CN108136019A - 外来体分泌抑制剂 - Google Patents

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Abstract

外来体分泌抑制剂，其含有：抑制NAPG、HINT3或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质活性的物质。所述外来体分泌抑制剂可抑制外来体的分泌，进而可抑制癌细胞的增殖或转移，因此抑制该基因表达或该蛋白质活性的物质作为适合用于癌症治疗或抑制癌症转移的药物组合物的有效成分，另外，可以提供特异性地抑制上述基因表达或该蛋白质活性的新型作用机制的抗癌剂。

Description

外来体分泌抑制剂
技术领域
本发明涉及外来体(exosome)分泌抑制剂。更具体而言，涉及含有抑制特定基因表达或特定蛋白质活性的物质的外来体分泌抑制剂和药物组合物；以及根据特定基因表达或特定蛋白质活性的变化的外来体分泌抑制物质的筛选方法。
背景技术
与正常细胞相比，癌细胞最常见的特征是快速且无法控制的增殖。于是，已经大力地研究了：通过发现成为癌症治疗的靶(target)的基因，抑制该靶基因的表达或功能，来抑制癌细胞的增殖，治疗癌症的方法。
例如，专利文献1中公开了：由肝癌患者分离的样品中，作为与肝癌复发相关的生物标记的miR-194。而且，专利文献2中记载了：使用miR-194，可以抑制与多发性骨髓瘤中的p53/HDM2相关的自身调节循环(loop)。
还已知：在卵巢癌的内皮细胞中，NAPG基因的表达增加(参见专利文献3)。据报道：除了上述疾病之外，该NAPG基因还与双相型障碍或小泡形成有关(参见非专利文献1、2)。
另一方面，据报道：生物体内的体液中存在的外来体由各种细胞、例如免疫系统的细胞或各种癌细胞分泌，作为生物体内的细胞间沟通的媒介物而发挥功能，与生理现象相关、或与癌症等疾病的相关性正在受到瞩目。
例如，非专利文献3中明确了：成纤维细胞所分泌的外来体参与肺癌细胞的隆起。而且，据报道：来自黑色素瘤的外来体促进原发灶的转移，或通过中性鞘磷脂酶2(nSMase2)的刺激由转移灶分泌的外来体进一步促进癌症的转移(参见非专利文献4、5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2012/151212号公报
专利文献2：WO2012/019053号公报
专利文献3：WO2008/101118号公报
非专利文献
非专利文献1：Neuroscience Letters, 457(2009), 159-162
非专利文献2：Genes to Cells, (2005), 10, 989-999
非专利文献3：Cell, 151, 1542-1556, December 21, 2012
非专利文献4：Nat Med., 2012 June; 18(6): 883-891
非专利文献5：J. Biol. Chem., 2013, 288: 10849-10859。
发明内容
发明所要解决的课题
尽管关于生物标记与癌症、外来体与癌症、各自的相关性已变得明确，但关于控制外来体分泌的生物标记仍属未知。
本发明的课题在于提供，作为癌症治疗的新型途径(approach)的外来体分泌抑制剂、药物组合物、以及根据特定基因表达或特定蛋白质活性的变化的外来体分泌抑制物质的筛选方法，通过抑制外来体的分泌，来抑制癌细胞的增殖或转移，发现可治疗癌症的基因。
用于解决课题的手段
本发明涉及下述[1]～[4]。
[1] 外来体分泌抑制剂，其含有：抑制NAPG、HINT3或GXYLT1基因表达的物质；或者抑制NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质活性的物质。
[2] 药物组合物，其含有：抑制NAPG、HINT3或GXYLT1基因表达的物质；或者抑制NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质活性的物质。
[3] 外来体分泌抑制剂，其含有miR-194。
[4] 外来体分泌抑制用物质的筛选方法，其中，以NAPG、HINT3或GXYLT1基因的表达或者NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质的活性为指标，以抑制表达或抑制活性的物质为候选化合物。
发明效果
根据本发明，通过抑制NAPG、HINT3或GXYLT1基因的表达，或者抑制NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质的活性，可抑制外来体的分泌，进而可抑制癌细胞的增殖或转移，抑制该基因表达或该蛋白质活性的物质可以用作适合用于癌症治疗或抑制癌症转移的药物组合物的有效成分。本发明的药物组合物提供特异性地抑制特定基因表达或该蛋白质活性的新型作用机制的抗癌剂。而且，根据本发明，还提供将上述基因或蛋白质用作靶的、筛选作为癌症的治疗用物质或转移抑制用物质有效的外来体分泌抑制物质的方法。
附图说明
[图1A] 图1A～D是显示探索具有外来体的分泌抑制作用的miRNA的结果的图。(A)是显示实施例1的一个例子的图，显示使用针对RAB27A (Applied Biosystems公司)，RAB27B (Applied Biosystems公司)、nSMase 2 (Applied Biosystems公司)的siRNA作为阳性对照的结果。图中的点线显示添加有阴性对照的siRNA的组的外来体分泌量，虚线显示添加有阳性对照即针对RAB27A的siRNA的组的外来体分泌量。
[图1B] 图1(B)是显示使用抗CD63抗体和抗CD9抗体测定外来体分泌量的结果的一个例子、显示相对于阴性对照miRNA的分泌量的相对分泌量的图。左图是使用PC-3ML细胞的结果，右图是使用MDA-MB-231D3H2LN细胞的结果。
[图1C] 图1(C)是显示将每细胞数的外来体的分泌粒子数进行比较而得的结果的一个例子的图。左图是使用PC-3ML细胞的结果，右图是使用MDA-MB-231D3H2LN细胞的结果。
[图1D] 图1(D)是显示通过给予LNA而使外来体的分泌粒子数发生改变的图。左图是显示使用PC-3ML细胞进行LNA处理的外来体分泌量的结果，右图是显示miR-194自身的表达量的图。
[图2A] 图2A～B是显示鉴定miR-194的靶基因的结果的图。(A)显示使用微阵列分析、提取由miR-194的表达变化而改变的基因的结果。
[图2B] 图2(B)是显示使用实时PCR法分析、对比靶基因的候选即NAPG的表达量的结果的图。左区分是使用PC-3ML细胞的结果，右区分是使用MDA-MB-231D3H2LN细胞的结果。
[图3A] 图3A～B是显示评价siRNA对外来体的分泌抑制的结果的图。(A)是针对MDA-MB-231D3H2LN细胞的结果，上段显示使用抗CD9抗体进行测定的结果的图，下段显示使用抗CD63抗体进行测定的结果的图。图中的点线显示阴性对照的值(NC1)，虚线显示阳性对照的值(RAB 27A)。
[图3B] 图3(B)是针对PC-3ML细胞的结果，上段显示使用抗CD9抗体进行测定的结果的图，下段显示使用抗CD63抗体进行测定的结果的图。图中的点线表示阴性对照的值(Allstar)，虚线表示阳性对照的值(RAB27A)。
[图4] 图4是显示评价NAPG的siRNA对外来体的分泌抑制的结果的图。左区分是针对PC-3ML细胞的结果，右区分是针对MDA-MB-231D3H2LN细胞的结果。
[图5] 图5是显示使用MDA-MB-231D3H2LN细胞来评价siRNA对外来体的分泌抑制的结果的图。关于外来体的分泌抑制，使用CD9抗体进行了测定。
[图6] 图6是显示评价体内模型中的癌症转移的抑制作用的结果的图。(A)是计测给予siRNA的原发灶的肿瘤大小改变的图，(B)是显示向肺的微小转移数的图。
具体实施方式
本发明的外来体分泌抑制剂的较大的特征在于，包含：抑制NAPG基因、HINT3基因或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG蛋白质、HINT3蛋白质或GXYLT1蛋白质活性的物质。需说明的是，除外特别提及的情形，本说明书中使用的术语以该领域中通常使用的含义来使用。
已经明确特定的生物标记与各种癌症相关。另一方面，已经明确外来体分泌量的增加与癌症的进展或转移相关。于是，本发明人关注可以控制外来体分泌的生物标记并进行了研究，结果明确了：通过抑制NAPG基因、HINT3基因或GXYLT1基因的表达，可以抑制外来体的分泌，进而抑制癌症的进展或转移。
在本说明书中，“NAPG基因”是指编码人NAPG蛋白质的基因。人NAPG基因的碱基序列和人NAPG蛋白质的氨基酸序列是已知的，例如，作为NAPG基因的碱基序列(SEQ ID NO：1)的GenBank Accession ID：CR536554、作为人NAPG蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的GenBank Accession ID：CAG 38791分别在GenBank中注册、公布。以往，仅知晓NAPG基因在卵巢癌的内皮细胞中表达量增加、或与双相型障碍或小泡形成相关的程度，而NAPG基因的外来体分泌抑制作用是本发明人初次发现的。
在本说明书中，“HINT3基因”是指编码人HINT3蛋白质的基因。人HINT3基因的碱基序列和人HINT3蛋白质的氨基酸序列是已知的，例如，作为HINT3基因的碱基序列(SEQ IDNO：3)的GenBank Accession ID：NM_138571、作为人HINT3蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的GenBank Accession ID：NP-612638分别在GenBank中注册、公布。已经报道了HINT3基因作为磷酰胺酸的水解酶发挥作用，但其功能几乎是未知的，HINT 3基因的外来体分泌抑制作用是本发明人初次发现的。
在本说明书中，“GXYLT1基因”是指编码人GXYLT1蛋白质的基因。人GXYLT1基因的碱基序列和人GXYLT1蛋白质的氨基酸序列是已知的，例如，作为GXYLT1基因的碱基序列(SEQ ID NO：5)的GenBank Accession ID：NM_173601、作为人GXYLT1蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的GenBank Accession ID：NP-775872分别在GenBank中注册、公布。有报道称GXYLT1基因作为多糖合成酶发挥功能，但未进行详细的分析，GXYLT1基因的外来体分泌抑制作用是本发明人初次发现的。
在本说明书中，人NAPG蛋白质不仅包含由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质，还包含可以在人类个体内产生的变异体，包含在由SEQ ID NO：2的序列组成的蛋白质中有一个或多个的氨基酸被缺失、取代和/或添加而得的蛋白质且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。然而，这些的变异体人NAPG蛋白质与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质具有相同的功能。
在本说明书中，“NAPG基因”不仅包含由SEQ ID NO：1的碱基序列组成的基因，还包含可以在人类个体内产生的变异体，例如，包含在由SEQ ID NO：1的碱基序列组成的基因中有一个或多个的碱基被缺失，取代和/或添加而得的基因且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。而且，“NAPG基因”包含：由相对于SEQ ID NO：1的碱基序列具有80％以上、例如85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5%以上、99.7%以上或99.9%以上同源性的核苷酸序列组成的变异体。碱基序列的同源性可以利用BLAST、FASTA等已知的算法来确定。而且，“NAPG基因”包含：相对于由SEQ ID NO：1的碱基序列组成的基因，由在严格的条件下进行杂交的碱基序列组成的变异体。需说明的是，在本说明书中，作为严格的杂交条件的例子，例如可举出：作为杂交后的洗涤条件，通常为“1×SSC、0.1％SDS、37℃”左右的条件。互补链优选为：即使在所述的条件下洗涤，也与成为对象的正链维持杂交状态。没有特别限定，可举出：作为更严格的杂交条件的“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”左右、作为进一步严格的杂交条件的“0.1×SSC、0.1％SDS、65℃”左右的洗涤条件。另外，关于杂交，可以按照Molecular Cloning(分子克隆)：A Laboratory Manual(实验手册)，SecondEdition(第二版)(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社))、Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学)(1994)(Wiley-Interscience)、DNA Cloning 1(DNA克隆1)：Core Techniques(核心技术)、A PracticalApproach(实用方法)，Second Edition(第二版)(1995)(Oxford University Press(牛津大学出版社))等中记载的方法来进行。然而，这些变异体基因编码与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
在本说明书中，人HINT3蛋白质不仅包含由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白质，还包含可以在人类个体内产生的变异体，包含在由SEQ ID NO：4的序列组成的蛋白质中有一个或多个的氨基酸被缺失、取代和/或添加而得的蛋白质且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。然而，这些的变异体人HINT3蛋白质与由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等的功能。
在本说明书中，“HINT3基因”不仅包含由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的基因，还包含可以在人类个体内产生的变异体，例如，包含在由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的基因中有一个或多个的碱基被缺失、取代和/或添加而得的基因且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。而且，“HINT3基因”包含：由相对于SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有80％以上、例如85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5%以上、99.7%以上或99.9%以上同源性的核苷酸序列组成的变异体。碱基序列的同源性可以与上述相同的方式确定。而且，“HINT3基因”包含：相对于由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的基因，由在严格的条件下进行杂交的碱基序列组成的变异体。然而，这些的变异体基因编码与由SEQID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
在本说明书中，人GXYLT1蛋白质不仅包含由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的蛋白质，还包含可以在人类个体内产生的变异体，包含在由SEQ ID NO：6的序列组成的蛋白质中有一个或多个的氨基酸被缺失、取代和/或添加而得的蛋白质且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。然而，这些的变异体人GXYLT1蛋白质与由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等的功能。
在本说明书中，“GXYLT1基因”不仅包含由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的基因，还包含可以在人类个体内产生的变异体，例如，包含在由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的基因中有一个或多个的碱基被缺失、取代和/或添加而得的基因且通过基于多态性或突变的变异而产生的物质。而且，“GXYLT1基因”包含：由相对于SEQ ID NO：5的碱基序列具有80％以上、例如85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5%以上、99.7%以上或99.9%以上同源性的核苷酸序列组成的变异体。碱基序列的同源性可以与上述相同的方式确定。而且，“GXYLT1基因”包含：相对于由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的基因，由在严格的条件下进行杂交的碱基序列组成的变异体。然而，这些的变异体基因编码与由SEQID NO：6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
在本说明书中，“抑制基因表达的物质”是指，只要是抑制靶基因的mRNA转录的物质、分解已转录的mRNA的物质、或抑制由mRNA翻译成蛋白质的物质即可没有特别限定。作为所述的物质，可举出核酸，可示例：siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶、以及它们的表达载体等。其中，优选siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、以及它们的表达载体，更优选siRNA和反义寡核苷酸。作为“抑制基因表达的物质”，除上述之外，还包含蛋白质或肽、或者其他的小分子。需说明的是，在本发明中，靶基因是NAPG基因、HINT3基因、或GXYLT1基因。
在本说明书中，“siRNA”是指，具有由约15～40碱基组成的双链RNA部分的RNA分子，切割与上述siRNA的反义链具有互补序列的靶基因的mRNA，并具有抑制靶基因表达的功能。详细而言，本发明中的siRNA是包含由有义RNA链和反义RNA链组成的双链RNA部分的RNA，所述有义RNA链由与NAPG基因、HINT3基因、或GXYLT1基因的mRNA中的连续的RNA序列相同的序列组成，所述反义RNA链由与该有义RNA序列互补的序列组成。所述siRNA和后述的变异体siRNA的设计和制造在本领域技术人员的技能范围内。
在本说明书中，“miRNA”是指，具有由约21～25碱基组成的双链RNA部分的RNA分子，通过与靶基因的mRNA结合而具有抑制靶基因表达的功能。详细而言，本发明中的miRNA是包含由有义RNA链和反义RNA链组成的双链RNA部分的RNA，所述有义RNA链由与NAPG基因、HINT3基因、或GXYLT1基因的mRNA中的连续的RNA序列相同的序列组成，所述反义RNA链由与该有义RNA序列互补的序列组成。所述miRNA和后述的变异体siRNA的设计和制造在本领域技术人员的技能范围内。
关于siRNA的双链RNA部分的长度，作为碱基，优选为约15～40碱基，更优选为15～30碱基，进一步优选为15～25碱基，进一步优选为18～23碱基，更进一步优选是19～21碱基。另外，关于miRNA的双链RNA部分的长度，作为碱基，优选为约21～25碱基，更优选为22～24碱基。作为siRNA和miRNA的有义链或反义链的末端结构，没有特别限定，可以根据目的适当选择，例如可以具有平滑末端，也可以具有突出末端(overhang，突出端)，优选3'末端突出的类型。在有义RNA链和反义RNA链的3'末端具有由多个碱基、优选1～3个碱基、更优选2个碱基组成的突出端的siRNA和miRNA，大多情形抑制靶基因表达的效果较大，是优选者。突出端的碱基的种类没有特别限定，可以是构成RNA的碱基或构成DNA的碱基。
而且，在上述siRNA和miRNA的有义链或反义链的一方或两方中有1～数个为止的核苷酸被缺失、取代、插入和/或添加的siRNA和miRNA，也可以用于本发明的外来体分泌抑制剂。在此，1～数个碱基是指，没有特别限定但优选为1～4碱基、更优选为1～3碱基、进一步优选为1～2碱基。作为所述变异的具体例，可举出：3'末端的突出端部分的碱基数为0～3个，将3'末端的突出端部分的碱基序列变更成其他的碱基序列、或通过碱基的插入、添加或缺失上述有义RNA链和反义RNA链的长度为1～3碱基不同，有义链和/或反义链中碱基被另外的碱基取代等，但不限于这些。然而，在这些的变异体siRNA和miRNA中有义链和反义链可以杂交、以及这些的变异体siRNA和miRNA与不具有变异的siRNA和miRNA具有同等的基因表达抑制能是必要的。
而且，该siRNA和miRNA可以是一方的端封闭的结构的分子、例如具有发夹结构的siRNA和miRNA (Short hairpin RNA；shRNA)。shRNA是包含靶基因的特定序列的有义链RNA、由与该有义链RNA互补的序列组成的反义链RNA和连接其两链的接头序列的RNA，并且有义链部分和反义链部分进行杂交，形成双链RNA部分。
希望siRNA和miRNA在临床应用时不显示所谓的脱靶(off-target)效应。脱靶效应是指，除了靶基因以外，抑制与使用的siRNA和miRNA具有部分同源的其他基因表达的作用。为了避免脱靶效应，对于候选siRNA和miRNA，可以预先利用DNA微阵列等确认不存在交叉反应。另外，使用NCBI (National Center for Biotechnology Information)等提供的已知数据库，除了成为靶的基因之外，还确认是否存在包含与候选siRNA和miRNA序列同源性高的部分的基因，由此可以避免脱靶效应。
为了制作本发明的siRNA和miRNA，可以适当使用：化学合成的方法和使用基因重组技术的方法等已知的方法。在合成的方法中，可以根据序列信息、通过常规方法合成双链RNA。另外，在使用基因重组技术的方法中，构建插入了有义链序列或反义链序列的表达载体，将该载体导入到宿主细胞后，分别获取通过转录而生成的有义链RNA或反义链RNA，由此也可以制作。另外，使包含靶基因的特定序列的有义链RNA、由与该有义链RNA互补的序列组成的反义链RNA和连接其两链的接头序列，且形成发夹结构的shRNA表达，由此也可以制作所需的双链RNA。
siRNA和miRNA只要具有靶基因的表达抑制活性，则构成siRNA和miRNA的核酸的一部分也可以是DNA。另外，siRNA和miRNA只要具有靶基因的表达抑制活性，则构成siRNA和miRNA的核酸全部或其一部分也可以是经修饰的核酸。
经修饰的核酸是指，对核苷(碱基位点，糖位点)和/或核苷间键位点实施修饰、与天然的核酸具有不同的结构。作为构成经修饰的核酸的“经修饰的核苷”，例如可举出：脱碱基(abasic无碱基)核苷；阿糖核苷、2'-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、具有其他的糖修饰的核苷；肽核酸(PNA)、键合有磷酸基的肽核酸(PHONA)、锁定核酸(LNA)、吗啉代核酸等。具有上述糖修饰的核苷中，包含：2'-O-甲基核糖、2'-脱氧-2'-氟核糖、3'-O-甲基核糖等的取代戊糖；1',2'-脱氧核糖；阿拉伯糖；取代阿拉伯糖；己糖和具有α-端基的糖修饰的核苷。这些的核苷也可以是碱基位点被修饰的修饰碱基。这样的修饰碱基中，例如可举出：5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶等的嘧啶；6-甲基腺嘌呤、6-硫代鸟嘌呤等的嘌呤；和其他的杂环碱基等。
作为构成经修饰的核酸的“经修饰的核苷间键”，例如可举出：烷基接头、甘油接头、氨基接头、聚(乙二醇)键、甲基膦酸酯核苷间键、甲基硫代膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前体药物、砜、氨磺酰、氨基磺酸酯、甲缩醛、N-甲基羟胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、吗啉代、硼代膦酸酯、氨基磷酸酯等的非天然核苷间键。
将与靶基因的mRNA互补的寡核苷酸称为“反义寡核苷酸”，该反义寡核苷酸通过与作为靶的基因(mRNA)形成双链而抑制mRNA的功能。在“反义寡核苷酸”中，还可以存在少许的错配，只要是不仅与成为靶的基因(mRNA)完全互补，而且还与mRNA稳定地杂交即可。
反义寡核苷酸还可以被修饰。通过实施适当的修饰，使该反义寡核苷酸在生物体内难于被分解，变得更加稳定，进而可以抑制靶基因的表达。作为这样的经修饰的寡核苷酸，可举出：S-寡聚型(硫代磷酸酯型)、C-5噻唑型、D-寡聚型(磷酸二酯型)、M-寡聚型(甲基膦酸酯型)、肽核酸型、磷酸二酯键型、C-5丙炔基嘧啶型、2-O-丙基核糖、2'-甲氧基乙氧基核糖型等的修饰型的反义寡核苷酸。而且，作为反义寡核苷酸，构成磷酸基的氧原子的至少一部分可以被硫原子取代、修饰。这样的反义寡核苷酸在核酸酶抗性、与RNA的亲和性方面特别优异。作为构成磷酸基的氧原子的至少一部分被硫原子取代、修饰的反义寡核苷酸，例如可举出：例如S-寡聚型等的寡核苷酸。
反义寡核苷酸(或其衍生物)可以通过常规方法合成，例如可以通过市售的DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司制等)容易地合成。合成方法有使用亚磷酰胺的固相合成法、使用氢磷酸酯的固相合成法等。
“核酶”是指具有切割核酸的酶活性的RNA，最近已经明确具有该酶活性位点的碱基序列的寡DNA也同样地具有核酸切割活性，因此本说明书中只要具有序列特异性的核酸切割活性，也用作包含DNA的概念。具体而言，核酶可以在编码区的内部(初始转录产物的情况下包含内含子部分)特异性地切割编码靶基因的mRNA或初始转录产物。作为通用性最高的核酶，有类病毒或拟病毒等的感染性RNA中发现的自剪接RNA，已知锤头型或发夹型等。锤头型在约40碱基左右发挥酶活性，通过使与获取锤头结构的部分相邻的两端的每多个碱基(总共约10碱基左右)与mRNA的所期望的切割位点为互补的序列，可以特异性地仅切割靶mRNA。而且，将核酶以包含编码该核酶的DNA的表达载体形式使用的情形下，为了促进转录产物向细胞质转移，也可以制成进一步连接有改变了tRNA的序列的杂种核酶(NucleicAcids Res , 29(13): 2780-2788(2001))。
抑制靶基因表达的物质可以是siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、或核酶等的核酸分子，以及编码该核酸分子的表达载体。关于该表达载体，编码上述核酸分子的寡核苷酸或多核苷酸必须功能性地连接到可以在给予对象即哺乳动物的细胞中发挥启动子活性的启动子上。使用的启动子没有特别限定，只要是可以在给予对象即哺乳动物中发挥功能即可，例如可举出：pol III启动子(例如，tRNA启动子、U6启动子、H1启动子)、哺乳动物用启动子(例如，CMV启动子、CAG启动子、SV40启动子)等。
关于表达载体，优选在编码核酸分子的寡(多)核苷酸的下游含有转录终止信号、即终止子区。而且，还进一步含有用于选择转化细胞的选择标记基因(对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素等的药物赋予抗性的基因、互补营养需求性变异的基因等)。
用作表达载体的基本骨架载体没有特别限定，例如可举出：质粒载体、病毒载体。作为适合给予人等哺乳动物的载体，可举出：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒、仙台病毒等的病毒载体。
作为本发明的表达载体，可示例：siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、或核酶的表达载体，其中，优选siRNA的表达载体。
这些的“抑制基因表达的物质”通过抑制外来体的分泌，而抑制包含肺癌、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌等在内的广范围的癌细胞的增殖或转移，或者具有使癌细胞减少的效果，因此可以用作药物组合物。
在本说明书中，“抑制蛋白质活性的物质”没有特别限定，只要是抑制靶蛋白质活性的物质即可。作为所述物质，可示例：蛋白质或肽、抗体或其他的低分子化合物等。其中，优选肽、抗体、和低分子化合物，更优选抗体、低分子化合物。需说明的是，在本发明中，靶蛋白质是NAPG蛋白质、HINT3蛋白质、或GXYLT1蛋白质。
在本发明中，抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质可以用作药物组合物的有效成分。该药物组合物通过在生物体内给予，可以用作例如癌症治疗用药物组合物或癌症转移抑制用药物组合物。
因此，本发明还提供含有抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质作为有效成分的药物组合物。
关于本发明的药物组合物，例如治疗对象为癌症的情形，对癌症的种类没有特别限定。另外，可以是实体癌也可以是浸润癌。具体而言，例如可举出：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、扁平上皮癌(鳞状上皮癌)、皮肤癌、骨癌、淋巴瘤、白血病和脑肿瘤。其中，期待本发明的药物组合物应用于乳腺癌、大肠癌。
另外，本发明的药物组合物不仅可以用于治疗癌症，而且还可以用于预防癌症治疗后的再复发、防止转移。因此，作为本发明的药物组合物的优选方案，可举出：癌症治疗用药物组合物、癌症再复发预防用药物组合物、癌症转移抑制用药物组合物。
本发明的药物组合物还可以采用口服给予和胃肠外给予的任一剂型。在胃肠外给予的情况下，也可以直接给予至肿瘤部位。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂，也可以包含药物上可接受的载体或添加物。作为这样的载体和添加物，可举出：水、药物上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物可接受的表面活性剂等。
关于添加物，根据本发明的药物组合物的剂型，可以从上述之中以单独或者2种以上适当组合而选择。作为剂型，在口服给予的情况下，可以以片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、液剂、糖浆剂等形式，或者采用适当的剂型进行给予。在胃肠外给予的情况下，可举出：经肺剂型(例如，使用雾化器等)、经鼻给予剂型、经皮给予剂型(例如，软膏、乳剂)、注射剂型等。在注射剂型的情况下，例如可以通过滴注等的静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部性地给予。
抑制靶基因表达的物质为siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、或核酶等的核酸分子或者编码该核酸分子的表达载体的情形下，将该表达抑制物质导入到脂质体等的磷脂小泡体中，该小泡体也可成为本发明的药物组合物。
本发明药物组合物的给予量根据年龄、性别、症状、给予途径、给予次数、剂型而不同。给予方法根据患者的年龄、症状适当选择。关于有效给予量，每次每1kg体重优选为0.01μg～1000mg，更优选为0.1μg～100μg。但是，上述治疗剂不限于这些的给予量。
本发明在另一方案中提供：
(i) 治疗癌症的方法，其具有：给予抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质的步骤；
(ii) 用于治疗癌症的抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质；以及
(iii) 抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质或者抑制NAPG、HINT3或GXYLT1蛋白质活性的物质在调制癌症治疗剂中的应用。
关于上述“抑制基因表达的物质”或“抑制蛋白质活性的物质”，如上所述。另外，作为“抑制基因表达的物质”，在使用siRNA的情形下，优选的siRNA如上所述。
在另一方案中，本发明提供筛选外来体分泌抑制剂的方法，其中，以外来体量为指标，以抑制外来体分泌的物质为候选化合物。
关于供于筛选方法的被检物质，可以是任何的已知化合物或新型化合物，例如可举出：核酸、糖质、脂质、蛋白质、肽、有机低分子化合物、使用组合化学技术制作的化合物文库、通过固相合成或噬菌体展示法制作的随机肽文库，或来自微生物、动植物、海洋生物等的天然成分等。
作为本发明的筛选方法，可以适合举出：以下的方案1和方案2的方法。作为方案1的筛选方法，包括下述的步骤(a1)～(c1)。
(a1) 使可测定外来体量的细胞与被检物质接触的步骤；
(b1) 测定接触了被检物质的细胞中的外来体量，将测定值与未接触被检物质的对照细胞中的外来体量进行比较的步骤；
(c1) 接触了被检物质的细胞中的外来体量低于未接触被检物质的对照细胞中的外来体量的情形下，将被检物质作为外来体分泌抑制用物质进行选择的步骤。
作为方案2的方法，包括下述的步骤(a2)～(c2)。
(a2) 使可测定外来体量的细胞与被检物质接触的步骤；
(b2) 测定接触了被检物质的细胞中的外来体量，将测定值与预先测定的使被检物质接触之前的上述细胞中的外来体量进行比较的步骤；
(c2) 接触了被检物质的细胞中的外来体量低于使被检物质接触之前的外来体量的情形下，将被检物质作为外来体分泌抑制用物质进行选择的步骤。
在步骤(a1)和(a2)中，将可测定外来体量的细胞与被检物质置于接触条件下。使被检物质与所述细胞的接触在培养培养基中进行。
作为可测定外来体量的细胞，可举出：几乎所有的动物细胞，作为其例子，可举出：以癌细胞为代表的疾病细胞或作为正常细胞的血管内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、免疫细胞等。需说明的是，这些的细胞可以使用动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猴、或人的哺乳动物细胞，其中，期望来自人的细胞。
关于使可测定外来体量的细胞与被检物质接触的培养培养基，根据所用细胞的种类等适当选择，例如为：包含约5～20％胎牛血清的极限必需培养基(MEM)、Dulbecco改良极限必需培养基(DMEM)、RPMI 1640培养基，199培养基等。培养条件也根据所使用细胞的种类等适当确定，例如培养基的pH值为约6～约8，培养温度通常为约30～约40℃，培养时间为约12～约144小时。
在步骤(b1)中，测定接触了被检物质的细胞和未接触被检物质的对照细胞中的外来体量，在步骤(b2)中，对于使被检物质接触的细胞，测定接触前后的外来体量。外来体量的测定可以按照已知的方法来进行，可以换算成每细胞数的外来体量。具体而言，例如作为适合例可举出：质谱分析方法或使用可以特异性地识别测定对象的标记的抗体的方法。需说明的是，关于未接触的对照细胞中的外来体量，在每次测定接触了被检物质的细胞中的外来体量时，可以重新进行测定，也可以利用预先测定的外来体量。细胞数的测定可以按照已知的方法来进行。
作为质谱分析方法，可举出：使用MALDI (Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Method)型质谱分析装置，ESI (Electrospray Ionization Method)型质谱分析装置等的质谱分析方法，可以是由蛋白质的一部分肽进行定量的方法。其中，优选使用MALDI型质谱分析装置的MALDI-TOF MS法。
作为使用抗体的方法(免疫学测定法)，例如可举出：蛋白质印迹法、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(ELISA、EIA)、发光免疫测定法、荧光免疫测定法(ExoScreen法等)。作为所述方法中使用的抗体，已知在外来体的膜表面特异性地表达的抗原(例如，CD9、CD63、CD147、EPCAM等)，因此可以使用可与它们特异性地结合的抗体(例如，国际公报第2013/099925号)。这样的抗体可以通过本领域技术人员周知的方法来制作，例如可以适当地使用单克隆抗体或其片段。另外，上述单克隆抗体或其片段可以按照通常已知的方法进行标记化或固相化后使用。需说明的是，在本说明书中，作为“单克隆抗体的片段”，是指上述单克隆抗体的一部分且与该单克隆抗体同样地对目标蛋白质具有特异性的结合性的片段。具体而言，可举出：Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二硫化物稳定化抗体(二硫键抗体，dsFv)、二聚化V区片段(Diabody，双抗体)、包含CDR的肽等。
在步骤(c1)中，将接触了被检物质的细胞中的外来体量与未接触的对照细胞中的外来体量进行比较，在步骤(c2)中，比较被检物质的接触前后的外来体量。关于外来体量的比较，优选根据是否存在显著差异来进行。例如，接触了被检物质的细胞中的外来体量相比未接触的对照细胞中的外来体量，或者接触了被检物质的细胞中的外来体量相比使被检物质接触前的细胞中的外来体量，分别在统计学上显著地、优选以2倍以上、更优选以3倍以上、进一步优选以4倍以上、进一步优选以5倍以上的量降低的情况下，优选将被检物质作为外来体分泌抑制用物质进行选择。关于统计学处理的检验方法，只要适当使用可判断有无显著性的已知的检验方法即可，没有特别限定。例如可以使用：Student t-检验法、多重比较检验法。
在本发明的另一个方案中，提供筛选癌症治疗剂的方法，其中，以外来体量为指标，以抑制外来体量分泌的物质为候选化合物。关于具体使用的试样或方法，与筛选上述本发明的外来体分泌抑制剂的方法同样。
实施例
以下，根据实施例来说明本发明，但实施例是为了更好地理解本发明而示例，没有意图使本发明的范围限定于这些实施例。需说明的是，本实施例中“常温”是指15～30℃。
实施例1 (探索具有外来体分泌抑制作用的miRNA)
在96孔板上在含血清的培养基中将1×104个PC-3ML细胞(Xenogen公司)或MDA-MB-231D3H2LN细胞(Xenogen公司)接种于各孔中。第二天，将培养上清交换成advanced RPMI(aRPMI；无血清添加、无抗生素添加) (90μL/孔)。
在另外准备的96孔板(PCR板)的各孔中，对于micro RNA文库(Accu Target HumanLibrary mimic)中的各miRNA，混合了5μL的2μM miRNA和10μL的aRPMI。
接下来，将DharmaFECT1转染试剂(Thermo Scientific)用aRPMI稀释成10μL/孔，在常温下培育5分钟，加入aRPMI使达到90μL/孔。在上述注入了miRNA的PCR板的每1孔中加入90μL该溶液，在常温下培育30分钟。在常温下培育30分钟后，将90μL分别添加到接种有PC-3ML细胞或MDA-MB-231D3H2LN细胞的96孔板的各孔中。第二天，去除培养上清，加入60μL新鲜的aRPMI。再过24小时后，将10μL培养上清用于外来体分泌量的定量，将剩余的培养上清用于细胞数的定量。需说明的是，各定量按照以下的方法来进行。
＜外来体量的定量＞
将已回收的培养上清以各10μL加入到96孔白板的各孔中。
使用AlphaLISA Universal Buffer (PerkinElmer公司)将生物素化抗CD9抗体(Shionogi Pharmaceutical，Clone 12A12)和生物素化抗CD63抗体(ShionogiPharmaceutical，Clone 8A12)稀释至5nM，另一方面，使用AlphaLISA Universal Buffer(PerkinElmer公司)，将与AlphaLISA受体珠结合的抗CD9抗体(Shionogi Pharmaceutical，Clone 12A12)、抗CD63抗体(Shionogi Pharmaceutical，Clone 8A12)稀释至50μg/mL。
向培养上清中加入各10μL的5nM生物素化抗体和与50μg/mL AlphaLISA受体珠结合的抗体，在37°C遮光条件下培育1小时。
用AlphaLISA Universal Buffer将5mg/mL的AlphaScreen链霉亲和素供体珠(PerkinElmer公司)稀释至62.5倍，以各25μL加入到各孔中，将TopSeal-A贴于平板上，在37°C遮光条件下培育30分钟，通过Enspire测定荧光强度。
<细胞数的定量>
向已回收的培养上清中加入MTS溶液(Dojindo，Cell Counting Kit-8)使达到50μL/孔，在37℃下培育1小时，测定细胞数的增殖。
将所得外来体量除以细胞数，作为每细胞数的外来体分泌量，比较了micro RNA文库中的2042种miRNA的效果。
比较的结果，判明了miR-194具有外来体分泌抑制作用(图1A～D)。
实施例2 (miR-194的靶基因的鉴定)
在6孔板上在含血清培养基中将1×104个的PC-3ML细胞或MDA-MB-231D3H2LN细胞接种于各孔中。第二天，将培养上清交换成advanced RPMI (aRPMI；无血清添加，无抗生素添加)(2mL/孔)。
向1.5mL容量管中加入100μL 2μM miR-194mimic(模拟)(Ambion公司)或miR-194的LNA、和100μL的aRPMI。准备DharmaFECT1转染试剂使达到6μL/孔，用aRPMI稀释至10μL/孔，在常温下培育5分钟。培育结束后，将400μL该溶液添加到各孔的细胞中。
第二天，去除培养上清，加入4mL新鲜的aRPMI。再过24小时后，回收培养上清，与实施例1同样地操作计算了每细胞数的外来体分泌量。另外，回收已转染的细胞，用miRNeasymini kit (QIAGEN公司)进行RNA提取，使用Agilent公司制的芯片通过微阵列比较了各基因的表达。
通过给予miR-194mimic而表达量减少、通过给予miR-194的LNA而表达量增加的基因是miR-194的靶基因候选时，作为mir-194的靶基因候选发现了NAPG等的基因(图2A、B)。
实施例3 (抑制NAPG、TMED5的siRNA的外来体分泌)
在96孔板上在含血清培养基中将1×104个的PC-3ML细胞或MDA-MB-231D3H2LN细胞接种于各孔中。第二天，将培养上清交换成advanced RPMI (90μL/孔)。
在另外准备的96孔板中，混合了10μL作为候选靶基因而举出的针对NAPG和TMED(参见图2A)的各siRNA (2μM)和10μL的aRPMI。
接下来，将DharmaFECT1转染试剂用aRPMI稀释至10μL/孔，在常温下培育5分钟，加入aRPMI使达到90μL/孔。在PCR板的每1孔中加入90μL该溶液，在常温下培育30分钟。在常温下培育30分钟后，将90μL分别添加到接种有PC-3ML细胞或MDA-MB-231D3H2LN细胞的96孔板的各孔中。第二天，去除培养上清，加入60μL新鲜的aRPMI。再过24小时后，将10μL培养上清用于外来体分泌量的定量，将剩余的培养上清用于细胞数的定量。各定量与实施例1同样地进行。
将所得外来体量除以细胞数，作为每细胞数的外来体分泌量，比较了作为候选而举出的针对各靶基因的siRNA的效果。
比较的结果判明了NAPG的siRNA具有显著的外来体分泌抑制作用(图3A、B)。
实施例4 (NAPG的siRNA参与外来体分泌的测定)
在6孔板上在含血清培养基中将5×105个的PC-3ML细胞或MDA-MB-231D3H2LN细胞接种于各孔中。第二天，将培养上清交换成advanced RPMI (2mL/孔)。
向1.5mL容量管中加入100μL的2μM NAPG的siRNA和100μL的aRPMI。
接下来，将DharmaFECT1转染试剂用aRPMI稀释至200μL/孔，在常温下培育5分钟，加入到装有各siRNA的管中。在常温下培育30分钟后，将400μL添加到各细胞的孔中。
第二天，去除培养上清，加入4mL新鲜的aRPMI。再过24小时后，回收了培养上清的总量。回收剩余的细胞，用血细胞计数器计测细胞数并计数。另外，将已回收的培养上清以2,000×g离心10分钟，回收上清，将已回收的培养上清用0.22μm过滤器进行了过滤。将经过滤的培养上清以100,000×g、70分钟、4℃进行了超离心。舍弃上清，用PBS进行了100,000×g、70分钟的洗涤。舍弃上清，向超离心管中加入200μL的PBS，回收外来体，使用Nanosight或microBCA分析(Pierce公司)定量了外来体量。
结果判明了NAPG的siRNA抑制外来体的分泌(图4)。
实施例5 (测定HINT3、GXYLT1的siRNA参与外来体分泌)
对实施例2中作为mir-194的靶基因候选而发现的、HINT3、GXYLT1的基因，也与实施例3进行了同样的分析。
具体而言，在96孔板上在含血清培养基中将1×104个的MDA-MB-231D3H2LN细胞接种于各孔中。第二天，将培养上清交换成advanced RPMI (90μL/孔)。
在另外准备的96孔板中，混合了各10μL 2μM的针对HINT3或GXYLT1的siRNA和10μL的aRPMI。
接下来，将DharmaFECT1转染试剂用aRPMI稀释至10μL/孔，在常温下培育5分钟，加入aRPMI使达到90μL/孔。在PCR板的每1孔中加入90μL该溶液，在常温下培育30分钟。在常温下培育30分钟后，将90μL分别添加到接种有MDA-MB-231D3H2LN细胞的96孔板的各孔中。第二天，去除培养上清，加入60μL新鲜的aRPMI。再过24小时后，将10μL培养上清用于外来体分泌量的定量，将剩余的培养上清用于细胞数的定量。各定量与实施例1同样地进行。
将所得外来体量除以细胞数，作为每细胞数的外来体分泌量，比较了作为候选而举出的针对各靶基因的siRNA的效果。
比较的结果判明了HINT3和GXYLT1的siRNA具有显著的外来体分泌抑制作用(图5)。
实施例6 (NAPG的siRNA抑制体内模型中的癌症转移)
向SCID(スキッド)小鼠的乳腺中以1×106细胞/小鼠移植MDA-MB-231D3H2LN细胞(各组10只)。自移植1周后起每周2次将20μg/小鼠的针对NAPG的siRNA和成为阴性对照的siRNA(AllStars、Qiagen公司)、使用体内JetPEI (Polyplus转染公司)进行了肿瘤内给予(3周、共给予6次)。利用卡尺每周计测一次原发灶的肿瘤大小(图6A)。移植44天后解剖小鼠，进行了肺转移程度的相关评价。制作肺组织的切片，进行了抗人波形蛋白抗体的免疫组织染色。计测各小鼠中以相同抗体成为阳性的微小转移数，计算了每1mm2的微小转移数(图6B)。其结果，给予了针对NAPG的siRNA的小鼠与给予了成为阴性对照的siRNA的小鼠相比，原发灶的肿瘤大小未见差异，但显著地减少了肺的微小转移数。
工业上的可利用性
本发明可利用于药品的领域、特别是抗癌剂的开发和制造的领域。
序列表的自由文本
序列表中的SEQ ID NO：1是人NAPG的mRNA的碱基序列；
序列表中的SEQ ID NO：2是人NAPG的多肽；
序列表中的SEQ ID NO：3是人HINT3的mRNA的碱基序列；
序列表中的SEQ ID NO：4是人类HINT3的多肽；
序列表中的SEQ ID NO：5是人GXLT1的mRNA的碱基序列；
序列表中的SEQ ID NO：6是人GXLT1的多肽。

Claims (14)

1.外来体分泌抑制剂，其含有：抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质。
2.权利要求1所述的外来体分泌抑制剂，其中，抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质的至少一个是核酸。
3.权利要求1或2所述的外来体分泌抑制剂，其中，抑制基因表达的物质是选自该基因的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶、和它们的表达载体的1种以上。
4.药物组合物，其含有：抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中，抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达的物质，或者抑制NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性的物质的至少1个是核酸。
6.权利要求4或5所述的药物组合物，其中，抑制基因表达的物质是选自该基因的siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶、和它们的表达载体的1种以上。
7.权利要求4～6的任一项中所述的药物组合物，其用于癌症治疗或用于抑制癌症转移。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中，癌症是大肠癌或乳腺癌。
9.外来体分泌抑制剂，其含有miR-194。
10.外来体分泌抑制用物质的筛选方法，其中，以NAPG、HINT3、或GXYLT1基因表达或者NAPG、HINT3、或GXYLT1蛋白质活性为指标，以抑制表达或抑制活性的物质为候选化合物。
11.权利要求9所述的筛选方法，其包括下述的步骤(a1)～(c1)：
(a1) 使可测定外来体量的细胞与被检物质接触的步骤；
(b1) 测定接触了被检物质的细胞中的外来体量，将该测定值与未接触被检物质的对照细胞中的外来体量进行比较的步骤；
(c1) 接触了被检物质的细胞中的外来体量低于未接触被检物质的对照细胞中的外来体量的情形下，将被检物质作为外来体分泌抑制用物质进行选择的步骤。
12.权利要求10所述的筛选方法，其包括下述的步骤(a2)～(c2)：
(a2) 使可测定外来体量的细胞与被检物质接触的步骤；
(b2) 测定接触了被检物质的细胞中的外来体量，将该测定值与预先测定的使被检物质接触之前的上述细胞中的外来体量进行比较的步骤；
(c2) 接触了被检物质的细胞中的外来体量低于使被检物质接触之前的外来体量的情形下，将被检物质作为外来体分泌抑制用物质进行选择的步骤。
13.癌症的治疗方法，其包括下述的步骤：向有必要治疗癌症的个体给予其治疗有效量的权利要求1～3的任一项中所述的外来体分泌抑制剂或权利要求4～8的任一项中所述的药物组合物。
14.癌症转移的抑制方法，其包括下述的步骤：向有必要抑制癌症转移的个体给予其治疗有效量的权利要求1～3的任一项中所述的外来体分泌抑制剂或权利要求4～8的任一项中所述的药物组合物。
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