CN111920769B - 一种包裹免疫抑制剂并过表达pd-l1的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包裹免疫抑制剂并过表达PD‑L1的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用，所述细胞膜纳米囊泡由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达PD‑L1蛋白，内部包裹有免疫抑制剂。细胞膜表面可表达PD‑L1蛋白，PD‑L1蛋白可与T细胞表面的PD‑1结合并激活PD‑1/PD‑L1免疫检查点信号轴，同时PD‑L1细胞膜纳米囊泡作为靶向给药系统用来负载免疫抑制剂，将包裹的免疫抑制剂带到PD‑1表达的效应T细胞上发挥作用，增强免疫抑制药物向靶组织传递；从而通过PD‑1/PD‑L1和免疫抑制剂的双免疫耐受机制对T细胞的联合应用显著抑制体内免疫排斥反应，提高免疫治疗的效果，同时降低免疫抑制剂的用量，降低其毒性。

Description

一种包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种包裹免疫抑制剂并过表 达PD-L1的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
利用移植健康组织来取代有缺失的器官组织一直是医界所致力的目标之一， 官移植几乎是器官衰竭患者完全治愈的唯一希望，但经常因为接受移植者因自身 因免疫反应而排斥外来个体的移植物，由此，免疫排斥是器官移植发展的最大障 碍，采用一定的免疫抑制剂或干预免疫调节过程降低器官移植后个体的免疫能力， 延长移植物在其体内存留的时间，可增加器官或组织移植后的存活率，延长生命 体的生存周期。
免疫抑制剂常用于临床治疗自身免疫性疾病，免疫介导的疾病以及器官移植。 虽然早期非特异性免疫抑制剂可以抑制免疫排斥反应，延长同种异体移植的存活 时间，但长期使用这些药物会引起严重的不良反应。例如，感染发生率增加或癌 症复发率增加。因此，为了减少剂量、增加靶向性和提高移植物存活率，其他治 疗方案有待于探究，进一步为临床开发新的治疗机会。目前，基于PD-1/PD-L1 生物轴的免疫检查点抑制剂疗法在临床上显示出巨大应用潜力。研究发现，以T 细胞/抗原呈递细胞相互作用和早期T细胞活化为靶向的PD-L1是PD-1受体的 配体，在免疫细胞和癌细胞中被上调，进而抑制效应器T细胞。而通过针对性阻 断程序性死亡-1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)途径的免疫检测点，阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细 胞的抑制作用，目前主要被用于肿瘤的免疫治疗中。因此，若是能增强PD-L1 和PD-1之间的相互作用或许可降低移植/移植中发生的免疫排斥反应。但是，如 何利用PD-1/PD-L1生物轴的免疫检查点进行器官移植中的免疫排斥反应治疗， 目前还鲜有报道。
雷帕霉素(RAPA)一种靶向作用于T细胞分化和增殖后期的mTOR途径免 疫抑制剂，然而，mTOR抑制剂除了淋巴细胞外，还具有多种其他细胞靶点，在 临床上引起骨髓抑制和胃肠道不耐受等严重的不良反应，因此亟需寻找一种可以 减少雷帕霉素等免疫抑制剂的用量、副作用并提高其疗效的方法。专利 CN110215514A公开了一种基因工程化细胞膜纳米囊泡PD-1/TRAIL@CAT NVs 然而其是提供一种多功能细胞膜衍生化纳米囊泡，选择性引起肿瘤细胞免疫原性 死亡并调控免疫抑制微环境，充分调动机体内在的抗肿瘤免疫反应，实现肿瘤细 胞的有效清除和自身免疫体系的快速激活，发挥多点协同增效的抗肿瘤效果，并非是用于免疫抑制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种包裹免 疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡。
本发明的另一目的在于提供所述细胞膜纳米囊泡的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述细胞膜纳米囊泡的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡，由生物细胞膜构 成，细胞膜表面表达PD-L1蛋白，内部包裹有免疫抑制剂。
本发明所述的包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡由基因工 程化细胞膜纳米囊泡PD-L1 NVs及包裹在细胞膜纳米囊泡内的免疫抑制剂组成。 细胞膜纳米囊泡作为一种天然生物材料，有着长循环、生物相容性好、毒副作用 小的优势。本发明提供的细胞膜纳米囊泡的细胞膜表面可表达PD-L1蛋白， PD-L1蛋白可与T细胞表面的PD-1结合并激活PD-1/PD-L1免疫检查点信号轴， 同时PD-L1细胞膜纳米囊泡作为靶向给药系统用来负载免疫抑制剂，将包裹的 免疫抑制剂带到PD-1表达的效应T细胞上发挥作用，增强免疫抑制药物向靶组 织传递；从而通过PD-1/PD-L1和免疫抑制剂的双免疫耐受机制对T细胞的联合 应用显著抑制体内免疫排斥反应，提高免疫治疗的效果，同时降低免疫抑制剂的 用量，从而降低其毒性。
优选地，所述生物细胞膜来源于HEK 293T或3T3-L1细胞系。
优选地，所述免疫抑制剂为mTOR抑制剂，包裹mTOR免疫抑制剂并过表 达PD-L1的细胞膜纳米囊泡可通过增强PD-1/PD-L1免疫抑制轴和共同抑制 mTOR途径来降低T细胞活性，进而导致同种免疫反应减弱和供体特异性同种异 体移植耐受。
进一步优选地，所述mTOR抑制剂为雷帕霉素或其衍生物。小剂量雷帕霉 素(RAPA)的PD-L1细胞纳米囊泡可以显著增强PD-1/PD-L1共抑制通路，抑 制T淋巴细胞的mTOR通路，进而导致同种免疫反应减弱和供体特异性同种异 体移植耐受。
进一步优选地，PD-L1与雷帕霉素的质量比为6:1～2。
优选地，所述细胞膜纳米囊泡的粒径为10～200nm；例如10～50nm、50～ 100nm、100～150nm、150～200nm。
优选地，所述细胞膜纳米囊泡的zeta电位为-20～-40mv；例如-20～-25mv、 -25～-30mv、-30～-35mv、-35～-40mv。
优选地，所述细胞膜纳米囊泡的载药量百分比为15～18％。
优选地，所述细胞膜纳米囊泡的包封率为93％～95％。
优选地，
本发明还提供所述包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡的制 备方法，包括如下步骤：
S1.将含PD-L1的质粒进行慢病毒包装，再将PD-L1慢病毒混合液感染293T 细胞或3T3-L1细胞，经抗性筛选得到细胞膜上稳定过表达PD-L1细胞系；
S2.用缓冲液裂解步骤S1稳定过表达PD-L1细胞系的细胞膜并连续挤压，然 后梯度离心，沉淀经重悬后依次经过0.8和0.22μm孔径的膜过滤，即得过表达 PD-L1的细胞膜纳米囊泡；
S3.将免疫抑制剂通过电转化法转入步骤S2的细胞膜纳米囊泡中，即得。
本发明利用病毒感染过表达的PD-L1蛋白能够稳定表达在细胞膜上的这一 特点，将该细胞膜制备成稳定的纳米囊泡。从而获得结合了纳米囊泡(经过长循 环，长效缓释)、细胞膜(生物相容性好、毒副作用小)与过表达PD-L1受体(靶 向性结合、免疫检查点)三重优势的一种新型的纳米载药系统，而且相比于免疫 检查点抑制剂，PD-L1细胞膜纳米载药系统所需成本低、易大量获取。进一步的， 通过电转化法制备了包裹免疫抑制剂的细胞膜纳米囊泡，从而以PD-L1 NVs为 负载体，携带免疫抑剂来进行协同免疫抑制。
优选地，所述利用PD-L1慢病毒混合液感染的方法包括：获得293T或3T3-L1 细胞，培养12～18h，用PD-L1慢病毒混合液感染293T细胞或3T3-L1细胞。 感染的方法包括按比例向5×106个细胞中加入2mL上述病毒混合液，并加入终 浓度为5μg/mL polybrene试剂，摇匀继续培养12～18小时后，换成新的10％FBS 的DMEM培养基，继续培养20～24小时。
优选地，所述抗性筛选的方法包括：加入嘌呤霉素对细胞进行筛选，嘌呤霉 素浓度范围为2到10μg/mL，持续培养直至不再有细胞出现死亡。
优选地，所述电转液为终浓度1.15mM磷酸氢钾和25mM氯化钾的无菌水溶 液，pH＝7.2。
本发明还请求保护所述的包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊 泡在制备抗免疫排斥药物的应用。尤其是在制备抑制器官移植免疫排斥的药物中 的应用。
本发明为了减少RAPA等免疫抑制剂的用量、副作用和提高其疗效，以RAPA 为例，设计了一种新型的微泡给药系统PD-L1 NVs，利用生物工程细胞膜衍生的 PD-L1纳米囊泡(PD-L1 NVs)来携带低剂量的RAPA。这些NVs通过增强 PD-1/PDL1免疫共抑制终末轴和抑制mTOR途径，在体外抑制T细胞的活化和 增殖，雷帕霉素包裹的PD-L1 NVs对T细胞增殖的抑制作用强于单独包裹的 PD-L1NVs和雷帕霉素，这一点在小鼠皮肤移植模型中可以得到再现，导致同种 免疫反应和移植耐受减弱，从而在提高效果的时候，减少了免疫抑制剂用量，降 低了毒性。因此，利用PD-L1 NVs递送纳米囊泡的功能，可携带其他具有协同 作用的免疫抑制剂类药物，来增强免疫治疗和促进同种异体器官移植接受程度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的包裹免疫制剂的PD-L1细胞膜纳米囊泡，细胞膜表面表达PD-L1 蛋白，可与T细胞表面的PD-1结合并激活PD-1/PD-L1免疫检查点信号轴，同 时细胞膜纳米囊泡作为靶向给药系统用来负载免疫抑制剂，将包裹的免疫抑制剂 带到PD-1表达的效应T细胞上发挥作用，增强免疫抑制药物向靶组织传递；从 而通过PD-1/PD-L1和免疫抑制剂的双免疫耐受机制对T细胞的联合应用显著抑 制体内免疫排斥反应，协同提高免疫治疗的效果，同时降低免疫抑制剂的用量， 降低其毒性；为降低免疫抑制剂严重不良反应、减少其剂量、甚至开发新的联合 用药提供了基础。
附图说明
图1为负载RAPA的PD-L1 NVs的制备示意图。I)在细胞膜上稳定表达 PD-L1受体的HEK 293T细胞株的工程化；II)获取表达PD-L1蛋白的细胞膜； III)通过研磨制备PD-L1NVs；IV)将RAPA包裹到PD-L1 NVs中得到包药囊 泡RAPA@PD-L1 NVs。
图2为过表达PD-L1蛋白的293T稳定细胞系的鉴定及PD-L1 NVs的表征。 A)PD-L1NVs可抑制效应T细胞下调T细胞早期活化的功能。mTOR抑制剂 RAPA的释放可抑制T细胞的增殖。B)共聚焦显微镜显示人PD-L1-OFP质粒在 293T细胞膜上表达，而OFP则在细胞质中表达和分散，比例尺：10μm；C)共 焦图像显示存在由红色斑点指示的PD-L1-OFP NVs，比例尺：1μm；D)透射电 镜图像显示PD-L1 NVs的形状和大小，比例尺：200nm；E)采用DLS分析法分别测定人PD-L1 NVs的粒径分布。F)用相分析散射(PALS)法分别测量了人 PD-L1 NVs的zeta电位分布。G)Western blot法检测稳定细胞株NVs和全细胞 裂解液(WCLs)上人PD-L1-OFP受体的表达，WCL/NVs蛋白输入量为2％。
图3为PD-L1 NVs的体外生物学行为及体内生物分布。A)共聚焦显微镜显 示PD-L1NVs可定位于Jurkat细胞膜。比例尺：5μm；B)共聚焦图像显示PD-L1 NVs可内化于DCs内。比例尺：10μm；C)共聚焦图像显示PD-L1 NVs可定位 于GFP-PD-1过度表达的293T细胞膜(比例尺：10μm)，下面的图片是放大的 白领在同侧的图片，30×放大倍数；D)用Co-IP和westernblot检测PD-1(在 NVs上)和PD-L1(在B16F10细胞上)的相互作用。免疫沉淀法(IP)；免疫印迹法(IB)；E)流式细胞仪检测CFSE染色结果显示PD-L1 NVs抑制Jurkat T 细胞增殖，用板结合的抗CD3和抗CD28重新刺激Jurkat T细胞，将PD-L1 NVs 加入T细胞3天，PC组为同一天培养的Jurkat T细胞，无PD-L1 NVs，NC组代 表第0天的Jurkat T细胞；F)小鼠尾静脉注射Cy5.5标记的opnvs和PD-L1 NVs 衍生的3T3L1细胞4h，荧光光谱图像显示PD-L1/pf-NVs在主要器官中的分布。
图4为RAPA@PD-L1 NVs在体外抑制PBMCs和T细胞的增殖。A)RAPA 抑制AKT/mTOR/p70S6K反馈通路的机制及对T细胞增殖的影响。B)RAPA体 外释放，C-H)代表性的Westernblot图，定量分析RAPA在不同时间点(C-E) 或不同药物浓度(F-H)对Jurkat T细胞中pS6和pAKT表达的影响，误差条， 均数±SEM。(n＝3)。I)PD-L1 NVs的流式细胞术数据，RAPA，RAPA@PD-L1 NVs使用CFSE染色抑制第3天PBMC或T细胞的增殖。PBMC或T细胞用 plate-bound CD3(10μg/mL)和CD28抗体(2μg/mL)刺激2天后，将PD-L1 NVs、 RAPA、RAPA@PD-L1NVs加入细胞3天。流式细胞术检测CFSE染色。PC组 为Jurkat T细胞，培养天数相同，不含药物。NC组表示第0天的Jurkat T细胞。
图5为小鼠PD-L1 NVs的制备和鉴定。A)小鼠PD-L1-OFP质粒在3T3L1 细胞上稳定高表达的共聚焦图像，比例尺：5μm；B)qPCR法分析3T3L1细胞 感染小鼠PD-L1-OFP质粒后PD-L1 mRNA的表达；C)小鼠PD-L1-OFP质粒在 3T3L1细胞膜上表达的Western blotting研究；D)小鼠PD-L1 NVs的透射电镜 图像，比例尺：200nm；E)小鼠PD-L1 NVs和RAPA@PD-L1NVs的动态光散 射分析；F)小鼠PD-L1 NVs和RAPA@PD-L1 NVs的相位分析散射(PALS)分析。
图6为RAPA@PD-L1 NVs抑制皮肤移植排斥反应和CD8+T细胞活。A) 小鼠同种异体皮肤移植模型的建立及给药；B)用生理盐水、RAPA、PD-L1 NVs 和RAPA@PD-L1 NVs(n＝3)处理后不同组的治疗小鼠的体重，生理盐水：皮 肤移植小鼠注射生理盐水；C)不同药物组(生理盐水、RAPA、PD-L1 NVs， RAPA@PD-L1 NVs)(n＝3)中小鼠同种异体皮肤移植的存活率；D-E)通过流 式细胞术对不同治疗组小鼠脾脏CD8+T细胞(以CD3+阳性细胞为门控)进行 代表性绘制和定量分析；F-G)通过流式细胞术(n＝3)对不同治疗组小鼠脾脏 中的CD4+T细胞(CD3+细胞)进行代表性绘制和定量分析；H)不同药物注射 组小鼠脾脏样品CD8+/CD4+T细胞比例的定量分析；I-J)用qPCR法测定移植 小鼠脾脏中FoxP3和TGF-β的含量；K-L)移植皮肤CD3抗体HE染色和免疫 荧光的代表性图像。使用单向方差分析和Tukey事后检验分析。NS：无显著性， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7为本发明示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
化学试剂：嘌呤霉素(Puromycin)购自Sigma-Aldrich公司；用于western blot 的OFP抗体购自Abcam公司；用于FACS分析的CD3、CD4和CD8抗体购自 Biolegend公司；麦胚芽凝集素(WGA)Alexa Fluor 488染料购自Thermo Scientific 公司。Ficoll Paque Plus购自GE Healthcare公司。
质粒：human pLV-puro-CD274-OFPSpark和小鼠pLV-puro-mCD274-OFPSpark 的质粒均购自购自北京义翘神州科技有限公司。
细胞培养：HEK 293T和3T3-L1细胞在DMEM(美国Thermo Scientific)中 保存，DMEM中添加100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gemstar，中国)和 10％胎牛血清(FBS)，温度37℃，二氧化碳浓度为5％。用含10％胎牛血清的 RPMI 1640培养基培养人外周血Jurkat细胞和外周血单个核细胞(PBMC)。
如图1所示，本发明设计了细胞膜衍生的纳米囊泡(NVs)来表达PD-L1 蛋白，该蛋白可与T细胞表面的PD-1结合并激活PD-1/PD-L1免疫检查点信号 轴。此外，我们使用PD-L1NVs作为载体，携带雷帕霉素(RAPA)来进行协同 免疫抑制。PD-1/PD-L1结合有望有效抑制CD8+效应T细胞(Teff)的活化和增 殖，促进调节性T细胞(Treg)的发育和维持(图2A)。
实施例1过表达PD-L1蛋白的细胞膜纳米囊泡的构建
1、构建能够在细胞膜上稳定过表达PD-L1蛋白和OFP标签蛋白的293T细 胞系
(1)将950μL 1×的HBS缓冲液、10μL浓度为1μg/μL的混合质粒的水溶 液，所述混合质粒为质量比为1:1的二代慢病毒包装载体pSPAX2质粒(吉赛生 物(geneseed)，GSF1)和pMD2.G质粒(吉赛生物(geneseed)，GSF2)、10μg的 human PDCD1 gene lentiviral ORFcDNA expression病毒质粒(义翘神州(Sino Biological Inc)，HG10377-UT)；混匀，再滴入50μL浓度为2.5mol/L的CaCl2水溶液，混匀，室温避光放置20～30min，得到病毒包装混合液；
(2)将培养有3×106个293T细胞的10％FBS的DMEM培养基换成新的相 同的培养基，再向所述培养基中加入病毒包装混合液，所述培养基和病毒包装混 合液的体积比为9：1，混匀，于37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱继续培养14h， 换相同体积的30％FBS的DMEM培养基，继续培养18h，吸取所有的培养基于 离心管中为第一批病毒培养基，4℃保存；换新的相同体积的30％FBS的DMEM 培养基，继续培养18h，吸取所有的培养基为第二批病毒培养基，将第二批病毒 培养基与第一批病毒培养基混匀，0.45μm滤器过滤，得到PD-L1-OFP慢病毒 感染液，分装-80℃保存；
(3)向1mL的PD-L1-OFP慢病毒感染液中加入5μg的polybrene试剂(索 莱宝(solarbio)，H8761-500ul*5)，获得含polybrene的PD-L1-OFP慢病毒感染液， 按比例向培养有5×106个293T细胞的10％FBS的DMEM培养基中加入2mL所 述含polybrene的PD-L1-OFP慢病毒感染液，摇匀，继续培养15小时后，更换 新鲜的10％FBS的DMEM培养基，继续培养22小时，用嘌呤霉素筛选，持续 培养直至不再有细胞出现死亡，得到能够在细胞膜上稳定过表达PD-L1蛋白和 OFP标签蛋白的293T细胞系PD-L1-OFP-293T。
共聚焦显微镜结果如图2B，显示人PD-L1-OFP质粒在293T细胞膜上表达， 确认在细胞膜上表达和定位了PD-L1-OFP，而作为对照，OFP则在细胞质中表 达和分散。
2、PD-L1细胞膜纳米囊泡(NVs)分离
1)将构建的稳定PD-L1-OFP-293T细胞系培养扩增至2个10cm培养皿的细 胞，细胞生长密度达到90％左右。用Trypsin裂解收集细胞，PBS重悬离心的方 法洗1-2次。
2)PBS离心去上清后，用1mLHM溶液重悬。4度放置过夜。HM溶液中 按要求加入PMSF蛋白酶抑制剂。约2盘10cm培养皿需加入1mLHM裂解液。
3)第二天，准备一盒冰块，研磨器提前洗净超声干燥后置于冰块上预冷。 将离心管中的溶液转移至50mL研磨器中，一次1-2mL，每次需研磨100-200次。
4)研磨后的溶液转移至冰上预冷的EP管中，配平后进行离心，1000g，4度， 5min，离心后取上清，转移至新的预冷的EP管中。该离心能够去掉沉淀中的细 胞核等大的细胞器。如果沉淀过多，说明步骤3裂解研磨不充分，需重复步骤3。
5)上清液继续离心，3000g，4度，5min，取上清。去掉细胞核等大的细 胞器。如果产量太少，跳过第5步。
6)20000rpm，需要约60000g离心30min，取沉淀，沉淀为细胞膜组分。 有超速离心机直接超速离心，100000g，25000rpm，离心取沉淀。
7)1mL HM重悬沉淀，4度保存。可保存2周左右。
8)过0.8μm纳米的滤器至少7次；再过0.22μm滤器至少7次。4度保存。 可以保存约20天左右。
共焦显微镜(confocal microscopy)和透射电镜(TEM)检测纳米囊泡的形 状，共焦图像如图2C所示，显示存在由红色斑点指示的PD-L1-OFP NVs；透射 电镜如图2D所示，显示PD-L1-OFP NVs的形状和大小，证实NVs为红色斑点 和膜结合的圆形。
细胞膜纳米囊泡的粒径分布及zeta电位分析：用PBS稀释并导入反应杯。 用仪器(NanoBrook 90+PALS，Brookhaven仪器)分析细胞膜的大小分布(0～ 5000nm)和zeta电位，显示NVs的平均大小为170nm，平均zeta电位为-38mv (图2E-F)。
Western blot：用RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)对PD-L1-OFP NVs 细胞进行裂解，将细胞裂解物和纯化的膜囊装入10％SDS-PAGE，然后用OFP 和β-actin一级抗体和HRP结合的抗鼠或抗兔二级抗体进行检测。采用ECL化学 发光试剂盒(中国蛋白质科技公司)进行信号照明，结果如图2G所示，PD-L1 蛋白在纯化的NVs上保持不变。以上实验均证明了从工程HEK293T细胞中成功 获得PD-L1 NVs。
实施例2 PD-L1 NVs的体外生物学行为及体内分布
由于过度活化的T细胞是通过PD-L1/PD-1途径负性调节的，我们希望在体 外研究NVs上的PD-L1蛋白是否与靶细胞上的相应配体PD-1相互作用。在此， 我们将PD-L1-OFPNVs与相应的IL-2刺激的Jurkat T细胞或骨髓来源的树突状 细胞(dc)孵育，具体试验步骤如下所述：
纳米囊泡细胞结合试验：将Jurkat T细胞与PD-L1 NVs(50微克/毫升，蛋 白质重量)孵育30分钟，用Ceoporep-4离心制成玻片(中国英台)。加入麦胚 凝集素(WGA)、Alexa-Fluor 488结合物染色细胞膜10min，HEK 293T细胞与 PD-L1-OFP NVs(50μg/mL，蛋白量)共孵育30min。在此基础上，加入麦胚凝 集素(WGA)、Alexa-Fluor 488结合物对细胞膜进行染色10min，293T-PD-1-GFP 细胞接种于共聚焦培养皿中。将PD-L1-OFP NVs(50微克/毫升，蛋白质重量) 加入培养基中培养30分钟。使用共焦显微镜(蔡司，LSM880)和适当的激光设 置拍摄图像。
结果如图3所示，观察到表达PD-L1-OFP的NVs与Jurkat T细胞表面结合 (图3A)，而这些小泡大多内化在DC内(图3B)。我们进一步使用PD-1-GFP- 表达的293T细胞来确认NVs上的PD-L1与靶293T细胞上的PD-1特别相互作 用(图3C)。
我们还采用共免疫沉淀法测定了PD-L1受体与表达PD-1-GFP的293T细胞 孵育20小时后，NVs上的PD-L1受体和细胞上的PD-1之间的分子相互作用。 值得注意的是，PD-L1抗体将PD-1和PD-L1一起拉低(图3D)，进一步支持 PD-L1 NVs与293T细胞表达的PD-1在物理上相互作用。这些结果证实了囊泡 表面的PD-L1能与靶细胞膜上的PD-1受体有效相互作用的结论。我们接下来验 证PD-L1 NVs在抑制T细胞增殖方面是否具有与细胞表面PD-L1相似的功能。 我们通过流式细胞术证实，与对照组相比，PD-L1 NVs抑制Jurkat T细胞的增殖，表现为含有稀释CFSE的细胞比例降低(图3E)。此外，为了研究PD-L1 NVs 在小鼠体内的生物分布，我们将cy5.5标记的PD-L1 NVs和对照的OFP NVs静 脉接种于小鼠体内。荧光成像结果显示PD-L1和对照组OFP NVs均能在脾、肾、 肝和肺中积聚(图3F)。同时荧光强度数据显示PD-L1 NVs组小鼠组织中NVs 分布较多，提示PD-L1 NVs适合于后续的体内实验研究。
实施例3 RAPA@PD-L1 NVs制备及体外培养试验
在本实施例中，我们验证PD-L1 NVs是否可以作为靶向给药系统，将小剂 量雷帕霉素(RAPA)输送到效应T细胞以增强免疫抑制。根据雷帕霉素抑制 mTOR反馈AKT/mTOR/p70S6K途径和T细胞增殖的机制(图4A)，雷帕霉素 可抑制mTOR上游蛋白AKT和下游S6核糖体蛋白的磷酸化。因此，我们采用 电转化法制备雷帕霉素包膜囊泡(RAPA@PD-L1 NVs)，并进行了雷帕霉素与 PD-L1 NVs的包封实验，然后测定雷帕霉素的体外释放度。具体试验步骤如下所 述：
RAPA负载(RAPA@PD-L1 NVs制备)：将6mg(蛋白质重量)纯化的囊 泡(PD-L1 NVs)和1mg RAPA(100mg/mL在pH 10的PBS中稀释)在4℃的 1mL电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾、pH7.2，25mM氯化钾)中轻轻混合以将 RAPA加载到PD-L1 NVs中。使用微脉冲电动操作器(Bio-Rad，美国)在300V 和150μF的0.4cm电穿孔反应杯中对样品进行电穿孔。之后，将含有样品的电 穿孔反应杯在冰上孵育30分钟，以回收膜。然后用冷PBS以100000×g的超速 离心洗涤NVs 3次。最后用乙腈稀释50倍测定浓度。
包封率和载药量的测定：采用紫外-可见分光光度法在278nm和室温下检测 RAPA。样品中RAPA的浓度由使用乙腈制备的标准RAPA溶液构建的校准曲线 确定。药物包封率(E.E.)由式(1)计算得出：％E.E.＝[1-(MR/MT)]×100％； 其中MR是上清液中RAPA的质量，MT是样品中RAPA的总质量。药物载量(D.L.) 的计算公式为：％D.L.＝[(MT-MR)/MNVs]×100％，其中MNVs是样品中PD-L1 NVs 的总质量。分析分三次进行，结果用平均值±标准差表示(n＝3)。结果显示， RAPA载药量百分比为15.58％。
药物释放：用6mg NVs将1mg RAPA样品封装在1mL乙腈中。然后将悬 浮液转移到透析袋(MWCO＝3500，上海生工，中国)中，在离心管中浸入50 毫升PBS中。随后，将试管放入轨道振动水浴中，并在37℃和90rpm下振动。 在选定的时间间隔内，透析袋外的上清液被另一个2毫升新鲜PBS替代，并进 行紫外可见光谱分析。如前所述，释放的RAPA量由UV-VIS检测。在278nm 处监测柱出水的吸光度。结果如图4B所述，观察到包裹的RAPA@PD-L1 NVs 在50小时内完全被控制释放，包封率为93.5％。
为了验证雷帕霉素对mTOR信号的影响，我们探索了mTOR信号的激活， 并发现，根据S6和AKT的磷酸化判断，在RAPA@PD-L1 NVs共培养的Jurkat T 细胞中，mTOR的激活被迅速而显著地抑制(图4C-E)。pS6和pAkt信号的抑 制作用在NVs孵育后24小时达到高峰(图4C-E)。在囊泡孵育的较长时间内， pS6仍保持激活状态，但pAkt的激活在治疗后72小时逐渐降低(图4C-E)。我 们还测定了增加雷帕霉素浓度(0，2.5，10，20μM)对Jurkat T细胞mTOR抑 制的影响。结果表明，包裹2.5μM和10μM雷帕霉素的PD-L1 NVs在mTOR信 号传导中均表现出较强的抑制作用(图4F-H)。因此，我们选择了10μM RAPA@PD-L1 NVs进行后续的体内外实验。
为探讨RAPA@PD-L1 NVs在体外的功能作用，CFSE标记的PBMC或T细 胞经NVs处理3d。
羧荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)细胞增殖试验：将PBMCs或T细胞接种 于24孔中，用10μg ml-1平板结合抗CD3(克隆OKT3；Biolegend)和2μg ml-1 抗CD28(Biolegend，美国)重新刺激。2天后，将不同的NVs组(50μg/mL) 加入上述孔中3天，然后收集细胞并用非血清RPMI 1640培养基洗涤。随后， 使用CFSE分区跟踪器试剂盒(Biolegend，美国)在37℃下标记CFSE工作液 (5μM)20分钟，用培养基淬火染色，然后进行下游流式细胞术分析。
流式细胞仪分析显示，PD-L1、RAPA和RAPA@PD-L1 NVs对PBMC的增 殖抑制率分别为40.5％、95.0％和98.4％，表明RAPA@PD-L1 NVs比PD-L1 NVs 或RAPA的个体存在具有更强的免疫抑制作用(图4I)。有趣的是，PD-L1、RAPA 和RAPA@PD-L1 NVs对T细胞增殖的抑制率分别为13.8％、52.6％和77.1％， 远低于PBMC(图4I)。PBMC和Jurkat对T细胞增殖的明显抑制作用可以解释 为PBMC不仅含有触发PD-L1/PD-1免疫检查点途径的T细胞，还含有激活雷帕 霉素免疫抑制途径的DCs。因此，与纯化的T细胞相比，RAPA@PD-L1 NVs对 PMBC细胞增殖具有协同作用，抑制体外培养的PBMCs和T细胞增殖。
实施例4 RAPA@PD-L1 NVs抑制体内免疫排斥反应试验
为了研究RAPA@PD-L1 NVs是否能抑制体内免疫排斥反应，我们首先构建 了表达小鼠PD L1蛋白的3T3-L1小鼠脂肪前细胞，以避免跨物种免疫应答。共 聚焦分析证实了3T3-L1中PD-L1的膜分布(图5A)。qPCR和western blotting 分析证实了3T3-L1中PD-L1的mRNA和蛋白表达(图5B-C)。建立3T3-L1-PD-L1 细胞系后，制备PD-L1 NVs，并用电子显微镜进行表征(图5D)。此外，我们使 用DLS分析证实，从小鼠3T3-L1细胞中提取的PD-L1 NVs和RAPA@PD-L1 NVs 具有相似的平均直径和zeta电位，适用于随后的动物实验(图5E-F)。
异体皮肤移植模型：经中山大学中山医学院动物伦理委员会审核批准，允许 在相关实验中使用实验动物。核准号码是2018000577。对8周龄小鼠进行皮肤 移植，麻醉、剃毛、75％乙醇消毒。将雄性BALB/c小鼠的皮片(0.8cm～2)背 向移植到受体雄性C57BL/6小鼠上。所有受者随机分为5组：PC组(生理盐水， n＝3)、2组(PD-L1 NVs，25mg/kg，n＝3)、3组(RAPA，2mg/kg，n＝3)、4 组(RAPA@PD-L1 NVs，2+25mg/kg，n＝3)。移植小鼠在前3天通过尾静脉注 射NVs、RAPA或生理盐水。3天后隔日注射药物，至14天处死，10天解剖移 植皮肤和脾脏。根据移植物的外观、质地和颜色确定移植物皮肤坏死。
苏木精和伊红(H&E)染色：取移植部位皮肤组织标本，用4％多聚甲醛固 定24小时后，转移至70％乙醇中。然后，用石蜡包埋样品，切片成4μm厚的玻 片。切片用苏木精和伊红(H&E)进行标准程序染色。光镜下100倍观察炎性细 胞浸润情况。
免疫组织化学(IHC)分析：免疫组化染色证实移植皮肤中有T细胞浸润。 简单地说，所有福尔马林固定的石蜡包埋组织切片都要进行脱蜡、再水化和热诱 导表位提取。随后，将载玻片与CD3一级抗体(1:50，1.5％BSA)孵育过夜， 相应的二级抗体在黑暗中室温孵育1h。最后，将载玻片与DAB基质溶液孵育， 以显示抗体染色的颜色，并用苏木精复染，以供观察量化。
流式细胞术的细胞准备：取小鼠脾脏，用PBS转移至1.5ml的EP管中，冰 冻保存后进行细胞分离。为了获得分离的脾细胞，将脾脏反复研磨，在PBS中 洗涤，通过70μm过滤器，并在细胞染色缓冲液(Biolegend，美国)中用以下抗 体在黑暗中染色15分钟：抗CD3-FITC(克隆17A2)、抗CD4-APC(GK1.5)、 抗CD8-亮紫510(克隆53-6.7)、抗CD25-PE(克隆PC61)，最后用流式细胞 仪(MoFlo-High-performance Cell Sorter，Beckman)进行分析。
定量实时PCR：总RNA通过TRIZOL试剂(TaKaRa，Tokyo，Japan)从细 胞和组织中收集和纯化，符合制造商的方案。在加入TRIZOL试剂之前，将组织 磨碎。RNA浓度用NANODROPONE(Thermo Fisher Scientific)测量。利用 HiScript III RT SuperMix对qPCR(+gDNAwiper)(中国Vazyme)和T100TM 热循环仪(BIO-RAD)将RNA反向转录成互补DNA(cDNA)，然后使用2x SYBR Green qPCR Mix(中国ES Science)和
Figure BDA0002559061270000132
96(Roche)对其进行定量。所有过程都是按照制造商的说明进行的。相关基因表达的折叠变化用2--ΔCt方 法鉴定。
表1本发明中使用的引物。
Figure BDA0002559061270000131
结果显示，在实验期间没有观察到明显的体重减轻，表明NVs对小鼠无毒 (图6B)。我们发现，与对照生理盐水组相比，PD-L1 NVs、RAPA和 RAPA@PD-L1 NVs均提高了移植皮肤的存活率，其中RAPA@PD-L1 NVs延长 移植物存活时间的时间比PD-L1 NVs和RAPA单独延长(图6C)。接下来，我 们检查RAPA@PD-L1 NVs治疗是否对CD8+T细胞有影响，CD8+T细胞是参与 移植排斥反应的主要免疫细胞。值得注意的是，我们观察到在脾脏中，RAPA或 PD-L1NVs导致CD8+T细胞(33％和32％)(图6D-E)和CD4+T细胞(16％和 25％)(图6F-G)适度减少，而RAPA@PD-L1 NVs导致CD8+T细胞减少66％， CD4+T细胞减少50％(图6D-H)。已知调节性T细胞通过抑制效应性T细胞的 功能来控制皮肤移植排斥反应。正如预期的那样，我们发现，与生理盐水组相比， RAPA@PD-L1 NVs组受者脾脏中调节性T细胞的关键标记FoxP3的mRNA表 达显著上调(图6I)。调节性T细胞在体内通过TGF-β信号抑制肿瘤特异性cd8t 细胞毒性。我们还发现RAPA@PD-L1 NVs显著上调了受者脾脏中TGFβmRNA 的表达，这比RAPA或PD-L1 NVs单独作用更为显著(图6J)。同样，苏木精- 伊红(HE)和免疫组化分析显示，在NVs或RAPA处理的同种异体皮肤移植中， 炎症减轻，浸润T细胞密度降低，其中RAPA@PD-L1 NVs组效果最为显著(图 6K-L)。综上所述，所有这些结果表明RAPA@PD-L1 NVs在皮肤移植模型中的 免疫抑制作用比单独的PD-L1 NVs或RAPA强得多，具有协同效果。

Claims (6)

1.一种包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达PD-L1蛋白，内部包裹有免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为雷帕霉素；其中，PD-L1与雷帕霉素的质量比为6:1～2；细胞膜纳米囊泡粒径为10～200nm。
2.根据权利要求1所述的细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述生物细胞膜来源于HEK293T或3T3-L1细胞系。
3.权利要求1～2任一项所述的包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将含PD-L1的质粒进行慢病毒包装，再将PD-L1慢病毒混合液感染293T细胞或3T3-L1细胞，经抗性筛选得到细胞膜上稳定过表达PD-L1细胞系；
S2.用缓冲液裂解步骤S1稳定过表达PD-L1细胞系的细胞膜并连续挤压，然后梯度离心，沉淀经重悬后依次经过0.8和0.22μm孔径的膜过滤，即得过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡；
S3.将免疫抑制剂通过电转化法转入步骤S2的细胞膜纳米囊泡中，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3为取5～100μL免疫抑制剂母液和总蛋白重量为0.5～2mg的PD-L1细胞膜纳米囊泡混在0.5～2mL电转液中，在280～320V，140～160μF的电转条件下进行电转化；于0～4℃静置25～35min，离心，沉淀加入2～6℃PBS溶液重悬清洗，离心，去上清，重复清洗2～3次，90000～110000g，2～6℃离心20～40min，沉淀用PBS溶液重悬，即得到包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述电转液为终浓度1.15mM磷酸氢钾和25mM氯化钾的无菌水溶液，pH＝7.2。
6.权利要求1～2任一所述的包裹免疫抑制剂并过表达PD-L1的细胞膜纳米囊泡在制备抗免疫排斥药物的应用。
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