancer patients, Clin Cancer Res 24:896-905 Yang et al., 2018, Exosomal PD-L1 harbors active defense function to suppress T cell killing of breast cancer cells and promote tumor growth Cell Res 28:862-864 Chen et al., 2018, Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature 560, 382-386 Ricklefs, et al., 2018, Immune evasion mediated by PD-L1 on glioblastoma-derived extracellular vesicles. Sci Adv 4, eaar2766

本明細書に開示されるのは、PD-L1および他の抑制分子を含有する循環EVの免疫抑制力に関連する様々な発明である。

第一の局面において、本発明の範囲は、抑制性EVの阻害剤およびその使用を対象とする。本明細書で実証されるように、PD-L1含有エキソソームなどの抑制性EVは、免疫系の全身抑制を促進し、腫瘍が免疫監視を免れることを可能にする。抑制性EVの阻害剤は免疫抑制剤の存在量を低減させ、腫瘍監視を再活性化する。一つの局面において、これらの阻害剤は、EVの抑制活性が低減するように、抑制分子の生産および／またはEV中のパッケージングを阻害する活性物質を包含する。別の局面において、これらの阻害剤は、EVの生産および放出を阻害し、循環中の抑制性EVの存在量を低減させる活性物質を包含する。本発明は、他の同時に実施される免疫療法による癌の治療における抑制性EV阻害剤の新規の使用をさらに包含する。抑制性EV阻害剤を用いて対象における全身性免疫抑制を軽減することにより、同時に実施される免疫療法の有効性が増加する。

第二の局面において、本発明の範囲は、抑制性EVの生産によって免疫攻撃を回避する癌細胞に対してT細胞をプライミングする新規の方法を対象とする。これらの方法は、PD-L1含有エキソソームなどの抑制性EVを生産する能力が正常に機能しない操作された癌細胞を含む新規組成物を採用する。第一の実装形態において、操作された癌細胞は、PD-L1などの抑制分子を生産する能力が低減した癌細胞を含む。第二の実装形態において、操作された癌細胞は、エキソソームなどのEVを生産する能力が低減した癌細胞を含む。癌の治療のために、操作された細胞を癌患者に導入し、常在腫瘍に対する免疫反応を引き出す。この方法により、免疫系の全身抑制が克服され、癌に対する頑強な免疫反応が促進される。

第三の局面において、本発明の範囲は、前述の治療が最も効果的な癌患者を同定するための予後および診断方法を包含する。これらの方法は、対象における全身抑制の度合いを評価することを包含する。第一の実装形態において、PD-L1エキソソームなどの抑制性EVの存在量が評価される。代替の実装形態において、常在腫瘍における浸潤免疫細胞の存在量が評価される。実質的な全身性免疫抑制を有することが見出された対象は、抑制性EVによって媒介される全身性免疫抑制を阻害または避ける治療に非常に適切であると見なされる。

第四の局面において、本発明の範囲は、抑制性エキソソーム生産を定量化する新規の方法を包含する。本発明の範囲は、PD-L1などのEV関連分子および蛍光タンパク質などのレポーター部分を含む融合タンパク質を包含する。融合タンパク質によって癌細胞を形質転換することで、癌細胞によって生産される抑制性エキソソームの容易な定量化および体全体にわたる追跡が可能となる。

第五の局面において、本発明の範囲は、抑制性エキソソームの治療的使用を包含する。細胞は、PD-L1含有エキソソームなどの抑制性EVを生産するように操作される。次に、例えば自己免疫状態の治療に使用し、炎症過程を低減させ、ならびに移植臓器および他の移植片の免疫拒絶を予防するなど、全身性または局所免疫抑制を促進するために、これらの外因的に生産された抑制性EVを対象に投与してよい。

T細胞、抗原提示細胞、およびPC-3エキソソームの間の相互作用を示す、エキソソームPDL1のインビトロ機能アッセイの概略図。APC上のMHC分子はT細胞受容体に認識される抗原に結合し、結果としてそれらを活性化する。B7およびCD28は相互作用してT細胞活性化を増強する。PC-3細胞からのエキソソームPD-L1は、T細胞上のPD-1と相互作用してT細胞活性化を阻害する。 図2Aは、免疫応答性B6マウスへ1×10⁶ WT、Rab27a null、またはPd-l1 null TRAMP細胞を皮下注射した後の腫瘍成長を示す。各遺伝子型についてN＝5。エラーバーはSEMを表す。Tramp WT対TRAMP Rab27a null、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP Pd-l1 null、p＜0.0001。Tramp WT対TRAMP nSMase2 null、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。図2Bは、細胞を注射した後の日数におけるマウス生存曲線を示す。各遺伝子型についてN＝10。Tramp WT対TRAMP Rab27a null、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP Pd-l1 null、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP nSMase2 null、p＜0.001。 図3Aは、CD63-GFPを発現するWTおよびRab27a null PC3細胞からのGFP^＋小胞のサイズおよび量についてナノ粒子追跡の密度トレースを示す。図3Bは、全粒子についての曲線下積分を示す、N＝3。 WT PC3、Rab27a null、およびnSMase2 null PC3細胞によって分泌されるエキソソームにおけるPD-L1の定量化を示す、N＝6。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Aは、脾臓重量をグラムで示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Bは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちのCD8＋細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Cは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちのCD4＋細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Dは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちの調節性T細胞（T-reg）細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Eは、流入領域リンパ節におけるCD8 T細胞のうちのPD-1＋細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Fは、流入領域リンパ節におけるCD4 T細胞のうちのPD-1＋細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Gは、流入領域リンパ節のCD8 T細胞におけるTim3＋陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Hは、流入領域リンパ節のCD4 T細胞におけるTim3＋陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Iは、流入領域リンパ節のCD8 T細胞におけるグランザイムB陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、および5Lは、3組のマウス：野生型Tramp細胞（WT）を注射したマウス、Pd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウス、およびRab27a null TRAMP細胞を注射したマウス、における様々な測定を示す。N＝5マウス/TRAMP遺伝子型、処理あたり注射された1×10⁶ 細胞。すべての測定値は、注射の14日後に得た、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。図5Jは、流入領域リンパ節のCD4 T細胞におけるグランザイムB陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 前もって偽処理またはPd-l1、Rab27a、もしくはnSMase2 null TRAMP細胞を注射した免疫応答性B6マウスへ1×10⁶ WT TRAMP細胞を二次皮下注射した後の経時的な腫瘍成長の体積。各条件についてN＝5。Tramp WT対TRAMP Rab27a nullを前注射したTRAMP WT、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP Pd-l1 nullを前注射したTRAMP WT、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP nSMase2 nullを前注射したTRAMP WT、p＜0.001（二元配置分散分析検定）。エラーバーはSEMを表す。 1×10⁶ WT、Rab27a null、またはPd-l1 null MC38細胞を免疫応答性B6マウスへ皮下注射した後の経時的な腫瘍成長を示す。各遺伝子型についてN＝5。エラーバーはSEMを表す。MC38 WT対MC38 Rab27a null、p＜0.05。MC38 WT対MC38 Pd-l1 null、p＜0.05。MC38 WT対MC38 Pd-l1 null；Rab27a null、p＜0.05（二元配置分散分析検定）。 図Aのように細胞を注射した後のマウス生存曲線を示す。各遺伝子型についてN＝10。MC38 WT対MC38 Rab27a null、p＜0.001。MC38 WT対MC38 Pd-l1 null、p＜0.001。MC38 WT対MC38 Pd-l1 null；Rab27a null、p＜0.001（ログランクテスト）。 WT、Rab27a null、またはPd-l1 null MC38細胞を注射し、続いて抗PD-L1またはアイソタイプ対照抗体のいずれかで処理したマウスの生存曲線を示す。各条件についてN＝5。MC38 WTアイソタイプ対MC38 WT抗PD-L1、p＜0.01。MC38 Rab27aアイソタイプ対MC38 Rab27a抗PD-L1、p＜0.05。MC38 Pd-l1アイソタイプ対MC38 Rab27a抗PD-L1、N.S.（ログランクテスト）。 1×10⁶ WT TRAMP細胞を単独で注射されたか、または一方の脇腹にPd-l1 nullもしくはRab27a null細胞のいずれかを、もう一方の脇腹に1×10⁶ WT TRAMP細胞を同時注射された免疫応答性B6マウスにおけるTRAMP腫瘍成長を示す。N＝5。Tramp WT対TRAMP Rab27a nullと同時注射されたTRAMP WT、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP pd-l1 nullと同時注射されたTRAMP WT、p＜0.001。Tramp WT対TRAMP nSMase2 nullと同時注射されたTRAMP WT、p＜0.01（二元配置分散分析検定）。 単独で注射またはWT TRAMP細胞を同時注射されたマウスにおけるPd-l1 nullまたはRab27a null TRAMP細胞の腫瘍成長を示す。N＝5。エラーバーはSEMを表す。 WT TRAMP細胞を単独で注射されたか、またはWTおよびPd-l1 nullもしくはRab27a null細胞を二重に注射されたマウスのマウス生存曲線を示す。各遺伝子型についてN＝5。 記載された条件下での腫瘍のリンパ球浸潤の組織学的解析の採点を示す。各マウスについての腫瘍のリンパ球浸潤は、重度、中等度、軽度、またはなしと格付けされた。 図9Aは、1×10⁶ MC38 Rab27a null細胞の皮下注射に続いて、インビトロで成長させたMC38 WTおよびMC38 Pd-l1 null細胞に由来する尾静脈エキソソーム後の経時的な腫瘍成長を示す。WT対Pd-l1 nullエキソソームで処理された、MC38 Rab27a null、p＜0.01（二元配置分散分析検定）。図9Bは、図9Aのように注射後の生存曲線を示す。WT対Pd-l1 nullエキソソームで処理されたMC38 Rab27a null腫瘍、p＜0.0エラーバーはSEMを表す。 要約概略図を示す。左：エキソソームの非存在下では、流入領域リンパ節で抗腫瘍T細胞が活性化され、全身性免疫および記憶につながり、エキソソームPD-L1を分泌する腫瘍細胞にすら向かう。中：PD-L1を保有するエキソソームの存在下では、流入領域リンパ節でT細胞応答が抑制され、腫瘍成長を可能にする。右：PD-L1を欠落したエキソソームの存在下では、流入領域リンパ節で抗腫瘍T細胞が活性化され、全身性免疫および記憶につながり、エキソソームPD-L1を分泌する腫瘍細胞にすら向かう。 図11Aは、野生型TRAMP腫瘍の経時的なサイズを示す。WT TRAMP細胞を一方の脇腹に注射し、35日間成長させ、続いてRab27a、sNmase2、またはPD-L1変異細胞を注射した。図11Bは、異なる治療についての生存曲線を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Aは、脾臓重量をグラムで示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Bは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちのCD8＋細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Cは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちのCD4＋細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Dは、流入領域リンパ節におけるCD45＋、CD3＋細胞のうちの調節性T細胞（T-reg）細胞のパーセントのフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Eは、流入領域リンパ節におけるCD8 T細胞のうちのPD-1＋細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Fは、流入領域リンパ節におけるCD4 T細胞のうちのPD-1＋細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Gは、流入領域リンパ節のCD8 T細胞におけるTim3＋陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Hは、流入領域リンパ節のCD4 T細胞におけるTim3＋陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Iは、流入領域リンパ節のCD8 T細胞におけるグランザイムB陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。 図12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、および12Jは、外因的に導入されたエキソソームPD-L1の効果を示す。マウスに1×10⁶個のRab27a null TRAMP細胞を移植し、続いてインビトロで成長させたWTまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかから収集したエキソソームを週3回尾静脈注射した。すべての測定は14日目に実行された。各ドットは個々のマウスを表す。エラーバーは平均値およびSDを表す。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001（スチューデントT検定）。エラーバーはSEMを表す。図12Jは、流入領域リンパ節のCD4 T細胞におけるグランザイムB陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。

発明の詳細な説明
本明細書に記載される様々な発明は、対象における癌の治療に適用されてよい。本明細書で使用される「癌」は、任意の腫瘍性状態を指す。例えば、腫瘍性状態は、以下からなる群より選択される癌を含んでよい：膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、多発性黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、および皮膚癌。

対象はヒト対象、例えば癌患者であってよい。あるいは、対象はマウス、ラット、イヌ、ネコ、げっ歯類などの非ヒト動物、または試験動物、癌モデル、および獣医対象を含む他の任意の動物種であってよい。

本明細書に開示される本発明の特定の態様は、状態の治療を対象とする。本明細書で使用される「治療」は、任意の治療効果または目的、例えば、状態の症状もしくは重症度の低減、状態の予防、状態の進行の遅延などを包含する。癌という観点から、治療は癌細胞数の低減、腫瘍サイズの低減、癌細胞の転移能もしくは活性の低減、腫瘍の成長もしくは拡大の停止、前癌細胞から癌への進行もしくは癌のより進行した段階への進行の停止を包含してよい。

特定の態様は、細胞外小胞（EV）を対象とする。本明細書で使用される場合、EVは任意の細胞外小胞、例えばエキソソームおよび微小胞を指す。エキソソームはエンドソームで生産され、生合成の間に多胞体内に蓄積され、多胞体のエキソサイトーシスの際に放出される。エキソソームは、一般的に30〜120nmのサイズ範囲である。微小胞は、原形質膜の外向きの出芽および分裂から生産され、20nmから1000nm以上までのサイズ範囲であってよい。

本発明の特定の局面は、免疫系の全身抑制を包含する。全身抑制には、選択された免疫細胞の活性、活性化、またはそれらの間の相互作用など、具体的および／または一般的な免疫過程の任意の阻害または下方制御が含まれる。EVという観点から、免疫系の全身抑制は、EVの供給源またはEV導入部位から遠位の抑制作用を包含する。一つの実装形態において、本発明は免疫抑制性エキソソームの阻害によって、癌細胞により媒介される全身性免疫抑制を阻害する方法を包含する。

本発明の特定の局面は、治療的有効量の投与された作用物質の使用を包含する。治療的有効量は、測定可能な生物学的反応および／または任意の治療効果を引き起こすのに十分な量である。

本明細書で使用される場合、「ある（a）」または「ある（an）」は、他に明示されない限り、1つまたは複数を意味してよい。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」、もしくは「有する（having）」という単語、またはこれらの用語の変形と連動して使用される場合、「ある（a）」または「ある（an）」という単語は1つまたは1つより多くを意味してよい。

癌を治療するための抑制性EVの阻害
本明細書に提示される研究結果は、免疫抑制分子を含有するエキソソームの分泌によって、癌細胞が腫瘍に対する免疫反応を抑制できることを実証する。その結果は、腫瘍の遠位にある免疫成分に対する全身抑制効果である。例えば、本明細書に実証されるように、前立腺腫瘍からのエキソソーム由来のPD-L1は、腫瘍から遠く離れたリンパ節におけるT細胞プライミングを阻害し、最終的に腫瘍部位へのT細胞遊走を低減させることができる。本明細書に実証されるように、抑制性EVの阻害により、癌治療のための新規の戦略が提供される。

本発明の範囲は、様々な抑制性EV阻害剤の使用を包含する。本明細書で使用される場合、「抑制性EV阻害剤」は、抑制性EVの抑制活性を阻害するか、または対象における抑制性EVの生産、分泌、または存在量を阻害する任意の組成物を含む。特定の局面において、抑制性EV阻害剤は、全身性免疫抑制を軽減するために使用される。この観点から、「全身性免疫抑制」は、腫瘍の遠位における任意の免疫抑制効果、例えば免疫活性の一般的な非特異的低減、または代わりに特定の腫瘍抗原に対するT細胞、B細胞、NK細胞、および／または好中球などの免疫細胞のプライミングおよび／または腫瘍への活性化細胞の遊走の任意の低減を意味する。

第一の局面において、本発明の範囲は、治療的有効量の抑制性EV阻害剤を対象へ投与することによって、対象における抑制性EVによる免疫系の全身抑制を阻害する方法を包含する。関連する局面において、本発明の範囲は、抑制性EVによる免疫系の全身抑制の阻害に使用するための抑制性EV阻害剤を包含する。一つの局面において、本発明の範囲は、癌治療のための医薬の製造における抑制性EV阻害剤の使用を包含する。

別の局面において、本発明の範囲は、治療的有効量の抑制性EV阻害剤を対象に投与することによって、対象において癌を治療する方法を包含する。関連する局面において、本発明の範囲は、癌治療において使用するための抑制性EV阻害剤を包含する。

別の局面において、同時に実施される免疫療法治療の有効性を増強するために、抑制性EV阻害剤による全身性免疫抑制の軽減が使用される。一つの局面において、本発明の範囲は、治療的有効量の抑制性EV阻害剤を対象に投与することによって、そのような治療を受けている対象における免疫療法治療の有効性を増強する方法を包含する。関連する局面において、本発明の範囲は、免疫療法治療の有効性の増強に使用するための抑制性EV阻害剤を包含する。

抑制性EV阻害剤は、任意の数の機構により作用する様々な組成物を含んでよい。第一の実装形態において、抑制性EVの阻害剤は抑制性EVの抑制能力を阻害する。例えば、抑制性EV阻害剤は、抑制性EVがT細胞活性化を下方制御する能力を阻害してよい。例えば、一つの態様において、抑制性EV阻害剤は単独でまたは他の細胞（すなわち、マクロファージまたは抗原提示細胞）と協働して、T細胞の表面上またはT細胞内のPD-1と相互作用するPD-L1を含む抑制性EV、例えばエキソソームの能力を低減させる。

一つの態様において、EV抑制活性の阻害剤は、抑制性EVの抑制活性、すなわちシグナル伝達機能を阻害することにより作用する。一つの態様において、EV抑制活性の阻害剤は、抑制性EV上または抑制性EV内に存在する1つまたは複数の抑制分子と免疫細胞上の受容体との相互作用を妨げる。一つの態様において、1つまたは複数の抑制分子はPD-L1を含み、抑制活性の阻害剤は、免疫T細胞上または免疫T細胞内のPD-1受容体とEV由来のPD-L1との相互作用の邪魔をする。

一つの態様において、抑制性EV活性の阻害剤は小分子を含む。一つの態様において、小分子は免疫細胞とのPD-L1相互作用を妨げる。例示的な小分子は、Domlingによる「Inhibitors of the pd-1/pd-l1 protein/protein interaction」と題された米国特許出願公開第20190016681号；ChupakおよびZhengによる「Compounds useful as immunomodulators」と題されたPCT国際特許出願公開第WO 2015034820号；およびChupakらによる「Compounds useful as immunomodulators」と題されたPCT国際特許出願公開第WO 2015160641号に記載されているものを含む。

一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、抑制性EV活性を妨げるかまたは阻害するペプチドを含む。一つの態様において、ペプチドはPD-L1と免疫細胞との相互作用の阻害剤を含む。例示的なペプチドは、Millerらによる「Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions」と題された米国特許出願公開第20150294898号に記載されたペプチドを含む。一つの態様において、ペプチドはEV抑制分子と免疫細胞との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片を含む。一つの態様において、抗体またはその断片は、PD-L1、PD-1に結合するか、さもなければPD-L1-PD-1相互作用を妨げる組成物を含む。例示的な抗体またはその断片は、Cuillerotらによる「Pd-1/pd-l1 inhibitors for the treatment of cancer」と題された米国特許出願公開第20180244781号；Irvingらによる「Anti-PD-L1 antibodies, compositions and articles of manufacture」と題された米国特許出願公開第8,217,149号；Freemanらによる「Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor」と題された米国特許第8,552,154号に記載されている抗体および抗原結合領域を含む。

別の態様において、EV抑制活性の阻害剤は、抑制性EVに存在する1つまたは複数の抑制分子の発現を妨げる構築物を含む。一つの態様において、抑制分子はPD-L1である。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、分泌されたEV中のPD-L1の存在量を低減させるか、または実質的に排除する。

代替の態様において、1つまたは複数の抑制分子は、PD-1、PD-2、アデノシンA2A受容体、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA、CTLA-4、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、リンパ球活性化遺伝子-3、NOX-2、PD-1、TIM-3、またはT細胞活性化のVドメインIgサプレッサーからなる群より選択される。

抑制分子の発現を妨げるための例示的な作用物質は、低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはCRISPRシステム（本明細書では、CRISPR/Cas9、CRISPR/dCAS9-KRAB、および遺伝子操作のための他のCRISPRに基づくシステムを含むと理解される）、または標的遺伝子の発現を選択的に妨げることができる他の組成物を含む。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、分解のために抑制分子を選択的に標的とする作用物質、例えば、タンパク質分解標的化キメラまたはPROTACを含む。

一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、EVにおける抑制分子のパッケージングを阻害することにより作用する。その結果は、抑制分子の数が低減することにより、抑制しない、またはより低い抑制活性を有するEVの生産である。一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、エキソソームにおけるPD-L1の搭載を阻害する。一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、抑制分子の搭載に関与する1つまたは複数の遺伝子、例えばエキソソームにおけるPD-L1搭載に関与する遺伝子の発現を阻害することによって作用する。

第二の実装形態において、抑制性EVの阻害剤は、EVの生産を阻害することにより作用する。一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、エキソソームの生産を阻害することにより作用する。一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、微小胞の生成を阻害することにより作用する。一つの態様において、抑制性EVの阻害剤は、EV生産遺伝子、すなわちその発現がEV、例えばエキソソームの生産、分泌、取り込み、および／または持続に関与するか、または必要である遺伝子によって発現されるタンパク質の発現、存在量、および／または活性を阻害する組成物を含む。一つの態様において、EV生産遺伝子はRab遺伝子である。一つの態様において、EV生産遺伝子はRab27aまたはRab27bのいずれかを含むRab27であり、原形質膜への多胞体の融合に関与し、エキソソーム放出を促進する。一つの態様において、EV生産遺伝子は、例えばESCRT0、ESCRT1、ESCRT2、およびESCRT3複合体のタンパク質をコードする遺伝子を含む、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（endosomal sorting complex required for transport；ESCRT）要素をコードする遺伝子である。一つの態様において、EV生産遺伝子はnSMase2であり、小胞内小胞の出芽を促進する。一つの態様において、EV生産遺伝子は、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor；SNARE）複合体のタンパク質をコードする遺伝子のいずれかである。例示的なEV生合成は、例えばALIX、TSG101、HRS、シンテニン、ユビキチン、クラスリン、VPS32、VPS、SNAP23、VAMP3、VAMP7、YKT6、RAB-11、RAB-35、RAB-5、RAB-7、および例えばNeil et al. 2018. Nat Rev Mol Cell Biolo. 19:213-228に記載されているような他の遺伝子をさらに含む。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤はEV、例えばエキソソームの生産を妨げる小分子を含む。一つの態様において、小分子はRab27aの阻害剤である。一つの態様において、Rab27aの阻害剤はNexinhib20である。一つの態様において、小分子はnSMase2の阻害剤である。一つの態様において、阻害剤はカンビノール、GW4869、または2,6-ジメトキシ-4-（5-フェニル-4-チオフェン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル）-フェノール（2,6-Dimethoxy-4-(5-Phenyl-4-Thiophen-2-yl-1H-Imidazol-2-yl)-Phenol；DPTIP）である。他の例示的なEV生合成の小分子阻害剤は、チピファルニブ、ネチコナゾール、クリンバゾール、イソプロテレノール、ケトコナゾール、ミトタン、トリアデメノール（triademenol）、ペンテトラゾール、カンナビジオール、シンバスタチン、ブレフェルジンA、ツニカマイシン、ジメチルアミロライド、モネンシン、クロラミジン（chloramidine）、およびビスインドリルマレイミド-Iを含む。nSMase2のさらなる阻害剤は、Slusherらによる「SMALL MOLECULE INHIBITORS OF NEUTRAL SPHINGOMYELINASE 2 (nSMase2) FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES」と題されたPCT国際特許出願公開第WO 2018129405号；Delaetらによる「4H-l,2,4-TRIAZOLE-3(2H)-THIONE DERATIVES AS SPHINGOMYELINASE INHIBITORS」と題されたPCT国際特許出願公開第WO 02/06644号；およびWilsonらによる「2-THIOXO-1,2,3,4-TETRAHYDROPYRIMIDINE DERIVATIVES」と題されたPCT国際特許出願公開第WO 02/066443号に記載されているものを含む。前掲した化合物の類似体および誘導体の使用は、本発明の範囲内であることが理解される。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、エキソソームの生合成および分泌を妨げるペプチドを含む。例示的なペプチドは、Bondらによる「Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release」と題された米国特許出願公開第20180305412号に記載されているものを含む。一つの態様において、ペプチドはエキソソーム生産遺伝子の発現産物、例えば細胞内抗体に対する抗体または抗体断片である。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、1つまたは複数のエキソソーム生合成遺伝子の発現を妨げる作用物質を含む。例えば、様々な態様において、阻害剤は低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはCRISPRシステムを含んでよい。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、Rab27aの発現を妨げる作用物質を含む。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、nSMase2の発現を妨げる作用物質を含む。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、EV生産を促進する分解タンパク質を選択的に標的とする作用物質、例えばPROTACまたは類似の構築物を含む。一つの態様において、標的タンパク質はRab27aである。一つの態様において、標的タンパク質はnSMase2である。

抑制性EVの例示的な阻害剤は以下を含む。一つの態様において、抑制性エキソソームの阻害剤は、例えば

という、Rab27aの発現を低減させるsiRNA構築物である。一つの態様において、抑制性エキソソームの阻害剤は、sgRNA、例えば：SEQ ID NO: 3、ヒトPd-l1 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 4、ヒトPd-l1 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 5、ヒトRab27a sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 6、ヒトRab27a sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 7、ヒトnSMase2 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 8、ヒトnSMase2 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 9、マウスPd-l1 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 10、マウスPd-l1 sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 11、マウスRab27a sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 12、マウスRab27a sgRNAガイド配列

；SEQ ID NO: 13、マウスnSMase2 sgRNAガイド配列

；およびSEQ ID NO: 14、マウスnSMase2 sgRNAガイド配列

を含むCRISPR/Cas9構築物である。

本発明の抑制性EV阻害剤は、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって腫瘍細胞に送達されてよい。一つの態様において、本発明の範囲は、抑制性EV阻害剤および送達剤を含む組成物を包含する。例示的な送達剤は、ウイルス性および非ウイルス性システムを含む。ウイルス性プラットフォームは、ポリヌクレオチドに基づく抑制性EV阻害剤に有用であり、他の作用物質の送達にも使用されてよい。例示的なウイルス送達剤は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびヘルペスウイルスを含む。非ウイルス性作用物質送達システムは、作用物質の送達のための生体材料またはナノ粒子などのナノ材料を含む。例示的な送達剤は、抗体、細胞内抗体、脂質、ポリマー、グラフェン、カーボンナノチューブ、ナノ球体、メソポーラスナノ粒子、デンドリマー、カチオン性リポソーム、および当技術分野において公知の他の送達組成物を含む。抑制性EV阻害剤の送達は、選択された送達剤上のリガンドおよび他の認識要素、例えば、腫瘍細胞上で特有または優先的に発現される標的種、例えば、インテグリン、受容体、および癌細胞の細胞膜に存在する他の種により、腫瘍細胞を標的としてよい。抑制性EV阻害剤の送達は、受動的な手段、例えば腫瘍血管の透過性および保持力の増強が原因で循環系に送達された作用物質の蓄積によって達成されてよい。あるいは、作用物質の送達は、バイオリスティック法、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マグネトフェクション、および化学トランスフェクション剤によって能動的に手助けされてよい。

本発明の例示的な態様は、抑制分子の発現を低減させるか、またはEV生産遺伝子の発現を低減させる抑制性EV阻害剤と組み合わせた送達剤を含む。例えば、抑制性EV阻害剤は、PL-D1および／またはRab27aおよび／またはnSMase2の発現を低減させる構築物を含んでよい。抑制性EV阻害剤は、例えば癌の治療に使用するために、インビボまたはインビトロで抑制性EV阻害剤を癌細胞に送達するように構成されたウイルス性または非ウイルス性ナノ粒子を含む送達剤と組み合わせて、低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはCRISPRシステムを含んでよい。

第一の実装形態において、抑制性EV阻害剤は独立型の治療として投与される。この実装形態において、作用物質の投与により抑制性EV、例えばPD-L1含有エキソソームの抑制能力または存在量が阻害される。これにより、抑制性EVによる全身性免疫抑制が軽減され、対象における自然免疫反応が癌細胞をより効果的に標的として破壊できる結果となる。

第二の実装形態において、本発明の抑制性EV阻害剤は、1つまたは複数の免疫療法剤と同時投与される。免疫療法の有効性は一定ではなく、一部の対象については非常に効果があり、他の対象については効果が低いか全く効果がない。本開示の発明者らは、腫瘍によって生産される抑制性EVの全身性免疫抑制効果のために、多くの場合、免疫療法は効果がないと考えている。したがって、抑制性EV阻害剤と免疫療法剤との同時投与は、全身性免疫抑制の軽減をもたらし、同時投与される免疫療法の有効性を増強する。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤と同時投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、当技術分野において公知の任意の免疫チェックポイント阻害剤を含んでよい。例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、例えばCTLA-4の阻害剤、例えばイピリムマブ；PD-1の阻害剤、例えばニボルマブおよびペンブロリズマブ；ならびにPD-L1の阻害剤、例えばアテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブを含む。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、細胞免疫療法剤と同時投与される。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、エクスビボでプライミングされた樹状細胞（例えばシプロイセル-T）と同時投与される。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、キメラ抗原受容体T細胞（例えばツァゲンレクルセル（Tsagenlecleucel）およびアキシカブタゲンシロロイセル）と同時投与される。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、腫瘍抗原を認識するようにエクスビボでプライミングされた腫瘍浸潤リンパ球と同時投与される。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、インビボで免疫細胞をプライミングする作用物質を含む免疫療法と同時投与される。例えば、作用物質は、腫瘍細胞を標的として免疫原性因子（例えばサイトカインGM-CSF）、腫瘍細胞溶解物、または樹状細胞を標的とする（例えばTLR3、TLR7、TLR8、またはCD40を標的とする）抗原含有抗体を発現するウイルス構築物を含んでよい。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、サイトカインを含む免疫療法と同時投与される。例えば、サイトカインは、インターフェロン-アルファ、インターロイキン-2、またはGM-CSFを含んでよい。

一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、癌関連抗原に対する抗体を含む免疫療法剤と同時投与される。そのような治療抗体は、腫瘍細胞上で過剰発現または排他的に存在するエピトープに結合し、細胞毒性免疫反応、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）または補体依存性細胞毒性を促進する。例示的な抗癌抗体は、CD20に対する抗体（例えばオファツムマブ、リツキシマブ）およびCD52に対する抗体（例えばアレムツズマブ）を含む。他の抗癌抗体は、異常な細胞成長を下方制御するか、そうでなければ癌を減衰させる、例えばHER2経路に対する抗体（例えばトラスツズマブ）。抗癌抗体は、抗体-薬物コンジュゲート、例えばトラスツズマブエンタムシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、およびイノツズマブオゾガマイシンをさらに包含する。

上記のように、本発明の範囲は、免疫療法の有効性を増強するのに使用するための抑制性EV阻害剤を包含し、例えば免疫療法は、チェックポイント阻害剤、プライミングされた樹状細胞、腫瘍浸潤リンパ球、キメラ抗原受容体T細胞、インビボで免疫細胞をプライミングするための作用物質、およびサイトカインからなる群より選択される。一つの態様において、抑制性EV阻害剤はRab27aの阻害剤である。一つの態様において、抑制性EV阻害剤はnSMase2の阻害剤である。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、EVにおけるPD-L1の発現またはパッケージングの阻害剤である。

他の実装形態において、抑制性EV阻害剤は、免疫療法剤以外の抗癌剤と同時投与される。例えば、化学療法薬物またはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤を抑制性EV阻害剤と同時投与してよい。

特定の場合において、抑制性EV阻害剤および同時投与される作用物質は、併用製品として包装および流通される。例えば、2つの作用物質は、例えば共通の包装要素内の2つの別個の区画または容器（例えばバイアル）に一緒に包装されてよい。いくつかの態様において、EV阻害剤および1つまたは複数の同時投与される作用物質は、注射、注入、または他の方法で送達できる単一製剤中の組み合わせに適合する。

本明細書で使用される同時投与は、2つの治療間の任意の時間的重複または時間的近接を意味する。同時投与は、抑制性EV阻害剤による全身性免疫抑制の軽減が、同時投与治療の有効性を向上させるように抑制性EV阻害剤および1つまたは複数のさらなる抗癌剤が投与される、任意の投与スケジュールを包含する。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、第一の時間間隔にわたって一連の投与量として投与され、1つまたは複数の同時投与される作用物質は、第二の時間間隔にわたって投与され、一連の個々の投与量として投与され、第一および第二の時間間隔は全体的または部分的に重複している。あるいは、抑制性EV阻害剤および同時投与される作用物質は、重複しない時間枠であるが、抑制性EV阻害剤が同時投与される作用物質の有効性を増強するのに十分な時間的近接内で投与される。いくつかの実装形態において、抑制性EV阻害剤は、1つまたは複数の同時投与される作用物質の投与の前および／または同時に投与される。

抑制性EV阻害剤は、選択された作用物質に適した任意の薬物送達方法によって投与されてよい。抑制性EV阻害剤は、選択された作用物質および選択された製剤に適切なように、静脈内注射、注入、体内注射、腫瘍内注射、経口摂取、座薬、吸入、または局所的に投与されてよい。抑制性EV阻害剤は、標的化ウイルスベクター、抗体、および当技術分野において公知の他の標的化技術によって腫瘍細胞に選択的に送達されてよい。抑制性EV阻害剤は、当技術分野において公知なように、適切な担体、賦形剤、緩衝液、防腐剤、および効果的な送達のための他の適切な組成物とともに製剤化されてよい。

抑制性EV阻害剤は、治療的有効量、すなわち測定可能な生理学的または治療的効果、例えば抑制性EVの抑制活性または存在量の阻害を誘導するのに十分な量で投与される。

腫瘍に対する免疫化のための操作された癌細胞
本発明の範囲は、PD-L1含有エキソソームなどの抑制性EVを生産する能力を欠落した癌細胞による免疫系の刺激により癌を治療する様々な方法を包含する。この方法論は、PD-L1含有エキソソームが、腫瘍に対する宿主免疫反応を抑制するのに強力な役割を果たすという発見に基づく。決定的には、本明細書で実証されるように、この抑制は、抑制性EVを生産する能力を欠落した癌細胞を免疫系に提示することで克服されてよい。

一つの局面において、本発明の範囲は、以下の一般的な方法により癌を治療する方法を包含する：
腫瘍または他の腫瘍性状態を有する対象から癌細胞を得る；
抑制性EVの活性または生産が低減するように癌細胞を操作する；および
操作された癌細胞を、直接または医療装置を介して（すなわち、生体適合性膜に封入して）対象に導入し、ここで操作された細胞に対する宿主免疫系反応が、類似の常在癌細胞に対する免疫療法反応をもたらす。

関連する局面において、本発明の範囲は、癌の治療に使用するための、全身性免疫抑制の能力が低減するように操作された癌細胞を包含する。そのような細胞は、それらが生産するEVが、操作されていない類似の細胞によって生産されたEVと比較して、免疫抑制の能力が低減している細胞を含んでよい。そのような細胞は、操作されていない類似の細胞と比較して、EVの生産を欠損した細胞を含んでよい。一つの態様において、本発明の範囲は、癌の治療のための医薬の製造における、全身性免疫抑制の能力が低減するように操作された癌細胞の使用を包含する。

本発明の操作された癌細胞は、腫瘍に由来する任意の細胞を含んでよい。一つの態様において、操作された癌細胞は、癌を患っている対象から単離された自己癌細胞である。有利なことに、そのような細胞は、それらが由来する宿主癌細胞と同一の免疫学的プロファイルを有し、供給源の腫瘍に対して効果がありかつ特異的な免疫反応を誘発し、宿主対象と免疫学的に適合する。細胞は、生検、例えば針生検、外科生検、骨髄生検、皮膚生検、またはそれにより癌性細胞もしくは組織が得られるかもしくは抽出される他の技術から得られる細胞を含んでよい。あるいは、細胞は、腫瘍が対象から除去される外科的切除手順から得られてよい。あるいは、細胞は循環細胞、例えば血液、リンパ液、もしくは組織試料から単離された白血病細胞または転移性細胞であってよい。

対象から抽出された細胞は、直接操作されてもよく、または操作の前に増殖されてもよい。癌細胞の培養は、当技術分野において公知の方法、例えば適切な培養培地、容器、および細胞培養技術の使用によるものであってよい。例えば、対象から除去された腫瘍組織は、当技術分野において公知の方法により解離され、選別され、成長培地上に播かれるか、または懸濁培養に配置されてよい。

代替の実装形態において、本発明の操作された癌細胞は同種癌細胞、すなわち対象に常在する癌細胞に対する免疫反応を呼び起こすことができるように、治療される対象と異なる対象に由来するが、治療される癌の種類に特徴的な免疫学的表現型を有する癌細胞である。

一つの態様において、本発明の範囲は、細胞によって生産されるEVにおいて、操作されていない類似の細胞と比較して抑制分子の存在量が低減されている、癌の治療に使用するための操作された癌細胞を包含する。一つの態様において、癌細胞は、操作されていない類似の細胞によって生産されるよりもエキソソームにおいてより少ないPD-L1を生産するように操作された、PD-L1含有エキソソームを生産する癌細胞である。抑制分子の存在量は、例えばEVあたりまたはEV質量あたりの抑制分子の数、EVあたりまたはEV質量あたりの生産された抑制分子の質量、生産されたEVの抑制活性、または抑制分子存在量の他の任意の尺度などの、任意の適切な尺度により評価されてよい。抑制分子の存在量の低減は、抑制分子の存在量の任意の実質的な低減、例えば操作されていない類似の細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％低減の低減であってよい。そのような低減は、操作された細胞の代表的な試料中に存在する抑制分子の平均的な存在量または活性を、操作されていない癌細胞の代表的なセットにおける抑制分子の平均的な存在量または活性と比較することにより評価されてよい。

第一の実装形態において、抑制分子の存在量の低減は、1つまたは複数の選択された抑制分子の発現を妨げることによって達成される。主要な態様において、操作された癌細胞は、PD-L1含有エキソソームを生産する癌細胞に由来し、操作された細胞は、例えばPD-L1発現を妨げることにより、操作されていない供給源の細胞よりもエキソソームあたりのPD-L1分子が少ないエキソソームを生産する。代替の態様において、1つまたは複数の選択された抑制分子は、PD-1、PD-2、アデノシンA2A受容体、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA、CTLA-4、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、LAG-3（リンパ球活性化遺伝子-3）、NOX-2、PD-1、TIM-3、またはT細胞活性化のVドメインIgサプレッサーからなる群より選択される。

代替の態様において、1つまたは複数の選択された抑制分子の存在量は、分泌されたEVにおける選択された分子のパッケージングに不可欠な過程、例えばエキソソームにおけるPD-L1分子の輸送および統合を妨げることにより達成される。

一つの態様において、本発明の範囲は、操作されていない類似の細胞と比較して抑制性EVを生産する能力が低減した、癌の治療に使用するための操作された癌細胞を包含する。一つの態様において、癌細胞は、操作されていない類似の細胞によって生産されるよりも少ないエキソソームを生産するように操作された癌細胞である。EVの生産は、例えば生産されたEVの数、生産されたEVの質量、EV生産の速度、またはEV生産の他の尺度などの、任意の適切な尺度により評価されてよい。抑制性EVの生産の低減は、抑制性EV生産における任意の実質的な低減、例えば操作されていない類似の細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％低減の低減であってよい。そのような低減は、操作された細胞の代表的な試料における抑制性EVの平均的な生産を、操作されていない類似の癌細胞の代表的なセットにおける抑制性EVの平均的な生産と比較することにより評価されてよい。

第一の実装形態において、抑制性EV生産の低減は、1つまたは複数のEV生産遺伝子、すなわちEV生合成、放出、または分泌に関与するかまたは必要な遺伝子の発現を妨げることによって達成される。一つの態様において、EV生産遺伝子はRab遺伝子である。一つの態様において、EV生産遺伝子はRab27aである。一つの態様において、EV生産遺伝子は、例えばESCRT0、ESCRT1、ESCRT2、およびESCRT3複合体のタンパク質をコードする任意の遺伝子などの、エンドソーム輸送選別複合体（ESCRT）要素をコードする遺伝子である。一つの態様において、EV生産遺伝子はnSMase2である。一つの態様において、EV生産遺伝子は可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNARE）複合体のタンパク質をコードする遺伝子のいずれかである。例示的なEV生合成遺伝子は、例えばALIX、TSG101、HRS、シンテニン、ユビキチン、クラスリン、VPS32、VPS、SNAP23、VAMP3、VAMP7、YKT6、RAB-11、RAB-35、RAB-5、RAB-7、および例えばNeil et al. 2018. Nat Rev Mol Cell Biolo. 19:213-228に記載されているような他の遺伝子を含む。

主要な態様において、操作された癌細胞は、PD-L1含有エキソソームを生産する癌細胞に由来し、操作された細胞は、その操作されていない供給源の細胞よりも少ないPD-L1含有エキソソームを生産する。一つの態様において、PD-L1含有エキソソームをより少なく生産する操作された癌細胞は、Rab27aの発現または活性が妨げられている癌細胞を含む。一つの態様において、PD-L1含有エキソソームをより少なく生産する操作された癌細胞は、nSMase2の発現または活性が妨げられている癌細胞を含む。

いくつかの実装形態において、本発明の操作された癌細胞は、抑制能力が低減し、かつEV生産が低減している、その両方であるように改変されてよいことが理解される。例えば、PD-L1およびRab27aおよび／またはnSMase2を欠損した細胞。

前述の態様は、抑制能力が低減したEVを有するか、またはEV生産が低減するように操作された癌細胞を対象とする。本明細書で使用される「操作」は、1つまたは複数の標的遺伝子の発現または活性を調整するための癌細胞の任意の遺伝子改変を包含する。操作は、1つまたは複数のさらなる遺伝子を発現するための癌細胞の形質転換をさらに含んでよい。

特定の態様において、操作は、標的遺伝子の発現を妨げることを含む。選択された標的遺伝子を妨げることは、当技術分野において公知の様々な手段によって達成されてよい。例えば、遺伝子の欠失、ノックアウト、ノックダウン、または標的遺伝子の発現を低減もしくは鎮める他の手段について、当技術分野において公知の任意の方法を採用してよい。標的遺伝子の発現を低減させるための例示的な方法は、挿入突然変異誘発、低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼの使用、またはCRISPRシステムの使用を含む。

他の態様において、操作は、標的タンパク質の存在量または活性の邪魔をする改変を含む。例えば、標的タンパク質の存在量は、タンパク質を分解のために選択的に標的とする構築物、例えばPROTACまたは類似の構築物の同時発現によって低減されてよい。標的タンパク質の活性に影響を与える別の改変は、タンパク質活性のドミナントネガティブ変異体または他のモジュレーターの同時発現である。

本発明の操作された癌細胞は、さらなる改変を含んでよい。一つの態様において、さらなる改変は、細胞に対する免疫原性反応を増強する因子の発現、例えばGM-CSF、IL-18、IL-6、ハイパーIL-6、IL-11、ハイパーIL-11、IL15、およびIL15αを含むサイトカインまたは環状ジグアニル酸、アルファフェトプロテイン、癌胎児性タンパク質、CA-125、MUC1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、および黒色腫関連抗原などの抗原の発現を含む。

一つの実装形態において、本発明の操作された癌細胞は、投与された細胞が免れるのを予防するために細胞の成長を正常に機能しなくするかまたは限定するために、例えば照射により改変される。一つの態様において、操作された細胞は、例えば薬物に対する感受性の付与、誘導性自殺遺伝子による形質転換、または転移能力を正常に機能しなくする改変により、免れる際にそれらが阻害されることを可能にするように改変される。

本明細書で実証されるように、本発明の操作された癌細胞の投与は、類似の癌細胞に対する免疫反応を呼び起こす。したがって、操作された細胞は、対象の免疫系を促進して常在腫瘍による全身性免疫抑制を克服するために使用できる。本発明の方法は、治療を必要とする対象、例えば癌を有する対象への、正常に機能しない抑制性EVを有する本発明の操作された癌細胞の治療的有効量の任意の投与を包含する。この観点から使用される場合、治療的有効とは、常在癌細胞に対する免疫系の任意の測定可能な増強を有することを意味する。

ワクチン接種手順は、細胞に基づくワクチンの生産および投与についての当技術分野において公知の方法により行われてよい。細胞性ワクチンの調製および投与のための例示的な方法は、Hannaによる「Autologous Tumor Vaccines and Methods」と題された米国特許出願公開第20180008686号；Liu et al., 2018, Abscopal effect of radiotherapy combined with immune checkpoint inhibitors. J Hematol Oncol 11, 104；Gao et al., 2008, Secretable chaperone Grp170 enhances therapeutic activity of a novel tumor suppressor, mda-7/IL-24. Cancer Res 68, 3890-3898；Hurwitz et al., 2000, Combination immunotherapy of primary prostate cancer in a transgenic mouse model using CTLA-4 blockade. Cancer Res 60, 2444-2448；Morris, et al., 2014,. Vaccination with tumor cells expressing IL-15 and IL-15Ralpha inhibits murine breast and prostate cancer. Gene Ther 21, 393-401；Overwijk et al., 2003, Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med 198, 569-580；およびvan Elsas et al., 1999, Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation. J Exp Med 190, 355-366.に記載されている。

生産および投与の一般的な方法は、送達組成物中に抑制性EV欠損細胞を製剤化し、送達製剤を1つまたは複数の部位に投与することを包含する。送達組成物は、当技術分野において公知の方法、例えば体内注射、皮下注射、筋肉内注射、または循環系内などの注射によって投与されてよい。投与された操作された細胞は、常在免疫細胞に遭遇して免疫反応を誘発し、そのような免疫反応は常在癌細胞を攻撃する。

ワクチンまたはワクチン様組成物は、当技術分野において公知なように、アジュバント、担体、賦形剤、および全細胞ワクチン製剤で利用される他の要素と組み合わせた操作された細胞を包含してよい。

いくつかの態様において、細胞は、例えばケージング構造、足場、ナノ粒子、ヒドロゲル、または当技術分野において公知の他の材料など、それらの成長を増強し、それらの免疫原性効果を増強し、および／またはそれらの局所的成長または移動性を限定する物理的要素中または物理的要素上に投与されてよい。

一般に、増強された免疫原性反応のためには、常在腫瘍に対する免疫反応を誘発するために、投与された細胞は生存可能であり、対象において成長または持続することが好ましい。代替の態様において、投与された細胞は、例えば生存能力を低減させるように、細胞が照射されるかまたは他の方法で処理され（例えばマイトマイシンCなどのDNA架橋剤によって）、免れるのを予防するために正常に機能しない生存能力を有する。

ワクチン組成物は、治療的有効量で投与される。この観点から治療的有効量は、例えば投与された細胞に対する、または類似の常在する細胞もしくは供給源の腫瘍に対する免疫反応などの免疫反応を誘発する任意の量を意味する。本明細書で実証されるように、いくつかの場合において、操作された癌細胞と常在癌細胞とのバランスは、本方法の有効性を決定する。したがって、いくつかの態様において、操作された細胞は、循環PD-L1エキソソームまたは供給源の腫瘍もしくは他の癌性組織によって生産される他の抑制性EVの抑制効果を克服するのに十分な量で投与される。そのような量は、細胞数、腫瘍サイズ、または腫瘍成長の他の尺度によって評価されてよい。例えば、投与される細胞の数は、対象における残存癌細胞の数より多くてよく、または投与される細胞の質量もしくは体積は、常在癌細胞または残存癌細胞の質量／体積より大きくてよい。いくつかの場合において、操作された免疫原性細胞と常在または残存癌細胞とのバランスは、投与された操作された細胞、すなわち投与された細胞の子孫によって作製される、結果として生じる腫瘍塊（または2つ以上の塊の集合体）のサイズによって決定される。

例えば、いくつかの態様において、投与される細胞および／またはそれらの子孫の数、質量、または体積は、対象における常在癌細胞／腫瘍の数、質量、または体積の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも200％、少なくとも300％、または少なくとも500％であってよい。例示的な最小投与量は、100万〜1億細胞以上の範囲内、例えば少なくとも1千万、少なくとも2千万、少なくとも5千万、少なくとも1億、少なくとも5億、少なくとも10億、少なくとも50億、または少なくとも100億細胞であってよい。例示的な最大投与量は、1千万から1千億細胞を超える範囲内、例えば1千万まで、2千万まで、5千万まで、1億まで、2億まで、3億まで、4億まで、5億まで、10億細胞まで、50億細胞まで、100億細胞まで、500億細胞まで、または1千億細胞までであってよい。投与量は1回投与してよく、または複数の投与量を数日、数週間、または数カ月の期間にわたって投与してよい。

一つの態様において、対象における操作されたおよび／またはエキソソーム欠損細胞と常在癌細胞とのバランスを増強するために、ワクチン接種治療は、常在癌細胞の数を損なう、破壊する、または低減させる治療と組み合わせて実施される。例えば、常在腫瘍は、照射、外科手術、または他の治療によって治療されてよい。例えば、本発明の治療方法は、免疫療法治療、例えばCAR-T細胞治療、樹状細胞療法、免疫チェックポイント療法、および当技術分野において公知の他の免疫療法と組み合わせて適用されてよい。

本発明のワクチン接種方法は、様々な観点から適用されてよい。一つの態様において、ワクチン接種方法は、例えば対象に存在する1つまたは複数の腫瘍に対する、対象における常在癌の治療に適用される。一つの態様において、ワクチン接種方法は、対象において残存癌細胞による腫瘍の再発または前癌性細胞の癌への進行を阻害する予防剤として適用される。例えば、腫瘍を有する対象において、腫瘍を切除し、切除した癌細胞から本発明のワクチン組成物を開発し、続いてワクチン組成物を投与して、任意の残存腫瘍細胞または癌の再発に対する対象の免疫系をプライミングしてよい。

予後方法
前述の治療方法は、それを患っている対象において癌を治療する新規の手段を提供する。本発明の範囲は、そのような治療方法に反応する対象の可能性を評価する新規の方法をさらに包含する。本開示の発明者らは、特定の腫瘍が本発明の治療方法に対してより反応性であり、具体的には、比較的少ない浸潤免疫細胞を有する腫瘍であることを決定した。現在、免疫療法の分野では、免疫学的に「ホット（hot）」および「コールド（cold）」な腫瘍の概念が確立されている。免疫学的には、ホットな腫瘍は、全体的な免疫浸潤が高いおよび／または浸潤免疫細胞が豊富である癌、例えば腫瘍浸潤リンパ球であり、一方、コールドな腫瘍はより少ない浸潤免疫細胞を有する。浸潤免疫細胞は、CD8^＋ T細胞、CD3^＋ T細胞、FOXP3^＋調節性T細胞（Treg）を含む。対照的に、コールドな腫瘍はより少ない浸潤免疫細胞を含み、高レベルの免疫抑制を示す。したがって、そのようなコールドな腫瘍は、全身抑制を改善または克服することを対象とする本発明の治療に反応する可能性が高い。

関連する実装形態において、循環抑制性EVの存在量を、全身抑制の尺度として利用できる。本発明の理論によれば、免疫療法に対する反応性は、対象における抑制性EVによって媒介される全身抑制の度合いに関連している。したがって、循環EVの存在量は全身抑制の尺度の役目を果たし、どの対象が抑制性EVの全身的作用からの軽減を必要としているかの指標として作用してよい。

したがって、一つの実装形態において、本発明の範囲は、以下の工程を含む、対象において癌を治療する方法を包含する：
選択された全身抑制の尺度によって対象における全身抑制の度合いを評価する工程；および
評価された全身抑制の度合いに基づいて対象についての治療計画を選択する工程であって、実質的な全身抑制を有する対象に、そのような全身抑制を軽減するための治療が実施される工程。

一つの態様において、全身抑制の尺度は、対象が1つまたは複数のコールドな腫瘍を有するかの決定である。一つの態様において、全身抑制の尺度は、対象が循環抑制性EVの実質的な存在量を有するかの決定である。一つの態様において、抑制性EVの尺度は、循環PD-L1含有エキソソームの存在量である。

一つの態様において、全身抑制を抑制するために選択される治療は、抑制性EV阻害剤の投与である。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、PD-L1含有エキソソームの阻害剤である。一つの態様において、PD-L1含有エキソソームの阻害剤は、Rab27aおよび／またはsnMase2の発現または活性を低減させる作用物質である。一つの態様において、抑制性EV阻害剤は、免疫療法治療と同時投与される。一つの態様において、全身抑制を阻害するために選択された治療は、抑制性EVを欠損した操作された癌細胞の投与である。一つの態様において、操作された癌細胞は、PD-L1含有エキソソームを生産する能力が低減した癌細胞である。

「コールド」な状態の決定は、腫瘍試料中の免疫細胞の定量化について当技術分野において公知の手段によって達成されてよい。腫瘍試料は、当技術分野において公知なように、外科的切除または生検法によって得てよい。腫瘍試料中の免疫細胞の定量化は、当技術分野において公知の方法、例えば免疫組織化学的標識、遺伝子発現データ（定量的RT-PCR、遺伝子発現アレイ、RNAシークエンシング（大量および単一細胞の両方））、または解離および細胞選別方法論によって達成されてよい。コールドな状態は、類似の癌を有する類似の対象のプールで確立された、選択された腫瘍および免疫細胞の種類に関連するカットオフ閾値に従って決定されてよい。一つの実装形態において、Pages et al, 2018, International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study, The Lancet 391:2128-213に記載されているように、国際的に確立されたイムノスコア（Immunoscore）が免疫学的状態の尺度として利用される。

抑制性EV存在量は、当技術分野において公知の手段によって測定されてよい。エキソソームなどの循環EVは、生物学的試料、例えば血液、血清、血漿、尿、またはリンパ液で評価されてよい。試料中のEVの存在量は、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、または抑制種（例えばPD-L1）の検出と組み合わせた沈殿試薬、例えば抑制分子に対する蛍光抗体、例えば蛍光標識抗体の検出のためのハイスループット定量的顕微鏡技術、ELISAなどの方法で評価されてよい。抑制分子、例えばPD-L1の抑制能力および／または存在量は、標識抗体、機能アッセイ、または当技術分野において公知の他の手段によって評価されてよい。例えば、当技術分野において公知であり、本明細書の実施例に記載されるRaji-Jurkat T細胞活性化アッセイ。抑制性EV、例えばPD-L1含有エキソソームの量が、そのような癌および対象の種類について確立された、選択されたカットオフ閾値を超える場合、対象は高レベルの全身抑制を有すると決定される。

抑制性EV定量化
本明細書および他の場所で開示された結果は、PD-L1含有エキソソームなどの抑制性EVが癌細胞によって利用され、免疫系を回避することを実証する。したがって、抑制性EVを追跡および定量化する方法が必要である。有利なことに、本開示の発明者らは、抑制性EVを可視化および定量化するためのツールおよび方法を開発した。

本発明のEV定量化ツールは、融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、レポーター部分に融合したEV関連分子を含む。融合タンパク質は、癌細胞で発現されてよく、レポーター標識産物は、EV中へ搭載されてEV内に分泌され、EVの膜上および／またはEVのカーゴ内のいずれかに提示される。

一つの態様において、融合タンパク質は、エキソソームで見出される任意のタンパク質を含んでよい。例えば、一般的なエキソソームマーカーは、CD63、CD81、CD9、TSG101、HRS、ALIX、または癌細胞によって放出されるエキソソームに共通する他の種を含んでよい。別の実装形態において、標識された種は、抑制性エキソソームで発現される免疫抑制タンパク質、例えばPD-L1、PD-1、CTLA-4 PD-1、PDL2、LAG3、TIM3、CD47、CD155、CD80、Gal-9、およびMHCクラスI/II抗原、または他の免疫抑制種を含む。

一つの態様において、融合タンパク質は、抑制性微小胞の可視化に使用され、融合タンパク質のEV関連種は、微小胞で見出される任意のタンパク質を含んでよい。

レポーター部分は、EV関連タンパク質との融合産物中で生産され得る任意のタンパク質レポーター種、例えば、そのようなタンパク質のc-またはn-末端に接合しているものを含む。レポーターは、GFP、YFP、または当技術分野において公知の他の蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を含んでよい。レポーターは、ルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ酵素などの生物発光レポーター、または当技術分野において公知の他の酵素レポーターなどの酵素レポーターを含んでよい。

融合タンパク質の発現は、当技術分野において公知の方法によって、それをコードする対応する核酸構築物により、癌細胞株へ操作されてよい。融合タンパク質は、構成的レポーターなどの適したプロモーターの制御下で発現されてよい。融合産物は、引き続いて癌細胞で発現され、EVにパッケージングされ、細胞外環境に放出される。形質転換された癌細胞は、インビトロで培養されてよいか、または例えば試験動物における腫瘍同種移植片もしくは異種移植片などの生きている動物に移植されてよい。一つの態様において、腫瘍を生じさせる特定の細胞型における融合タンパク質の発現は、生物全体に操作され、癌が発生した場合、癌によって生産されるエキソソームレポーター融合タンパク質は、発現された融合タンパク質を含む。

ヒトおよび非ヒト癌細胞株などの、任意の種類の癌細胞を形質転換して、本発明の融合タンパク質を発現させてよい。一つの態様において、融合タンパク質は、前立腺癌細胞株で発現される。一つの態様において、前立腺癌細胞株は、PC3、SK-MEL 28、DU145、またはTRAMP細胞株を含む。使用してよいさらなる細胞株は、当技術分野において公知であるように、NCI60細胞株を含む。

様々な態様において、本発明の範囲は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質自体、融合タンパク質を発現する細胞、および融合タンパク質を含むEVを包含する。

本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質の可視化または定量化によって抑制性EVの追跡および／または定量化を可能にする。そのような可視化または定量化は、試料中で実行される。一つの態様において、融合タンパク質は培養細胞で発現され、試料は成長培地または細胞培養浸出液を含む。一つの態様において、本発明の融合タンパク質は、同種移植または異種移植された癌細胞、または癌細胞において融合タンパク質を発現する動物で発現される。そのような態様において、試料は血液、血漿、リンパ液、もしくはリンパ節などの免疫区画組織、または腫瘍生検材料を含んでよい。一つの態様において、試料は組織切片である。

抑制性EVの存在および／または存在量は、場合によっては、蛍光顕微鏡法または生物発光アッセイなどによる、レポーターの可視化および／または定量化のための適したアッセイを使用することによって観察できる。

一つの実装形態において、抑制性エキソソームの融合タンパク質バイオマーカーは、抑制性エキソソームの形成、放出、または活性を阻害する作用物質の同定または最適化のためのスクリーニングプロトコルにおいて評価される。別の実装形態において、動物全体で、融合タンパク質は、例えばリンパ系における抑制性エキソソームの輸送および分布の追跡に利用される。

免疫抑制剤としての抑制性EV
循環PD-L1エキソソームの観察された免疫抑制特性に基づいて、本開示の発明者らは、対象における免疫過程の全身抑制のための組成物および方法を開発した。本明細書に開示される、癌細胞によって生産される循環抑制性EVの抑制効果は、免疫活性に関連する状態の治療に役立てることができる。本明細書において治療的抑制性EVと呼ばれる外因的に生産された抑制性EVは、免疫系の全身性下方制御を促進するか、または免疫関連状態を治療するために対象に投与できる。本明細書で使用される場合、免疫関連状態は、炎症状態もしくは自己免疫状態、または例えば移植物の受容に関連する免疫抑制の必要性などの、免疫抑制の必要性を含む。

一つの態様において、炎症または自己免疫状態は、関節炎（例えば、関節リウマチ）、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、狼瘡、自己免疫性ブドウ膜炎、I型糖尿病、気管支喘息、狼瘡、網膜炎、膵炎、心筋症、心膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、肺炎、食道炎、胃炎、十二指腸炎、回腸炎、髄膜炎、脳炎、脳脊髄炎、横断性骨髄炎、膀胱炎、尿道炎、粘膜炎、リンパ節炎、皮膚炎、肝炎、骨髄炎、乾癬、強皮症、皮膚筋炎、表皮水疱症、および水疱性類天疱瘡からなる群より選択される。

免疫抑制の必要性に関して、必要性は、移植物の受容の前または後に対象に適用可能であってよく、移植物は任意の移植片、例えば臓器、組織、細胞、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚、角膜、腸、膵臓、四肢、指、骨、靭帯、軟骨、および腱からなる群より選択される移植片を含んでよい。

一つの局面において、本発明の範囲は、免疫関連状態の治療に使用するための治療的免疫抑制性EVを包含する。治療的免疫抑制性EVは、1つまたは複数の免疫抑制分子を含有するEVを含んでよい。免疫抑制性EVは、免疫関連状態の治療を必要とする対象へ治療的有効量が投与される。一つの態様において、本発明の範囲は、免疫関連状態の治療のための医薬の製造における治療的免疫抑制性EVの使用を包含する。

本発明の治療的抑制性EVは、1つまたは複数の免疫抑制分子を含む。免疫抑制分子は、EV膜および／またはEVカーゴに存在してよい。第一の態様において、1つまたは複数の免疫抑制分子は、1つまたは複数の免疫チェックポイント分子を含む。一つの態様において、1つまたは複数の免疫抑制分子はPD-L1を含み、そのようなものは治療的PD-L1エキソソームと呼ばれる。他の態様において、1つまたは複数の免疫抑制分子は、例えばPD-1、PD-2、アデノシンA2A受容体、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA、CTLA-4、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、リンパ球活性化遺伝子-3、NOX-2、PD-1、TIM-3、またはT細胞活性化のVドメインIgサプレッサーを含んでよい。

他の態様において、1つまたは複数の免疫抑制分子は、免疫抑制ペプチド、例えばアンタミド、コルテリンA、シクロスポリンA、ジデムニンA/B、FK506（トラクロリムス）、アスコマイシン（ピメクロリムス、SDZ ASM 981）、ホモフィミン、ゲオジアモリドH、ヒメニスタチン、カリブドトキシンI、クルカシクリンB、シクロリノペプチドA/Bイベリオトキシン、カラタB1、マガトキシン、およびカリオトキシンを含んでよい。

一つの態様において、免疫抑制分子は、免疫反応に関係する受容体を不活性化する抗体またはその断片を含んでよい。一つの態様において、免疫抑制分子は小分子免疫抑制薬物またはステロイドを含んでよい。

一つの態様において、EVは、その表面に結合部分を見せるように操作され、免疫抑制薬物または他の組成物による分泌後の機能化を可能にする。EVを機能化する例示的な方法は、Smyth et al., 2014, Surface Functionalization of Exosomes Using Click Chemistry, Bioconjug Chem 25:1777-1784に記載されている。

1つまたは複数の免疫抑制分子、例えばPD-L1は、任意の生物学的有効量、例えば、数十個、数百個、数千個（例えば、小胞あたり少なくともまたは10,000個まで、少なくともまたは50,000個まで、少なくともまたは100,000個までの免疫抑制分子）、数百万個（例えば、小胞あたり少なくともまたは1千万個まで、少なくともまたは2千万個まで、少なくともまたは5千万個まで、少なくともまたは7千5百万個まで、少なくともまたは1億個まで、または少なくともまたは5億個までの免疫抑制分子）、または数十億個（例えば、小胞あたり少なくともまたは10億個まで、少なくともまたは50億個まで、少なくともまたは100億個までの免疫抑制分子）で存在してよい。

タンパク質（例えばPD-L1）を含む免疫抑制分子の場合、タンパク質は、野生型タンパク質を含んでよいか、または変異もしくは操作されたタンパク質、または例えば活性な細胞外ドメインを含む、生物学的に活性なタンパク質断片もしくは融合タンパク質を含んでよい。

本発明の抑制性EVは、抑制分子を見せるおよび／または保有することができ、かつ1つまたは複数の免疫反応の下方制御または阻害を促進できる任意の細胞外小胞を包含する。第一の態様において、EVは、細胞内で生産されるEVであるエキソソームを含む。第二の態様においては、EVは、原形質膜から生産され、出芽した微小胞を含む。代替の態様において、EVは合成小胞である。

治療的免疫抑制性EVは任意のサイズであってよく、例えば10nm〜200μmの範囲内であってよい。一つの態様において、免疫抑制性エキソソームは、エキソソームが投与される対象の細胞に由来する。別の態様において、免疫抑制性エキソソームは、別の対象の細胞に由来する包括的または普遍的エキソソームであって、包括的エキソソームは非免疫原性であり、それらが投与される対象と適合する。

EV、例えばエキソソームの生産は、培養細胞、例えば治療的抑制性EVが投与される対象に由来する自己細胞の使用により達成されてよい。培養細胞は、当技術分野において公知の手段により、培養細胞により生産されるエキソソームまたは他のEVにパッケージングされる1つまたは複数の免疫抑制分子を発現するように遺伝的に形質転換されてよい。例えば、エキソソーム上でPD-L1を発現するように操作された細胞を利用してよい。培養細胞によって生産された抑制性EVは、当技術分野において公知の手段により、例えば細胞培養液体培地の収集、続いて濾過、遠心分離、または当技術分野において公知の他のEV単離工程により採集されてよい。

カスタマイズされたEVの生産は、当技術分野において公知である。治療的抑制性EVの例示的な供給源は、例えば培養細胞、例えば培養ヒト細胞、例えば培養ヒト癌細胞を含む。治療的抑制性EVのさらなる例示的な供給源は、Li et al., Exosomal cargo-loading and synthetic exosome-mimics as potential therapeutic tools, Acta Pharmacologica Sinica volume 39, pages 542-551 (2018)；Kooijmans et al., Exosome mimetics: a novel class of drug delivery systems, Int J Nanomedicine, 2012; 7: 1525-1541；Conlan et al., Exosomes as Reconfigurable Therapeutic Systems, Trends Mol Med 23:636-650 (2017)；Wuらによる「Methods and systems for processing exosomes」と題された米国特許第9,480,714号；DelCayreおよびLePeqによる「Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes」と題された米国特許第7,704,964号；ならびにTerOvanesyanらによる「Exosomes and uses thereof」と題されたPCT国際特許出願第WO 2016172598号に記載されている組成物を含んでよい。

本発明の一般的な治療方法は以下の通りである：
以下を含む、免疫抑制治療を必要とする対象の免疫系を抑制する方法、
1つまたは複数の免疫抑制分子を含有する治療的有効量の抑制性EVの対象への投与。

対象は、免疫関連状態、例えば自己免疫障害、例えば関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎、狼瘡、進行性全身性強皮症、混合性結合組織病および抗リン脂質症候群、多発性硬化症、ならびに糖尿病などの自己免疫障害を患っていてよい。対象は、移植片もしくは移植物を受容しようとしているか、または受容した、例えば拒絶、例えば移植前または移植後の免疫抑制、維持抑制を予防するために、または急性拒絶過程を治療するために投与されている対象であってよい。例示的な移植物は、腎臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚移植片、血管、および当技術分野において公知の他の移植片を含む。一つの態様において、対象は、慢性炎症状態を患っている対象である。

治療的免疫抑制性EVは、当技術分野において公知の方法によって測定されるように、免疫機能の測定可能な抑制を生産する任意の投与量で投与されてよい。免疫機能の抑制は、例えば1つまたは複数の選択された免疫反応の抑制、1つまたは複数の免疫細胞活性の阻害、1つまたは複数の炎症過程の低減または消失、免疫細胞数の調整（例えば、絶対数または相対数）、T細胞のプライミングの阻害、または任意のPD-L1媒介性過程の促進を含む。

治療的抑制性エキソソームは、任意の投与量、例えば1ng〜200mgのエキソソーム（タンパク質含有量または総エキソソーム質量による測定として）、例えば、少なくとも10ng、少なくとも100ng、少なくとも1μg、少なくとも10μg、少なくとも100μg、少なくとも1mg、または少なくとも10mgで投与されてよい。例えば、一つの実装形態において、平均70kgのヒトに対して2〜20mgの投与量のエキソソームを投与してよい。

あるいは、投与量は、1投与あたり、供給源の細胞により生産される1日あたりのエキソソームとして、例えば1日あたり百万〜5百億細胞により生産される、例えば1日あたり約1千万、2千万、5千万、1億、5億、10億、100億、または500億細胞により生産されるエキソソーム、例えば1日あたり50億〜500億細胞のエキソソーム生産量として表現されてよい。

投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または投与されたエキソソームを対象の免疫細胞に曝露する任意の他の手段によるものであってよい。全身抑制のために、循環系またはリンパ系への投与を採用してよい。局所的な抑制のために、標的領域への投与を採用してよい。

例示的な態様において：本発明の範囲は、免疫関連状態を治療する方法で使用するための外因的に生産された抑制性EVを包含する。一つの態様において、外因的に生産された抑制性EVは、PD-L1を含むエキソソームである。一つの態様において、本発明は、自己免疫障害を治療する方法で使用するための抑制性EVを包含する。一つの態様において、本発明は、移植拒絶を予防または治療する方法で使用するための抑制性EVを包含する。本発明の範囲は、抑制性エキソソーム、例えばPD-L1含有エキソソームの使用により免疫抑制医薬を作製する方法をさらに包含する。

別の局面において、本発明の範囲は、免疫関連状態の治療に使用するための医薬組成物であって、1つまたは複数の抑制分子、例えばPD-L1を含む治療的抑制性EV（例えばエキソソーム）を含む医薬組成物を包含する。医薬組成物は、緩衝剤、防腐剤、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの薬学的に許容される担体、ならびに治療的エキソソームの保存および送達を促進する他の薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。一つの態様において、医薬組成物は液体である。一つの態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末または乾燥製剤を含む。

本明細書で引用されたすべての特許、特許出願、および出版物は、あたかも各々の独立した特許出願または出版物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。開示された態様は、限定ではなく例示の目的で提示されている。本発明は、その説明された態様を参照して説明されているが、本発明全体としての精神および範囲から逸脱することなく、本発明の構造および要素に変更を加えることができることは当業者に理解される。

実施例1．抑制性エキソソームの阻害
本明細書に開示されるのは、免疫チェックポイントの提示を調節する新規経路である。特に、免疫チェックポイントリガンドPD-L1は、細胞の原形質膜上におけるその公知の提示とともにエキソソーム上に提示されることができ、例えば本明細書に開示されるように、エキソソームは、前立腺癌細胞株PC3におけるPD-L1提示の主要な源である。エキソソームは細胞によって放出される小さい小胞であり、細胞とは異なり、体全体にわたって長い距離を移動できる。したがって、PD-L1のエキソソーム上における提示は、腫瘍床の局所だけでなく遠位でも免疫抑制という結果になり、その潜在的効力を大幅に増加させることができる。エキソソームの生合成を調節する酵素を遺伝的に標的とすることにより、PD-L1のエキソソーム提示は、インビトロおよびインビボでほとんど遮断された。前立腺癌のインビボモデルでは、エキソソームPD-L1を遮断すると、腫瘍の進行が抑制され、生存が増加した。重要なことに、このモデルは以前にPD-L1の抗体遮断に抵抗性があることが示され、現在の治療戦略ではこの決定的な免疫チェックポイント調節因子を完全には阻害できないことが証明されている。PD-L1のエキソソーム提示を抑制することが現在の治療と直交することを考慮すると、その調整は単独で機能するだけでなく、現在の免疫チェックポイント療法と協調して作用する可能性がある。

本明細書に提示される証拠は、Rab27aまたはnSMase2のいずれかの欠失により、腫瘍細胞からのPD-L1の分泌が遮断され、インビボにおける腫瘍の進行が抑制されることを示す。エキソソーム生産およびPD-L1分泌の両方のためのハイスループット細胞アッセイも本明細書に開示されている。

PD-1-PD-L1経路は、腫瘍床内で機能して悪性細胞の免疫攻撃を抑制すると一般に考えられている。特に、悪性細胞はその表面上でPD-L1を上方制御し、次に細胞溶解性T細胞上のPD-1受容体と相互作用する。この相互作用によりT細胞の活性化および増殖が遮断され、それにより腫瘍細胞のT細胞による殺傷が抑制される。PD-L1は抗原提示細胞上にも見出され、同様にT細胞活性化を抑制する。本分野においては、以前はPD-L1の細胞表面提示に焦点が当てられていたが、本明細書ではPD-L1の大部分がエキソソームと呼ばれる小さい小胞中で細胞から分泌されることを開示する。エキソソームの表面上のPD-L1は、細胞表面PD-L1と同様にT細胞を抑制することができる。しかしながら、エキソソームは細胞から遠くへ移動することができ、腫瘍自体および体全体にわたっても、両方でより広範な抑制を誘導し、全身的な免疫不全状態を潜在的に誘導できる。したがって、PD-L1のエキソソーム提示は、腫瘍細胞の表面上で見出されるPD-L1よりも、癌に対する体の反応に対してはるかに大幅な影響を及ぼす可能性がある。

エキソソームは、細胞内で注意深く演出された過程に起因する。細胞の原形質膜は、エンドサイトーシスと呼ばれる内部の挟む過程を体験する。結果として生じるエンドソームは、次に膜にリサイクルされるか、または後期エンドソームに成熟するかのいずれかが可能である。後期エンドソームへの成熟過程の間に、周囲の（または限界）膜が内部で挟み、腔内小胞と呼ばれる小さい小胞を形成する。結果として生じる後期エンドソームは複数の腔内小胞を保有するため、多小胞体（MVB）と呼ばれる。MVBは、リソソームと融合してその内容物の分解という結果になるか、または原形質膜と融合して、次にエキソソームと名付けられる内部小胞の放出という結果になるかのいずれかが可能である。本明細書で実証されるように、腫瘍細胞はこの生合成過程を使用して、原形質膜結合PD-L1をエキソソームの表面に輸送できる。nSMase2およびRab27aなどの多数の酵素がエキソソーム生合成経路で同定されている。これらの酵素をコードする遺伝子を欠失させることにより、エキソソームPD-L1の分泌が遮断される（図4）。さらに、前立腺癌の同系マウスモデルを使用して、PD-L1、Rab27a、nSMase2をコードする遺伝子のいずれかを欠失させると、腫瘍成長が劇的に抑制され、長期生存が延長されることが観察された（図2Aおよび2B）。注目すべきことに、この腫瘍モデルは、既存の抗PD-L1抗体遮断療法に抵抗性があることが以前に示されている。これらのデータは、エキソソームPD-L1が腫瘍細胞の免疫破壊を抑制するのに効果があり、現在の抗PD-L1療法に抵抗性があることを実証する。したがって、抗エキソソームPD-L1療法は、PD-L1遮断の効率および治療に対する腫瘍の反応を増加させる。
エキソソーム生合成の2つの公知の調節因子nSMase2およびRab27aを欠失させるとPD-L1の分泌が遮断されることが本明細書において実証されている。

エキソソームの追跡および定量化
エキソソーム生産を定量的に査定するために、PC3細胞株にCD63-GFP導入遺伝子を形質導入した。ナノ粒子トラッカーを使用して、培養細胞の培地へ放出された小胞のサイズおよび蛍光を同時に測定した。この解析により、Rab27aおよびnSMase2ノックアウト細胞の両方から分泌されるGFP＋エキソソームサイズの粒子の数が劇的に減少することが確認され、2つの酵素の阻害を定量的に測定するこのアプローチの感度および特異性が確認された（図3Aおよび3B）。

上記のように、CD63-GFPツールをNanosightナノ粒子追跡システムと一緒に組み合わせることにより、抗エキソソーム活性について化合物をスクリーニングすることができる。ナノルシフェラーゼ酵素（Nluc）をコードする遺伝子でGFPを置き換えて、同様の構築物を作製した。PD-L1のN末端またはC末端のいずれかに融合したNlucを有する構築物も作製した。WT PC3細胞からのエキソソームへのC-term PD-L1-Nluc融合タンパク質のパッケージングを確認し、システムを検証するためにnSMase2KOおよびRab27aKO細胞株へ構築物を導入した。96ウェルフォーマット中の分泌されたPD-L1-Nlucからルシフェラーゼシグナルが観察され、wtとノックアウト株との間の最大の差異について細胞密度および培養時間を最適化した。細胞数または導入遺伝子発現における任意の違いを補正するために、培地のすべてのルシフェラーゼ測定値を細胞中のルシフェラーゼに対して正規化した。

抗エキソソーム化合物を評価するために、PD-L1-Nluc単独、PD-L1-NlucおよびCD63-Nluc、またはCD63-Nluc単独の抑制を使用してよい。例えば、PD-L1-Nluc単独では、エキソソームの他の機能を改変せずに、PD-L1のエキソソームへの搭載を阻害した。抑制の度合い、最小細胞毒性、他のヒットと共通する化学構造、公知の活性、ならびに予測された薬物動態学および薬力学的特性に基づいてヒットに優先順位を付けてよい。

実施例2．エキソソームで分泌されるPD-L1の抑制は、全身性抗腫瘍免疫および記憶を促進する
要約：
免疫チェックポイントタンパク質PD-L1の抗体遮断は、癌患者のサブセットにおける長期寛解につながる。PD-L1は、その受容体PD-1をエフェクターT細胞に結合させることにより、腫瘍床で作用すると考えられている。ここで説明されているのは、エキソソームの形で腫瘍細胞によって分泌されるPD-L1の代替の役割および感受性である。エキソソームPD-L1を除去すると、抗PD-L1/PD-1抗体に抵抗性のあるモデルにおいてすら腫瘍成長が阻害される。腫瘍から放出されたエキソソームPD-L1は、流入領域リンパ節においてT細胞活性化を抑制した。全身的に導入されたエキソソームPD-L1は、自身を分泌できない腫瘍の成長を救済した。エキソソームPD-L1欠損腫瘍細胞へ曝露すると、同時または何カ月も後に、遠隔部位に注射された野生型腫瘍細胞の成長を抑制した。抗PD-L1抗体は、エキソソームPD-L1遮断と冗長的ではなく付加的に働いて腫瘍成長を抑制した。まとめると、これらの結果は、エキソソームPD-L1を阻害することにより、抑制性EVによって媒介される全身抑制および現在の抗体アプローチに対する抵抗性を克服できることを示す。

EVは不均一である。EVの特定の形態はエキソソームであり、これはエンドサイトーシス経路に由来する。エンドソームが成熟するにつれて、小胞は内部へ出芽し、後期エンドソーム内の小胞内体（intravesicular body）を形成する管腔中に放出される。これらの後期エンドソームは、多胞体（MVB）とも呼ばれる。MVBは、内容物の分解およびリサイクルのためにリソソームと融合するか、または原形質膜と融合して、次にエキソソームと呼ばれる小胞内体を細胞外に放出するかのいずれかが可能である。エキソソームは、そのサイズ、形態、密度、マーカー発現、およびそれらの生合成のための特定の酵素への依存性に基づいて、他のEVと区別できる。それらの生合成における鍵となる酵素は、小胞内小胞の出芽を促進するNSMASE2およびMVBの原形質膜への融合に関与するRAB27Aを含む。これらの酵素の遺伝子操作により、インビボにおけるエキソソームの役割を分析する機会が提供される。

上記のように、癌細胞は、それらの細胞表面にPD-L1を提示するというよりは、それらのPD-L1の大部分をエキソソーム内に分泌できることが示されている。Rab27aおよびnSMase2の遺伝子ノックアウトならびに外因的に導入されたエキソソームPD-L1を使用して、腫瘍細胞からのエキソソームPD-L1がインビトロおよびインビボでT細胞機能を抑制し、免疫依存的に腫瘍成長を促進することが実証された。そのような療法に反応性でない前立腺癌の同系モデルは、その成長についてPD-L1およびエキソソームの両方に依存しているため、エキソソームPD-L1は抗PD-L1/PD-1に抵抗性があるようである。注目すべきことに、エキソソームPD-L1を欠損した癌細胞が過渡的に存在してすら、癌に対する長期の全身性免疫という結果になる。エキソソームPD-L1の役割は、同系結腸直腸モデルでも見られる。このモデルでは、抗PD-L1はPD-L1分泌の抑制と、冗長的ではなく付加的に作用する。これらの結果は、癌療法への免疫療法アプローチに重要な意義を有する。

癌細胞株間のPD-L1の差次的分泌
前立腺癌細胞株および原発性前立腺腫瘍組織では、表面PD-L1レベルが低いことが報告されており、抗PD-L1遮断に対する治療反応の一般的な欠落を潜在的に説明する。転写、転写後、翻訳、または翻訳後の機構がレベル低減の根底にあるかどうかを決定するために、前立腺癌細胞株（P3、DU145、LNCaP）を黒色腫細胞株（SK-MEL-28）と比較した。mRNAおよびタンパク質レベルの測定値は、異なる癌細胞株にわたって、mRNAとタンパク質レベルとの間で不一致を示した。逆転写酵素定量的PCR（RT-qPCR）により、SK-MEL-28と比較してPC3およびDU145でPd-l1 mRNAレベルが15倍増加したことが示された。LNCaPでは、転写産物がほとんどないことが示された。mRNAレベルとは対照的に、ウェスタン解析では、PC3およびDU145細胞でSK-MEL-28と同様の細胞PD-L1タンパク質レベルが示された。LNCaP細胞では、タンパク質は検出できなかった。PC3とSK-MEL-28との間のmRNAおよびタンパク質レベルの不一致が、タンパク質翻訳の違いによって説明できるかどうかを探求した。高い翻訳速度を反映する多くのリボソームに結合された転写産物が、低い翻訳速度を反映する1つまたは少数のリボソームに結合された転写産物から分離される方法である、ポリソームプロファイリングによって翻訳速度を決定した。2つの集団をショ糖勾配で分離し、次に結合したmRNAをRT-qPCRで測定した。この解析により、PC3およびSK-MEL-28の画分にわたってPd-l1 RNAの均等な分布が示された。したがって、株間のmRNAとタンパク質レベルと間の不一致は、翻訳速度の違いでは説明できない。

次に、タンパク質分解における潜在的な違いを査定した。タンパク質分解の2つの主な経路はリソソームおよびプロテアソームである。小分子バファロマイシンA1（BafA1）は、V-ATPase水素ポンプ、すなわちリソソームの酸性化を遮断することでリソソーム活性を阻害する。リソソームの公知の標的であるタンパク質LC3Bの増加により、PC3およびSK-MEL-28細胞に対する小分子の効き目が確認された。しかしながら、両株におけるPD-L1のレベルは改変されておらず、これらの細胞においてリソソームによるPD-L1の代謝回転がほとんどないことを暗示した。小分子MG132は、26sプロテアソーム複合体を遮断することによりプロテアソーム活性を抑制し、結果としてタンパク質分解を抑制する。プロテアソームは、その標的上のユビキチン側鎖を認識する。ユビキチン化タンパク質の存在の増加により、2つの細胞株に対するMG132の効き目が確認された。再度、PD-L1タンパク質レベルには最小限の影響が与えられたにもかかわらず、どちらかと言えば、PD-L1レベルはSK-MEL-28においてわずかに上昇したが、PC3細胞では上昇しなかったため、2つの株の違いは予想とは逆であった。これらの結果は、mRNAおよびタンパク質レベルの不一致が、タンパク質の安定性の違いによって説明されないことを示す。

次に、PD-L1が膜小胞の形で細胞から差次的に分泌されるかもしれないという可能性を検討した。細胞外小胞は、最後に100,000×重力（100k g）でペレット化する前に、増加する重力を通して上清を移動させる連続的な遠心分離を使用して細胞の破片およびアポトーシス小体を除去することで濃縮できる。ウェスタン解析により、SK-MEL-28細胞と比較してPC3細胞の100k g画分で2倍から3倍多いPD-L1が示された。この違いは、小胞ごとにより多くのPD-L1が搭載されているか、またはより多くの小胞の放出が原因であり得た。ナノ粒子追跡器具は、ブラウン運動の下で移動する粒子からの光の回折を使用して、小胞のサイズおよび数を追跡できる。2つの細胞型からの馴化培地の解析により、均等な総小胞計数が示された。したがって、PC3およびSK-MEL-28細胞が同様の細胞PD-L1タンパク質レベルを有していたとしてすら、PC3細胞はより多くの量のPD-L1を細胞外小胞へパッケージングした。この違いが、2つの細胞株間のmRNAとタンパク質レベルと間の不一致の根底にあるようである。

インビボでは、腫瘍細胞は、腫瘍床内の細胞傷害性Tリンパ球により放出されるインターフェロン-ガンマ（IFNγ）に反応してPD-L1を上方制御することにより適応抵抗を媒介できる。したがって、細胞PD-L1の上方制御に加えて、IFNγがPD-L1の分泌を増加させるかもしれないかどうかを探求した。IFNγで癌細胞を処理すると、細胞画分および100k g画分の両方においてPD-L1の増加につながった。増加は、2つの画分間で相対的に同様であり、PD-L1分泌に対するIFNγの直接的な影響力がないことを示唆した。さらに、IFNγは分泌される小胞の数を増加させなかった。したがって、細胞表面膜PD-L1と同様に、細胞外小胞PD-L1はIFNγに反応して増加した。

PD-L1は、エキソソーム内で特異的に分泌される
細胞外小胞は、サイズ、密度、タンパク質マーカー、および生合成が異なる複数の形態で提供される。PD-L1が細胞の表面からエンドサイトーシスされることを考慮すると、PD-L1はエキソソームの形で特異的に分泌されていると仮定された。エキソソームは、粗製の100k gペレットをショ糖勾配で回転させることにより、それらの密度に基づいて、他の小胞と比較して濃縮させることができる。エキソソームマーカーCD63は20〜40％のショ糖画分に移動した。PD-L1およびさらなるエキソソームマーカーHRSはCD63と共局在した。これらのデータは、PD-L1がエキソソームにパッケージングされることを支持する。

次に、PD-L1がエキソソームで特異的に見出されるかどうかを決定するために、エキソソームを除去する遺伝的アプローチを利用した。CRISPR/Cas9媒介性突然変異誘発を使用して、PC3細胞においてRab27aおよびnSMase2遺伝子をノックアウトした。これら2つの遺伝子の欠失は、PC3細胞の増殖に変化をもたらさなかった。エキソソームを追跡するために、3つの遺伝的背景においてCD63-GFPを異所的に発現させた。馴化培地の測定値は、WTに対して2つの変異株に起因するCD63-GFP＋粒子が概ね完全に存在しないことを示した。エキソソームに対するRab27aおよびnSMase2の欠失の効果をさらに査定するために、ショ糖勾配濃縮粒子に対して電子顕微鏡法を実行した。結果として得られた画像は、Rab27aおよびnSMase2 null試料においてエキソソーム様粒子がほとんどなく、Rab27a null細胞での喪失がより大きいことを示した。これらの画像と一致して、ウェスタン解析により、Rab27a null細胞からの100K g前処理物には内因的なCD63が存在せず、nSMase2 null細胞には少量残っていることが示された。CD63レベルと対照的に、nSMase2では完全に存在しないことが示された一方で、Rab27a null細胞では100K g画分においてPD-L1の劇的な低減が示された。この違いは、Pd-l1転写におけるNSMASE2のさらなる役割が原因のようである。まとめると、これらのデータは、エキソソーム生合成およびPD-L1分泌におけるRab27aおよびnSMase2の両方の決定的な役割を示す。

PD-L1が膜貫通タンパク質であることを考慮すると、エキソソームPD-L1は後期エンドソームの限界膜に起因しなければならない。後期エンドソームの限界膜は、最初に原形質膜のエンドサイトーシスから発生する。しかしながら、結果として生じるエンドソームが成熟するにつれて、ERおよびゴルジ体ならびに細胞質から直接提供される材料が追加される。フローサイトメトリーおよび免疫蛍光法により、PC3細胞の内部の表面および小胞様構造内の両方にPD-L1の存在が示された。標準的な細胞分画技術を使用すると、PD-L1およびCD63は、ショ糖の軽量画分またはエンドリソソーム画分に共局在した。エキソソームPD-L1がERまたは初期ゴルジ体に直接起因するかどうかを決定するために、PD-L1がグリコシル化されているという事実を活用した。このグリコシル化は、それがN結合型オリゴ糖鎖であることと一致して、アミダーゼPNGaseFで簡単に除去される。対照的に、細胞PD-L1の大部分およびすべてのエキソソームPD-L1は、遠位ゴルジ体におけるオリゴ糖鎖の成熟と一致して、EndoH開裂に抵抗性であった。したがって、エキソソームPD-L1は、ERまたは初期ゴルジ体から直接にはもたらされないようである。原形質膜を供給源として測定するために、細胞表面ビオチン化アッセイを実行した。ビオチン標識PD-L1は、細胞および処理された細胞のエキソソームで見出され、PC3細胞の表面がエキソソームPD-L1の起源であることを示した。

エキソソームPD-L1はT細胞活性化を抑制する
次に、エキソソームPD-L1がT細胞活性化の抑制において細胞表面PD-L1と同様に機能できるかを探求した。当技術分野において公知なように、PD-L1の機能は、Jurkat T細胞に対する抗原のRaji B細胞提示の状況においてインビトロで測定できる。普通は、この提示はT細胞を活性化し、これはインターロイキン-2（IL-2）の分泌によって測定できる。しかしながら、PD-L1がRaji B細胞で外因的に発現され、PD-1がJurkat T細胞で外因的に発現される場合、T細胞活性化は抑制される（図1）。この状況で、PC3細胞からのエキソソームPD-L1が、Raji B細胞上のPD-L1の外因的発現を置き換えることができるかどうかを探求した。予想されたように、Raji B細胞におけるPD-L1の外因的発現がない場合は、IL-2分泌は高かった。しかしながら、PC3 100K g細胞外画分の導入によりIL-2分泌が再度抑えられ、PC3小胞がRaji細胞PD-L1発現を置き換えられることが示された。エキソソームPD-L1がこの効果の原因であるかどうかを決定するために、CRISPR/Cas9編集を使用して、PC3細胞においてPd-l1遺伝子を欠失させた。Pd-l1遺伝子の欠失は、PC3細胞の増殖に否定的な結果を有さず、放出された小胞の数も改変しなかった。しかしながら、Pd-l1 null PC3 100K g細胞外画分の導入によって、IL2分泌は抑えられなかった。これらのデータは、エキソソームPD-L1がインビトロでT細胞活性化を抑制するように機能することを示す。

エキソソームPD-L1は腫瘍の進行を促進する
インビトロでT細胞活性化を抑制する能力を考慮して、エキソソームPD-L1がインビボで機能して腫瘍の進行を促進できるかどうかを探求した。前立腺癌の同系モデルであるTRAMPモデルを採用した。この前臨床モデルは、ヒト前立腺癌に似て、抗PD-L1抗PD-1遮断に抵抗性があることが知られている。CRISPR/Cas9を媒介してRab27aおよびPd-l1を欠失させると、EV画分におけるPD-L1の喪失という結果になった。Rab27aの喪失は、細胞表面PD-L1レベルに影響せず、Pd-l1の喪失もエキソソーム生産に影響しなかった。PC3細胞に似て、Rab27aまたはPd-l1の欠失は細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。wt、Rab27a null、Pd-l1 null TRAMP細胞をC57BL6/j同系マウスの脇腹に注射し、4カ月間を超えて追跡した。WT TRAMP細胞を注射したすべてのマウスは、およそ35日までに目に見える腫瘍を有し、40〜71日の間に安楽死させなければならなかった。対照的に、Rab27a nullまたはPd-l1 null TRAMP細胞を注射したすべてのマウスは、同じ期間の間に腫瘍成長を示さなかった（図2A）。同様に、Rab27aおよびPd-l1 null TRAMP細胞を注射したマウスは、それらの野生型の対応物と比較して劇的に延長された寿命を示した（図2B）。実際、大部分のマウスは90日後も依然として生存しており、その時点で以下に説明する記憶実験に使用された。

Rab27aの喪失が、エキソソーム生合成におけるその役割を通して腫瘍成長を遮断していたことをさらに確認するために、nSMase2 null細胞を使用して実験を繰り返した。CRISPR/Cas9媒介性突然変異誘発を使用してnSMase2を再度欠失させた。PC3と同様に、nSMase2 null TRAMP細胞はPD-L1の細胞および細胞外レベルの両方において減少を示した。これらの細胞を同系マウスに注射し、それらのWT対応物と比較した。Rab27a null TRAMP細胞と同様に、nSMase2 null TRAMP細胞は、WT細胞を受容したマウスを安楽死させなければならなかった期間の間に、触知可能な腫瘍を形成しなかった（図4A）。再度、大部分のマウス（10匹中8匹）は90日後もまだ生存していた。まとめると、これらのデータは、エキソソーム生合成またはPD-L1において重要な因子を除去することにより、極めて同様の腫瘍成長抑制表現型という結果になることを示す。

エキソソーム生物発生因子が、抗腫瘍免疫反応を介して腫瘍成長を抑制するためにエキソソームPD-L1を介して非自律的に細胞に作用しているというよりは、腫瘍成長を抑制するために自律的に細胞に作用しているということは、依然としてもっともらしく思われる。これらの代替的な可能性を区別するために、Rab27aおよび／またはnSMase2の喪失の効果が能動免疫系に依存するかどうかを探求した。WT、Rab27a、nSMase2、およびPd-l1 null TRAMP細胞をNOD-scid NSG免疫不全マウスに注射した。免疫応答性マウスで見られた結果とは著しく対照的に、免疫不全の背景において、4つの株は同一の割合で末期腫瘍につながった。したがって、RAB27AおよびNSMASE2は、PD-L1と似て、免疫系の抑制を通して腫瘍成長を促進している。

エキソソームPD-L1は、流入領域リンパ節におけるT細胞のプライミングを抑制する
次に、エキソソームおよびPD-L1の喪失が腫瘍に対する免疫反応に同様の効果を有するかどうかを探求した。この問題に対処するために、wt、Rab27a null、およびPd-l1 null TRAMP細胞の注射に続いて、リンパ組織における免疫反応を測定した。14日目には、いずれかの変異細胞株を注射したマウスの脾臓は、WT細胞を注射したものよりも有意に大きかった（図5A）。脾臓の免疫表現型検査により、3つの遺伝子型にわたって均等な割合のCD8、CD4、および調節性T細胞が示された（図5B〜5D）。これらのデータは、エキソソームまたはPD-L1が存在しない場合の全身的な全身性免疫反応の増強と一致している。対照的に、流入領域リンパ節の免疫表現型検査は、WTと変異動物との間で著しい違いを示した（図5E〜5J）。CD8陽性細胞は、2つの変異腫瘍細胞株の注射に続いて、WT株と比較してT細胞のはるかに大きい画分を構成した。変異体ではCD4の画分が比較的低い一方で、FoxP3＋ T調節性細胞はT細胞の一定の画分を構成した。エキソソームまたはPD-L1が存在しない場合はCD8細胞が相対的に増加することを考慮して、T細胞消耗のマーカーを査定し、CD8およびCD4 T細胞集団内の活性化。PD-1が高かったCD8およびCD4細胞の画分は、変異細胞を受容したマウスで減少傾向にあった。さらにより重要なのは、消耗マーカーTim3を発現する細胞のパーセントの減少および活性化マーカーグランザイムBを発現する細胞のパーセントの増加であった。さらに、増殖マーカーKi67が陽性の細胞の画分は、CD8 T細胞の間で有意に上昇し、CD4 T細胞の間で上昇傾向にあった。これらのデータは、流入領域リンパ節に移動し、T細胞活性化を抑制する、腫瘍由来のエキソソームPD-L1と一致する。

エキソソームがPD-L1を通して作用してT細胞のプライミングを抑制する場合は、エキソソームPD-L1が存在しなければ、免疫応答性マウスは変異腫瘍細胞の即時の成長を抑制するだけでなく、腫瘍細胞に対する記憶も発達させるという仮説が立てられた。この仮説を試験するために、一方の脇腹にRab27aまたはPd-l1 null TRAMP細胞のいずれかを注射したマウスに、90日後にもう一方の脇腹にWT TRAMP細胞を再負荷した。以前にいかなる腫瘍細胞も注射されていない、年齢が一致したマウスを対照として使用した。注目すべきことに、WT TRAMP腫瘍は、以前にいずれかの変異細胞株を注射されたマウスのいずれでも成長しなかったが、年齢が一致した対照では正常な成長を示した（図6）。したがって、エキソソームまたはPD-L1を欠落した腫瘍細胞への曝露は、エキソソームPD-L1を分泌する細胞に対してすら頑強な記憶反応という結果になる。これは、エキソソームPD-L1の非存在下でT細胞がいったんプライミングされると、次にエキソソームPD-L1の抑制効果に抵抗性があるようになることを意味すると解釈された。

エキソソームPD-L1は、異なる腫瘍の種類にわたって成長を促進する
次に、腫瘍の進行に対するエキソソームPD-L1の効果がTRAMPモデルに固有のものであるかが問われた。この問題に対処するために、結腸直腸癌モデルであるMC38が査定された。TRAMPモデルとは異なり、このモデルは抗PD-L1および抗PD-1療法に対する部分的な反応を示す。ウェスタン解析により、TRAMP細胞に似て、MC38細胞はPD-L1を分泌することが示された。それらは、細胞表面上でも低レベルで発現する。TRAMPモデルにおけるのと同一のガイドRNAを使用して、CRISPR/Cas9媒介性突然変異誘発を介してMC38細胞でPd-l1およびRab27aをノックアウトした。Rab27aノックアウト細胞は分泌画分においてPD-L1の喪失を示し、エキソソームにおけるPD-L1のパッケージングが確認された。また、TRAMP細胞と同様に、Rab27aおよびPd-l1ノックアウトMC38細胞は増殖に変化を示さなかった。これらの細胞を同系のWTマウスに注射した。WT MC38腫瘍は急速に成長し、9日目からマウスを安楽死させなければならなかった。Rab27aまたはPd-l1のいずれかの喪失により、腫瘍成長が遅延し、寿命が延長された。しかしながら、TRAMPモデルと異なり、Pd-l1の喪失はRab27aの喪失よりも大きな効果を有するようであった（図7A、7B、および7C）。

Pd-l1対Rab27aの喪失効果の違いにより、エキソソームがPD-L1を通して特異的に作用して腫瘍成長に影響しているかどうかの問題に対処するためのエピスタシスが可能になった。エキソソームがPD-L1の独立した役割を有する場合は、それらを除去するとPd-l1 nullの背景において腫瘍成長がさらに低減され、寿命が延長されるはずである。したがって、我々はRab27a；Pd-l1ダブルノックアウトMC38細胞が作製された。これらの細胞は、Pd-l1単一変異細胞と概ね同一の速度で成長した。したがって、エキソソームは、完全ではないにしても、大部分はそれらのPD-L1の提示を通して機能していると結論できる。

腫瘍成長に対するPd-l1対Rab27aの喪失効果の違いは、エキソソームとは独立したPD-L1のプールがあり、このモデルにおいて免疫反応を抑制するように同様に機能していることも暗示した。エキソソームPD-L1と異なり、このプールは抗PD-L1に感受性であるかもしれないという仮説が立てられた。このプールは、なぜMC38モデルがTRAMPモデルと異なり、抗PD-L1抗体に部分的に反応するかを説明できるであろう。この仮説を試験するために、抗PD-L1単独およびエキソソーム枯渇との組み合わせの生存に対する効果を探求した。Rab27aの喪失と同様に、抗PD-L1抗体でマウスを処理すると生存が延長されたが、Pd-l1の喪失と同じ度合いではなかった（図7C）。注目すべきことに、Rab27aの欠失および抗PD-L1抗体による処理の組み合わせにより、Pd-l1欠失と概ね同一の生存曲線につながる。この結果は、エキソソームPD-L1は抗PD-L1に抵抗性である一方で、このモデルにはおそらく細胞表面PD-L1である別のプールが存在し、どちらも抗腫瘍免疫反応の有意な抑制因子であり、抗体に感受性であるという結論を強く支持する。

エキソソームPD-L1欠損腫瘍細胞は、遠隔部位のWT腫瘍成長を抑制できる
エキソソームは血液およびリンパ系に入り、体全体にわたって移動し、遠隔部位の腫瘍成長に潜在的に影響することができる。同様に、1つの腫瘍部位で学んだ免疫細胞は体全体にわたって移動し、遠隔部位の腫瘍成長に潜在的に影響することができる。したがって、異なる部位にWTおよび変異細胞を同時に注射すると、いずれかの腫瘍の成長に影響を与えるかどうかを探求した。特に、WT腫瘍細胞から放出されたエキソソームPD-L1が遠隔部位で変異細胞の成長を促進できるか、および／または変異細胞によって活性化されたT細胞が遠隔部位でWT細胞の成長を抑制するかを探求した。この問題に対処するために、各マウスの一方の脇腹にWT TRAMP細胞を、もう一方の脇腹にPd-l1、Rab27a、またはnSMase2 null TRAMP細胞を同時に注射した。次に、各脇腹における腫瘍成長を経時的に追跡した。注目すべきことに、これらの二重注射におけるWT腫瘍の成長は、WT細胞単独が注射されたマウスと比較して劇的に低減された（図8A）。遠隔WT腫瘍に対するPd-l1、Rab27a、またはnSMase2 null細胞の効果は同様であった。対照的に、WT細胞はRab27aまたはnSMase2 null細胞の成長にいかなる変化ももたらさなかった（図8B）。しかしながら、WT細胞はPd-l1 null細胞の成長を促進した。腫瘍成長がWT対応物よりもはるかに遅延したため、この効果は小さかった。全体として、二重注射されたマウスは、WT TRAMP細胞単独を受容したものと比較して大幅に延長された生存を示した（図8C）。これらの結果は、変異側の流入領域リンパ節でプライミングされた免疫細胞が、反対側の脇腹のWT腫瘍細胞に移動して攻撃できるという見解を強く支持した。実際に、WT腫瘍の組織学的分析により、反対側の脇腹に変異細胞を同時注射すると、浸潤リンパ球の数が劇的に増加することが示された（図8D）。まとめると、これらのデータは、腫瘍間に情報伝達があり、変異腫瘍の効果がWT腫瘍のものよりも優勢であることを示す。

外因的に導入されたエキソソームPD-L1は、免疫抑制および腫瘍成長を救済できる
外因的に導入された高用量のエキソソームPD-L1が抗腫瘍免疫反応を抑制し、腫瘍成長を促進できるかどうかを探求した。免疫反応への効果に対処するために、Rab27 null TRAMP細胞を同系マウスの脇腹に移植し、続いてそれらのWTまたはPd-l1 null対応物からインビトロで収集されたエキソソームを尾静脈注射した。脾臓サイズが50パーセント近く低減したことによって証明されるように、Pd-l1 null細胞ではなくWTからのエキソソームは全身性免疫抑制を誘導することができた（図12A）。さらに、WTエキソソームは、Rab27a欠損細胞の流入領域リンパ節における免疫反応を抑制することができた（図12B〜12J）。Pd-l1欠損エキソソームと比較して、WTエキソソームはT-reg細胞にほとんど効果を有さずに、CD8/CD4比の低減につながった。さらに重要なことに、それらは高レベルの消耗マーカーPD-1およびTIM3ならびに低レベルの活性化マーカーグラムザイムBを発現する細胞の画分の増加につながった。これらの結果は、Rab27a null細胞に対してWTを移植したマウスで見られた結果と同等であった。腫瘍成長への効果に対処するために、そのより急速な成長という特徴を考慮して、MC38モデルを採用した。TRAMPモデルで見られた免疫抑制と一致して、Pd-l1欠損MC38細胞ではなくWTから収集されたエキソソームの注射により、腫瘍成長が促進され、生存が低減された（図9Aおよび9B）。これらの結果は、抗腫瘍免疫反応を抑制し、したがって腫瘍成長を促進するために、エキソソームがPD-L1を通して機能していることを確認する。

癌免疫付与
抑制性EVを欠落した癌細胞の、常在腫瘍に対する免疫反応を促進する能力が実証された。10⁶個の野生型TRAMP細胞をマウスの一方の脇腹に注射し、35日間成長させたところ、腫瘍塊の形成という結果になった。35日目に、同じマウスは、常在腫瘍と反対側の脇腹にRab27a null、sNmase2 null、PD-L1 null変異TRAMP細胞、または対照媒体の注射を受けた。変異TRAMP細胞を受容しなかったマウスでは、常在腫瘍が積極的に成長し続けた。対照的に、Rab27a、sNmase2、またはPD-L1 null TRAMP細胞を受容したマウスは、実質的により遅延した腫瘍成長（図11A）および生存の向上（図11B）を示した。これらの結果は、抑制分子の生産が正常に機能しない（PD-L1 null）またはEVの生産が正常に機能しない（Rab27a null、sNmase2 null）操作された癌細胞が、常在腫瘍に対して効果がある免疫反応を刺激できることを示す。

議論：
総合すると、これらのデータは、癌細胞が抗腫瘍免疫を回避できるようにするためのエキソソームPD-L1の鍵となる役割を明らかにする。実際、エキソソームPD-L1の存在下では、腫瘍の流入領域リンパ節のT細胞は消耗のマーカーを発現し、脾臓はより小さい。エキソソームの生合成を遺伝的に遮断するか、またはPd-l1を欠失させると、T細胞の活性化、増殖、および殺傷の潜在力が強く促進されることにより、表現型が逆転する。この効果は、外因的にエキソソームPD-L1を導入することによって再度逆転する。したがって、腫瘍エキソソームは流入領域リンパ節に移動する能力を有し、そこでT細胞活性化を阻害するPD-L1を提示する。注目すべきことに、エキソソームPD-L1の放出を遮断すると、局所の腫瘍細胞の成長が抑制されただけでなく、同時にまたは何カ月も後のいずれかに遠隔部位に注射された野生腫瘍細胞も遮断した。したがって、局所のリンパ節でT細胞活性化を可能にすると、エキソソームPD-L1の分泌によってもはや影響を与えられることのない、持続的な全身性免疫反応につながる。最終結果は、罹患したマウスの生存の延長である（図10）。

腫瘍の進行における、エキソソームを含むEVの役割は、多数の状況で提案されてきた。EVは腫瘍抗原を保有することができる。樹状細胞に取り込まれると、これらの抗原が提示され、免疫反応を誘導できる。そのため、EVはもともと抗腫瘍効果を有すると考えられていた。しかしながら、より最近の研究では、多数の免疫抑制効果が示唆されている。例えば、EVは樹状細胞の成熟、NK細胞の機能を阻害し、CD8 T細胞を直接殺傷できる。EVは、腫瘍細胞の方向性のある移動を促進し、腫瘍細胞をリンパ節へ戻し、腫瘍血管の血管新生および漏出を誘導し、さらには転移前のニッチを確立することすらも示されている。これらの様々な機能の背後にある提案された機構は、ほとんど推測に基づいている。

本明細書に提示されているのは、EV、具体的にはエキソソームが、PD-L1を提示することによって腫瘍の進行を促進するように機能できるという広範な証拠である。インビトロでは、エキソソームはT細胞をPD-L1依存的に抑制した。インビボでは、2つの独立した遺伝子変異を使用してTRAMP細胞から腫瘍エキソソームを除去すると、Pd-l1欠失の効果が反復された。これらの反復効果は、様々な活性化、消耗、および増殖マーカーに対して概ね同一の効果を有し、腫瘍成長の抑制、脾臓の細胞充実性の増加、およびリンパ節におけるT細胞反応の活性化を含んでいた。これらすべての結果は、インビトロで収集された、PD-L1を保有するエキソソームの注射によって逆転した。PD-L1が存在しない場合は、外因的に導入されたエキソソームはほとんど効果を有さなかった。これは、PD-L1の提示が、それによりエキソソームが癌の進行を促進する主要な機構であることを実証する。

エキソソームPD-L1のこの役割は、TRAMPモデルに限定されない。結腸直腸MC38モデルにおいてエキソソームを除去すると、腫瘍成長も抑制され、生存も延長された。またしても、エキソソームの除去はPd-l1 null背景でさらなる効果を有さなかったため、効果はPD-L1に依存していた。興味深いことに、TRAMPモデルと異なり、エキソソームの喪失単独ではPd-l1の喪失ほどの影響力はなく、MC38モデルにおけるエキソソームPD-L1および細胞PD-L1の組み合わさった役割を示唆した。注目すべきことに、エキソソームの喪失および抗PD-L1処理を組み合わせると、PD-L1を完全に除去するのと同様の度合いでこれらのマウスの生存を延長した。これらのデータは、MC38モデルでは、エキソソームPD-L1および細胞PD-L1の両方が、抗PD-L1療法に感受性になる前ではなく、感受性になった後に、腫瘍進行の促進に重要な役割を果たすことを示す。

データは、任意の治療戦略において、PD-L1の細胞表面およびエキソソーム提示の両方を標的とすることを考慮すべきであることを実証する。TRAMPモデルは、現在の抗PD-L1および抗PD-1抗体による遮断に抵抗性がある。しかしながら、腫瘍細胞におけるPd-l1の欠失は、著しい効果を有した。同様に、MC38モデルは抗PD-L1/PD-1療法に対して部分的な反応性を示すが、Pd-l1遺伝子の欠失はより大きな効果を有する。これらのデータはすべて、エキソソームPD-L1が現在の抗PD-L1/抗PD-1療法に抵抗性があることと一致している。

本明細書に示されるように、1つの腫瘍部位におけるエキソソーム分泌の阻害は、遠隔腫瘍部位または二次腫瘍負荷に対する全身性および持続的な免疫反応につながり得る。この観察は、照射により治療された患者にもともと見られた、未照射部位への効果（abscopal effect）を連想させる。特に、原発腫瘍の照射は、転移の二次退行につながり得る。この現象は、抗腫瘍免疫反応の活性化によって駆動されると考えられており、照射を免疫抑制と組み合わせた前臨床研究が進行中である。本明細書の結果は、全身性抗PD-L1/PD-1遮断と組み合わせた局所的な抗エキソソーム療法が相乗作用して、複数の腫瘍部位に対する全身性免疫反応を同時に誘導できるであろうことを示唆する。

本明細書では、2つの重要なエキソソーム生合成遺伝子：Rab27aおよびnSMNase2を欠失させることにより、腫瘍進行におけるエキソソームPD-L1の役割を分析するために遺伝的アプローチを使用した。マーカー（CD63、HRS）、粒子追跡、および電子顕微鏡法で測定されたように、Rab27aの欠失は、すべてのエキソソームの喪失につながった。同じアッセイで測定されたように、nSMNase2の欠失は、すべてではないが大部分のエキソソームの喪失につながった。したがって、両方の酵素が治療標的を表す。要約すると、本明細書に提示された結果は、エキソソームPD-L1が流入領域リンパ節のT細胞活性化を抑制するその能力を通した腫瘍進行の主要な調節因子であり、その阻害が長期にわたる全身性抗腫瘍免疫につながり得ることを示す。

方法
CRISPR-Cas9媒介性遺伝子破壊
公知のプロトコルに従って、sgRNAオリゴヌクレオチドSEQ ID NO: 3〜14をpSpCas9(BB)-2A-GFPにクローニングした。破壊された各遺伝子について、2つの異なるガイドを同時にトランスフェクトした。FUGENE HD（TM）（Promega）を使用して、1ugの各ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、GFP＋単一細胞クローニングによってPd-l1 null、Rab27a null、およびnSMase2 nullクローンを得た。細胞表面PD-L1のウェスタン（Rab27a）またはフローサイトメトリー解析のいずれかによってノックアウトクローンを同定した。

ナノ粒子追跡解析
収集の24時間前に、同量の細胞をKSR培地に播種した。培地を室温において300gで10分間、続いて4℃において2k gで20分間、次に4℃において12k gで40分間前処理した。処理された培地をNANOSIGHT LM10（TM）（Nanosight limited）で解析した。

腫瘍細胞注射
マウスに100万個のTRAMP-c2 wtまたはTRAMP-c2 Pd-l1 nullまたはTRAMP-c2 Rab27a nullまたはTRAMP-c2 nSMase2 null細胞を注射した。マウスに100万個のMC38 wtまたはMC38 Pd-l1 nullまたはMC38 Rab27a null細胞を注射した。腫瘍が少なくとも1次元で2cmに達した場合に、マウスは「末期」と見なされた。腫瘍の長さおよび幅を測定することにより、腫瘍成長を週に3回モニターした。次の方程式に従って腫瘍体積を計算した：長さ×幅×0.5×幅。

示された場合、マウスは尾静脈にIV注射されたエキソソームで処理された。1千5百万細胞を5つの15cmディッシュ（Corning CLS430599）に播種し、48時間培養した。上記のように小胞を100k gのペレットとして単離した。MC38小胞を1ml PBSに、TRAMP小胞を600μlに再懸濁した。各マウスに小胞を含むPBSを100μl注射した。

Claims (51)

1. 免疫系の全身抑制の阻害に使用するための、抑制性EVの阻害剤。
2. PDL1含有エキソソームの抑制活性および／または存在量を低減させる、請求項1記載の抑制性EVの阻害剤。
3. 癌の治療に使用するための、抑制性EVの阻害剤。
4. PDL1含有エキソソームの抑制活性および／または存在量を低減させる、請求項3記載の抑制性EVの阻害剤。
5. 癌が、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、および皮膚癌からなる群より選択される癌である、請求項3記載の抑制性EVの阻害剤。
6. 免疫療法治療の有効性の増強に使用するための、抑制性EVの阻害剤。
7. PDL1含有エキソソームの抑制活性および／または存在量を低減させる、請求項6記載の抑制性EVの阻害剤。
8. 免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤、エクスビボでプライミングされた樹状細胞、キメラ抗原受容体T細胞、腫瘍抗原を認識するようにエクスビボでプライミングされた腫瘍浸潤リンパ球、腫瘍細胞を標的として抗原を発現するウイルス構築物、腫瘍細胞溶解物、樹状細胞を標的とする抗原含有抗体、サイトカイン、および癌関連抗原に対する抗体からなる群より選択される、請求項4記載の抑制性EVの阻害剤。
9. 抑制分子の発現を低減させる作用物質を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抑制性EVの阻害剤。
10. PDL1の発現を低減させる作用物質を含む、請求項9記載の抑制性EVの阻害剤。
11. 低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはCRISPRシステムを含む、請求項9記載の抑制性EVの阻害剤。
12. EVにおける抑制分子のパッケージングを阻害する、請求項11記載の抑制性EVの阻害剤。
13. 癌細胞により生産される抑制性EVの存在量を低減させる作用物質を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抑制性EVの阻害剤。
14. 癌細胞により生産されるPDL1含有エキソソームの存在量を低減させる作用物質を含む、請求項13記載の抑制性EVの阻害剤。
15. EV生産遺伝子の発現を低減させる作用物質を含む、請求項13記載の抑制性EVの阻害剤。
16. EV生産遺伝子が、Rab27、nSMase2、ESCRT0、ESCRT1、ESCRT2、およびESCRT3複合体のタンパク質をコードする遺伝子、nSMase2、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNARE）複合体のタンパク質をコードする遺伝子、ALIX、TSG101、HRS、シンテニン、ユビキチン、クラスリン、VPS32、VPS、SNAP23、VAMP3、VAMP7、YKT6、RAB-11、RAB-35、RAB-5、ならびにRAB-7からなる群より選択される、請求項15記載の抑制性EVの阻害剤。
17. EV生産遺伝子がRab27である、請求項16記載の抑制性EVの阻害剤。
18. EV生産遺伝子がnSMase2である、請求項16記載の抑制性EVの阻害剤。
19. 低分子干渉RNA、ヘアピンRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはCRISPRシステムを含む、請求項15記載の抑制性EVの阻害剤。
20. 小分子を含む、請求項13記載の抑制性EVの阻害剤。
21. GW4869を含む、請求項20記載の抑制性EVの阻害剤。
22. Nexinhib20を含む、請求項20記載の抑制性EVの阻害剤。
23. DPTIPを含む、請求項20記載の阻害剤。
24. カンビノールを含む、請求項20記載の抑制性EVの阻害剤。
25. チピファルニブ、ネチコナゾール、クリンバゾール、イソプロテレノール、ケトコナゾール、ミトタン、トリアデメノール（triademenol）、ペンテトラゾール、カンナビジオール、シンバスタチン、ブレフェルジンA、ツニカマイシン、ジメチルアミロライド、モネンシン、クロラミジン（chloramidine）、およびビスインドリルマレイミドからなる群より選択される、請求項20記載の抑制性EVの阻害剤。
26. 癌の治療に使用するための操作された癌細胞であって、1つまたは複数の抑制分子の発現が正常に機能しないように操作されている、および／または操作されていない類似の細胞と比較して抑制性EV生産の能力が低減するように操作されている、操作された癌細胞。
27. 膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、および皮膚癌からなる群より選択される癌のものである、請求項26記載の操作された癌細胞。
28. 1つまたは複数の抑制分子の発現が正常に機能しないように操作されており；および
    1つまたは複数の抑制分子がPDL1である、
    請求項26記載の操作された癌細胞。
29. 操作されていない類似の細胞と比較して抑制性EV生産の能力が低減するように操作されており；
    ここでEV生産の能力の低減が、エキソソーム生産の能力の低減である、
    請求項26記載の操作された癌細胞。
30. EVにおける抑制分子のパッケージングのための能力が低減するように操作されている、請求項26記載の操作された癌細胞。
31. 操作されていない類似の細胞と比較して抑制性EV生産の能力が低減するように操作されており；および
    1つまたは複数のEV生産遺伝子が阻害されている、
    請求項26記載の操作された癌細胞。
32. 1つまたは複数のEV生産遺伝子が、Rab27a、Rab27b、nSMase2、ESCRT0、ESCRT1、ESCRT2、およびESCRT3複合体のタンパク質をコードする遺伝子、nSMase2、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNARE）複合体のタンパク質をコードする遺伝子、ALIX、TSG101、HRS、シンテニン、ユビキチン、クラスリン、VPS32、VPS、SNAP23、VAMP3、VAMP7、YKT6、RAB-11、RAB-35、RAB-5、ならびにRAB-7からなる群より選択される、請求項31記載の操作された癌細胞。
33. 1つまたは複数のEV生産遺伝子がRab27aである、請求項31記載の操作された癌細胞。
34. 1つまたは複数のEV生産遺伝子がnSMase2である、請求項31記載の操作された癌細胞。
35. 免疫原性反応を増強する1つまたは複数の因子を発現するようにさらに操作されている、請求項26記載の操作された癌細胞。
36. 免疫原性反応を増強する1つまたは複数の因子が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項35記載の操作された癌細胞。
37. 免疫原性反応を増強する1つまたは複数の因子が、環状ジグアニル酸、アルファフェトプロテイン、癌胎児性タンパク質、CA-125、MUC1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原、IL-18、IL-6、ハイパーIL-6、IL-11、ハイパーIL-11、IL15、およびIL15αからなる群より選択される、請求項35記載の操作された癌細胞。
38. EVタンパク質を含む第一のタンパク質；および
    レポータータンパク質を含む第二のタンパク質
    を含む融合タンパク質。
39. EVタンパク質が、CD63、CD81、CD9、TSG101、HRS、ALIX、PDL1、PD1、CTLA-4 PD1、PDL2、LAG3、TIM3、CD47、CD155、CD80、Gal-9、およびMHCクラスI/II抗原からなる群より選択される、請求項38記載の融合タンパク質。
40. レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項38記載の融合タンパク質。
41. 請求項38〜40のいずれか一項記載の融合タンパク質を発現するように形質転換された細胞。
42. エキソソーム生産を定量化する方法であって、請求項41記載の細胞により生産されるレポーターシグナルの量を測定する工程を含む、方法。
43. 請求項41記載の細胞を生産するように形質転換された非ヒト動物。
44. 抑制性EVを阻害する治療または抑制性EVによる全身抑制を克服する治療に対する、癌を有する対象の適合性を評価する方法であって、
    対象の癌がホット（hot）またはコールド（cold）であるかを評価する工程を含み、ここで、コールドな癌は、抑制性EVを阻害する治療または抑制性EVによる全身抑制を克服する治療に対する適合性を示す、方法。
45. 抑制性EVを阻害する治療または抑制性EVによる全身抑制を克服する治療に対する、癌を有する対象の適合性を評価する方法であって、
    対象における抑制性EVの存在量を評価する工程を含み、ここで、抑制性EVの上昇したレベルが、抑制性EVを阻害する治療または抑制性EVによる全身抑制を克服する治療に対する適合性を示す、方法。
46. PDL1含有エキソソームの存在量が評価される、請求項45記載の方法。
47. 1つまたは複数の免疫抑制分子を含有する外因的に生産されたEVを含む、免疫関連状態の治療において使用するための治療用免疫抑制性EV。
48. 1つまたは複数の抑制分子がPDL1を含む、請求項47記載の治療用免疫抑制性EV。
49. 免疫関連状態が、炎症状態、自己免疫状態、または移植物の受容に関連する免疫抑制の必要性である、請求項47記載の治療用免疫抑制性EV。
50. エキソソームである、請求項47記載の治療用免疫抑制性EV。
51. 培養細胞によって生産される、請求項47記載の治療用免疫抑制性EV。

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