CN115837031B - Traf4抑制剂在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TRAF4抑制剂在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用，具体涉及肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）抑制剂联合视黄酸在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用。本发明通过靶向TRAF4的siRNA在SK‑N‑MC和SH‑SY5Y细胞中将TRAF4敲低，证实敲低TRAF4可提高人神经母细胞瘤细胞系对视黄酸治疗的敏感性。进一步在裸鼠上建立了人神经母细胞瘤SK‑N‑MC异种移植模型，评估了TRAF4靶向siRNA和视黄酸的抗肿瘤效果。结果证明TRAF4抑制剂可改善人神经母细胞瘤中视黄酸的敏感性，这为人神经母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

Description

TRAF4抑制剂在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）抑制剂联合视黄酸在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用。

背景技术

神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一种由交感神经系统祖细胞发展而来的儿童颅外恶性实体肿瘤，占所有小儿恶性肿瘤病死率的 15%，具有恶性程度高、侵袭力强等临床特点。同时神经母细胞瘤受临床因素和遗传因素的影响，导致其不确定的发病机制和不同的治愈可能性。基于其不同的风险等级，手术切除、常规化疗及骨髓移植等一系列治疗策略被应用于神经母细胞瘤的治疗中。然而该肿瘤对常规化疗和放疗不敏感，故患儿的生存率较低。随着神经母细胞瘤发病的分子机制研究取得较大进展，触发神经母细胞瘤分化、凋亡成为当今肿瘤研究热点。

视黄酸（Retinoic acid , RA），一种视黄醇（维生素A）衍生物，在神经母细胞瘤中表现出抗增殖和抗氧化活性，进一步引发其凋亡。视黄酸作为继放疗和化疗后的综合治疗方法，已被广泛应用于神经母细胞瘤的治疗中。尽管如此，神经母细胞瘤患者对视黄酸的整体响应较差，因此识别预测视黄酸治疗疗效的分子标记在临床实践中至关重要。研究表明，视黄酸与神经母细胞瘤患者预后不良有关的因素，包括MYCN、ZNF423、HIF-1α等基因，在视黄酸调节神经母细胞瘤治疗起关键作用。例如，下调与不良预后相关的原癌基因MYCN可以缓解MYCN扩增的神经母细胞瘤对视黄酸的耐药性。然而，目前尚无可用于临床的视黄酸反应性预测标志物。

肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）介导SMAD和非SMAD TGF-β受体诱导的下游信号反应，包括炎症、适应性免疫和细胞死亡等，是多种癌症发生的生物标志物。不同于其他家族成员的结构特性，TRAF4具有特定的三个富含半胱氨酸基序列TRAF（CART）结构域，且含有调节细胞间通路的核定位信号。研究表明，TRAF4缺失导致神经系统发育异常，甚至胚胎死亡。因此，敲除TRAF4或与其他方法联合应用的潜在治疗效果值得研究。

目前，关于TRAF4在视黄酸治疗神经母细胞瘤中的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）抑制剂联合视黄酸在制备神经母细胞瘤治疗药物中的应用。

本发明通过挖掘并分析TCGA数据库发现相比于其他TRAF家族成员，TRAF4具有高mRNA表达水平，并在人神经母细胞系中验证TRAF4的蛋白表达水平较高。随后利用靶向TRAF4的siRNA(siTRAF4)在SK-N-MC和SH-SY5Y细胞中将TRAF4敲低，证实敲低TRAF4可提高人神经母细胞瘤细胞系对视黄酸治疗的敏感性。为了进一步验证TRAF4靶向siRNA和视黄酸在体内的联合作用，在裸鼠上建立了人神经母细胞瘤SK-N-MC异种移植模型，评估了TRAF4靶向siRNA和视黄酸的抗肿瘤效果。结果证明TRAF4抑制剂可改善人神经母细胞瘤中视黄酸的敏感性，这为人神经母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

附图说明

图1为TRAF家族在人神经母细胞瘤中的表达情况。A 为TARGET人神经母细胞瘤队列中TRAF家族的mRNA水平。B为人神经母细胞瘤SK-N-MC和SK-SY5Y细胞中TRAFs的蛋白水平。

图2为敲低TRAF4后人神经母细胞瘤细胞系对视黄酸治疗的敏感性结果。A为不同浓度的视黄酸处理转染阴性对照(siNEG)或靶向TRAF4的siRNA(siTRAF4)的SK-N-MC细胞结果；B为不同浓度的视黄酸处理转染阴性对照(siNEG)或靶向TRAF4的siRNA(siTRAF4)的SH-Y5Y细胞结果。

图3为抑制TRAF4后提高SK-N-MC人神经母细胞瘤异种移植模型对视黄酸治疗的敏感性结果。A为四个不同治疗组(n=9)的SK-N-MC异种移植瘤体积；B为四个不同治疗组的动物生存曲线，ns代表无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

1.生物信息学分析

使用TARGET数据库检索所有数据进行生信处理。TRAFs家族（TRAF1-TRAF7）mRNA水平在UCSC Xena网站(http://xena.ucsc.edu/)上进行分析。

2. 细胞培养

两种不同的人神经母细胞瘤细胞株 SK-N-MC和 SH-SY5Y 购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，上述细胞均采用DMEM高糖培养基（含10%FBS, 1% 青霉素-链霉素）于5% CO₂的37°C恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10% DMSO的FBS冻存。

3. 细胞转染

前一天开始在60 mm皿中培养SK-N-MC和 SH-SY5Y细胞，使每皿细胞预计在普板后第二天的细胞汇聚度为70%-80%。在500 μL Opti-MEM reduced serum medium中加入5 μMsiGENONE SMARTpool TRAF4 siRNA（M-006908-01-0005，Horizon Discovery ） 或siGENOME non-targeting Control siRNA（D-001206-13-5，Horizon Discovery），轻轻混匀，静置5 min。在500 μL Opti-MEM reduced serum medium中加入10 μL 转染试剂Lipofectamine RNAiMax，轻轻混匀，静置5 min。将上述溶液轻轻混匀，室温孵育15 min，即获得转染溶液。将此混合溶液滴加至分别培养SK-N-MC和 SH-SY5Y细胞的60 mm细胞培养皿中，轻轻混匀。转染6 h后，更换新鲜完全培养基，置于5% CO₂的37°C恒温细胞专用培养箱培养中培养24 h。

siGENMONE SMARTpool TRAF4 siRNA序列如下：

（1）5’-GAAACUAUGUGCGGGAUGA-3’ (Seq_1)

（2）5’-UGAUCUACCUGCACACUUG-3’ (Seq_2)

（3）5’-GGCCACCGUUUCUGCGAUA-3’ (Seq_3)

（4）5’-CAUCCGUGCUGCUGUUGAA-3’ (Seq_4)。

4. 细胞增殖测定

上述细胞培养24 h后，收集并计数siRNA转染SK-N-MC和 SH-SY5Y细胞，一部分用于细胞活力测定，一部分用于Western blot分析。将2000-4000个细胞/孔接种在90 μL培养基/孔96孔板中。培养过夜后，用最终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μM的10 μL视黄酸处理细胞5天。将10 μL CYQUANT试剂混合物直接加入每个孔中，并在37°C下孵育板1h，激发光480 nm和发射光520 nm条件下测定细胞活性。每个药物浓度下进行三次细胞毒性试验。

5. Western blot 分析

转染细胞培养48h 后收集细胞，1*NETN裂解缓冲液(100 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl (pH 8.0)，0.5 mM EDTA, 0.5% (V/V) Nonidet P-40 (NP-40))加入1*蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂重悬细胞沉淀，冰上孵育30分钟。将上述裂解混合物进行超声处理， 4°C下12000 g离心10 min，上清即为总蛋白。使用Quick Start™Bradford 1x Dye试剂测定蛋白浓度，在蛋白样品中加入上样缓冲液后，95°C煮沸8 min，进行Western bolt 分析。

20 μg裂解液上样至4%-20%的预制蛋白胶中，200V恒压SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，当loading buffer移动至蛋白胶最下层时，电泳结束。配制转膜液，聚偏氟乙烯(PVDF)膜使用前用甲醇浸泡1-2 min，转膜滤纸提前浸泡于转膜液中。利用半干转（25V，10 min）进行转膜。转膜结束后， 将膜置于5% 脱脂奶粉（in TBST）中封闭1 h。使用1% BSA稀释的一抗，4度过夜孵育一抗。用1×TBST冲洗膜5 min，室温下用1×TBST稀释的HRP偶联二抗孵育1 h。用1×TBST洗涤膜3次，每次5 min。用SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate对蛋白条带进行识别， ChemiDoc™触摸成像系统下进行曝光处理。

6. SK-N-MC人神经母细胞瘤异种移植模型

利用6周大的雌性无胸腺裸（Foxn1^nu）构建SK-N-MC人神经母细胞瘤异种移植模型，每只小皮下注射100 µL PBS中含有1×10⁷ SK-N-MC细胞。将40只雌性裸鼠分为4组。当所有组的平均肿瘤直径达到6 mm时，四组小鼠每隔一天给予siGENOME non-targeting ControlsiRNA（siNEG）、siGENONE SMARTpool TRAF4 siRNA （siTRAF4）、视黄酸(RA)、视黄酸(RA)+siTRAF4，每只小鼠共三次。采用Invivofectamine 3.0试剂与2 µg siRNA进行孵育，然后取10 µL分别注入瘤内。小鼠灌胃给予玉米油悬浮视黄酸 (25 mg/kg体重)，同时监测并比较肿瘤体积和动物存活率。

首先从TARGET数据库(https://ocg.cancer.gov/programs/target/projects/neuroblastoma)挖掘人神经细胞母细胞瘤中TRAF1-TRAF7的mRNA水平，该数据库使用综合基因组方法来确定驱动儿童恶性肿瘤的分子异常。结果显示，所有TRAF1-TRAF7 mRNA均在TARGET人神经细胞母瘤队列中表达 (n = 717)(图1A所示)，其中TRAF4的mRNA表达量最高，其次为TRAF6和TRAF7, TRAF3的mRNA表达量最低。其次在SK-N-MC和SH-SY5Y两种人成神经细胞瘤细胞系中检测TRAF1-TRAF7的蛋白水平。如图1B所示，TRAF蛋白在成神经细胞瘤细胞系中的表达是不同的。具体来说，与其他家族成员相比，TRAF4高表达，这与TARGET成神经细胞瘤数据集获得的mRNA水平一致。据此，推测TRAF4可能在成神经细胞瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用。

从图2可以看出，首先，SK-N-MC和SH-SY5Y细胞利用四种序列介导的针对TRAF4的siRNA干扰被瞬时敲除，Western bolt 验证TRAF4蛋白减少，说明TRAF4成功敲低。与对照细胞相比，加入终浓度为0.125 μM-32 μM的视黄酸处理细胞5天后，进行CyQUANT直接细胞增殖试验以确定相对细胞数。siRNA介导的TRAF4的敲除，显著降低了视黄酸对SK-N-MC细胞的IC50（从16.510 μM到11.036 μM）和对SH-SY5Y细胞的IC50（从8.289 μM到6.256 μM），表明抑制TRAF4显著提高了人神经母细胞瘤细胞对视黄酸敏感性。

此外，为了进一步验证TRAF4靶向siRNA和视黄酸在体内的联合作用，在裸鼠上建立了人神经母细胞瘤SK-N-MC异种移植模型，评估TRAF4靶向sinas和视黄酸的抗肿瘤效果。由图3可知，四组小鼠每隔一天分别给予siNEG(瘤内)、视黄酸单用(灌胃)、siTRAF4单用(瘤内)、视黄酸(灌胃)+siTRAF4(瘤内)，每只小鼠共3次。肿瘤体积曲线显示，单独siTRAF4治疗有延迟作用，联合治疗明显抑制肿瘤生长(图3A所示)。动物生存曲线表明，两种单药治疗未能显著延长动物生存期，相反，与对照组和单药治疗组相比，联合治疗显著提高了生存期(图3B所示)。该动物实验进一步证实了TRAF4抑制和视黄酸治疗的联合作用。

综上所述，在体内外研究中TRAF4抑制可改善人神经母细胞瘤中视黄酸的敏感性。因此TRAF4可能是视黄酸治疗人神经母细胞瘤的一个潜在靶点，为人神经母细胞瘤的治疗提供新的思路。

Claims (2)

1.肿瘤坏死因子受体相关因子4抑制剂联合视黄酸在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤坏死因子受体相关因子4抑制剂为siRNA，所述肿瘤为神经母细胞瘤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述siRNA序列如下：

5’-GAAACUAUGUGCGGGAUGA-3’；

5’-UGAUCUACCUGCACACUUG-3’；

5’-GGCCACCGUUUCUGCGAUA-3’；

5’-CAUCCGUGCUGCUGUUGAA-3’。