CN114025798B - 癌干细胞标记物以及癌干细胞靶向药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有抑制SDC4的表达或功能的物质的癌干细胞去除剂。提供在癌细胞群中以SDC4的表达为指标来检测或筛选癌干细胞的方法等。
Description
技术领域
本发明涉及属于癌干细胞标记物且作为癌干细胞特异性药物研发靶的Syndecan4(SDC4)、以及以其为指标的癌干细胞的检测方法和以其为靶的癌干细胞特异性抗癌药。
背景技术
近年，已知仅被称为癌干细胞的癌细胞亚群即能够重建癌组织，引起复发和转移这两者。癌干细胞由于分裂速度慢而对抗癌药、放疗显示抗性，可认为是各种癌症的预后不良的要因。反过来说，若打击癌干细胞，则也可以期待根治，因此正在积极地进行用于识别癌干细胞的标记物探索、对已识别的癌干细的特性解析。
在癌细胞中存在蛋白酶体活性极其低的低代谢细胞群，报告了在各种癌中的低蛋白酶体活性细胞与癌干细胞的关联(例如、非专利文献1、2)。本发明人等在胰腺癌细胞株Panc-1中导入了用于使低代谢可视化的经荧光标识的鸟氨酸脱羧酶(ODC)-degron。蛋白酶体活性低的细胞无法分解ODC-degron，荧光蛋白质(ZsGreen)累积而可视化。本发明人等分选出发出荧光的细胞(dZsG+)，将该细胞由整体的0.06％浓缩至81.18％。确认了dZsG+细胞具有成球能力、对抗癌药显示抗性、对已知的癌干细胞标记物Dclk1、CD44v9进行高表达、显示非对称性分裂等癌干细胞的特征性的各种性质。
将非癌干细胞(dZsG-)与癌干细胞(dZsG+)分别对150只免疫不全小鼠进行皮下移植，结果6周后，在所有的小鼠中，非癌干细胞未形成肿瘤，而癌干细胞形成了肿瘤。将对CD44v9进行高表达的非癌干细胞和癌干细胞(dZsG-/CD44v9high和dZsG+/CD44v9high)分别对150只免疫不全小鼠进行皮下移植，结果在所有的小鼠中，仍然是dZsG-/CD44v9high未形成肿瘤，而dZsG+/CD44v9high形成了肿瘤。
针对向106只免疫不全小鼠移植dZsG-/CD44v9-并形成了肿瘤者(肿瘤组1)、移植dZsG+/CD44v9-和dZsG+/CD44v9high者(均通过150个移植而形成了肿瘤；分别为肿瘤组3和肿瘤组4)，使用新一代测序仪进行基因表达解析的结果，通过主成分解析可知三者间存在基因上的区别。关于该基因上的区别，使用分子间网络-路径解析解释分子功能意义，结果发现，相对于肿瘤组1，肿瘤组4中活化的路径与肿瘤组织的增殖/进展、肿瘤细胞的转移/分化/增殖相关，而相对于肿瘤组1，肿瘤组3中活化的路径没有与肿瘤相关。因此，肿瘤组4显然是非常活跃的肿瘤细胞群。
于是，将肿瘤组4的肿瘤进行单细胞化而确立了细胞株(super Panc-1CSC)。从该super Panc-1 CSC分选出dZsG+/CD44v9high群，逐个向免疫不全小鼠进行移植，结果在第45天发现形成肿瘤形成，然后2周期间观察到爆发性的肿瘤增殖。这样，本发明人等成功地由单一细胞获得了具有肿瘤形成能力的癌干细胞。
作为CD44的剪接变体的CD44v9已知为大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等各种癌症中的癌干细胞标记物，不仅单纯作为标识，还报告了也参与癌组织的增大、治疗抗性的获得。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Vlashi,E.et al.,J.Natl.Cancer Inst.,101:350-359(2009)非专利文献2：Adikrisna,R.et al.,Gastroenterology,143:234-245(2012)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供不仅作为能够特异性检测癌干细胞的标记物分子、而且还能够成为杀灭癌干细胞的治疗靶的新型标记物分子，由此提供癌干细胞的新型检测方法、以及癌干细胞靶向治疗药等。
用于解决问题的方案
本发明人等为了实现上述目的而反复进行了深入研究，结果发现，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖Syndecan家族的Syndecan-4(SDC4)在胰腺癌的癌干细胞Panc-1dZsG+/CD44v9high中表达高于非癌干细胞Panc-1dZsG-/CD44v9-。针对来自由106个非癌干细胞的移植得到的肿瘤的培养细胞和来自由150个癌干细胞的移植得到的肿瘤的培养细胞进行了免疫印迹(Western blot)解析，结果与前者相比，后者中的SDC4和CD44v9两者的表达高，可知两者有蛋白质方面的联动。在细胞免疫染色中也确认了两者的局部共存。
从本发明人等确立的胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC分别分选dZsG+/CD44v9high和dZsG+/SDC4high的细胞，逐个对免疫不全小鼠进行移植并比较致瘤能力，结果后者的致瘤率更高，可知SDC4作为癌干细胞标记物比CD44v9更优异。进而，将dZsG+/SDC4high的细胞与SDC4的配体FGF2一同进行移植时，致瘤率上升为约2倍，由此启示了SDC4的信号转导有助于癌干细胞特性。对由dZsG+/CD44v9high和dZsG+/SDC4high的1个细胞产生的肿瘤进行组织荧光染色时，在其中均几乎没有CD44v9阳性细胞，而高频率观察到SDC4阳性细胞。
从super Panc-1 CSC分别分选CD44v9high和SDC4high的细胞，对免疫不全小鼠进行腹腔给药，结果在后者中确认到显著的肿瘤形成和体重减少。进而，从没有进行基因操作的胰腺癌细胞株Panc-1和Bxpc3分别分选CD44v9high和SDC4high细胞，对免疫不全小鼠进行皮下移植，结果对任一细胞株而言，后者均比前者的致瘤率更高。另外，从Bxpc3分别分选CD44v9high和SDC4high的细胞，对免疫不全小鼠进行腹腔给药，结果在后者中确认到显著的肿瘤形成和体重减少。即，可知即使不筛选低代谢细胞群而仅以SDC4的高表达作为指标，也能够从癌细胞群中高效地筛选癌干细胞。
来自大肠癌患者的摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光染色的结果，CD44v9有时也未确认到表达，而SDC4则在任一检体中均确认到高表达。另外，对来自大肠癌患者的摘除癌组织的PDX模型的肿瘤样品、源自该模型的细胞株进行荧光免疫染色，结果SDC4高表达，但CD44v9未确认到表达。进而，从前述源自PDX模型的细胞株分别分选SDC4高表达细胞和低表达细胞，对免疫不全小鼠进行腹腔给药，结果对前者确认到显著的肿瘤形成。对于食道癌细胞株TE4也同样，对SDC4高表达细胞确认到显著的肿瘤形成。根据这些结果，可知SDC4在人类临床的各种癌症中可以作为有效的癌干细胞标记物。
接着，为了研究SDC4是否能够成为针对癌干细胞的治疗靶，本发明人等将独立设计的3种针对SDC4的siRNA和市售的3种SDC4 siRNA分别导入至super Panc-1 CSC和源自来自大肠癌患者的摘除癌组织的PDX模型的细胞株中，结果2种siRNA显示了明显的抗肿瘤效果。通过与化疗剂、mTOR抑制剂的组合使用，这些siRNA的抗肿瘤效果进一步增大。在与Wnt抑制剂的组合使用中，1种siRNA显示了明显的抗肿瘤效果。这些SDC4 siRNA对正常细胞不显示毒性，确认到针对癌干细胞的高选择毒性。另外，SDC4 siRNA不仅在体外(in vitro)，在体内(in vivo)也发挥了抗肿瘤效果。
免疫印迹解析的结果，认为针对SDC4的siRNA所产生的抗肿瘤效果的发挥需要持续的SDC4蛋白质的表达低。为了对针对SDC4的siRNA的癌干细胞的抗肿瘤效果的机理进行研究，从分别导入了发挥抗肿瘤效果的siRNA和对照siRNA的胰腺癌干细胞提取RNA，针对表达明显变化的基因组进行了IPA解析，结果预测了mTOR、PPARγ1A、Jnk、ERK1/2、ERK、Creb等上游调控分子的抑制。另外，将胰腺癌干细胞用Wnt抑制剂进行处理，结果确认到SDC4的表达增加，教导了SDC4对Wnt信号转导的参与。
对由从super Panc-1 CSC分别分选dZsG+/CD44v9high和dZsG+/SDC4high而得到的单一细胞形成的实体肿瘤进行HIF1α和SDC4的免疫染色，结果在HIF1α核染色阳性(低氧区域)确认到多数SDC4阳性细胞，与癌干细胞局部存在于低氧区域的认知是一致的。
与siRNA同样，针对SDC4的抗体也在in vitro和in vivo两者中对各种癌细胞、癌干细胞显示出显著的抗肿瘤效果。抗SDC4抗体也对正常细胞不显示毒性，确认到针对癌干细胞的高选择毒性。
根据Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)数据库，间皮瘤细胞(mesothelioma)的Sdc4 mRNA表达量在整体中高居第3位，因此本发明人等研究了针对间皮瘤细胞株的SDC4 siRNA、抗SDC4抗体的效果。其结果，SDC4 siRNA、抗SDC4抗体均对间皮瘤细胞株显示了显著的抗肿瘤效果。对于以间皮瘤的癌干细胞标记物CD24阳性为指标而分选的间皮瘤癌干细胞，确认到特别强的抗肿瘤效果。
本发明人等基于这些见解，发现SDC4是比已知的癌干细胞标记物CD44v9更优异的癌干细胞标记物，且是针对癌干细胞的治疗药的药物研发靶，成功地开发了通过抑制SDC4的表达而高效地去除癌干细胞的药物，从而完成了本发明。
即、本发明提供以下的技术方案。
[1]一种癌干细胞去除剂，其含有抑制SDC4的表达或功能的物质。
[2]根据[1]所述的癌干细胞去除剂，其中，抑制SDC4的表达的物质为：
(a)对SDC4基因的转录产物具有RNAi活性的核酸或其前体、
(b)针对SDC4基因的转录产物的反义核酸、或
(c)针对SDC4基因的转录产物的核酶核酸。
[3]根据[2]所述的癌干细胞去除剂，其中，抑制SDC4的表达的物质为如下的核酸或其前体：其包含与用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号41～637所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列互补的核苷酸序列。
[4]根据[2]所述的癌干细胞去除剂，其中，抑制SDC4的表达的物质为如下的核酸或其前体：其包含与用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号475～606所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列互补的核苷酸序列。
[5]根据[3]或[4]所述的癌干细胞去除剂，其为siRNA。
[6]根据[1]所述的癌干细胞去除剂，其中，抑制SDC4的功能的物质为：
(a)针对SDC4的抗体、或
(b)针对SDC4的拮抗剂。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的癌干细胞去除剂，其是与其它抗肿瘤药物组合而成的。
[8]根据[7]所述的癌干细胞去除剂，其中，其它抗肿瘤药物为选自化疗药物、Wnt抑制剂以及mTOR抑制剂中的1种以上。
[9]一种在癌细胞群中以SDC4的表达为指标来检测或筛选癌干细胞的方法。
[10]一种癌干细胞的检测用试剂，其含有针对SDC4的抗体。
发明的效果
根据本发明，能够提供以癌干细胞为靶的抗肿瘤药物，因此能够抑制癌症的复发/转移，使癌症的根治成为可能。另外，根据本发明，可提供比已知的癌干细胞标记物更优异的癌干细胞标记物，因此癌干细胞的检测/筛选变得容易。
附图说明
图1-1为示出Panc-1dZsG-/CD44v9-、Panc-1dZsG+/CD44v9high、以及superPanc-1CSC中的基因表达的主成分解析结果的图。
图1-2为示出Panc-1dZsG-/CD44v9-、Panc-1dZsG+/CD44v9high、以及super Panc-1CSC中的SDC4基因的表达比较的图。
图2-1为示出1-1：dZsG-/CD44v9-、1-2：dZsG-/CD44v9high、3-3：dZsG+/CD44v9-、3-4：dZsG+/CD44v9high中的SDC4和CD44v9的表达的图。
图2-2为示出表示super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的细胞中的SDC4和CD44v9的表达的细胞免疫染色的结果的图。红：CD44v9、绿：SDC4、蓝：细胞核
图3-1为示出以单细胞水平下的致瘤能力为指标，SDC4为比CD44v9更优异的癌干细胞标记物的图。
图3-2为示出由单细胞得到的肿瘤的组织机构免疫染色的结果的图。未确认到CD44v9阳性细胞，确认到多数Sdc4阳性细胞，由此显示SDC4是比CD44v9更优异的癌干细胞标记物。HE：苏木精-伊红染色
图4-1为示出以基于腹腔给药的致瘤能力为指标，SDC4为比CD44v9更优异的癌干细胞标记物的图(super Panc-1 CSC)。
图4-2为示出以基于腹腔给药的致瘤能力为指标，SDC4为比CD44v9更优异的癌干细胞标记物的图(Bxpc3)。
图5-1为示出以基于皮下注射的致瘤能力为指标，SDC4为比CD44v9更优异的癌干细胞标记物的图(Panc-1)。
图5-2为示出以基于皮下注射的致瘤能力为指标，SDC4为比CD44v9更优异的癌干细胞标记物的图(Bxpc3)。
图6-1为示出大肠癌患者摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图(No.2检体)。在高恶性度区域中未确认到CD44v9阳性细胞，确认到多数Sdc4阳性细胞。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图6-2为示出大肠癌患者摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图(No.4检体)。未确认到CD44v9阳性细胞，确认到多数Sdc4阳性细胞。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图6-3为示出大肠癌患者摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图(No.6检体)。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图6-4为示出大肠癌患者摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图(No.8检体)。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图7-1为示出大肠癌患者摘除癌组织的PDX模型中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图(No.2检体)。未确认到CD44v9阳性细胞，确认到多数Sdc4阳性细胞。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图7-2为示出源自大肠癌患者摘除癌组织的PDX模型的细胞株(PDX No.2)中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色的结果的图。绿：CD44v9、红：SDC4、蓝：细胞核
图8-1为示出以基于腹腔给药的致瘤能力为指标，SDC4为优异的大肠癌的癌干细胞标记物的图(PDX No.2)。
图8-2为示出以基于腹腔给药的致瘤能力为指标，SDC4为优异的大肠癌的癌干细胞标记物的图(PDX No.2)。
图8-3为示出以基于腹腔给药的致瘤能力为指标，SDC4为优异的食道癌的癌干细胞标记物的图(TE4)。
图9-1为示出基于SDC4靶siRNA的抗肿瘤细胞效果的图。
图9-2为示出基于SDC4靶siRNA与化疗剂的组合使用的抗肿瘤细胞效果的图。
图9-3为示出基于SDC4靶siRNA与Wnt抑制剂FH535的组合使用的抗肿瘤细胞效果的图。
图9-4为示出基于SDC4靶siRNA与Wnt抑制剂PNU的组合使用的抗肿瘤细胞效果的图。
图9-5为示出基于SDC4靶siRNA与mTOR抑制剂的组合使用的抗肿瘤细胞效果的图。
图9-6为示出针对正常细胞和癌干细胞的SDC4靶siRNA的毒性试验的结果的图。
图9-7为示出正常细胞和癌干细胞中的SDC4的表达的图。
图9-8为示出小鼠皮下实体肿瘤模型中的、SDC4靶siRNA的抗肿瘤效果的图。
图10-1为示出基于SDC4靶siRNA的抗肿瘤细胞效果与SDC4表达水平的关系的图。
图10-2为示出利用IPA的上游解析来解析基于SDC4靶siRNA的抗肿瘤细胞效果的机理的结果的图。
图10-3为示出利用Wnt抑制剂在super Panc-1 CSC中诱导SDC4表达的图。
图11为示出在由1个癌干细胞形成的肿瘤中，SDC4在低氧区域表达的图。(a)～(c)源自super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的实体肿瘤。(d)～(f)源自super Panc-1 CSC的dZsG+/SDC4high的实体肿瘤。
图12-1为示出针对大肠癌的Sdc4抗体的抗肿瘤效果的图。
图12-2为示出针对大肠癌的Sdc4抗体的抗肿瘤效果的图。
图12-3为示出针对胰腺癌的Sdc4抗体的抗肿瘤效果的图。
图12-4为示出针对胰腺癌的Sdc4抗体的抗肿瘤效果的图。
图12-5为示出针对正常细胞的Sdc4抗体的毒性试验的结果的图。
图12-6为示出针对正常细胞的Sdc4抗体的毒性试验的结果的图。
图12-7为示出小鼠皮下实体肿瘤模型中的、SDC4抗体的抗肿瘤效果的图。图13-1为示出针对间皮瘤细胞株的SDC4靶siRNA的抗肿瘤细胞效果的图。
图13-2为示出针对间皮瘤细胞株的SDC4抗体的抗肿瘤细胞效果的图。
图13-3为示出针对间皮瘤癌干细胞的SDC4抗体的抗肿瘤细胞效果的图。
具体实施方式
本发明提供含有抑制Syndecan-4(SDC4)的表达或功能的物质的癌干细胞去除剂(以下也称为“本发明的CSC去除剂”。)。
本说明书中，“癌干细胞(CSC)”是具有自我复制能力和多能性的癌细胞，是指特征如下的细胞：具有高致瘤性和转移能力，对化疗剂、放疗有抗性，由干细胞不对称分裂成干细胞和非干细胞。
本说明书中，癌干细胞的癌症种类没有特别限制，可列举出任意的癌症。例如，可以是源自上皮细胞的癌症，也可以是非上皮性的肉瘤、血癌。更具体而言，例如包括消化道癌(例如食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)、胆嚢癌、胆管癌、胰腺癌、肛门癌)、泌尿系统癌(例如肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢(睾丸)癌)、胸部癌(例如乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌))、生殖器癌(例如子宫癌(宫颈癌、子宫内膜癌)、卵巢癌、外阴癌、阴道癌)、头颈癌(例如上颌癌、咽癌、喉癌、舌癌、甲状腺癌)、皮肤癌(例如基底细胞癌、棘细胞癌)、间皮细胞癌(间皮瘤)，但不限定于这些。可优选列举出大肠癌、胰腺癌、食道癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等，可更优选列举出大肠癌、胰腺癌、间皮瘤等。
本发明的CSC去除剂的靶分子SDC4是属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖Syndecan家族的单次跨膜型蛋白质，人类具有用序列编号2表示的由198个氨基酸构成的氨基酸序列，其中1-18位为信号肽、19-145位为细胞外区域、146-170位为跨膜区域、171-198位为细胞内区域。
本说明书中，“SDC4”是包含与用序列编号2表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。本说明书中，蛋白质和肽按照肽标记的惯例，以左端为N末端(氨基末端)、右端为C末端(羧基末端)进行记载。
“与用序列编号2表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列”是指：
(a)由用序列编号2表示的氨基酸序列构成的人SDC4的、其他恒温动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔子、狗、猪、羊、牛、猴子等)中的直系同源的氨基酸序列；或
(b)由用序列编号2表示的氨基酸序列构成的人SDC4或上述(a)的直系同源的天然的等位基因突变体或基因多型中的氨基酸序列。
优选的是，SDC4为由用序列编号2表示的氨基酸序列构成的人SDC4或其天然的等位基因突变体或基因多型。作为该基因多型，例如可列举出在dbSNP中作为rs2228384登记的、12位的Phe(TTC)置换为Leu(CTC)的SNP，但不限定于此。
本发明中，“抑制SDC4的表达的物质”可以是在SDC4基因的转录水平、转录后调节的水平、向蛋白质的翻译水平、翻译后修饰的水平等任何阶段产生作用的物质。因此，作为抑制SDC4的表达的物质，例如包括：抑制SDC4基因的转录的物质(例、反基因)、抑制由初期转录产物向mRNA的加工的物质、抑制向mRNA的细胞质的输送的物质、抑制由mRNA向蛋白质的翻译(例、反义核酸、miRNA)或分解mRNA(例、siRNA、核酶、miRNA)的物质、抑制初期翻译产物的翻译后修饰的物质等。在任一阶段产生作用的物质均可使用，但优选为与mRNA互补地结合并抑制向蛋白质的翻译或分解mRNA的物质。
作为特异性地抑制由SDC4基因的mRNA向蛋白质的翻译(或分解mRNA)的物质，可优选列举出：包含与该mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸。
与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列是指，在生理条件下，具有能够与该mRNA的靶序列结合并抑制其翻译(或将该靶序列切断)的程度的互补性的核苷酸序列，具体而言，例如为与该mRNA的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列(即、mRNA的互补链的核苷酸序列)、以及关于重叠的区域具有90％以上、优选为95％以上、更优选为97％以上、特别优选为98％以上的相同性的核苷酸序列。本发明中的“核苷酸序列的相同性”可以使用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information BasicLocal Alignment Search Tool)，按照以下的条件(期待值＝10；允许空位(gap)；Filtering＝ON；Match score＝1；Mismatch score＝-3)进行计算。
更具体而言，与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列是与用序列编号1表示的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。此处，“严格的条件”例如是指Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,6.3.1-6.3.6,1999中该记载的条件，例如可列举出：6×SSC(sodiumchloride/sodium citrate)/45℃下的杂交、然后在0.2×SSC/0.1％SDS/50～65℃下清洗一次以上等，本领域技术人员可以适当选择可提供与此同等的严格性的杂交条件。
作为SDC4基因的mRNA的优选例，可列举出：包含用序列编号1表示的核苷酸序列的人SDC4A(RefSeq Accession No.NM_002999)、或者其它恒温动物中的其直系同源、进而它们的天然等位基因突变体或基因多型等mRNA。
“与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的一部分”只要是能够与SDC4基因的mRNA特异性结合、且能够抑制从该mRNA的蛋白质翻译(或将该mRNA分解)的核苷酸序列，其长度、位置就没有特别限制，从序列特异性的方面来看，以至少10个碱基以上、优选为15个碱基以上、更优选为19个碱基以上包含与靶序列互补的部分。
具体而言，作为包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的的核苷酸序列的一部分的核酸，可优选例示以下(a)～(c)中的任一者。
(a)对SDC4基因的mRNA具有RNAi活性的核酸或其前体
(b)针对SDC4基因的mRNA的反义核酸
(c)针对SDC4基因的mRNA的核酶核酸
(a)对SDC4基因的mRNA具有RNAi活性的核酸或其前体
本说明书中，包含与SDC4基因的mRNA互补的低聚RNA及其互补链的双链RNA、即所谓的siRNA定义为包括在包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸中。
siRNA可以基于靶基因的cDNA序列信息，按照例如Elbashir等(Genes Dev.,15,188-200(2001))倡导的规则进行设计。作为siRNA的靶序列，例如可列举出AA+(N)19、AA+(N)21或者NA+(N)21(N为任意的碱基)等，但不限定于这些。靶序列的位置也没有特别限制。关于所选择的靶序列的候选组，使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等同源搜索软件调查靶以外的mRNA中的16-17个碱基的连续序列是否有相同性，确认所选择的靶序列的特异性。例如，将AA+(N)19、AA+(N)21或NA+(N)21(N为任意的碱基)作为靶序列时，关于已确认特异性的靶序列，可以设计包含在AA(或NA)之后的19-21个碱基中具有TT或UU的3’末端突出的有义链以及具有与该19-21个碱基互补的序列和TT或UU的3’末端突出的反义链的双链RNA作为siRNA。另外，siRNA的前体即短发夹RNA(shRNA)可以通过适当选择可形成环结构的任意连接序列(例如、5-25个碱基左右)并使上述有义链与反义链介由该连接序列连接而进行设计。
siRNA和/或shRNA的序列可使用在各种web站点上免费提供的检索软件进行检索。作为这种站点，例如可列举出Dharmacon提供的siDESIGN Center(http://dharmacon.horizondiscovery.com/jp/design-center/？rdr＝true&LangType＝1041&pageid＝17179928204)、GenScript提供的siRNA Target Finder(https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder)等，但不限定于这些。基于检索到的siRNA序列信息合成的siRNA或shRNA实际上能够以治疗上有效的程度抑制癌干细胞中的SDC4表达，例如如后述的实施例2的(4-1)所示，可以通过测定从该核酸的导入起3天后的癌干细胞中的SDC4蛋白的表达水平来进行验证。需要说明的是，原本具有RNAi活性但导入后3天以内SDC4蛋白表达抑制效果减弱的情况下，通过如后述那样对siRNA或shRNA的构成核苷酸施加各种修饰来提高其体内稳定性，从而能够使SDC4的表达抑制效果更持久，能够实现期望的治疗效果。
在优选的实施方式中，本发明的siRNA和shRNA包含与用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号41～637所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列互补的核苷酸序列。特别优选的一个实施方式中，本发明的siRNA和shRNA包含与用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号475～606、更优选为564～594所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列互补的核苷酸序列。
本说明书中，以SDC4基因的mRNA为靶的微小RNA(miRNA)也同样定义为包括在包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸中。miRNA通过与作为靶的mRNA互补地结合而抑制mRNA的翻译，或者通过分解mRNA来参与基因表达的转录后控制。
关于miRNA，首先由将其进行编码的基因转录为一次转录产物primary-microRNA(pri-miRNA)，接着通过Drosha而被加工为具有特征性的发夹结构的约70个碱基长度的precursor-microRNA(pre-miRNA)后，从核输送至细胞质，进而，通过基于Dicer间插的加工而成为成熟型miRNA，被吸收至RISC并作用于靶mRNA。因此，作为miRNA的前体，也可以使用pre-miRNA、pri-miRNA、优选为pre-miRNA。
miRNA可以使用在各种web站点上免费提供的靶预测软件来进行检索。作为这种站点，例如可列举出：美国怀特海研究所公开的TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、希腊的亚历山大·弗莱明生物医学科学研究中心公开的DIANA-micro-T-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php？r＝microT_CDS/index)等，但不限定于这些。或者也可以使用切萨里大学·巴斯德研究所等公开的、实验上证明了作用于靶mRNA的miRNA相关的数据库TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r＝tarbase v8/index)来检索以SDC4 mRNA为靶的miRNA。例如，作为在该数据库中检索到的针对SDC4 mRNA的miRNA之中的、在上述靶预测软件中分数高的miRNA，例如可列举出hsa-miR-1277-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-936等。这些miRNA和/或pre-miRNA的序列信息例如可以使用英国曼彻斯特大学公开的miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)来获取。
构成siRNA和/或shRNA、或者miRNA和/或pre-miRNA的核苷酸分子可以是天然型RNA或者DNA，但为了提高稳定性(化学上和/或对酶)、比活性(与RNA的亲和性)，可以包含各种化学修饰。例如，为了防止由核酸酶等水解酶造成的分解，可以将构成反义核酸的各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯)取代为例如硫代磷酸酯(PS)、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等化学修饰磷酸残基。另外，可以将各核苷酸的糖(核糖)的2’位的羟基取代为-OR(R＝CH3(2’-O-Me)、CH2CH2OCH3(2’-O-MOE)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等)。进而，也可以对碱基部分(嘧啶、嘌呤)施加化学修饰，例如可列举出向嘧啶碱基的5位导入甲基、阳离子性官能团、或将2位的羰基取代为硫羰基等。
RNA的糖部的构象为C2’-endo(S型)和C3’-endo(N型)两者主导，单链RNA中以这两者的平衡的形式存在，但形成双链时固定为N型。因此，为了对靶RNA赋予强结合能力，通过使2’氧与4’碳进行交联而将糖部的构象固定为N型的RNA衍生物BNA(LNA)(Imanishi,T.etal.,Chem.Commun.,1653-9,2002；Jepsen,J.S.et al.,Oligonucleotides,14,130-46,2004)、ENA(Morita,K.et al.,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,22,1619-21,2003)也同样可以优选使用。
siRNA可以如下地制备：用DNA/RNA自动合成机分别合成mRNA上的靶序列的有义链和反义链，在适当的退火缓冲液中、约90～约95℃下进行约1分钟左右的改性后，在约30～约70℃下进行约1～约8小时的退火，由此制备。另外，也可以通过合成作为siRNA的前体的shRNA并将其用dicer切断来制备。miRNA和pre-miRNA可以基于它们的序列信息利用DNA/RNA自动合成机来合成。
本说明书中，被设计为可以在生物体内生成针对SDC4基因的mRNA的siRNA或miRNA的核酸也同样定义为包括在包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸中。作为这样的核酸，可列举出以表达上述shRNA或者siRNA、或miRNA或者pre-miRNA的方式构建的表达载体等。shRNA可以如下地制备：设计包含将mRNA上的靶序列的有义链和反义链之间插入可形成适当的环结构的长度(例如5～25个碱基左右)的间隔序列而连接的核苷酸序列的低聚RNA，将其用DNA/RNA自动合成机进行合成，从而制备。表达shRNA的载体有串联型和茎环(发夹)型。前者是将siRNA的有义链的表达盒与反义链的表达盒串联而成的，是指通过在细胞内各链进行表达并退火而形成双链的siRNA(dsRNA)。另一方面，后者是将shRNA的表达盒插入到载体中，是指在细胞内表达shRNA并受到基于dicer的加工而形成dsRNA。作为启动子，也可以使用polII系启动子(例如、CMV前初期启动子)，但为了准确地进行短RNA的转录，通常使用polIII系启动子。作为polIII系启动子，可列举出小鼠和人的U6-snRNA启动子、人H1-RNase PRNA启动子、人缬氨酸-tRNA启动子等。另外，作为转录终止信号，使用4个以上T连续而成的序列。miRNA、pre-miRNA的表达盒也可以与shRNA同样地制作。
接着，将如此构建的siRNA或者shRNA、或miRNA或者pre-miRNA表达盒插入到质粒载体、病毒载体中。作为这样的载体，可使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体、动物细胞表达质粒等。
(b)针对SDC4基因的mRNA的反义核酸
本发明中的“针对SDC4基因的mRNA的反义核酸”是指包含与该mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸，通过与靶mRNA形成特异性且稳定的双链而结合，从而具有抑制蛋白质合成的功能。
反义核酸可列举出：含有2-脱氧-D-核糖的多聚脱氧核糖核苷酸、含有D-核糖的多聚核糖核苷酸、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的其它类型的多聚核苷酸、具有非核苷酸骨架其它聚合物(例如、市售的蛋白质核酸以及合成序列特异性的核酸聚合物)或含有特殊结合的其它聚合物(其中，该聚合物含有具有允许像DNA、RNA中所发现的碱基的配对、碱基的附着的配置的核苷酸)等。这些可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、DNA:RNA杂交，进而还可以是非修饰多聚核苷酸(或非修饰低聚核苷酸)、施加了公知的修饰者、例如具有该领域已知的标识者、赋予了端帽(cap)者、被甲基化者、将1个以上的天然核苷酸用类似物进行了取代者、进行了分子内核苷酸修饰者、例如具有非带电结合(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)者、具有带电结合或含硫结合(例：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、例如蛋白质(例：核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)、糖(例：单糖等)等具有侧链基者、具有嵌入化合物(例：吖啶、补骨脂素等)者、含有螯合化合物(例如金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)者、含有烷基化剂者、具有修饰的结合者(例如α异构型的核酸等)。此处，“核苷”、“核苷酸”以及“核酸”不仅含有嘌呤和嘧啶碱基，也可以包括具有经修饰的其它杂环型碱基者。这样的修饰物可以是甲基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤和嘧啶、或者包含其它杂环者。另外，经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以修饰糖部分，例如可以是1个以上羟基被卤素等、脂肪族基团等取代，或被转化为醚、胺等官能团。
如上所述，反义核酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合体。反义核酸为DNA时，由靶RNA与反义DNA形成的RNA:DNA杂交可以被内源性RNase H识别并引起靶RNA的选择性分解。因此，导向基于RNase H的分解的反义DNA的情况下，靶序列不仅可以是mRNA中的序列，也可以是SDC4基因的初期翻译产物中的内含子区域的序列。内含子序列可以通过将基因组序列与SDC4基因的cDNA核苷酸序列用BLAST、FASTA等同源检索程序进行比较来确定。
本发明的反义核酸的靶区域只要是通过使该反义核酸进行杂交，结果可抑制向蛋白质的翻译，其长度就没有特别限制，可以是编码蛋白质的mRNA的全序列，也可以是部分序列，较短者可列举出约10个碱基左右，较长者可列举出mRNA或者初期转录产物的全序列。若考虑合成的容易程度、抗原性、细胞内迁移性的问题等，则优选由约10个～约40个碱基、特别是由约15个～约30个碱基构成的低聚核苷酸，但不限定于此。具体而言，可选择SDC4基因的5’端发夹环、5’端6-碱基对·重复、5’端非翻译区域、翻译起始密码子、蛋白质编码区域、ORF翻译终止密码子、3’端非翻译区域、3’端回文区域或3’端发夹环等作为反义核酸的优选靶区域，但不限定于这些。
一个实施方式中，作为本发明的反义核酸的靶区域，与上述siRNA同样地，可列举出：包含用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号41～637所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列，特别是用序列编号1表示的核苷酸序列中核苷酸编号475～606、更优选为564～594所示的区域内的、由连续的至少15个核苷酸构成的序列。
进而，本发明的反义核酸不仅与SDC4基因的mRNA、初期转录产物杂交而抑制向蛋白质的翻译，还可以是与作为双链DNA的这些基因结合而形成三链(Triplex)，从而能够抑制向RNA的转录的物质(反基因)。
另外，构成反义核酸的核苷酸分子也可以为了提高稳定性、比活性等而受到与上述siRNA等情况同样的修饰。
本发明的反义低聚核苷酸可以如下地制备：基于SDC4基因的cDNA序列或者基因组DNA序列确定mRNA或者初期转录产物的靶序列，使用市售的DNA/RNA自动合成机(AppliedBiosystems公司、Beckman公司等)合成与其互补的序列，由此制备。另外，包含上述各种修饰的反义核酸也均能够通过本身公知的手法进行化学合成。
(c)针对SDC4基因的mRNA的核酶核酸
作为包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸的其它例子，可列举出可将该mRNA在编码区域的内部特异性地切断的核酶核酸。“核酶”狭义上是指具有用于切断核酸的酶活性的RNA，但在本说明书中，采用只要具有序列特异性的核酸切断活性则也包括DNA的概念。作为核酶核酸，作为通用性最高的物质，有在类病毒、拟病毒等感染性RNA中发现的自我剪接RNA，已知锤头型、发夹型等。锤头型以约40个碱基左右发挥酶活性，使邻接于形成锤头结构的部分的两端的数个碱基分别为(一共约10个碱基左右)与mRNA的期望切断部位互补的序列，从而能够仅将靶mRNA特异性切断。这种类型的核酶核酸具有仅以RNA为基质，因此不会攻击基因组DNA的进一步的利点。SDC4基因的mRNA以自身形成双链结构时，通过使用连接于源自能够与RNA解旋酶特异性结合的病毒核酸的RNA模体的杂交核酶，能够使靶序列成为单链[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(10):5572-5577(2001)]。进而，将核酶以包含将其编码的DNA的表达载体的形态使用时，为了促进转录产物向细胞质的迁移，也可以采用进一步连接有改变了tRNA的序列的杂交核酶[Nucleic AcidsRes.,29(13):2780-2788(2001)]。
包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸可以以脂质体、微球体之类的特殊形态提供，或应用于基因治疗，或以附加形态提供。作为以附加形态使用的情况，可列举出用于中和磷酸基骨架的电荷的多聚赖氨酸之类的多聚阳离子体、提高与细胞膜的相互作用或增大核酸的吸收之类的脂质(例：磷脂、胆固醇等)等疏水性物质。作为优选用于附加的脂质，可列举出胆固醇、其衍生物(例：氯甲酸胆固醇酯、胆酸等)。这样的物质能够附着于核酸的3’端或5’端，能够借助碱基、糖、分子内核苷结合而附着。作为其它基团，可列举出在核酸的3’端或5’端特异性配置的端帽用基团、用于阻止核酸外切酶、RNase等核酸酶造成的分解的基团。作为这样的端帽用基团，可列举出以聚乙二醇、聚丁二醇为代表的该领域已知的羟基的保护基，但不限定于这些。
这些核酸的SDC4蛋白质表达抑制活性可以使用导入了SDC4基因的转化体、生物体内、生物体外的SDC4基因表达体系、或生物体内、生物体外的SDC4蛋白质翻译体系进行研究。
本发明中的抑制SDC4的表达的物质不限于如上所述的包含与SDC4基因的mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其中一部分的核酸，只要直接或间接抑制SDC4蛋白质的产生，则也可以是低分子化合物等其它物质。
本发明中的“抑制SDC4的功能的物质”只要是抑制有助于功能性产生的SDC4的癌干细胞特性的功能(例：借助配体FGF2的信号传导等)，则可以为任何物质，例如可列举出：与SDC4结合而抑制前述功能的物质、抑制SDC4与配体的结合活性的物质、抑制SDC4向细胞膜的迁移的物质等。
具体而言，作为抑制SDC4的功能的物质，例如可列举出针对SDC4的抗体。该抗体为多克隆抗体、单克隆抗体中的任一者均可。这些抗体可以按照本身公知的抗体或抗血清的制造法来制造。抗体的同种型没有特别限定，可优选列举出IgG、IgM或IgA、可特别优选列举出IgG。另外，该抗体只要至少具有用于特异性识别SDC4并结合的互补决定区(CDR)，就没有特别限制，除完全抗体分子之外，例如还可以为Fab、Fab'、F(ab’)2等片段、scFv、scFv-Fc、minibody、diabody等基因工学上制作的共轭分子、或者用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定化作用的分子等进行了修饰的它们的衍生物等。
优选的一个实施方式中，针对SDC4的抗体被用作以人为给药对象的医药品，因此该抗体(优选为单克隆抗体)为对人给药时显示抗原性的危险性得以降低的抗体，具体而言为完全人抗体、人源化抗体、小鼠-人嵌合抗体等，特别优选为完全人抗体。人源化抗体和嵌合抗体可以按照常法在基因工学上制作。另外，完全人抗体也可以通过人-人(或者小鼠)杂交瘤来制造，但为了稳定且低成本地提供大量抗体，理想的是使用产生人抗体的小鼠、噬菌体展示法来制造。
另外，抑制SDC4的功能的物质例如可以是与配体FGF2竞争性地结合于SDC4的拮抗剂。这种拮抗剂可以通过构建使用了SDC4和FGF2的竞争检测体系并筛选化合物库而获取。
如后述实施例所示，抑制SDC4的表达或者功能的物质具有特异性地作用于癌干细胞并将其杀灭的效果，因此作为癌细胞靶治疗药，对癌症的根治有用。另外，抑制SDC4的表达或者功能的物质对正常细胞为低毒性，可发挥副作用的风险低这一进一步有利的效果。因此，含有抑制SDC4的表达或者功能的物质的药物可以用作癌干细胞的去除药、以及癌症的治疗药。
抑制SDC4的表达或者功能的物质可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。2种以上抑制SDC4的表达或者功能的物质可以分别作为单独的药物而制剂化，也可以配混在同一药物组合物中。2种以上抑制SDC4的表达或者功能的物质分别作为单独的药物而制剂化时，可以将各制剂同时进行给药，也可以隔开时间而进行给药。另外，给药途径可以相同也可以不同。后述给药量表示1种抑制SDC4的表达或者功能的物质的给药量，但在组合使用2种以上的物质时，在不会对给药对象造成不良印象的范围内，也可以对各物质使用同样的给药量。
(1)含有反义核酸、核酶核酸、siRNA及其前体的药物
能够与SDC4基因的转录产物互补地结合并抑制由该转录产物向蛋白质的翻译的本发明的反义核酸(或者miRNA)、以SDC4基因的转录产物中的相同的(或者互补的)碱基序列为靶并能够切断该转录产物的siRNA(或者核酶、miRNA)、进而该siRNA、miRNA的前体即shRNA、pre-miRNA等(以下有时统称为“本发明的核酸“)能够作为癌干细胞的去除药、进而作为癌症的治疗药使用。
含有本发明的核酸的药物可以直接以液剂的形式、或以适当剂型的药物组合物的形式对人或非人恒温动物(例：大鼠、兔子、羊、猪、牛、猫、狗、猴、鸡等)通过经口或非经口方式(例：血管内给药、皮下给药等)进行给药。
将本发明的核酸用作癌干细胞的去除药时，可以按照本身公知的方法制剂化并进行给药。即，可以单独使用本发明的核酸，或者也可以以可作用的方式插入到逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等适当的哺乳动物细胞用的表达载体中。该核酸可以直接或者与用于促进摄取的助剂一起，通过基因枪、水凝胶导管之类的导管进行给药。或者也可以气溶胶化从而以吸入剂的形式进行气管内局部给药。
进而，出于体内代谢动力学的改良、半衰期的长期化、细胞内吸收效率的改善等目的，也可以将前述核酸单独或与脂质体等载体一同制剂(注射剂)化并对静脉、皮下等进行给药。
本发明的核酸可以将其本身进行给药，或也可以以适当的药物组合物的形式进行给药。作为用于给药的药物组合物，可以包含本发明的核酸与药学上可允许的载体、稀释剂或赋形剂。这样的药物组合物可以以适合于经口或非经口给药的剂形的形式提供。
作为用于非经口给药的组合物，例如可使用注射剂、栓剂、鼻内给药剂等，注射剂可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂形。这样的注射剂可以按照公知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如可以通过使上述本发明的核酸在通常用于注射剂的无菌的水性液或油性液中溶解、悬浮或乳化而制备。作为注射用的水性液，例如可使用生理食盐水、含有葡萄糖、其它辅助药物的等渗溶液等，可以与适当的溶解助剂例如醇(例：乙醇)、多元醇(例：丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂〔例：聚山梨醇酯80、HCO-50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕等组合使用。作为油性液，例如可使用芝麻油、大豆油等，作为溶解助剂，可以组合使用苯甲酸苄酯、苄醇等。所制备的注射液优选填充在适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述核酸与通常的栓剂基质混合而制备。
作为用于经口给药的组合物，可列举出固体或液体的剂形，具体而言为片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。这样的组合物通过公知的方法制造，可以包含制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或者赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如可使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
上述非经口用或经口用药物组合物制备成适合于活性成分的给药量的剂量单位的剂形是方便的。作为这样的剂量单位的剂形，例如可列举出片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。本发明的核酸优选例如在每单位剂量单位剂形中通常含有0.01～500mg左右。
含有本发明的核酸的上述药物的给药量也因给药对象、对象疾患、症状、给药路径等而异，例如在癌症的治疗/复发预防中为了去除癌干细胞而使用时，方便的是将本发明的核酸以1次量计，按照通常0.0001～20mg/kg体重左右、1日～6个月1次左右通过静脉注射进行给药。在其它非经口给药和经口给药的情况下也可以依据该量进行给药。症状特别严重时，也可以根据其症状而增量。
需要说明的是，前述各组合物中，只要不会对与本发明的核酸的配合产生不良的相互作用，就也可以含有其它活性成分。作为其它活性成分，例如可以适宜配混对癌症具有治疗效果的各种化合物。例如，作为其它活性成分，可以含有烷基化药物(例：芥子类、亚硝基脲类)、代谢拮抗药物(例：叶酸系、嘧啶系、嘌呤系)、抗肿瘤性抗生物质(例：蒽醌)、激素类药物(例、抗雌激素药物、抗雄激素药物、LH-RH激动剂、黄体酮、雌二醇)、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂(例：拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂)、生物制剂(例：干扰素、白细胞介素)、分子靶向药物(例：抗体(例：曲妥珠单抗、帕尼单抗)、低分子(吉非替尼、厄洛替尼、索拉非尼)、维甲酸)等。特别是化疗药物(例：吉西他滨、奥沙利铂等)、Wnt抑制剂(例：FH535、PNU、IWR等)、mTOR抑制剂(例：雷帕霉素等)通过与本发明的核酸组合使用，能够对癌干细胞发挥优异的抗肿瘤细胞效果。
(2)含有针对SDC4的抗体、抑制SDC4的表达或功能的低分子化合物等的药物
针对SDC4的抗体、抑制SDC4的表达或功能的低分子化合物能够抑制SDC4的产生或有助于其癌干细胞特性的功能。因此，这些物质能够作为癌干细胞的去除药、进而作为癌症的治疗药使用。
含有上述抗体、低分子化合物的药物可以直接以液剂的形式、或以适当剂型的药物组合物的形式对人或其它恒温动物(例：大鼠、兔子、羊、猪、牛、猫、狗、猴、鸡等)通过经口或非经口方式(例：血管内给药、皮下给药等)进行给药。
上述抗体、低分子化合物可以将其本身进行给药，或也可以以适当的药物组合物的形式进行给药。作为用于给药的药物组合物，可以包含上述抗体或者低分子化合物或其盐与药学上可允许的载体、稀释剂或赋形剂。这样的药物组合物可以以适合于经口或非经口给药的剂形的形式提供。
作为用于非经口给药的组合物，例如可使用注射剂、栓剂、鼻内给药剂等，注射剂可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂形。这样的注射剂可以按照公知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如可以通过使上述本发明的抗体或者低分子化合物或其盐在通常用于注射剂的无菌的水性液或油性液中溶解、悬浮或乳化而制备。作为注射用的水性液，例如可使用生理食盐水、含有葡萄糖、其它辅助药物的等渗溶液等，可以与适当的溶解助剂例如醇(例：乙醇)、多元醇(例：丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂〔例：聚山梨醇酯80、HCO-50(polyoxyethylene(50mol)adduct ofhydrogenated castor oil)〕等组合使用。作为油性液，例如可使用芝麻油、大豆油等，作为溶解助剂，可以组合使用苯甲酸苄酯、苄醇等。所制备的注射液优选填充在适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述抗体或其盐与通常的栓剂基质混合而制备。
作为用于经口给药的组合物，可列举出固体或液体的剂形，具体而言为片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。这样的组合物通过公知的方法制造，可以包含制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或者赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如可使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
上述非经口用或经口用药物组合物制备成适合于活性成分的给药量的剂量单位的剂形是方便的。作为这样的剂量单位的剂形，例如可列举出片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。抗体、低分子化合物优选在每单位剂量单位剂形中通常含有0.1～500mg、尤其在注射剂中含有5～100mg、在其它剂形中含有10～250mg。
含有上述抗体或者低分子化合物或其盐的上述药物的给药量也因给药对象、对象疾患、症状、给药路径等而异，例如，方便的是，以1次量计，将抗体或者低分子化合物按照通常0.0001～20mg/kg体重左右，若为低分子化合物则1天1～5次左右，通过经口或非经口给药，若为抗体则1天～数月1次，通过静脉注射给药。其它非经口给药和经口给药的情况下也可以依据该量进行给药。症状特别严重时，也可以根据其症状而增量。
需要说明的是，前述各组合物中，只要不会对与上述抗体、低分子化合物的配合产生更不良的相互作用，就也可以含有其它活性成分。例如，作为其它活性成分，可以含有烷基化药物(例：芥子类、亚硝基脲类)、代谢拮抗药物(例：叶酸系、嘧啶系、嘌呤系)、抗肿瘤性抗生物质(例：蒽醌)、激素类药物(例：抗雌激素药物、抗雄激素药物、LH-RH激动剂、黄体酮、雌二醇)、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂(例、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂)、生物制剂(例：干扰素、白细胞介素)、分子靶向药物(例：抗体(例：曲妥珠单抗、帕尼单抗)、低分子(吉非替尼、厄洛替尼、索拉非尼)、维甲酸)等。
另外，本发明提供通过在癌细胞群中以SDC4的表达为指标来检测或筛选癌干细胞的方法(以下也称“本发明的检测/筛选方法”。)。
如后述实施例所示，SDC4是比已知的癌干细胞标记物CD44v9更优异的癌干细胞标记物。因此，可以以SDC4的表达为指标，从癌细胞群中特异性地检测并筛选癌干细胞。
可利用本发明的检测/筛选方法进行检测/筛选的癌干细胞的癌症种类没有特别限制，可列举出任意的癌症。例如，可以是源自上皮细胞的癌症，也可以是非上皮性的肉瘤、血癌。更具体而言，例如包括消化道癌(例如食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)、胆嚢癌、胆管癌、胰腺癌、肛门癌)、泌尿系统癌(例如肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢(睾丸)癌)、胸部癌(例如乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌))、生殖器癌(例如子宫癌(宫颈癌、子宫内膜癌)、卵巢癌、外阴癌、阴道癌)、头颈癌(例如上颌癌、咽癌、喉癌、舌癌、甲状腺癌)、皮肤癌(例如基底细胞癌、棘细胞癌)、间皮细胞癌(间皮瘤)，但不限定于这些。可优选列举出大肠癌、胰腺癌、食道癌、间皮瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等，可更优选列举出大肠癌、胰腺癌、食道癌、间皮瘤等。
本发明的检测/筛选方法中，SDC4的表达优选可以使用针对SDC4的抗体并使用各种免疫化学手法进行检测。作为针对SDC4的抗体，可以同样地使用作为前述癌干细胞去除剂的有效成分而使用的抗体。为了其目的，可以使用完全抗体分子，另外，也可以使用抗体分子的F(ab')2、Fab'、或Fab部分等任意片段。
成为癌干细胞的检测/筛选对象的癌细胞群没有特别限制，例如可以是从癌症患者摘除的癌组织、由癌组织诱导的癌细胞株等。
作为用于使用标识物质的测定法的标识剂，例如可使用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，例如可使用[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。作为上述酶，优选稳定且比活性大的酶，例如可使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，例如可使用荧光胺、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。作为发光物质，例如可使用鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、光泽精等。
可以用直接标识物质来标识本发明的抗体，也可以间接地标识。在优选的方式中，抗SDC4抗体可以采用非标识抗体，通过针对制作该抗SDC4抗体的动物的抗血清、抗Ig抗体等被标识的二次抗体检测SDC4。或者也可以使用生物素化的二次抗体，形成SDC4-抗SDC4抗体-二次抗体的复合体，使用对其进行标识的链霉亲和素进行可视化。
例如，将被检癌细胞样品用戊二醛、多聚甲醛等进行固定/透过处理，用PBS等缓冲液清洗、用BSA等封闭后，与本发明的抗iPS/ES细胞抗体进行孵育。可以用PBS等缓冲液清洗而去除未反应的抗体后，利用对与抗SDC4抗体反应的细胞进行标识的二次抗体使其可视化，使用共聚焦激光扫描型显微镜、IN Cell Analyzer(Amarsham/GE)等自动化的活细胞图像解析装置等进行解析。
其它实施方式中，可以使用抗SDC4抗体从包含癌干细胞的癌细胞群中分离癌干细胞。为了该目的，例如可以将抗SDC4抗体固定在包含琼脂糖、丙烯酰胺、Sepharose、Sephadex等任意适当的基质的固相上。该固相可以是微量滴定板等任意适当的培养器。使样品与该固相接触时，样品中的癌干细胞被固定在该固相上。该细胞可以使用适当的溶出缓冲液而从固相游离。
其它实施方式中，可以将抗SDC4抗体固定在磁性微珠上，施加磁场时，癌干细胞从样品中分离(即、磁活化细胞分离(MACS))。进而在其它的优选方式中，可以将抗SDC4抗体用上述的任意适当的荧光分子直接或者间接进行标识，使用荧光活性化细胞分选仪(FACS)分离癌干细胞。
另外，本发明提供含有针对SDC4的抗体的、癌干细胞的检测用试剂。作为此处使用的抗SDC4抗体，可同样地使用作为前述癌干细胞去除剂的有效成分而使用的抗体。该抗体可以使用完全抗体分子，另外，也可以使用F(ab')2、Fab'、或Fab部分等任意片段。抗SDC4抗体可以溶解于本身公知的适宜的缓冲液中并冷冻保存。也可以在抗SDC4抗体的基础上组合标识化的二次抗体、反应用缓冲液、封闭液、清洗液等而进行试剂盒化。
以下通过实施例等详细说明本发明，但本发明不受它们的限定。
实施例
实施例1新型癌干细胞标记物的探索
(1)单细胞基因解析
向人胰腺癌细胞株Panc-1(ATCC CRL1469)中导入在CMV启动子的控制下对荧光蛋白质ZsGreen与鸟氨酸脱羧酶-degron的融合蛋白质进行编码的逆转录病毒载体，使低代谢细胞可视化，使用抗CD44v9抗体Anti human CD44v9(提供方：Cosmo Bio；作为二次抗体，Mouse Anti-Rat IgG2a(提供方：BD pharmingen))和FACS(装置名：SH800Z SONY)，分选ZsGreen阴性(dZsG-)/CD44v9阴性(CD44v9-)细胞群和dZsG+/CD44v9高表达(CD44v9high)细胞群。针对这些Panc-1dZsG-/CD44v9-、Panc-1dZsG+/CD44v9high、以及来自将150个Panc-1dZsG+/CD44v9high细胞对免疫不全小鼠进行移植而产生的肿瘤的培养细胞super Panc-1CSC(保藏号：NITE BP-02449)，分别用新一代测序仪(装置名：HiSeq Illumina)进行了基因解析。主成分解析的结果，在PC1(70.7％)+PC2(29.3％)的基因组中，可以将三者从基因上区分，可知存在基因上的区别(图1-1)。
通过单细胞基因解析对属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖Syndecan家族的Syndecan-4(SDC4)的表达进行测定/比较，结果与胰腺癌的非癌干细胞Panc-1dZsG-/CD44v9-(n＝8)相比，癌干细胞Panc-1dZsG+/CD44v9high(n＝9)的SDC4的表达高(Fold Change:4.826；P-value:0.0001)。另一方面，源自由Panc-1dZsG+/CD44v9high产生的肿瘤的细胞株superPanc-1 CSC(n＝13)中，SDC4的表达减少(图1-2)。
(2)SDC4蛋白质的表达
(2-1)免疫印迹
使用以下4种细胞进行免疫印迹。作为抗CD44v9抗体使用Anti human CD44v9(提供方：Cosmo Bio)、作为二次抗体使用Mouse Anti-Rat IgG2a(提供方：BD pharmingen))，作为抗SDC4抗体使用Syndecan-4(5G9)sc-12766(提供方：Santa Cruz)、作为二次抗体使用Alexa Fluor 647(提供方：invitrogen)。
1-1：dZsG-/CD44v9-(来自由1×106个非癌干细胞得到的肿瘤的培养细胞)
1-2：dZsG-/CD44v9high(来自由1×106个非癌干细胞得到的肿瘤的培养细胞)
3-3：dZsG+/CD44v9-(来自由150个癌干细胞得到的肿瘤的培养细胞)
3-4：dZsG+/CD44v9high(来自由150个癌干细胞得到的肿瘤的培养细胞)
结果示于图2-1。与1-1和1-2相比，3-3和3-4中SDC4的表达高，同时CD44v9的表达也高。可知两者在蛋白上有联动。
(2-2)细胞免疫染色
使用胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC，按照与上述(1)同样的方法用FACS分选super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的细胞，培养24小时后进行SDC4与CD44v9的细胞共染色。SDC4的染色使用抗SDC4抗体(提供方：Santa Cruz)和作为二次抗体的Alexa Fluor647(提供方：Invotrogen)来进行。利用Keyecnce all-in-one荧光显微镜(装置名：BZ-X700)进行观察，结果观察到SDC4与CD44v9局部共存的区域(图2-2)。
(3)以单细胞水平的致瘤能力为指标的、SDC4作为癌干细胞标记物的评价
使用胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC，按照与上述(1)同样的方法用FACS分选super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的细胞，如图3-1所示，在SCID beige小鼠(提供方：Oriental Yeast Co.,Ltd.)的背部9处分别逐个进行皮下移植(50μl DMEM+50μl matrigel中1个细胞)。进行184个皮下移植，1～2个月后确认到21个实体肿瘤的形成。其致瘤率为11.4％(图3-1)。
另一方面，同样地使用胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC，用FACS分选super Panc-1 CSC的dZsG+/SDC4high的细胞。作为抗SDC4抗体使用Syndecan-4(5G9)sc-12766(提供方：Santa Cruz)、作为二次抗体使用Alexa Fluor 647(提供方：Invotrogen)。将得到的细胞在SCID beige小鼠的背部9处分别逐个进行皮下移植(50μl DMEM+50μl matrigel中1个细胞)。进行64个皮下移植，1～2个月后确认到11个实体肿瘤的形成。其致瘤率为17.2％(图3-1)。
由以上可知，作为癌干细胞标记物，SDC4比已知标记物CD44v9更优异。
进而，混合SDC4的配体FGF2(含有10μg/ml FGF2的50μl DMEM+50μlmatrigel中1个细胞)并进行皮下移植时，dZsG+/SDC4high细胞的致瘤率增加至33.33％。另一方面，即使在super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的细胞中FGF2进行皮下移植，其致瘤率也为11.11％，没有变化(图3-1)。
(4)由单细胞得到的肿瘤的组织荧光免疫染色
对由super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high的1个细胞得到的肿瘤进行CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色。CD44v9的染色使用抗CD44v9抗体(提供方：Cosmo Bio；作为二次抗体，Mouse Anti-Rat IgG2a(提供方：BD pharmingen))，SDC4的染色使用Syndecan-4(5G9)sc-12766(提供方：Santa Cruz)作为抗SDC4抗体、使用Alexa Fluor 647(提供方：Invotrogen)作为二次抗体。其结果，几乎没有CD44v9阳性细胞(绿)，但以高频率确认到SDC4阳性细胞(红)(图3-2)。
(5)以基于腹腔给药的致瘤能力为指标的、SDC4作为癌干细胞标记物的评价
(5-1)2017年5月14日，用FACS分选以下3组细胞后，分别对SCID beige小鼠以100000个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年7月5日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)仅super Panc-1 CSC的2次抗体
(2)super Panc-1 CSC的CD44v9high上位4％
(3)super Panc-1 CSC的SDC4high上位4％
(1)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也正常，为22.1g，但(2)(3)的小鼠体重分别为16.6g和17.1g，尤其是(3)的小鼠确认了黄疸(图4-1左)。另外，(1)的小鼠在腹腔内未确认到肿瘤，而(2)的小鼠在肠道周围确认到数个肿瘤形成。另一方面，(3)小鼠在肠道周围确认到更多的实体肿瘤，进而在肝胆胰腺周围也有肿瘤形成，肝脏局部变色为黄色，确认到明显的胆嚢肥大(图4-1右)。
(5-2)2017年8月16日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别对SCIDbeige小鼠以98000个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年9月19日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)仅super Panc-1 CSC的2次抗体
(2)super Panc-1 CSC的CD44v9high上位5％
(3)super Panc-1 CSC的SDC4high上位3.5％
(1)(2)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也正常，分别为22.0g和22.1g，但(3)的小鼠的体重为15.1g，确认到黄疸。另外，(1)
(2)的小鼠在腹腔内未确认到肿瘤，但(3)的小鼠特别是在肝胆胰腺周围有肿瘤形成，确认到胆嚢肿大。
(5-3)2017年8月14日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别对SCID beige小鼠以100000个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年10月3日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)仅super Panc-1 CSC的2次抗体
(2)super Panc-1 CSC的CD44v9high上位5％
(3)super Panc-1 CSC的SDC4high上位4％
(1)(2)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也正常，分别为21.2g和21.0g，但(3)的小鼠的体重为16.7g，确认到黄疸。另外，(1)(2)的小鼠在腹腔内未确认到肿瘤，但(3)的小鼠在肠道周围局部确认到实体肿瘤，在肝胆胰腺周围也有肿瘤形成，肝脏局部变色为黄色，确认到明显的胆嚢肥大。
(5-4)2017年8月14日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别对SCIDbeige小鼠以50000个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年9月28日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)仅super Panc-1 CSC的2次抗体
(2)super Panc-1 CSC的CD44v9high上位5％
(3)super Panc-1 CSC的SDC4high上位4.5％
(1)(2)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也正常，分别为18.0和19.4g，但(3)的小鼠的体重为15.0g。另外，(1)(2)的小鼠在腹腔内未确认到明显的肿瘤，但(3)的小鼠在肝胆胰腺周围确认到肿瘤形成。
(5-5)使用其它的胰腺癌细胞株Bxcp3(ATCC CRL-1687)，进行与(5-1)～(5-4)同样的实验。2017年9月6日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别对SCID beige小鼠以21954个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年6月12日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)仅Bxpc3 2次抗体
(2)Bxpc3 CD44v9high上位4％
(3)Bxpc3 SDC4high上位5％
(1)(2)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也正常，分别为21.5和21.3g，但(3)的小鼠的体重为15.2g(图4-2左)。另外，(1)(2)的小鼠在腹腔内未确认到明显的肿瘤，但(3)的小鼠在肝胆胰腺周围确认到肿瘤形成，引起肠梗阻，确认到胃的明显扩张(图4-2右)。
(6)以基于皮下注射的致瘤能力为指标的、SDC4作为癌干细胞标记物的评价
(6-1)Panc-1
1st实验：2017年1月27日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别以50个细胞/100ul(DMEM:matrigel＝1:1)如图5-1那样对SCID beige小鼠的背部进行皮下注射，观察直至同年3月21日的肿瘤形成。
2nd实验：2017年2月28日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别以50个细胞/100ul(DMEM:matrigel＝1:1)如图5-1那样对SCID beige小鼠的背部进行皮下注射，观察直至同年4月13日的肿瘤形成。
(1)Panc-1
(2)Panc-1 CD44v9high上位8.5％
(3)Panc-1 SDC4high上位1％
结果示于图5-1。(3)的细胞的致瘤能力最高。
(6-2)Bxpc3
使用其它的胰腺癌细胞株Bxcp3进行与(6-1)同样的实验。2017年3月5日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别以75个细胞/100ul(DMEM:matrigel＝1:1)如图5-2那样对SCIDbeige小鼠的背部进行皮下注射，观察直至同年6月12日的肿瘤形成。
(1)Bxpc3
(2)Bxpc3 CD44v9high上位4％
(3)Bxpc3 SDC4high上位5％
结果示于图5-2。(3)的细胞的致瘤能力最高。
(7)来自大肠癌患者的摘除癌组织中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色
针对从4位大肠癌患者摘除的癌组织，按照与上述(4)同样的方法进行组织荧光免疫染色。使用的4个样品的一般信息/病理结果示于表1。
[表1]
将No.2检体的样品的组织荧光染色结果的代表例示于图6-1。在如#14那样的中分化区域中，SDC4未染色，但在如#10、#9那样的低分化区域中SDC4为高表达。但是，未确认到癌部的CD44v9的表达。
将No.4检体的样品的组织荧光染色结果的代表例示于图6-2。在#9、#14等区域中SDC4为高表达，但未确认到CD44v9的表达。
将No.6检体的样品的组织荧光染色结果的代表例示于图6-3。在#6、#7等区域中，在细胞膜中确认到高的CD44v9与SDC4的共表达。
将No.8检体的样品的组织荧光染色结果的代表例示于图6-4。在#9、#10中，整体的SDC4的表达高，但细胞膜中也有确认到高的CD44v9与SDC4的共表达的部分。
(8)来自大肠癌患者的摘除癌组织的PDX模型中的CD44v9和SDC4的组织荧光免疫染色
(8-1)将从No.2检体摘除的癌组织如图7-1所示那样对SCID beige小鼠进行移植，使用连续移植5次的肿瘤样品(MP5)，与上述(7)同样地进行荧光免疫染色。其结果，在癌部中，SDC4为高表达，但未确认到CD44v9的表达(图7-1)。
(8-2)使用从No.2检体摘除的癌组织的PDX肿瘤样品(MP5)进行细胞株化。针对得到的细胞株PDX No.2，与上述(7)同样地进行荧光免疫染色。其结果，SDC4为高表达，但未确认到CD44v9的表达(图7-2)。
(9)以使用了PDX No.2的致瘤能力为指标的、SDC4作为癌干细胞标记物的评价
(9-1)2017年9月10日，用FACS分选以下的2组细胞后，分别对SCID beige小鼠以10000个细胞/1ml DMEM进行腹腔给药，同年12月2日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)PDX No.2的SDC4染色下位12％
(2)PDX No.2的SDC4染色上位1.2％
(1)(2)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重分别为22.9和21.4g。但是，(2)的小鼠在腹腔内确认到明显的肿瘤，在肝胆胰腺周围、横隔膜、进而胸腔内壁侧胸膜确认到肿瘤形成(图8-1)。
(9-2)2018年1月30日，用FACS分选以下的3组细胞后，分别对SCIDbeige小鼠(雄)以10000个细胞/800ul DMEM进行腹腔给药，同年3月21日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)PDX No.2的SDC4染色下位12％
(2)PDX No.2的SDC4染色上位1％
(3)仅PDX No.2的2次抗体
(1)(3)的小鼠在外观上没有需要特别记录的事项，体重也分别为29.6g和23.2g。另一方面，(2)的小鼠的体重为20.3g，确认到黄疸(图8-2左)。另外，(2)的小鼠在肠道周围局部有肿瘤形成，在肝胆胰腺周围有明显的肿瘤形成，肝脏局部变色为黄色，确认到胆嚢肥大。(3)的小鼠仅在肝胆胰腺周围局部确认到肿瘤形成。(1)的小鼠未确认到肿瘤形成(图8-2右)。
(10)以使用了食道癌细胞株的致瘤能力为指标的、SDC4作为癌干细胞标记物的评价
2018年3月31日，用FACS分选以下的2组细胞后，分别对SCID beige小鼠(雄)以10000个细胞/800ul DMEM进行腹腔给药，同年6月26日，杀死小鼠并调查小鼠的外观/体重、腹腔内有无肿瘤。
(1)TE4的SDC4阳性上位2％
(2)仅TE4的2次抗体
(2)的小鼠的体重为20.1g，而(1)的小鼠的体重为17.9g。与(2)的小鼠相比，(1)的小鼠确认到肿瘤形成(图8-3)。
实施例2基于SDC4靶siRNA的抗肿瘤效果
(1)单独给药
使用以SDC4为靶的单独设计的3种siRNA#6、#7、#10、市售的SDC4靶siRNA#1、#2、#3(提供方：applied biosystems)、以及阴性对照siRNANC这7种siRNA，验证针对来自从大肠癌患者(No.2检体)摘除的癌组织的PDX模型的细胞株PDX No.2、胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC的抗肿瘤细胞效果。7种siRNA的核苷酸序列如下所示。
#6：(sense)5’-GGUCCUGGCAGCUCUGAUUdTdT(序列编号3)
(anti-sense)5’-AAUCAGAGCUGCCAGGACCdTdT(序列编号4)
#7：(sense)5’-AGGAUGAAGGCAGCUAUGAdTdT(序列编号5)
(anti-sense)5’-UCAUAGCUGCCUUCAUCCUdTdT(序列编号6)
#10：(sense)5’-GCAAGAAACCCAUCUACAAdTdT(序列编号7)
(anti-sense)5’-UUGUAGAUGGGUUUCUUGCdTdT(序列编号8)
#1：(sense)5’-CUACUGCUCAUGUACCGUAtt(序列编号9)
(anti-sense)5’-UACGGUACAUGAGCAGUAGga(序列编号10)
#2：(sense)5’-GCUAUGACCUGGGCAAGAAtt(序列编号11)
(anti-sense)5’-UUCUUGCCCAGGUCAUAGCtg(序列编号12)
#3：(sense)5’-CCAAGAAACUAGAGGAGAAtt(序列编号13)
(anti-sense)5’-UUCUCCUCUAGUUUCUUGGgt(序列编号14)
NC：(sense)5’-AUCCGCGCGAUAGUACGUA(序列编号15)
(anti-sense)5’-AUCCGCGCGAUAGUACGUA(序列编号16)
在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamin200(提供方：Invitrogen)以10pmol/孔导入siRNA，72h后用WST8(提供方：DojinDo)测定细胞活性。进而将全部孔的培养基交换为DMEM(FBS10％)，72h后再次用WST8测定细胞活性。72h+72h后，siRNA#7和#2显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图9-1)。
(2)与其它抗肿瘤药物的组合使用给药
(2-1)与化疗剂的组合使用
与上述(1)同样地研究了7种siRNA与化疗剂的组合使用效果。在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，72h后用WST8测定细胞活性，接着，对于胰腺癌super Panc-1 CSC，将全部孔的培养基交换为含吉西他滨(GEM)的DMEM(FBS10％)，对于大肠癌PDX No.2，将全部孔的培养基交换为含奥沙利铂(L-OHP)的DMEM(FBS10％)，72h后再次用WST8测定细胞活性。72h+72h后，对于胰腺癌super Panc-1 CSC，siRNA7+GEM和#2+GEM显示出显著的抗肿瘤细胞效果，对于大肠癌PDXNo.2，siRNA7+L-OHP和#2+L-OHP显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图9-2)。
(2-2)与Wnt抑制剂的组合使用
与上述(1)同样地研究了7种siRNA与Wnt抑制剂的组合使用效果。在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，72h后用WST8测定细胞活性，接着，将全部孔的培养基交换为含Wnt抑制剂(FH535)的DMEM(FBS10％)，72h后再次用WST8测定细胞活性。72h+72h后，siRNA#7+FH535显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图9-3)。
另外，在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA、同时还添加Wnt抑制剂PNU。72h后用WST8测定细胞活性，接着将全部孔的培养基交换为含PNU的DMEM(FBS10％)，72h后再次用WST8测定细胞活性。72h+72h后，siRNA#7+PNU显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图9-4)。
(2-3)与mTOR抑制剂的组合使用
与上述(1)同样地研究了7种siRNA与mTOR抑制剂的组合使用效果。在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，72h后用WST8测定细胞活性，接着将全部孔的培养基交换为含mTOR抑制剂(雷帕霉素)的DMEM(FBS10％)，72h后再次用WST8测定细胞活性。72h+72h后，siRNA#7+雷帕霉素和siRNA#2+雷帕霉素显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图9-5)。
(3)SDC4靶siRNA的针对正常细胞的毒性
(3-1)针对正常细胞和癌干细胞的SDC4靶siRNA的毒性试验
使用市售的SDC4靶siRNA#2与阴性对照siRNA NC，验证了针对BJ-5ta源自正常包皮的成纤维细胞株、HPNE源自正常胰管的上皮细胞株、3-4胰腺癌癌干细胞、源自No.2H16-2490大肠癌患者摘除癌组织的PDX模型的细胞株PDX No.2的毒性。在6孔中以200000个/孔播种并培养一夜后，用lipofectamine2000以100pmol/孔导入siRNA，96h后用WST8测定细胞活性。其结果，对2种正常细胞未确认到毒性，对2种癌细胞确认到显著的毒性(图9-6)。
(3-2)正常细胞和癌干细胞中的SDC4的表达
对BJ-5ta源自正常包皮的成纤维细胞株、HPNE源自正常胰管的上皮细胞株、superPanc-1 CSC胰腺癌癌干细胞、源自No.2H16-2490大肠癌患者摘除癌组织的PDX模型的细胞株PDX No.2进行基于SDC4抗体的细胞免疫染色，用FACS进行解析。其结果，2种正常细胞未确认到SDC4的表达，2种癌细胞确认到显著的SDC4表达(图9-7)。
(3-3)小鼠皮下实体肿瘤模型中的SDC4靶siRNA的抗肿瘤效果
在裸鼠的皮下移植super Panc-1 CSC胰腺癌癌干细胞3×106个/Tumor，体积达到约70mm3后，每日一次，将SDC4靶siRNA#7、或阴性对照siRNA NC用核酸递送系统超级磷灰石(Super apatite)以20ug/次通过小鼠尾静脉进行静脉注射。将未处置组(control)与阴性对照给药组(NC)进行比较，#7给药组确认到显著的抗肿瘤效果。Day5和Day9时，#7给药组与control和NC相比，肿瘤的体积明显小(图9-8)。
(4)基于SDC4靶siRNA的抗肿瘤效果的机理
(4-1)SDC4的蛋白水平与抗肿瘤效果的关系
验证了市售的SDC4靶siRNA#1、#2、#3、阴性对照siRNANC针对胰腺癌干细胞superPanc-1 CSC的抗肿瘤细胞效果机理。在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，用WST8测定48h和72hr后的细胞活性，另外，通过免疫印迹测定SDC4的蛋白水平。其结果，48hr时，与阴性对照siRNANC相比，观察到基于siRNA#1、#2、#3的SDC4蛋白的减少，但细胞活性没有变化。72hr时，仅因SDC4靶siRNA#2而确认到SDC4的蛋白和细胞活性的减少(图10-1)。
(4-2)基于IPA的上游解析的机理预测
验证了市售SDC4靶siRNA#2针对胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC的抗肿瘤细胞效果机理。在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选细胞并静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，36h后回收并提取RNA，进行RNA-sequencing。其结果，相对于阴性对照siRNANC，siRNA#2中，以Fold Change 2.0以上、p<0.05发生变异的基因为172个。对该172个変异基因集合进行Ingenuity Pathways Analysis(IPA)的Upstream解析，结果预测了mTOR,PPARG1A,Jnk,ERK1/2,ERK,Creb等Upstream regulator的抑制(图10-2)。
(4-3)基于Wnt抑制剂的SDC4表达诱导
在96孔板中，用FACS以6000个/孔分选胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC并培养一夜后，添加西妥昔单抗(Cmab)、雷帕霉素(Rapamycin)、2种Wnt抑制剂(IWR、FH535)，48小时后进行SDC4的细胞免疫染色和免疫印迹。免疫印迹中，由于Wnt抑制剂IWR、FH535的添加，SDC4的蛋白表达增加。细胞荧光免疫染色中也观察到基于FH535的SDC4表达增加(图10-3)。
实施例3 1个癌干细胞形成肿瘤中的低氧区域和SDC4的表达
在实施例1(3)得到的、源自super Panc-1 CSC的dZsG+/CD44v9high单细胞的21个实体肿瘤、以及源自super Panc-1 CSC的dZsG+/SDC4high单细胞的11个实体肿瘤中，分别针对6个(n＝6)进行HIF1α和SDC4的免疫荧光染色。HIF1α在低氧状态下稳定并蓄积，从细胞质向核发生迁移，因此通过HIF1α和DAPI的二重染色，细胞核为HIF1α阳性的区域相当于低氧区域，细胞核为HIF1α阴性的区域相当于非低氧区域。结果示于图11。图11的(a)～(c)(源自dZsG+/CD44v9high单细胞)中，白实线包围的部分的细胞核为HIF1α阳性、白虚线包围的部分的细胞核为HIF1α阴性。因此，在低氧区域中确认到多数SDC4(+)细胞。源自dZsG+/SDC4high单细胞的实体肿瘤(图11的(d)～(f))也同样，在HIF1α核染色阳性(白实线包围的部分)的低氧区域确认到SDC4(+)。另一方面，非低氧区域确认不到SDC4的表达。
实施例4基于抗SDC4抗体的抗肿瘤效果
(1)针对胰腺癌和大肠癌的抗SDC4抗体的抗肿瘤效果
验证了针对源自No.2H16-2490大肠癌患者摘除癌组织的PDX模型的细胞株PDXNo.2和大肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480、进而胰腺癌干细胞super Panc-1 CSC和胰腺癌细胞株miapaca、PSN、Panc-1的抗肿瘤细胞效果。在96孔板中，用FACS以5000个/孔进行分选并静置一夜后，加入IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体或IgG抗体(作为NC)使其为2.5、5、10和20ug/ml，Day4和Day6用WST8测定细胞活性。其结果，抗SDC4抗体对任一癌细胞株均显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图12-1～图12-4)。
(2)针对正常细胞的SDC4抗体的毒性
在96孔板中，用FACS以5000个/孔分选BJ-5ta源自正常包皮的成纤维细胞株、HPNE源自正常胰管的上皮细胞、MRC5人胚肺正常成纤维细胞、以及HEK293人胚肾细胞，静置一夜后，加入IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体使其为10ug/ml，Day4用WST8测定细胞活性。其结果，抗SDC4抗体对任一正常细胞均未显示相对毒性(图12-5)。
另外，在96孔板中，将BJ-5ta源自正常包皮的成纤维细胞株、HPNE源自正常胰管的上皮细胞以5000个/孔进行播种，静置一夜后，加入IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体或IgG抗体(作为NC)使其为20ug/ml，48hr、72hr时用WST8测定细胞活性。其结果，抗SDC4抗体对任一正常细胞均未显示相对毒性(图12-6)。
(3)小鼠皮下实体肿瘤模型中的抗SDC4抗体的抗肿瘤效果
在裸鼠的皮下移植super Panc-1 CSC胰腺癌癌干细胞3×106个/Tumor，体积达到约70mm3时，将IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体或IgG抗体对小鼠进行2天一次、每次100ug/ml或25ug/ml、1ml的腹腔内注射。其结果，与未处置组(control)和阴性对照给药组(IgG100ug)相比，SDC4 100ug和SDC4 25ug给药组确认到显著的抗肿瘤效果。Day5和Day9时，SDC4给药组与control和NC相比，肿瘤的体积明显小(图12-7)。
实施例5针对间皮瘤的SDC4靶治疗的抗肿瘤效果
(1)针对间皮瘤细胞株的Sdc4靶siRNA的抗肿瘤细胞效果
根据Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)的数据库，间皮瘤细胞(mesothelioma)的SDC4 mRNA表达量在整体中高居第3位。于是，使用市售的SDC4靶siRNA#2、本发明人等独自设计的siRNA#7、阴性对照siRNA NC，验证了针对2种间皮瘤细胞株MSTO-211H和H2052的抗肿瘤细胞效果。在96孔板中，用FACS以5000个/孔进行分选，静置一夜后，用lipofectamine2000以10pmol/孔导入siRNA，72h后用WST8测定细胞活性。其结果，SDC4靶siRNA显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图13-1)。
(2)针对间皮瘤细胞株及其癌干细胞分化的抗SDC4抗体的抗肿瘤细胞效果
验证了针对间皮瘤细胞株H2452和H28的抗肿瘤细胞效果。在96孔板中，用FACS以5000个/孔进行分选，静置一夜后，加入IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体(poly)或IgG抗体(NC)使其为10和20ug/ml，48hr、72hr后用WST8测定细胞活性。其结果，抗SDC4抗体显示出显著的抗肿瘤细胞效果(图13-2)。
CD24已知作为间皮瘤的癌干细胞标记物，有文献报告CD24阳性细胞作为癌干细胞的性质强。H2452的CD24阳性率为3.7％，而H28的CD24阳性率高达81.8％。与H2452相比，针对H28的SDC4的抗体在更早期(与72h相比，48hr)且显示出更显著的抗肿瘤细胞效果。因此，可知抗SDC4抗体对间皮瘤癌干细胞有非常强的抗肿瘤细胞效果。
于是，将间皮瘤细胞株H28播种于96孔板并使其为10000个/孔，进而用FACS在96孔板中分选CD24阳性上位40％的细胞并使其为10000个，静置一夜后，加入IBL公司制多克隆抗体SDC4抗体(poly)或IgG抗体(NC)使其为20ug/ml，96hr后用WST8测定细胞活性。其结果，抗SDC4抗体不仅对未分化的H28显示出显著的抗肿瘤细胞效果，对CD24强阳性的H28细胞组显示出更显著的抗肿瘤细胞效果(图13-3)。
产业上的可利用性
SDC4是比已知的癌干细胞标记物更优异的癌干细胞标记物，因此以SDC4表达为指标来对癌干细胞进行检测/筛选在癌干细胞的识别及其研究利用中是有用的。
进而，SDC4不仅只是标记物，还成为针对癌干细胞的治疗的靶，因此以SDC4为靶的核酸等药物能够用于癌干细胞的去除、进而癌症的根治疗法，是非常有用的。
Claims (6)
1.一种抑制SDC4的表达或功能的物质在制备癌细胞去除剂中的用途，所述抑制SDC4的表达或功能的物质为具有以下核苷酸序列的siRNA：
#6：(sense)5’-GGUCCUGGCAGCUCUGAUUdTdT
(anti-sense)5’-AAUCAGAGCUGCCAGGACCdTdT
或#7：(sense)5’-AGGAUGAAGGCAGCUAUGAdTdT
(anti-sense)5’-UCAUAGCUGCCUUCAUCCUdTdT
或#10：(sense)5’-GCAAGAAACCCAUCUACAAdTdT
(anti-sense)5’-UUGUAGAUGGGUUUCUUGCdTdT
或#2：(sense)5’-GCUAUGACCUGGGCAAGAAtt
(anti-sense)5’-UUCUUGCCCAGGUCAUAGCtg；
所述癌为选自大肠癌或胰腺癌干细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌细胞去除剂与其它抗肿瘤药物组合，所述其它抗肿瘤药物为选自化疗药物、Wnt抑制剂以及mTOR抑制剂中的1种以上。
3.根据权利要求1或2所述的用途，所述癌细胞的细胞株为选自大肠癌细胞株PDXNo.2、大肠癌细胞株HCT116、大肠癌细胞株HT29、大肠癌细胞株SW480或胰腺癌干细胞superPanc-1 CSC。
4.一种抑制SDC4的表达或功能的物质在制备癌细胞去除剂中的用途，所述抑制SDC4的表达或功能的物质为具有以下核苷酸序列的siRNA：
或#7：(sense)5’-AGGAUGAAGGCAGCUAUGAdTdT
(anti-sense)5’-UCAUAGCUGCCUUCAUCCUdTdT
或#2：(sense)5’-GCUAUGACCUGGGCAAGAAtt
(anti-sense)5’-UUCUUGCCCAGGUCAUAGCtg；
所述癌为间皮瘤。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌细胞去除剂与其它抗肿瘤药物组合，所述其它抗肿瘤药物为选自化疗药物、Wnt抑制剂以及mTOR抑制剂中的1种以上。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌细胞的细胞株为选自间皮瘤细胞株MSTO-211H或间皮瘤细胞株H2052。
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