CN114887075B - 一种包括免疫细胞外泌体的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种包括免疫细胞外泌体的药物组合物及其应用，所述外泌体作为药物递送载体，与靶向Her2特异性抗体形成复合物，该抗体为人源化抗体，可高特异性结合目标抗原，提高治疗靶向性，还能够降低机体排斥反应，改善生物利用度；所述外泌体为DC细胞外泌体Dex，DC细胞经过肿瘤标志物和免疫因子诱导后，可有效激活DC细胞改善外泌体活性成分和抗肿瘤效能；Dex‑抗体复合物在体内、体外实验中展现出协同作用，可同时改善治疗有效性和杀伤靶向性，延长实验动物生存期，调节免疫蛋白表达水平。

Description

一种包括免疫细胞外泌体的药物组合物及其应用
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种包括免疫细胞外泌体的药物组合物及其应用。
背景技术：
癌症是严重危害人们生命健康的恶性疾病，其中胃癌是癌症相关死亡的第三大原因，全球每年有超过100万人新诊断出胃癌，2020年大约有47.8万新增胃癌病例以及大约37.3万死亡病例，新增和死亡胃癌患者总数居世界第一，尽管过去5年全球发病率和死亡率有所下降，但仍成为一个全球性的健康问题。根据国际癌症研究机构的统计，胃癌发病率随着年龄的增长而增加，胃癌在50岁以下的成年人中发病较少，在55至80岁之间高发，并且男性胃癌的发病率是女性的2至3倍，胃癌是男性第四大最常见的癌症类型，也是女性第七大最常见的癌症类型。胃癌有两个主要的局部亚部位：贲门胃癌(起源于与食管胃交界处相邻的胃区域)和非贲门胃癌(起源于胃的更远端区域)，胃癌的发生受多种因素影响，其中慢性幽门螺杆菌感染是胃癌的主要原因，约占全球远端胃癌病例的89％；其他原因包括吸烟、酗酒、体力活动水平低和辐射暴露、有害物质暴露等等。
随着对胃癌发病机制的研究不断深入，已开发出多种胃癌治疗药物，其中一线化学治疗药物包括奥沙利铂、卡培他滨、伊立替康、紫杉醇等等，上述药物虽然能够有效抑制肿瘤细胞生长，诱导其凋亡，但是由于早期化疗药物的靶向性较差，对正常细胞或尤其是处于快速增殖阶段的正常细胞具有较大的毒害作用，使得化学治疗导致了严重的副反应，影响患者生活质量和治疗效果；为提高治疗的靶向性，研究人员开发出多种分子靶向治疗剂，包括VEGF-VEGFR抑制剂、FGFR抑制剂、EGFR酪氨酸激酶抑制剂、HER-2抑制剂等，使得胃癌的治疗效果得到改善。尽管如此，胃癌的临床治疗效果仍不尽人意，进展期胃癌预后仍然很差，中位生存期仅有7.5～12.0个月。
癌症免疫疗法是目前正在研究的新方法之一，包括但不限于过继性T细胞疗法(ACT)、树突状细胞(DC)疫苗疗法、自然杀伤(NK)细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法以及免疫检查点抑制剂疗法等，以PD-1抗体为例，近3年全球范围内提交了数以百计的临床试验申请，受到了业内的广泛重视。这类方法不使用对机体损伤较大的化学毒剂，可以避免严重化疗副反应，提高患者生活质量，且能够达到有效杀灭癌细胞的目的。
在众多免疫治疗手段中，DC细胞疗法引起了人们的重视。DC细胞是一种先天免疫细胞，参与机体对肿瘤和病毒的应激反应，DC细胞可作为抗原呈递细胞(APC)，可通过主要组织相容性复合分子I类(MHC I)和II(MHC II)分别促进CD8+和CD4+T细胞的激活程度；DC细胞还可调节细胞因子和趋化因子表达水平，调节炎症和淋巴细胞的归巢。DC还被广泛用于药物递送载体，如基于DC细胞开发抗肿瘤疫苗，Sipuleucel-T(Provenge DendreonCorporation)是第一个DC疫苗疗法，于2010年4月被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗转移性前列腺癌，随后数以百计的DC细胞相关临床试验在全球多个国家和地区展开。然而，利用DC细胞来制备抗肿瘤疫苗具有挑战性，其分子组成极易发生变化，使得疫苗的质量控制参数难以把握，并且其表面的肿瘤相关抗原MHC-Ⅱ复合物丰度低，导致疫苗的产量较低、价格昂贵。DC来源的外泌体(Dendritic cell exosomes，Dex)似乎是解决DC免疫治疗相关问题的有效解决方式，Dex拥有DC细胞的膜成分，表达MHC-I和MHC-II以及共刺激分子，具备DC细胞基本的免疫刺激功能，有报道称Dex呈现的TAA-MHCII复合体比DC细胞多10～100倍，并且Dex膜成分易于控制，稳定性好，易于保存，生物利用度好，体内半衰期长。此外，Dex还可作为药物递送载体，携带小分子化学药物或抗体药物，发挥协同抗肿瘤作用，如CN112957341B、CN111840528A、CN113292608B等公开了外泌体作为药物递送载体，携带小分子或大分子药物。
人表皮生长因子受体2(HER2)，称为erbB-2，或原癌基因Neu，是一种受体酪氨酸蛋白激酶，由17q12染色体上的ERBB2(HER2)基因编码，HER2蛋白与EGF受体家族的配体结合成员形成异二聚体，稳定配体结合并增强激酶介导的下游信号传导，包括激活phosphatidylinositol-3激酶和丝裂原活化蛋白激酶。HER2表达可在胃肠道、呼吸道、生殖道、泌尿道、皮肤、乳房和胎盘上皮细胞的细胞膜上检测到，因此HER2成为了抗肿瘤药物开发中的明星靶点。在胃癌治疗中，HER2抗体也发挥了重要作用，其中曲妥珠单抗是第一个被批准上市的抗HER2的人源化IgG型单克隆抗体，能选择性结合HER2基因调控细胞表达的P185糖蛋白，是目前进展期HER2阳性胃癌患者的标准一线靶向治疗药物，有研究显示，曲珠联合奥沙利铂和卡培他滨，以及联合奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的治疗方案，优于一线化疗药物，患者中位生存期得到延长。HER2抗体治疗胃癌的方案在不断的优化和改进中，如使用HER2抗体ADC药物、联合PD-1抗体、使用CAR-T细胞等增强免疫手段等等，虽然该类抗体为胃癌的防治提供了新的治疗途径，但是仍面临复发率高、脱靶相应、免疫逃逸等诸多限制因素，使得其治疗效果仍不理想。
面对上述情况，本发明试图诱导和制备具有高抗肿瘤活性的DC细胞外泌体，并携带靶向HER2的高亲和力抗体，从而发挥高效的肿瘤杀伤作用，为有效解决DC细胞难储存、制备繁琐、体内半衰期短，以及HER2抗体疗效持久性差，易复发等临床困难提供新的研究思路。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中提供了一种用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括携带靶向HER 2抗体的树突细胞外泌体，所述外泌体通过磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯交联剂与靶向HER 2抗体连接，所述靶向HER2抗体为人源化抗体，所述抗体的轻链CDR区包括如SEQ ID NO:1所示的LCDR1、SEQ ID NO:2所示的LCDR2、SEQ ID NO:3所示的LCDR3；重链CDR区，包括如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ IDNO:6所示的HCDR3。
树突细胞外泌体(Dendritic cell exosomes，Dex)中包括DNA、RNA、细胞因子、主要组织相容物MHC-I和MHC-II等多种抗肿瘤活性成分，已被报道对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病等多种恶性肿瘤具有抑制作用，被广泛用于肿瘤疫苗研究，目前全球范围内已经开展了100多项相关临床试验研究，然而我们在前期的研究中发现，单独使用Dex治疗肿瘤的效果并不稳定，在不同种类的恶性肿瘤，甚至是同一肿瘤不同亚型的肿瘤中，展现出了比较大的差异，这可能与天然Dex的成分复杂、不确定性因素较多有关；此外，单独使用Dex治疗，肿瘤靶向性差，难以发挥有针对性的治疗作用。
为了解决上述困难，我们利用了前期筛选获得的靶向HER2的人源化抗体(antiHER2)，该抗体不仅可与目标抗原高亲和力结合，而且具有人源化结构，可降低机体内免疫排斥反应，提高治疗的安全性和有效性。我们利用磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯交联剂，将anti HER2与Dex连接，形成Dex-anti HER2复合物，该复合物以Dex为药物递送载体，可提高生物利用度，延长体内半衰期，还可以提高药物靶向性，特异性清除肿瘤细胞，发挥系统性抗肿瘤作用。
进一步的，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步的，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步的，所述树突细胞外泌体的制备步骤包括：使用AIM-V培养基在5％CO2在37℃培养箱中原代培养人DC细胞，当细胞融合度达到90％后，更换新鲜培养基，在5％CO2在37℃培养箱中培养48h；收集培养基，采用梯度离心法除去培养基中游离的活细胞、死细胞、细胞碎片；所得溶液采用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒杂质；然后在4℃下10000g超速离心60min，弃去上清，使用无菌PBS洗涤3次，在4℃下10000g超速离心90min，收集沉淀获得树突细胞外泌体颗粒。
进一步的，所述树突细胞外泌体的制备步骤包括：在DC细胞培养过程中加入诱导剂，所述诱导剂包括癌胚抗原CEA、糖类抗原CA125、糖类抗原CA19-9、甲胎蛋白、IL-12中的一种或多种。
进一步的，所述诱导剂包括癌胚抗原CEA、糖类抗原CA19-9和IL-12。
在早期研究中，使用天然DC细胞产生的Dex难以达到令人满意的抗肿瘤效果。这可能是由于天然DC细胞未处于有效激活状态，导致Dex中含有的抗肿瘤物质不足，影响了在体外实验中的抗肿瘤效果，经过初步测定，天然DC细胞Dex中核酸和蛋白含量较低，也印证了我们的猜测。因此本发明中拟采用不同诱导剂激活DC细胞，促进抗肿瘤活性物质的分泌。
有报道称，癌胚抗原CEA、糖类抗原CA125、糖类抗原CA19-9、甲胎蛋白等是胃癌的重要肿瘤标志物，其与胃癌的发生发展密切相关，上述蛋白分泌的异常变化属于肿瘤微环境中标志性事件，故本实施例中采用上述物质作为DC细胞诱导试剂；在前期的研究中，我们发现IL-12对于DC的激活和成熟至关重要，故考虑使用IL-12与肿瘤标志物进行组合，因此本发明中将胃癌标志物与上述细胞因子IL-12组合构成诱导试剂，刺激Dex分泌，改善抗肿瘤效果。经过实验证实，癌胚抗原CEA、糖类抗原CA19-9和IL-12组合的诱导效果最好，经过其刺激后DC细胞分泌的Dex抗肿瘤能力得到显著提高。
进一步的，所述树突细胞外泌体与靶向HER 2抗体的连接步骤包括：将溶解于有机溶剂二甲基亚砜中的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(DSPE-PEG-NHS)与HER 2抗体按1:10-10:1比例混合均匀，在4℃无菌环境中搅拌混合30min，然后将其在4℃下反应过夜，5000rpm离心10-15min除去未反应的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，得到磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯-HER 2抗体复合物；将树突细胞外泌体溶于无菌磷酸盐缓冲溶液中得到树突细胞外泌体溶液，将所述复合物与树突细胞外泌体按1:5-5:1比例混合均匀，在4℃下轻轻吸打混合均匀，37℃下反应2-4h，4500rpm离心5min得到携带靶向HER 2抗体的树突细胞外泌体。
本发明中选用磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯作为交联剂，连接Dex和靶向HER 2抗体，该交联剂为生物相容性交联剂，不仅能够有效连接抗体与Dex形成二元复合物，还能够最大程度的保留二者生物活性，防止对生物分子和微囊泡结构磷脂双层的破坏，有利于抗肿瘤作用的发挥。
提供了一种所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤中的一种或几种。
进一步的，所述肿瘤选自胃癌。
据报道，DC细胞外泌体具有广泛的抗肿瘤作用；HER2靶点也在多种肿瘤细胞中表达，包括但不限于乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤等等，在临床上HER2抗体已被用于治疗多种恶性肿瘤，如期刊文献(HER2heterogeneity and resistance to anti-HER2 antibody-drug conjugates，Alberto
Figure BDA0003682644850000061
et al，Breast Cancer Res.2020；22:15.)报告了HER2抗体可用于治疗乳腺癌、上皮癌、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤，因此本发明中所提供的药物组合物具有相当广泛的应用前景，可治疗多种肿瘤。
有益效果
本申请提供了一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括携带靶向HER 2抗体的树突细胞外泌体，具有以下优势：
(1)选用具有新型氨基酸序列结构的人源化抗体，可高特异性结合目标抗原，提高治疗靶向性；
(2)使用人源化抗体，对目标抗原的特异性更强，排斥反应更低，有利于临床应用；
(3)DC细胞经过诱导剂激活程序，可有效刺激核酸、细胞因子、调节蛋白等抗肿瘤活性成分分泌，改善肿瘤杀伤效果；
(4)Dex-抗体复合物在体内、体外实验中展现出显著协同作用，可同时改善治疗有效性和杀伤靶向性，延长实验动物生存期，调节免疫蛋白表达水平。
附图说明
图1：DC细胞外泌体Dex电子显微镜图片；
图2：不同诱导条件下Dex的肿瘤杀伤能力；
图3：Dex抗体复合物的肿瘤杀伤能力；
图4：Fas蛋白表达水平变化；
图5：实验动物肿瘤体积变化；
图6：实验动物IFN-γ表达水平。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1HER2人源化抗体的设计和获得
使用人HER2蛋白免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，通过ELISA法测定筛选抗原特异性杂交瘤，选择亲和力强的鼠源单克隆抗体进行人源化改造。使用B细胞表位分析软件AbEpiMax，针对鼠源单克隆抗体的可变区进行B细胞表位的免疫原性分析，找出抗体FR区具有较强B细胞表位的序列。测定并选用人类抗体FR库中与原始序列具有高度结构同源性并且具有较弱的B细胞表位的序列替换抗体FR区具有强B细胞表位的序列，获得人源化antiHER2单克隆抗体。利用分子互相作用分析平台Biacore，检测所述抗体与人HER2蛋白的亲和力，其KD值为35.68nM，亲和力在纳摩尔水平，说明其具有较高的目标抗原结合活性。
经鉴定，所述人源化单克隆抗体的轻链CDR区，包括如SEQ ID NO:1所示的LCDR1、SEQ ID NO:2所示的LCDR2、SEQ ID NO:3所示的LCDR3；重链CDR区，包括如SEQ ID NO:4所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ ID NO:6所示的HCDR3。进一步的，所述抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示.
实施例2DC细胞外泌体的制备
2.1原代DC细胞培养
利用已知方法原代培养人DC细胞，本发明中参考了WO2019213550A1中公开的培养方法，具体步骤包括：利用淋巴细胞分离液获得来自健康志愿者的外周血单核细胞(PBMC)，将其在37℃5％CO2培养箱中培养2-4小时。然后在AIM-V培养基(购自GIBCO公司)中用800-1000IU/ml GM-CSF和400-600IU/ml IL-4刺激贴壁细胞6天，得到未成熟的树突细胞(iDC)。在第6天，加入200ng/ml IL6、10ng/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β和1μg/ml PGE2。在第7天，收获成熟的树突细胞。通过流式细胞术进行表型鉴定，经鉴定所述DC细胞满足后续实验要求。
2.2DC细胞外泌体的制备
使用AIM-V培养基在5％CO2在37℃培养箱中培养上述DC细胞，当细胞融合度达到90％后，更换含10％FBS的新鲜培养基，在5％CO2在37℃培养箱中培养48h；收集培养基，分别在4℃500g、3000g和5000g离心5min、10min和20min，以便除去培养基中游离的活细胞、死细胞、细胞碎片；所得溶液采用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒杂质；然后在4℃下10000g离心60min，弃去上清，使用无菌PBS洗涤3次，在4℃下10000g离心90min，收集沉淀获得树突细胞Dex颗粒。使用扫码电子显微镜分析检测，如图1所示，所述Dex颗粒直径集中分布于80-150nm之间，粒径均一稳定。将所述Dex颗粒置于-80℃冰箱中长期保存，以满足后续实验需要。
2.3DC细胞诱导表达和诱导后Dex的制备
前期研究中发现，直接使用天然DC细胞分泌的Dex难以取得令人满意的抗肿瘤效果，这可能是由于天然DC细胞未处于有效激活状态，导致Dex中含有的抗肿瘤物质不足，影响了在体外实验中的抗肿瘤效果。因此本发明中拟采用不同诱导剂激活DC细胞，促进抗肿瘤活性物质的分泌。
有报道称，癌胚抗原CEA、糖类抗原CA125、糖类抗原CA19-9、甲胎蛋白AFP等是胃癌的肿瘤标志物，与胃癌的发生发展以及肿瘤微环境的形成和稳定密切相关，因此本实施例中尝试采用上述物质作为DC细胞诱导试剂；此外报道称IL-12、IL-10、IFN-γ、TGF-β等细胞因子，也能够参与免疫细胞的激活过程，诱导免疫细胞分化成熟，刺激外泌体分泌，在发明人的早期研究中，实验结果表明IL-12的刺激作用最为显著，所以本实施例中采用IL-12与其他肿瘤标志物配合使用，期望提高对DC细胞的刺激效果。
分别以CEA+IL-12、CA125+IL-12、CA19-9+IL-12、AFP+IL-12为诱导试剂，待DC细胞融合度达90％后，更换含10％FBS的新鲜培养基，同时加入上述诱导试剂，各个诱导剂中肿瘤标志物和IL-12的浓度均为20ng/mL，所述各个肿瘤标志物购自abcam公司，IL-12购自近岸蛋白公司。在初步实验完成后，我们发现CEA和CA19-9的诱导效果突出，故为了进一步促进抗肿瘤效果的提升，我们还尝试了使用CEA、CA19-9和IL-12等三种诱导剂联合使用，具体的方法和试剂浓度同上。在5％CO2在37℃培养箱中培养48h后，提取Dex(方法同第2.2节)。
实施例3DC细胞外泌体体外抗肿瘤实验
为研究本发明所提供的Dex对胃癌的抑制作用，本实施例中以MKN45胃癌细胞系为实验对象。
3.1肿瘤杀伤能力
复苏MKN45细胞(本发明人保存)，加入含10％FBS的RPMI1640培养基，37℃、5％CO2饱和湿度进行培养，传2-3代使细胞恢复活力。收获细胞，使用新鲜培养基调整细胞密度，接种于96孔细胞培养板中，每孔1×105个细胞，37℃、5％CO2饱和湿度培养12h后，分别加入等体积的RPMI1640培养基(对照组)和终浓度为20ng/mL的天然Dex、CEA和IL-12诱导DC细胞产生的Dex(CEA+IL-12)、CA125和IL-12诱导DC细胞产生的Dex(CA125+IL-12)、CA19-9和IL-12诱导DC细胞产生的Dex(CA19-9+IL-12)、AFP和IL-12诱导DC细胞产生的Dex(AFP+IL-12)、CEA、CA19-9和IL-12诱导DC细胞产生的Dex(CEA+CA19-9+IL-12)。加入诱导剂后，37℃、5％CO2饱和湿度下孵育48h。然后，每孔加入20μL/孔加入2.5mg/mL的MTT溶液，避光孵育4h，弃去细胞培养液，每孔150μL二甲基亚砜，置于摇床震荡15min，于490nm读取吸光度值。计算肿瘤细胞存活率，存活率＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。
如图2所示，使用天然Dex虽然具有一定的肿瘤抑制作用，但这种作用比较微弱，难以达到满意的效果；在使用IL12与CEA或CA19-9组合诱导处理后，DC细胞的抗肿瘤活性得到激发，产生的Dex也具有较强的肿瘤杀伤能力，使得胃癌细胞存活率降低；但是IL-12与CA125或AFP的组合却效果不佳，所产生的Dex并未表现出更强的肿瘤杀伤作用；在使用IL12、CEA和CA19-9三种诱导剂组合诱导后，取得了更加强烈的肿瘤抑制效果。通过上述实验说明，CEA+CA19-9+IL-12为有效的诱导试剂组合，后续实验中采用该方式诱导Dex形成。
实施例4Dex-抗体复合物制备
为进一步提高抗肿瘤效果，本实施例中制备了Dex-anti HER2复合物。本发明中选用磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(DSPE-PEG-NHS)作为交联剂，连接Dex和靶向HER 2抗体，该交联剂为生物相容性交联剂，不仅能够有效连接抗体与Dex形成二元复合物，还能够最大程度的保留二者生物活性，防止对生物分子和微囊泡结构磷脂双层的破坏，有利于抗肿瘤作用的发挥。
常规交联反应条件为在低温(如4℃)反应，这种方式虽然能够制备得到Dex-抗体复合物，但是反应时间较长，产物得率较低，不利于大规模生产，本发明中借鉴了期刊文献(Targeted Exosomes for Drug Delivery:Biomanufacturing,Surface Tagging,andValidation，Yingnan Si et al,Biotechnol J.2020Jan；15(1):e1900163.)中的制备方式，在Dex与DSPE-PEG-NHS-anti HER2复合物反应阶段使用了中高温度(37℃)，该温度更接近细胞生存环境，能够维持微囊泡稳定，大大缩短反应时间，提高制备效率和产物得率。
具体步骤包括：将溶解于有机溶剂二甲基亚砜中的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与HER 2人源化抗体按10:1比例混合均匀，在4℃无菌环境中搅拌混合30min，然后将其4℃下反应过夜，5000rpm离心15min除去未反应的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(DSPE-PEG-NHS)，得到磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯-HER2人源化抗体复合物(DSPE-PEG-NHS-anti HER2)；将树突细胞外泌体溶于无菌磷酸盐缓冲溶液中得到树突细胞外泌体溶液，将所述复合物与树突细胞外泌体按5:1比例混合均匀，在4℃下轻轻吸打混合均匀，37℃下反应4h，4500rpm离心5min得到携带靶向HER 2人源化抗体的树突细胞外泌体。
采用上述方法，分别制备了天然Dex与抗体结合得到的复合物Dex-anti HER2，CEA+CA125+IL-12诱导而产生的Dex与抗体结合得到的复合物inDex-anti HER2，用于后续验证抗肿瘤效果。
实施例5Dex-抗体复合物的肿瘤杀伤实验
5.1体外肿瘤杀伤实验
检测上述Dex-抗体复合物对胃癌MKN45细胞的杀伤作用，具体方法参照3.1节。如图3所示，Dex与抗体组成复合物后，抗肿瘤能力得到强化，肿瘤存活率降至50％左右，相比于单独Dex肿瘤杀伤能力提高了近一倍，但使用未经诱导激活的DC细胞产生的Dex抗体复合物的抗肿瘤活性，与单独使用经过CEA+CA125+IL-12诱导而产生的Dex的抗肿瘤效果相近，说明其抗肿瘤活性仍有待于进一步提高；经过CEA+CA125+IL-12诱导激活的Dex抗体复合物的抗肿瘤活性得到大大强化，说明这种组合方式可有效提高抗肿瘤能力。
5.2调节Fas蛋白表达
FAS(也称为Apo-1或CD95)是死亡受体家族的有效成员，在许多细胞类型的凋亡信号传导中起关键作用，FAS与其FAS配体(FASL)相互作用以触发死亡信号级联，随后诱导凋亡细胞死亡。有证据表明，许多肿瘤表现出FAS下调或功能丧失，从而对免疫系统诱导的死亡信号产生抗性，以及FASL介导的免疫特权的表达增加，因此，FAS表达减少和/或FASL表达增加可能促进了恶性转化和进展。本节采用Western blot法检测经过外泌体处理后Fas基因的变化情况，具体步骤如下：
采用蛋白提取试剂盒(购自BestBio Biotech公司)提取经处理后(处理方法同3.2节)的胃癌细胞总蛋白；进行蛋白质凝胶电泳，电泳条件为浓缩胶2030min，电压为90V，分离胶约1h，电压110V；使用甲醇浸泡PVDF膜活化5min，再用半干转方法在25V电压下转膜，把蛋白质从胶中转移到PVDF膜上；膜正面朝上在37℃封闭液中摇动孵育2h，然后使用TBST清洗3次；PVDF膜正面朝上浸泡于一抗稀释液中(所述抗体购自Abcam公司)，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次；PVDF膜正面朝上浸泡于二抗稀释液中(所述抗体购自Abcam公司)，37℃孵育2h，TBST洗涤3次；滴加显色剂，进行拍照检测。
如图4所示，使用本发明提供的Dex抗体复合物处理后，细胞中的Fas蛋白表达量显著提高，在Dex-anti HER2组中Fasb蛋白的表达水平虽有小幅度提升，但效果并不明显；而使用inDex-anti HER2处理后Fas表达水平显著提高，说明该复合物能够通过Fas途径有效介导肿瘤细胞凋亡过程，发挥强效肿瘤杀伤作用。
5.3体内抗肿瘤作用
培养和扩增胃癌MKN45细胞，具体方法参见第3.1节。待细胞融合度达90％以上时，收集细胞调整细胞浓度至5×106个/mL，用注射器将100μL细胞悬液接种于Balb/c裸小鼠前左肢腋窝皮下，待肿瘤体积生长至100-200mm3时用于后续实验。
将所述肿瘤裸鼠随机分为三组，每组20只，分别注射100μg/kg Dex-anti HER2、100μg/kg inDex-anti HER2和等体积的生理盐水，每2天给药一次，共给药4周，每周测量肿瘤体积，实验结束后颈椎脱臼处死。如图5所示，使用本发明中所提供的Dex抗体复合物可以有效抑制肿瘤生长，且从第2周开始inDex-anti HER2的抗肿瘤效果开始优于Dex-antiHER2，但还没有显著差异，到第3周后，inDex-anti HER2组的肿瘤体积显著小于Dex-antiHER2组，并且这种趋势延续到了第4周。上述结果说明，经过CEA+CA19-9+IL-12诱导激活的DC细胞能够更多的可适应肿瘤微环境，发挥抗肿瘤作用，且所述Dex作为药物传递载体，能够有效携带抗HER2抗体，使其发挥靶向抗肿瘤作用。
给药4周后，处死实验动物断头取血，3000r/min离心5min分离血清，使用ELISA试剂盒(购自eBioscience公司)检测血清中的IFN-γ含量。IFN-γ是一种重要的免疫细胞因子，可调节多种免疫反应，有报道称在胃癌治疗过程中，IFN-γ表达水平的提升有利于激活免疫细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡。如图6所示，经过使用Dex抗体复合物治疗后，实验动物体内的IFN-γ表达水平有所提升，但是在Dex-anti HER2、inDex-anti HER2处理组中差异不明显，可能说明IFN-γ的升高主要有HER2抗体所导致，该抗体可有效激活体液免疫系统，而经过诱导的Dex则主要通过Fas等信号通路发挥抗肿瘤作用。
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。
序列表
<110> 南京涵台余生物科技有限公司
<120> 一种包括免疫细胞外泌体的药物组合物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Cys Leu Arg Ala Leu
1               5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Arg Gly Tyr Phe His
1               5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Phe Ser Ser Thr Arg Ile Ser Arg Phe Ser Asp Ile Phe
1               5                   10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Gln Arg Val Glu Thr Ile Ser Pro
1               5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Gln Lys Ser Thr Glu Thr
1               5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Thr Tyr Lys Leu Glu Phe Cys Ser Gly Ser Ser
1               5                   10
<210> 7
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gly Ser Cys Leu Arg Ala
            20                  25                  30
Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Val Tyr Asp Arg Gly Tyr Phe His Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Arg Phe Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Arg Ile Ser Arg Phe Ser Asp Ile Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys
            100                 105                 110
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
        115                 120                 125
Pro Thr Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
    130                 135                 140
Leu Asn Asn Phe Ser Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210> 8
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Thr Gln Arg Val
        35                  40                  45
Glu Thr Ile Ser Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
    50                  55                  60
Leu Glu Trp Met Gly Met Gln Gln Lys Ser Thr Glu Thr Arg Leu Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Lys Leu Glu Phe Cys Ser Gly Ser Ser Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Glu Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Phe Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys Lys
465

Claims (6)

1.一种用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，特征在于所述药物组合物包括携带靶向HER2抗体的树突细胞外泌体，所述外泌体通过磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯交联剂与靶向HER2抗体连接，所述靶向HER2抗体为人源化抗体，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQID NO:7所示，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO:8所示，所述树突细胞外泌体的制备步骤包括：在DC细胞培养过程中加入诱导剂，所述诱导剂包括癌胚抗原CEA、糖类抗原CA19-9和IL-12。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述树突细胞外泌体的制备步骤包括：使用AIM-V培养基在5％CO2在37℃培养箱中培养人DC细胞，当细胞融合度达到90%后，更换新鲜培养基，在5％CO2在37℃培养箱中培养48h；收集培养基，采用梯度离心法除去培养基中游离的活细胞、死细胞、细胞碎片；所得溶液采用0.22μm滤膜过滤，除去大颗粒杂质；然后在4℃下10000g超速离心60min，弃去上清，使用无菌PBS洗涤3次，再4℃下10000g超速离心90min，收集沉淀获得树突细胞外泌体颗粒。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述树突细胞外泌体与靶向HER2抗体的连接步骤包括：将溶解于有机溶剂二甲基亚砜中的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与HER2人源化抗体按1:10-10:1比例混合均匀，在4℃无菌环境中搅拌混合30min，然后将其在4℃下反应过夜，5000rpm离心10-15min除去未反应的磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，得到磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯-HER2人源化抗体复合物；将树突细胞外泌体溶于无菌磷酸盐缓冲溶液中得到树突细胞外泌体溶液，将所述复合物与树突细胞外泌体按1:5-5:1比例混合均匀，在4℃下轻轻吸打混合均匀，37℃下反应2-4h，4500rpm离心5min得到携带靶向HER2人源化抗体的树突细胞外泌体。
4.权利要求1至3中任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的应用，所述肿瘤选自胃癌。
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