FR2974369A1 - Amplification de cellules t regulatrices a l'aide d'immunoglobulines anti-thymocytes - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une méthode ex vivo de préparation de cellules T régulatrices à partir de cellules T CD4+ et d'immunoglobulines anti-thymocytes, ainsi que les cellules T régulatrices susceptibles d'être obtenues par cette méthode, une composition pharmaceutique les contenant, et leurs utilisations pour le traitement et/ou la prévention de la maladie du greffon contre l'hôte, du rejet de tissu(s) ou d'organe(s) après greffe, d'une maladie autoimmune, ou d'une allergie. L'invention concerne aussi une trousse pour l'amplification de cellules T régulatrices.
Description
Amplification de cellules T régulatrices à l'aide d'immunoglobulines antithymocytes
L'invention concerne une méthode ex vivo de préparation de cellules T régulatrices à partir de cellules T CD4+ et d'immunoglobulines anti-thymocytes, ainsi que les cellules T régulatrices susceptibles d'être obtenues par cette méthode, une composition pharmaceutique les contenant, et leurs utilisations pour le traitement et/ou la prévention de la maladie du greffon contre l'hôte, du rejet de tissu(s) ou d'organe(s) après greffe, d'une maladie autoimmune, ou d'une allergie. L'invention concerne aussi une trousse pour l'amplification de cellules T régulatrices. La réponse immunitaire visant à assurer l'intégrité d'un organisme vis a vis des agressions externes (agents microbiologiques ou substances exogènes) ou internes (cancer, autoimmunité, vieillissement) est gouvernée par des moyens effecteurs de rejet ou de tolérance d'une cible dénommée antigène. Ces moyens effecteurs sont contrôlés par des mécanismes d'amplification (cellules amplificatrices ou « helper ») ou de suppression (cellules suppressives ou régulatrices). Il existe plusieurs populations de cellules T régulatrices (Treg). Cependant l'une d'entre elle semble avoir un rôle majeur dans le bras de la régulation négative de la réponse immune. Cette population de cellules régulatrices est caractérisée par des marqueurs de surface et intracytoplasmiques spécifiques. Classiquement elle est décrite comme une population de cellules T CD4+CD25+Foxp3+ et peut exprimer divers marqueurs supplémentaires comme CTLA4+ CD40L+ GITR+ GranzymeA+ Granzyme B+ ILT3+, ILT4+ CD109+ IL10+ CD127dim, CD62L+. Cette population a deux origines : l'une provient directement de la différenciation intrathymique des cellules CD4 en T régulateurs dits « naturels » (nTreg) et l'autre est issue des CD4 périphériques à la suite de sollicitation du système effecteur, produisant les CD4 régulateurs « induits » (iTreg). Ce sont ces derniers que les biologistes souhaitent produire en induisant leur différenciation et leur expansion par différents modes de stimulations. A ce jour, la meilleure induction est réalisée avec la combinaison d'anticorps monoclonaux agonistes anti-CD3 (TCR) et anti-CD28. Malheureusement ce signal TCR/CD28 est insuffisant pour induire les cellules iTreg et cette combinaison induit aussi des cellules effectrices et ne permet pas d'obtenir une population totalement pure de cellules iTreg. D'autres facteurs sont requis pour l'induction de cellules iTreg, comme la sollicitation des récepteurs gamma de l'IL2 et le TGFR. Or l'utilisation de ces signaux est encore insuffisante pour obtenir une population de cellules iTreg pure et effectrice.
L'immunomanipulation de cette branche régulatrice avec les cellules supportant cette activité représente un moyen thérapeutique rationnel pour traiter les maladies autoimmunes, pour la préparation de l'organisme à recevoir une transplantation de tissu(s) ou d'organe(s), ou pour traiter les situations d'emballement de la réponse immunitaire ou les rejets d'organe(s) ou de tissu(s) après greffe, comme la maladie du greffon contre l'hôte (« graft versus host disease », GvHD).Dans sa conception première le sérum anti-lymphocytaire (SAL) était destiné à détruire les principales cellules à l'origine des rejets de greffes allogéniques. L'objectif fut pleinement atteint de sorte que ce produit, élaboré selon différentes modalités, s'est vite imposé comme un élément important de la pharmacopée de l'immunosuppression en transplantation d'organe(s) ou de tissus. La Thymoglobuline® (immoglobulines de lapin anti-thymocytes humains) est devenue le produit majeur de cette classe thérapeutique. Elle est produite en immunisant des lapins avec des thymus humains, comme décrit dans la demande de brevet internationale WO 2002/026830. Il s'agit d'une préparation d'immunoglobulines polyclonale de type IgG. Depuis quelques années, on découvre que le pouvoir lymphopéniant de la Thymoglobuline® ne représente pas le seul mécanisme d'action. Il s'avère en effet que la Thymoglobuline® possède en outre la propriété d'induire l'expansion de sous-populations lymphocytaires régulatrices (Feng et al., Blood, 111(7), 3675-3683), ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques. La capacité des immunoglobulines anti-thymocytes (ATG) à induire des cellules iTreg peut être mise à profit pour traiter, notamment, une pathologie grave survenant à la suite des greffes de cellules souches hématopoïétiques, à savoir la maladie du greffon contre l'hôte ou GvHD. Le GvHD est une des complications majeures des allogreffes de cellules souches hématopoïétiques et représente la première cause de mortalité hors rechute dans les greffes familiales. Elle atteint principalement la peau, le tube digestif et le foie. Le traitement de la GvHD aiguë repose sur l'adjonction, au traitement immunosuppresseur préventif en cours (par inhibiteur de calcineurine ou mycophénolate), d'une corticothérapie (à 2 mg/kg/j), qui est ensuite réduite une fois la réponse obtenue. Il n'y a pas de traitement de référence au-delà de cette ligne de traitement, ni en cas de réponse incomplète ou de cortico-dépendance.
La maladie chronique du greffon (GvHD chronique) prend le masque d'une atteinte auto-immune par déficit de la tolérance immune. Les signes principaux sont cutanés (pouvant aller jusqu'à la sclérodermie) et muqueux, avec une atteinte digestive, un syndrome sec, et/ou une atteinte hépatique pulmonaire ou autre. De même, dans la GvHD chronique, le traitement de première ligne des formes extensives (ou score IBMTR > 3) repose sur une corticothérapie à 1 mg/kg/j associée ou non à un immunosuppresseur. En cas de réponse incomplète ou de cortico-dépendance, ou au-delà d'une première ligne de traitement, il n'y a pas de traitement de référence.
La reconstitution en lymphocytes T régulateurs, évaluée par les marqueurs CD4+ CD25+ Foxp3+, est déficitaire pendant au moins 6 à 12 mois en post-greffe chez l'homme, et la richesse des greffons en ce type cellulaire, qu'ils soient issus de moelle osseuse ou de sang périphérique, est également très limitée. La faisabilité de l'utilisation thérapeutique de lymphocytes T régulateurs chez l'homme est aujourd'hui établie à partir de lymphocytes T régulateurs hautement purifiés par cytométrie de flux, puis amplifiés. Pour l'instant, il n'a pas été rapporté d'effet indésirable en terme de tolérance. Cependant ce type de procédure est très lourd et peu reproductible. Or, dans le sang d'un sujet sain, les cellules CD4+CD25+ représentent la quasi-totalité des cellules T régulatrices et le tri sur le seul marqueur CD25+ suffit pour obtenir une purification > 70 % de ces cellules. Sachant que l'objectif visé est d'obtenir entre 5.105 et 1.106 cellules par kg, il est possible de purifier sur la base du seul tri CD25, en condition GMP, une population lymphocytaire utilisable en thérapeutique à partir de cytaphérèse du donneur. La quantité de cellules T non régulatrices ré-infusées ne doit toutefois pas dépasser le seuil de 5.105/kg, seuil maximum admis pour le tri en greffe haplo- identique (greffe en situation de risque maximal de GvHD), ce qui va limiter le nombre de cellules Treg ré-infusées et par voie de conséquence limiter l'efficacité de cette thérapie cellulaire. C'est pourquoi il est urgent de pouvoir disposer facilement de grandes quantités de cellules iTreg purifiées pour traiter ce type de patients.
La capacité des immoglobulines de lapin anti-thymocytes humains Thymoglobuline® (Genzyme, Cambridge, MA, Etas-Unis) à induire des cellules T CD4+CD25+Foxp3+ à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (Feng et al., Blood, 2008, 111(7), 3675-3683) ou de cellules T CD25+ du sang périphérique (Sewgobind et al., Transplantation. 2010;89(6):655-66) a été décrite. Selon Feng et al. (Blood, 2008, 111(7), 3675-3683), les immunoglobulines de cheval anti-thymocytes humains ATGAM (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI, Etats-Unis) conduiraient en revanche à une réduction du nombre absolu et du pourcentage de cellules T CD4+CD25+Foxp3+ obtenus à partir de cellules mononucléées du sang périphérique. Par ailleurs, le maintien des cellules CD4+CD25+Foxp3+ en culture en présence de Thymoglobuline® conduit progressivement à l'apoptose des cellules au-delà de 24 heures de culture (Feng et al., Blood, 2008, 111(7), 3675-3683). Un certain nombre d'obstacles sont à surmonter avant de parvenir à réaliser une expansion ex vivo de cellules Treg pour leur administration chez des patients, comme rapporté par Sakaguchi et al., Nat Rev Immunol. 2010, 10(7), 490-500. En effet, les cellules T régulatrices effectrices sont promptes à entrer en apoptose et se multiplient très difficilement, même en culture en présence de fortes doses d'IL-2. Par ailleurs, l'utilisation de fortes doses d'IL2 peut induire la production de cytokines pro-inflammatoires par une fraction non négligeable de cellules T. Le développement d'un cocktail de cytokines et d'agents chimiques pour permettre l'expansion de cellules T régulatrices fonctionnelles pures apparait donc souhaitable. L'incorporation de rapamycine dans un tel cocktail a été suggérée, de manière à accroître la pureté en cellules Treg (Sakaguchi et al., Nat Rev Immunol. 2010, 10(7), 490-500).
Cependant, jusqu'à présent, aucune amplification des cellules iTreg après induction par des immunoglobulines anti-thymocytes (ATG) n'a été rapportée. La présente demande concerne donc une méthode d'induction et d'amplification de cellules T régulatrices effectrices à partir de cellules T CD4+, à l'aide d'immunoglobulines anti-thymocytes.
Les cellules T régulatrices ainsi produites trouvent des applications pour le traitement et/ou la prévention du GvHD, du rejet de tissu(s) ou d'organe(s) après greffe, de maladies autoimmunes et des allergies.
Méthode de préparation de cellules T régulatrices L'invention concerne donc une méthode ex vivo de préparation de cellules T régulatrices qui comprend, ou consiste en, les étapes consistant à : a) cultiver des cellules T CD4+ dans un milieu de culture contenant des immunoglobulines anti-thymocytes ; b) cultiver les cellules obtenues à l'étape a) dans un milieu de culture contenant des immunoglobulines anti-thymocytes et au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation ; et c) récolter les cellules CD4+CD25+Foxp3+ obtenues à l'étape b), les cellules CD4+CD25+Foxp3+ étant des cellules Treg.
Par « cellules T régulatrices » ou « Treg » on entend des cellules T CD4 exprimant au moins les marqueurs CD25 et Foxp3, c'est-à-dire des cellules CD4+CD25+Foxp3+, en particulier des cellules CD4+CD25++Foxp3+ aussi appelées CD4+CD25h'ghFoxp3+. Les cellules T régulatrices peuvent aussi présenter un ou plusieurs des marqueurs phénotypiques de Treg additionnels suivants : GITR, CTLA4, CD40L, GITR, GranzymeA, Granzyme B, ILT3, ILT4, CD109, IL10, CD127dim, CD62L, et CCR4. Les cellules Treg selon l'invention peuvent être en particulier des cellules CD4+CD25+Foxp3+GITR+CTLA4+CD62L+CCR4+ ou CD4+CD25++Foxp3+GITR+CTLA4+CD62L+CCR4+. Il s'agit plus spécifiquement de cellules T régulatrices induites (iTreg).
Des anticorps appropriés pour la détection de ces différents marqueurs phénotypiques sont couramment disponibles dans le commerce pour permettre à l'homme du métier de déterminer si une cellule exprime l'un ou l'autre des marqueurs de cellules T régulatrices. Avantageusement, la méthode de préparation de cellules T régulatrices selon l'invention conduit à l'obtention de cellules Treg fonctionnelles, c'est-à-dire des cellules capables d'exercer une immunosuppression. Les cellules Treg fonctionnelles expriment le marqueur GARP (glycoprotein-A repetitions predominant), également appelé LRRC32 (Leucine-rich repeat-containing protein 32), et le marqueur LAP (latency-associated peptide), qui est une molécule liant le récepteur GARP. L'expression de GARP peut être détectée au niveau intracellulaire, principalement, mais aussi au niveau membranaire. L'identification des cellules Treg fonctionnelles peut donc être effectuée en détectant l'expression du marqueur GARP/LRRC32 et/ou LAP, par exemple à l'aide d'anticorps anti-GARP/LRRC32 ou anti-LAP, comme approprié. Les cellules Treg fonctionnelles peuvent ainsi être par exemple des cellules CD4+CD25+Foxp3+GARP+LAP+, en particulier des cellules CD4+CD25++Foxp3+ GARP+LAP+, ou encore CD4+CD25+Foxp3+GITR+CTLA4+CD62L+CCR4+GARP+LAP+ ou CD4+CD25++Foxp3+GITR+CTLA4+CD62L+CCR4+GARP+LAP+. La fonctionnalité des cellules Treg peut aussi être vérifiée par tout moyen connu de l'homme du métier, tel qu'un test d'inhibition de la réaction allogénique, aussi appelée réaction lymphocytaire mixte. Un tel test est décrit dans l'exemple 1 de la présente demande.
Brièvement, des cellules CD4 dites « répondeuses » sont mélangées des cellules mononucléées homologues ou allogéniques dites « stimulantes », qui ont été irradiées de manière à stopper leur prolifération, en présence ou en absence de cellules Treg irradiées, et cultivées pendant, par exemple, 5 jours de culture à 37°C et 5% de 002. De la thymidine tritiée est ensuite ajoutée au milieu de culture, et après, par exemple, 16 heures de culture supplémentaires, le niveau d'incorporation de thymidine tritiée par les cellules est mesuré. Une quantité réduite de thymidine tritiée incorporée dans les cellules CD4 répondeuses cultivées en présence de cellules Treg, par rapport aux cellules mononucléées cultivées en absence de cellules Treg, est indicatrice de cellules Treg fonctionnelles, capables d'exercer une immunosuppression. La méthode d'évaluation de la fonction des cellules Treg telle que décrite dans l'article Feng et al. (Blood, 2008, 111(7), 3675-3683) peut également être utilisée.
Dans cadre de la méthode selon l'invention, les cellules T CD4+, et donc les cellules T régulatrices obtenues à partir de ces cellules, peuvent être des cellules d'un sujet mammifère humain ou non humain, tel qu'un primate (en particulier homme, singe), un rongeur (en particulier rat, souris), un félin (en particulier chat), un canin (en particulier chien), un équidé (en particulier cheval), un bovin (en particulier vache), un ovin, ou un porcin. Les cellules T CD4+ utilisées dans le cadre de la méthode selon l'invention peuvent provenir de différentes sources. Il peut s'agir de cellules T CD4+ obtenues à partir de sang périphérique d'un sujet sain, d'un sujet destiné à recevoir une greffe de tissu(s) et/ou d'organe(s), d'un sujet affecté d'une maladie autoimmune, ou d'un sujet allergique, c'est-à-dire par exemple un sujet ayant manifesté des signes cliniques d'allergie (tels que rhinite allergique, asthme allergique, conjonctivite, eczéma). Les cellules T CD4+ peuvent être obtenues à partir de sang périphérique d'un donneur par tout moyen connu de l'homme du métier, tel que par cytaphérèse, après administration de G-CSF ou GM-CSF au donneur. Les cellules T CD4+ peuvent aussi être obtenues à partir de sang de cordon ombilical. Les cellules T CD4+ peuvent être purifiées à partir de sang périphérique ou de sang de cordon ombilical, à partir des cellules mononucléées isolées par exemple par centrifugation sur gradient de Ficoll, et sélection des cellules CD4+ au sein des cellules mononucléées récoltées. La sélection des cellules CD4+ peut être une sélection positive effectuée par exemple à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps monoclonaux anti-CD4, comme décrit dans l'exemple 1 ci-après, ou par tri en cytométrie de flux. Une sélection négative des cellules CD4+, par élimination des cellules CD4- par exemple à l'aide de cocktails d'anticorps, donne les mêmes résultats.
De préférence, les immunoglobulines anti-thvmocvtes sont dirigées contre des thymocytes de la même espèce de mammifère que l'espèce dont proviennent les cellules T CD4+. En d'autres termes, et à titre illustratif, les immunoglobulines anti-thymocytes seront de préférence des immunoglobulines anti-thymocytes humains lorsque les cellules T CD4+ sont des cellules humaines. Selon un mode de réalisation les immunoglobulines anti-thymocytes (ATG) sont des immunoglobulines anti-thymocytes humains, en particulier des immunoglobulines de lapin anti-thymocytes humains ou des immunoglobulines de cheval anti-thymocytes humains.
Contrairement à l'enseignement de Feng et al. (Blood, 2008, 111(7), 3675-3683), les inventeurs ont en effet montré que des cellules Treg pouvaient être induites à partir de cellules T CD4+ à l'aide d'ATG de cheval. Les ATG sont de préférence le produit Thymoglobuline® (Genzyme, Cambridge, MA, Etats-Unis) ou Lymphoglobuline® (Genzyme, Cambridge, MA, Etats-Unis), tous deux dans le commerce.
Les immunoglobulines anti-thymocytes humains peuvent être obtenues par un procédé tel que décrit dans la demande de brevet internationale WO 2002/026830. Ce procédé comprend ou consiste à : (i) injecter une préparation cellulaire de thymocytes humains à un animal exempt d'organismes pathogènes spécifiés (EOPS) ; (ii) recueillir le sérum humain produit par l'animal ; (iii) isoler les immunoglobulines anti-thymocytes humains du sérum, sans hémadsorption sur hématies, ni adsorption sur tissus humains, stroma ou extraits grossiers de ces tissus. La préparation cellulaire de thymocytes humains utilisée dans l'étape (i) peut être constituée de cellules de lignées en culture, ou avoir été obtenue par purification de thymocytes humains frais, purifiés préférentiellement à partir de fragments de thymus ou éventuellement à partir de suspensions de rate, d'amygdales, de ganglions lymphatiques, de trachée thoracique ou encore de sang périphérique. Les fragments de thymus humains peuvent être facilement prélevés lors d'actes chirurgicaux, notamment à la suite de chirurgies cardiaques sur des enfants. L'animal EOPS peut être en particulier un lapin (Thymoglobuline®) ou un cheval (Lymphoglobuline®). Dans ce procédé, l'étape d'isolement (iii) peut mettre en oeuvre une chromatographie échangeuse d'ions et/ou une ou plusieurs précipitations. En particulier l'étape (iii) met en oeuvre une chromatographie échangeuse sur colonne échangeuse d'anions (DEAE) à température ambiante, suivie de deux étapes de précipitation successives avec du sulfate de sodium. Les immunoglobulines ne sont pas retenues par la colonne et sont éluées rapidement de la colonne, ce qui permet de les récolter de manière sélective. Une chromatographie sur colonne d'affinité spécifique, éliminant les anticorps restant indésirables, peut en outre être mise en oeuvre.
Des étapes de filtration/ concentration/diafiltration peuvent être mises en oeuvre pour concentrer la préparation d'immunoglobulines ainsi obtenue. Selon un autre mode de réalisation les immunoglobulines anti-thymocytes sont des immunoglobulines anti-thymocytes de mammifère non humain.
Dans les étapes a) et b), les milieux de culture utilisés comprennent, ou sont constitués, pour l'étape a) d'un « milieu de base de culture » additionné d'ATG, et pour l'étape b) d'un « milieu de base de culture » additionné d'ATG et de ladite/ledit au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation. Un « milieu de base de culture » approprié pour la mise en oeuvre des étapes a) et b) peut être un milieu synthétique avec ou sans sérum, couramment disponible dans le commerce, tel qu'un milieu sans sérum du type RPMI ou X-VIVO (Lonza Walkersville, Inc.), ou un milieu avec sérum IMDM ou DMEM. La présence de sérum dans le milieu de culture n'est pas obligatoire mais améliore les résultats de culture. Le milieu de base de culture peut classiquement contenir ou être additionné d'antibiotiques pour éviter les contaminations au cours de la culture cellulaire, et de glutamine. Un milieu de base de culture approprié est typiquement un milieu RPMI de préférence additionné de 10% (vol/vol) d'un pool de sérum humain AB, inactivé par chauffage, ou de 10% (vol/vol) de sérum de veau foetal, éventuellement additionné encore de 2 mM de glutamine et d'antibiotiques tels que 100 Ul/ml de pénicilline, et 100 pg/ml de streptomycine. Selon un mode de réalisation, le milieu de culture de l'étape a) ne contient pas d'autre additif, notamment cytokine, facteur de croissance, ou agent chimique, etc., que les immunoglobulines anti-thymocytes et les sérum/antibiotique(s)/glutamine éventuellement présent(s) ou ajouté(s) dans le milieu de base de culture. Autrement dit, selon un mode de réalisation, les seuls additifs, en particulier cytokines, facteurs de croissance, ou agents chimiques, présents dans le milieu de culture de l'étape a) sont les immunoglobulines antithymocytes et éventuellement du sérum et/ou antibiotique(s) et/ou glutamine.
Egalement, ou alternativement, le milieu de culture de l'étape b) peut ne contenir aucune autre additif, notamment cytokine, facteur de croissance, ou agent chimique, etc., que les immunoglobulines anti-thymocytes et ladite/ledit au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation tels que décrits plus bas, ainsi que et les sérum/antibiotique(s)/glutamine éventuellement présent(s) ou ajouté(s) dans le milieu de base de culture. Autrement dit, selon un mode de réalisation, les seuls additifs, en particulier cytokines, facteurs de croissance, ou agents chimiques, présents dans le milieu de culture de l'étape b) sont les immunoglobulines anti-thymocytes et ladite/ledit au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation tels que décrits plus bas, ainsi que éventuellement du sérum et/ou antibiotique(s) et/ou glutamine. Les étapes de culture a) et b) peuvent être mise en oeuvre classiquement à 37°C et avec 5% CO2.
Dans l'étape a) de la méthode selon l'invention, les cellules T CD4+ sont cultivées dans un milieu de culture contenant les immunoglobulines anti-thymocytes (ATG) dans des conditions et pendant une durée suffisantes pour induire des cellules Treg telles que définies ci-dessus. Les cellules T CD4+ peuvent être ensemencées, par exemple, à une concentration de 0,1.106 à 5.106 cellules/mL, en particulier 0,5.106 à 3.106 cellules/mL, ou encore 1.106 à 2.106 cellules/mL.
Par exemple, les cellules CD4+ peuvent être cultivées pendant 8 à 48 h, de préférence pendant 12 à 36 h, pendant 20 à 28 h, pendant 23 à 25h, ou encore pendant 24 h. La culture peut être effectuée en présence de 1 à 200 pg/mL d'ATG, en particulier de 10 à 150 pg/mL, 20 à 100 pg/mL, 30 à 80 pg/mL, de 40 à 70 pg/mL, de 50 à 60 pg/mL, ou encore en présence de 50 pg/mL d'ATG, l'ATG étant de préférence Thymoglobuline®. La culture peut aussi être effectuée en présence de 1 à 200 pg/mL d'ATG, en particulier de 30 à 180 pg/mL, 50 à 150 pg/mL, 80 à 150 pg/mL, ou encore 100 à 130 pg/mL d'ATG, l'ATG étant de préférence Lymphoglobuline®.
Toutes les combinaisons de ces durées de culture et concentrations d'ATG sont possibles.
Les cellules obtenues à l'issue de l'étape a) sont ensuite cultivées pendant l'étape b) dans un milieu contenant des immunoglobulines anti-thymocytes et au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation. Préalablement à leur culture selon l'étape b), les cellules issues de l'étape a) peuvent être lavées et réensemencées, par exemple, à une concentration de 0,1.106 à 5.106 cellules/mL, en particulier 0,5.106 à 3.106 cellules/mL, ou encore 1.106 à 2.106 cellules/mL. Les immunoglobulines anti-thymocytes sont de préférence du même type que celles utilisées pour l'étape de culture a), mais pas nécessairement. Elles peuvent être utilisées à une concentration de 1 à 200 pg/mL d'ATG, en particulier de 10 à 150 pg/mL, 20 à 100 pg/mL, 30 à 80 pg/mL, de 40 à 70 pg/mL, de 50 à 60 pg/mL, ou encore en présence de 50 pg/mL d'ATG, l'ATG étant de préférence Thymoglobuline®. Elles peuvent aussi être utilisées à une concentration de 1 à 200 pg/mL d'ATG, en particulier de 30 à 180 pg/mL, 50 à 150 pg/mL, 80 à 150 pg/mL, ou encore 100 à 130 pg/mL d'ATG, l'ATG étant de préférence Lymphoglobuline®. En particulier, les immunoglobulines anti-thymocytes peuvent être présentes dans les milieux de culture des étapes a) et b) à une même concentration, mais pas nécessairement. Un inhibiteur de la protéine kinase TOR (« Target Of Rapamycine ») peut être la rapamycine (aussi appelée sirolimus, numéro CAS 53123-88-9) et/ou un de ses analogues, à savoir temsirolimus (numéro Cas 162635-04-3) et everolimus (numéro Cas 159351-69-6). L'inhibiteur de la protéine kinase TOR peut être présent dans le milieu de culture à une concentration totale de 5 à 25 ng/mL, en particulier de 7,5 à 15 ng/mL, ou encore de 9 à 11 ng/mL, par exemple 10 ng/mL.
Un agent de différenciation peut être choisi parmi l'acide rétinoïque et ses dérivés, en particulier trétinoïne (ou acide tout-trans-rétinoïque), isotrétinoïne (ou acide 13-cis- rétinoïque), ou encore alitrétinoïne (acide 9-cis-rétinoïque). L'agent de différenciation peut typiquement être présent dans le milieu de culture à une concentration de 3 à 5 pg/mL. Le milieu de culture de l'étape b) contenant les immunoglobulines anti-thymocytes peut contenir au moins une cytokine, par exemple deux, trois, ou quatre cytokines, en particulier au moins une (par exemple deux, trois, ou quatre) cytokine(s) liant la chaîne gamma du récepteur de l'IL2 (le CD132) et éventuellement du TGF-132. Dans le cadre de la présente demande, on entend par « cytokine liant la chaîne gamma du récepteur de I'IL2 » I'IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 ou IL21. Le milieu de culture de l'étape b) peut en particulier contenir de I'IL2 et/ou IL15, de préférence encore de I'IL2 et de I'IL15.
La concentration d'IL2 dans le milieu de culture peut être de 50 à 500 UI/mL, en particulier de 100 à 400 UI/mL, ou encore de 150 à 300 UI/mL, par exemple de 180-220 UI/mL, en particulier 200 UI/mL. La concentration d'IL15 dans le milieu de culture peut être de 5 à 50 ng/mL, en particulier de 5 à 30 ng/mL, ou encore de 7,5 à 15 ng/mL, par exemple de 10 à 12 ng/mL, en particulier 10 ng/mL. La concentration TGF132 dans le milieu de culture peut être de 2 à 5 ng/mL. La concentration d'IL4, IL7, IL9, ou IL21 dans le milieu de culture peut être de 1 à 100 ng/mL, en particulier de 5 à 50 ng/mL, de 5 à 30 ng/mL, ou encore de 50 à 70 ng/mL. Le milieu de culture de l'étape b) peut en particulier contenir les immunoglobulines anti-thymocytes et (i) au moins une cytokine (en particulier deux, trois, ou quatre cytokines) et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR ; (ii) au moins une cytokine (en particulier deux, trois, ou quatre cytokines) liant la chaîne gamma du récepteur de I'IL2 et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR ; (iii) au moins une cytokine (en particulier deux, trois, ou quatre cytokines) et un inhibiteur de la protéine kinase TOR ; (iv) au moins une cytokine (en particulier deux, trois, ou quatre cytokines) liant la chaîne gamma du récepteur de I'IL2 et un inhibiteur de la protéine kinase TOR ; (v) deux, trois, ou quatre cytokines liant la chaîne gamma du récepteur de I'IL2 dont I'IL2 et/ou I'IL15, et éventuellement en outre un inhibiteur de la protéine kinase TOR. En particulier, dans le milieu de culture de l'étape b), les additifs ajoutés au milieu de base de culture peuvent être limitativement ceux énumérés ci-dessus, et éventuellement du sérum et/ou antibiotique(s) et/ou glutamine.
Ainsi, le milieu contenant des immunoglobulines anti-thymocytes et au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation, peut en particulier être constitué dudit « milieu de base de culture » additionné de : - immunoglobulines anti-thymocytes, en particulier Thymoglobuline® ou Lymphoglobuline® ; - au moins une cytokine liant la chaîne gamma du récepteur de l'IL2, en particulier un, deux, trois, ou quatre cytokines sélectionnées dans le groupe constitué de IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 et IL21I ; de préférence IL2 et IL15 ; - rapamycine et/ou temsirolimus et/ou everolimus, de préférence rapamycine ;et - éventuellement sérum et/ou antibiotique(s) et/ou glutamine I'ATG, ladite au moins une cytokine liant la chaîne gamma du récepteur de I'IL2, et rapamycine et/ou temsirolimus et/ou everolimus pouvant être présents dans le milieu de culture aux plages de concentrations indiquées ci-dessus. La culture selon l'étape b) peut être effectuée pendant un minimum de 1 jour et jusqu'à 14 jours (par exemple de J1 à J15, si l'étape a) dure 24 heures), en particulier jusqu'à 11 jours (par exemple de J1 à J13, si l'étape a) dure 24 heures), jusqu'à 9 jours (par exemple de J1 à J10, si l'étape a) dure 24 heures), jusqu'à 7 jours (par exemple de J1 à J8, si l'étape a) dure 24 heures), ou encore jusqu'à 4 jours (par exemple de J1 à J5, si l'étape a) dure 24 heures). La durée minimale de l'étape de culture b) peut être de 3 jours, 5 jours ou 7 jours, par exemple. Ainsi la durée de culture à l'étape b) peut être par exemple de 3 à 11 jours, ou encore de 5 à 9 jours. Au cours de la culture selon l'étape b), les cellules cultivées peuvent, au moins une fois, être lavées puis diluées pour réensemencement à une concentration de 0,1.106 à 5.106 cellules/mL, en particulier 0,5.106 à 3.106 cellules/mL, ou encore 1.106 à 2.106 cellules/mL.
Ce lavage/réensemencement peut être mis en oeuvre par exemple après 3 à 4 jours de culture selon l'étape b), notamment lorsque la durée totale de culture selon l'étape b) est de 7 à 14 jours.
Selon un mode de réalisation, la méthode de préparation de cellules T régulatrices selon l'invention comprend, ou consiste en, les étapes de : a) cultiver pendant 20 à 28 h, en particulier pendant 23 à 25 heures, en particulier environ 24 heures, des cellules T CD4+ dans un milieu de culture contenant les immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® ou Lymphoglobuline®, à une concentration de 1 à 200 pg/mL, et en particulier pour de 10 à 125 pg/mL, de 20 à 100 pg/mL, de 30 à 80 pg/mL, de 40 à 70 pg/mL, ou encore de 50 à 60 pg/mL, de préférence 50 pg/mL (notamment pour Thymoglobuline®), ou en particulier de 30 à 180 pg/mL, 50 à 150 pg/mL, 80 à 150 pg/mL, ou encore 100 à 130 pg/mL (notamment pour Lymphoglobuline®); b) cultiver pendant 1 à 14 jours, en particulier pendant 3 à 11 jours, ou encore 5 à 9 jours, les cellules issues de l'étape a) dans un milieu de culture contenant - lesdites immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® ou Lymphoglobuline®, à une concentration de 1 à 200 pg/mL, et en particulier de 10 à 125 pg/mL, de 20 à 100 pg/mL, de 30 à 80 pg/mL, de 40 à 70 pg/mL, ou encore de 50 à 60 pg/mL, de préférence 50 pg/mL (notamment pour Thymoglobuline®), ou en particulier de 30 à 180 pg/mL, 50 à 150 pg/mL, 80 à 150 pg/mL, ou encore 100 à 130 pg/mL (notamment pour Lymphoglobuline®) ; - de l'IL2 à une concentration de 50 à 500 Ul/mL, en particulier de 100 à 400 Ul/mL, ou encore de 150 à 300 Ul/mL, par exemple de 180-220 Ul/mL, en particulier 200 Ul/mL ; - de I'IL15 à une concentration de 5 à 50 ng/mL, en particulier de 5 à 30 ng/mL, ou encore de 7,5 à 15 ng/mL, par exemple de 10 à 12 ng/mL, en particulier 10 ng/mL ; et - de la rapamycine, ou un des ses analogues, à une concentration de 5 à 25 ng/mL, en particulier de 7,5 à 15 ng/mL, ou encore de 9 à 11 ng/mL, par exemple 10 ng/mL ; et c) récolter les cellules CD4+CD25+Foxp3+ obtenues à l'étape b), les cellules CD4+CD25+Foxp3+ étant des cellules Treg. Selon un mode tout particulier de réalisation, la méthode de préparation de cellules T régulatrices selon l'invention comprend, ou consiste en, les étapes de : a) cultiver pendant 23 à 25 heures, en particulier environ 24 heures, des cellules T CD4+ dans un milieu de culture contenant les immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® à une concentration de 50 à 60 pg/mL ou Lymphoglobuline® à une concentration de 80 à 150 pg/mL ; b) cultiver pendant 5 à 9 jours, en particulier pendant 9 jours, les cellules issues de l'étape a) dans un milieu de culture contenant lesdites immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® à une concentration de 50 à 60 pg/mL ou Lymphoglobuline® à une concentration de 80 à 150 pg/mL ; et de I'IL2 à une concentration de 180-220 Ul/mL, en particulier 200 Ul/mL ; de I'IL15 à une concentration de 7,5 à 15 ng/mL, en particulier 10 ng/mL ; et de la rapamycine à une concentration de 9 à 11 ng/mL, par exemple 10 ng/mL ; et c) récolter les cellules CD4+CD25+Foxp3+ obtenues à l'étape b), les cellules CD4+CD25+Foxp3+ étant des cellules Treg. Selon ces deux modes de réalisation, l'étape b) peut consister à b1) cultiver pendant 3 à 4 jours, en particulier pendant 4 jours, les cellules issues de l'étape a) dans un milieu de culture contenant lesdites immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® à une concentration de 50 à 60 pg/mL ou Lymphoglobuline® à une concentration de 80 à 150 pg/mL ; et de l'IL2 à une concentration de 180-220 UI/mL, en particulier 200 UI/mL ; de I'IL15 à une concentration de 7,5 à 15 ng/mL, en particulier 10 ng/mL ; et de la rapamycine à une concentration de 9 à 11 ng/mL, par exemple 10 ng/mL ; b2) laver les cellules et les réensemencer, par exemple à une concentration de 0,1.106 à 5.106 cellules/mL, en particulier 0,5.106 à 3.106 cellules/mL, ou encore 1.106 à 2.106 cellules/mL, dans un milieu de culture contenant lesdites immunoglobulines anti-thymocytes (ATG), en particulier Thymoglobuline® à une concentration de 50 à 60 pg/mL ou Lymphoglobuline® à une concentration de 80 à 150 pg/mL ; et de I'IL2 à une concentration de 180-220 UI/mL, en particulier 200 UI/mL ; de I'IL15 à une concentration de 7,5 à 15 ng/mL, en particulier 10 ng/mL ; et de la rapamycine à une concentration de 9 à 11 ng/mL, par exemple 10 ng/mL ; et b3) cultiver les cellules réensemencées à l'étape b2) pendant 2 à 5 jours, en particulier pendant 5 jours.
La durée totale de culture cumulée, pour les étapes a) et b), peut être de 2 à 15 jours, en particulier de 4 à 12 jours, ou encore de 7 à 10 jours. En effet, l'allongement de la durée totale de culture au-delà de 15 jours ne contribue pas à augmenter le niveau d'amplification des cellules Treg produites par la méthode selon l'invention, car au delà de 15 jours, les cellules Treg semblent redevenir sensibles aux immunoglobulines anti-thymocytes et entrent progressivement en apoptose.
L'étape c) de récolte des cellules peut être mise en oeuvre par exemple en récoltant la totalité des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) et en sélectionnant les cellules Treg.
Les cellules Treg peuvent être par exemple sélectionnées en effectuant un tri par cytométrie en flux ou utilisant des billes, en particulier des billes magnétiques, recouvertes par exemple d'anticorps anti-CD25 et/ou anti-FoxP3 et/ou anti-LAP et/ou anti-GARP. La méthode selon l'invention peut inclure une ou plusieurs étapes supplémentaires, après l'étape c), consistant à laver et/ou concentrer les cellules Treg, et/ou congeler les cellules Treg, et/ou irradier les cellules Treg, et/ou mettre les cellules Treg en suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les cellules Treg, et notamment les cellules Treg fonctionnelles, peuvent en effet être irradiées pour stopper leur prolifération tout en préservant leurs propriétés fonctionnelles. La méthode de préparation selon l'invention permet d'obtenir : - des cultures contenant de 50 à 80 % de cellules CD4+/CD25+/FoxP3+ ; et - un facteur d'amplification du nombre total de cellules CD4+/CD25+/FoxP3+ de 20 à 120.
Ces résultats ont été obtenus en particulier à partir de cellules CD4+ du sang périphérique et après 1 jour de culture d'induction avec les immunoglobulines antithymocytes, et 9 jours de culture en présence d'immunoglobulines anti-thymocytes, d'IL2, IL15 et de rapamycine.
Cellules T régulatrices et applications thérapeutiques L'invention concerne également les cellules T régulatrices susceptibles d'êtres obtenues, ou obtenues, par la méthode de préparation selon l'invention, et leurs applications thérapeutiques. Les cellules Treg constituent en effet un produit de thérapie cellulaire pour la mise en oeuvre d'immunothérapies spécifiques. Ainsi, l'invention concerne les cellules T régulatrices selon l'invention pour leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention de la maladie du greffon contre l'hôte, du rejet d'une greffe de tissu(s) ou d'organe(s), d'une maladie autoimmune ou d'une allergie. L'invention concerne également une méthode de traitement et/ou prévention de la maladie du greffon contre l'hôte, du rejet d'une greffe de tissu(s) ou d'organe(s), d'une maladie autoimmune, ou d'une allergie, la méthode comprenant l'administration de cellules T régulatrices selon l'invention à un sujet qui le nécessite. Dans le contexte de l'invention, le terme "traiter" ou "traitement" signifie supprimer, alléger ou empêcher la progression d'un désordre ou prévenir l'apparition d'un tel désordre 20 ou d'un ou plusieurs symptômes liés à ce désordre. Les cellules T régulatrices constituent un traitement immunosuppresseur pour l'induction d'une tolérance vis-à-vis d'organe(s) ou tissu(s) transplanté(s), ou pour prévenir le rejet d'organe(s) ou tissu(s) transplanté(s), en particulier lors d'une allogreffe (entre deux sujets distincts appartenant à une même espèce biologique) ou xénogreffe (entre deux 25 sujets appartenant deux espèces biologiques distinctes mais proches). Le tissu et/ou organe transplanté, encore appelé greffon, peut être en particulier de la moelle osseuse, rein, foie, poumon, coeur, bloc coeur/poumon, pancréas, valve cardiaque, cornée, ou encore main et partie du visage. La « maladie du greffon contre l'hôte » ou « GvHD » est une complication des 30 allogreffes de moelle osseuse, de cellules souches du sang périphérique ou de sang de cordon ombilical, fréquemment observée lorsque le donneur et le receveur sont incompatibles et que le receveur est profondément immunodéprimé et le greffon contient des cellules immunocompétentes comme des lymphocytes T. On distingue la maladie du greffon contre l'hôte aigüe, qui survient généralement entre 2 et 4 semaines après la greffe, et peut 35 durer jusqu'à environ 3 mois, et la maladie du greffon contre l'hôte chronique, qui apparaît généralement après 100 jours après la greffe.
Les cellules T régulatrices peuvent également être utiles pour le traitement et/ou la prévention d'une maladie autoimmune. Par « maladie autoimmune » on désigne non limitativement le lupus erythémateux , le lupus erythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde, la scérodermie systémique, la sclérose en plaque, les anémies hémolytiques autoimmunes, les thrombopénies autoimmunes, les polymyosites , les dermatomyosites, le pemphigus vulgaire ou bulleux, le psoriasis, le diabète de type 1, la maladie de Berger, la maladie de Basedow, la thyroïdite d'Hashimoto, le myxoedème primaire, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la dermatite herpétiforme, la myasthénie, la rectocolite hémorragique, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, l'anémie de Biermer, le syndrome de CREST, l'épidermolyse bulleuse acquise, le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, la polymyosite, le syndrome de Goujerot-Sjëgren, le syndrome de Guillain-Barré, la névrite optique, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, l'aplasie médullaire, le syndrome de Reiter, la cirrhose biliaire primitive, le syndrome des anticorps antiphospholipides, le syndrome Opsoclonus Myoclonus, l'artérite temporale, l'encéphalomyélite aiguë disséminée, le syndrome de Goodpasture, la granulomatose de Wegener, le syndrome de Churg-Strauss, la sarcoïdose, le syndrome néphrotique et la maladie de La Peyronie. Les cellules T régulatrices peuvent également être utiles pour le traitement et/ou la prévention d'une allergie, en particulier une allergie associée à un déficit en cellules T régulatrices. L'allergie est une réponse humorale déclenchée en réponse à un allergène qui est associée à une sécrétion d'IgE par les plasmocytes. L'allergie peut être associée à des manifestations cliniques telles que l'eczéma, l'asthme, la rhinite allergique, la dermatite atopique, la conjonctivite, et dans les cas plus graves un choc anaphylactique. Les allergènes déclenchant les allergies peuvent être, à titre non limitatif, des allergènes de pollens (d'arbres, de graminées, etc.), des allergènes d'acariens (de la poussière domestique ou de stockage), des allergènes d'insectes (d'hyménoptères, de blattes, etc.), des allergènes d'animaux (de chien, de chat, de cheval, de rat, de souris, etc.), des allergènes de moisissure et des allergènes alimentaires. Les cellules Treg peuvent être formulées sous forme de composition pharmaceutique comprenant les cellules Treg et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les cellules Treg peuvent en particulier avoir été congelées et sont alors reconstituées avant utilisation sous forme de suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les cellules Treg peuvent également avoir été irradiées, ce qui stoppe leur prolifération tout en maintenant leurs propriétés fonctionnelles. Eventuellement, les cellules Treg peuvent être irradiées avant ou après congélation. Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend un véhiculer adapté pour une utilisation en contact avec des cellules humaines ou animales, sans induire de toxicité, irritation, ou réponse allergique indue. Des exemples non limitatifs de véhicules pharmaceutiquement acceptables incluent notamment une solution physiologique, c'est-à-dire ayant la même osmolarité que le sang, et qui peut être une solution d'eau double distillée contenant 0,9 g/L de NaCl, ou une solution de Ringer ou solution de Ringer lactate.
Les cellules Treg peuvent être suspendues par exemple dans un volume total de solution physiologique de 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, ou 500 mL. La composition pharmaceutique comprend de préférence une quantité thérapeutiquement efficace de cellules T régulatrices, c'est-à-dire une quantité suffisante pour traiter et/ou prévenir la maladie en question. La quantité de cellules T régulatrices et de la composition selon la présente invention ainsi que la fréquence d'administration peuvent être déterminées par des études cliniques, par le médecin ou par le pharmacien. La dose "thérapeutiquement active" spécifique à chaque sujet pourra dépendre d'un certain nombre de facteurs comme la nature et la sévérité de la maladie à traiter, la composition utilisée, l'âge, le poids, l'état de santé général, le sexe et le régime du sujet, le mode d'administration, la durée du traitement (en monodose ou en plusieurs doses), et des médicaments utilisés en combinaison et d'autres facteurs bien connus des spécialistes médicaux. La composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre un minimum de 0,5.106 cellules Treg/mL, en particulier un minimum de 1.106 cellules Treg/mL, ou encore 2.106 cellules Treg/mL, ou encore 2,5.106 cellules Treg/mL.
Les cellules T régulatrices ou la composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être administrées à un sujet qui le nécessite par voie intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, topique, ou intraganglionnaire, notamment par perfusion, injection. Les cellules T régulatrices peuvent être pour une utilisation hétérologue, c'est-à-dire que les cellules Treg peuvent avoir été obtenues à partir de cellules CD4+ provenant d'un sujet autre que le sujet à traiter. De préférence, les cellules T régulatrices sont pour une utilisation autologue, c'est-à-dire qu'il s'agit de cellules autologues du sujet à traiter. Le « sujet » peut être un mammifère humain ou non humain, comme décrit plus haut. Les cellules T régulatrices peuvent être utilisées en combinaison, pour une administration simultanée ou séquentielle, avec un autre traitement immunosuppresseur, tel que cyclosporine A, tacrolimus, un inhibiteur de la protéine kinase TOR tel que défini dans la présente demande, l'acide mycophénolique, un glucocorticoïde, le méthotrexate, le cyclophosphamide (endoxan), l'azathioprine, la sulfasalazine, un anticorps anti-TNF, un anticorps anti CD-20 (par exemple Mabthera).35 Kit L'invention concerne également une trousse pour l'amplification de cellules T régulatrices comprenant : - des immunoglobulines anti-thymocytes ;et - un ou des moyens de purification de cellules CD4+ et/ou - au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation ; et/ou - un ou plusieurs marqueurs pour la sélection de cellules CD4+CD25+Foxp3+G ITR+CTLA4+CD62L+CCR4+GARP+LAP+.
Lesdites immunoglobulines anti-thymocytes, au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation sont tels que définis plus haut dans la section « Méthode de préparation de cellules T régulatrices ». La trousse inclut en particulier des immunoglobulines anti-thymocytes et au moins une cytokine et un inhibiteur de la protéine kinase TOR. Elle peut comprendre en outre un ou des moyens de purification de cellules CD4+. Elle peut aussi comprendre un ou plusieurs anticorps sélectionnés dans le groupe constitué des anticorps anti-CD4, anti-CD25, anti-Foxp3, anti-GITR, anti-CTLA4, anti-CD62L, anti-CCR4, anti-GARP et anti-LAP, de préférence anticorps anti-CD25, anti-Foxp3, et anti-GARP et/ou anti-LAP.
Des moyens de purification de cellules CD4+ sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple des moyens de sélection positive tels que le tri de cellules CD4+ par cytométrie en flux ou des billes, notamment magnétiques, recouvertes d'anticorps anti-CD4, ou des moyens de sélection négative tels que des billes recouvertes d'anticorps permettant la capture des cellules CD4-.
L'invention sera illustrée davantage au vu des exemples et figures suivants.
FIGURES La figure 1 illustre l'inhibition de la réponse allogénique de cellules CD4 répondeuses incubées en présence de cellules T régulatrices induites par les immunoglobulines antithymocytes (CD4 ATG) et de cellules mononucléées allogéniques, par rapport aux cellules CD4 répondeuses seules (CD4). Les T cellules régulatrices ont été ajoutées dans un ratio par rapport aux cellules répondeuses de 1/20, 1/10, 1/4, 1/2, 0,75/1, 1/10, 2/1 et 5/1. Les contrôles utilisés sont constitués par des cellules CD4+ répondeuses en présence de cellules mononucléées allogéniques (T Pos), des cellules CD4+ répondeuses cultivées en présence de cellules CD4 autologues irradiées (T auto) et des cellules CD4+ répondeuses seules en culture (T Neg). La figure 2 illustre que le volume de culture n'a pas d'incidence sur le profil d'expression des marqueurs phénotypiques des cellules Treg CD25/Foxp3, GITR, CTLA4, CD62L, CCR4, et sur les marqueurs d'apoptose Annexine/lodure de Propidium.
EXEMPLES Exemple 1 : Matériels et méthodes Purification des cellules humaines CD4+ Du sang périphérique est obtenu à partir de donneurs de sang en bonne santé prélevés à la banque de sang de Lyon. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées en centrifugeant le sang total dilué au demi dans du PBS déposé sur un gradient de Ficoll de densité 1,077. Les CMN sont ensuite incubées avec des billes magnétiques recouvertes d'un anticorps monoclonal anti-CD4. Un aimant est appliqué sur le tube pour retenir les cellules CD4 pendant que l'on retire les cellules non retenues (sélection positive avec le kit Milteny Biotech GmbH, Germany). Au terme de la procédure, la pureté des cellules CD4 évaluée en cytométrie de flux est de plus de 95%.
Culture cellulaire Les cellules CD4 purifiées sont incubées à à raison de 2.106 cellules/ml dans un milieu de culture de type RPMI avec 10% d'un pool de sérum humain AB inactivé par chauffage, additionné de 2 mM de glutamine, 100 Ul/ml de pénicilline, et 100 pg/ml de streptomycine. Dans ce milieu de culture, l'effet sur l'amplification des cellules Treg de l'ajout de différents inducteurs de la différenciation cellulaire a été testé avec l'éventail des concentrations suivant : - Thymoglobuline® de 1 à 150 pg/ml - IL2 de 50 à 500 Ul/mL -IL10de10à100ng/mL - IL15 de 5 à 50 ng/mL - TGF32 de 2 à 5 ng/mL - Acide rétinoïque de 3 à 5 pg/mL - Rapamycine de 10 à 22,5 ng/mL - milieu conditionné (surnageant de culture mixte lymphocytaire) de 1 à 20%. 35 Ainsi, dans le milieu de culture de type RPMI décrit ci-dessus, les inducteurs de la différenciation et de la prolifération des cellules CD4 ont été testés selon le schéma suivant.
JO) Mise en culture CD4+ à 2.106 cell/mL et stimulation par Thymoglobuline® à 50 pg/mL J1) Lavage et remise en culture à 1.106 cellules/mL puis restimulation par Thymoglobuline® à 50 pg/mL + inducteur(s) de la différenciation J5) Lavage et remise en culture à 1.106 cellules/mL puis restimulation par Thymoglobuline® à 50 pg/mL + inducteur(s) de la différenciation La meilleure combinaison pour l'amplification des cellules Treg a été Thymoglobuline® 50 pg/mL + IL2 200 Ul/mL + IL15 10 ng/ml+ Rapamycine à 10 ng/mL. Ainsi, dans le milieu de culture de type RPMI décrit ci-dessus, un protocole typique de culture est réalisé selon le schéma suivant. JO) Mise en culture CD4+ à 2.106 cell/mL et stimulation par Thymoglobuline® à 50 pg/mL J1) Lavage et remise en culture à 1.106 cellules/mL puis restimulation par Thymoglobuline® à 50 pg/mL + IL2 200 Ul/mL + IL15 10 ng/ml+ Rapamycine à 10 ng/mL J5) Lavage et remise en culture à 1.106 cellules/mL puis restimulation par Thymoglobuline®à 50 pg/mL + IL2 200 Ul/mL + IL15 10 ng/ml+ Rapamycine à 10 ng/mL
Analyse des cellules par cytométrie de fluxLes cellules cultivées en présence ou absence d'immunoglobulines anti-thymocytes (aussi appelées ATG) sont d'abord marquées avec un anticorps anti-CD4 marqué à la fluorescéine (anti-CD4-FITC) et un anti-CD25 marqué à la phycoérythrine (anti-CD25-PE) durant 30 min. Les cellules sont ensuite lavées et resuspendues dans 1 ml de tampon de fixation/perméabilisation (Cold Fix/Perm Buffer de eBioscience) durant 45 mn à 4°C. Les cellules sont encore lavées deux fois avec le tampon de perméabilisation (eBioscience) et bloquées avec un tampon PBS contenant 2% de sérum de rat durant 15 min. Un anticorps anti-Foxp3 marqué à l'allophycocyanine (PCH101) est ajouté aux cellules pendant 30 min à 4 °C dans l'obscurité. Les cellules sont encore lavées deux fois avant d'être analysées en cytométrie de flux avec un FACSCalibur de Becton Dickinson. Pour le marquage de surface des autres marqueurs cellulaires, ont été utilisés les anticorps suivants : anti CD62L-FITC, CD49d-FITC, CTLA4-PE, CD127-PE, GITR-PE, de Beckman et GARP de Alexis Biochemicals et LAP-PE, et CCR4-PE de R&D. L'analyse des événements a été réalisée en utilisant le logiciel CellQuest de Becton Dickinson. L'apoptose et la viabilité des cellules ont été mesurées en utilisant le kit Annexin-V- Fluos de Roche, selon les recommandations du fabriquant, suivi d'une analyse en cytométrie de flux.
Réaction lymphocytaire mixte (RLM) Les cellules CMN d'un donneur de sang « X » dites répondeuses, à 105 cellules/mL sont mise en présence de CMN stimulantes à 105 cellules/mL, d'un donneur « Y », irradiées à 40 Gy, pour induire une réaction allogénique. Les cellules sont incubées dans 200 pl d'un milieu de culture de type RPMI avec 10% d'un pool de sérum humain AB inactivé par chauffage plus 2 mM de glutamine, plus 100 Ul/ml de pénicilline, plus 100 pg/ml de streptomycine dans une plaque 96 puits à fond rond. Des cellules Treg CD4+CD25+Foxp3+ irradiées sont ajoutées à cette réaction pour déterminer leur capacité immunosuppressive de la réaction allogénique dans une proportion cellules régulatrices / cellules répondeuses de 1/20, 1/10, 1/4, 1/2, 0,75/1, 1/10, 2/1 et 5/1. Le contrôle est constitué par des cellules répondeuses à 105 cellules/mL, irradiées. Après 5 jours de culture à 37°C et 5% de 002 on ajoute 1.0 pCi/puit de thymidine tritiée. Les cellules sont récoltées 16 heures plus tard et l'incorporation de la thymidine est mesurée avec un compteur gamma. Toutes les mesures sont faites en triple. L'incorporation de thymidine tritiée reflète le niveau de prolifération des cellules répondeuses, et donc le niveau de développement de la réaction allogénique.
Exemple 2 : Production et amplification des cellules Treg par culture de cellules CD4 en présence de Thymoglobuline® Les cellules cultivées en présence d'immunoglobulines anti-thymocytes (ATG) seules, et en particulier les cellules CD4+CD25+Foxp3+ induites à J1 par le produit Thymoglobuline®, entrent en apoptose si elles sont maintenues en présence d'ATG seules. Inversement, les cellules CD4+CD25+Foxp3+ induites par l'ATG, si elles sont cultivées en présence d'agent de différenciation sans ATG, se dédifférencient vers un phénotype CD4+.
La culture des CD4+CD25+Foxp3+ induites dans un milieu contenant et de l'ATG et un ou plusieurs facteurs de différenciation est donc nécessaire pour obtenir un maintien, et si possible une amplification, de ces cellules. L'effet de différents inducteurs de différenciation cellulaire a été testé à J5, dans le cadre du protocole de culture défini dans l'exemple 1. Les résultats sont montrés dans le Tableau 1.
Tableau 1 : Effet des inducteurs de différenciation cellulaire sur le maintien/amplification à J5 des cellules CD4+CD25+Foxp3+ induites par Thymoglobuline® 0/0 de cellules CD4+CD25+Foxp3+ J1 J5 Thymoglobuline® 50 pg/mL 35 4 + Milieu conditionné 5% 3 + Milieu conditionné 10% 3,5 + Milieu conditionné 20% 4 + IL10 50 ng/mL 4 + IL10 100 ng/mL 4 +TGF 82 2 ng/mL 18 +IL2 100+ TGF [32 2 ng/mL 24 +IL2 100+ TGF [32 5 ng/mL 19 +IL2 200+ TGF [32 2 ng/mL 27 +IL2 200+ TGF [32 5 ng/mL 24 +Acide Rétinoïque 3 pg/mL 23 +Acide Rétinoïque 5 pg/mL 20 + IL2 200 Ul/mL 26 + Rapamycine 10 ng/mL 6 +IL2 100 Ul/mL + Rapamycine 10 ng/mL 34 +IL2 100 Ul/mL + Rapamycine 22,5 ng/mL 39 +IL2 200 Ul/mL + Rapamycine 10 ng/mL 44 +IL2 200 Ul/mL + Rapamycine 22,5 ng/mL 26 +IL15 10 ng/mL 37 +IL15 10 nq/mL+ IL2 200 Ul/mL 42 +IL15 10 ng/mL+IL2 200 Ul/mL + Rapamycine 10 ng/mL 50 Ces résultats montrent que les immunoglobulines anti-thymocytes seules, l'IL10 et le milieu conditionné n'étaient pas appropriés pour le maintien des cellules CD4+CD25+Foxp3+ induites à J1 par les immunoglobulines anti-thymocytes. Le TGF [32 et l'acide rétinoïque, seuls, conduisent à un maintien satisfaisant des CD4+CD25+Foxp3+. La combinaison la plus efficace pour l'amplification des cellules Treg CD4+CD25+Foxp3+ a été Thymoglobuline® + IL2, IL15, et rapamycine. En partant de cellules CD4+ comportant moins de 3% de cellules CD4+CD25++Foxp3+ nous constations qu'après 10 jours de culture jusqu'à environ 80% des cellules sont devenues des cellules Treg CD4+CD25++Foxp3+. Le facteur d'expansion des cellules Treg est de 120 dans les cultures à 10 jours en présence d'IL2, d'IL15, de Rapamycine et de Thymoglobuline® (Tableau 2).
Tableau 2: Production de cellules CD4+CD25++Foxp3+ induites par Thymoglobuline® JO J1 J5 J10 Quantité de cellules totales en culture 20.106 20.106 34.106 43.106 (moyenne de 7 expérimentations) % de cellules CD4+/CD25++/FoxP3+ 1-3% 20-40% 30-60% 50-80% (écarts trouvés sur 7 expérimentations) Quantité de cellules 0,2.106 5.106 8.106 24.106 CD4+/CD25++/FoxP3+ (moyenne de 7 expérimentations) Par ailleurs l'analyse de ces cellules montre qu'elles possèdent aussi les autres marqueurs de surface présents sur les cellules Treg induites CTLA4, GITR, CD127dim, CD62L et CCR4. A ce jour, les marqueurs les plus communs pour l'identification et la caractérisation des cellules Treg sont les molécules : CD4, CD25, CD127 et FoxP3. Le facteur de transcription FoxP3 est nécessaire mais insuffisant pour le développement et la fonction des lymphocytes T-Regs. Une nouvelle molécule régule aussi l'expression de FoxP3 : cette molécule GARP (glycoprotein-A repetitions predominant) également appelé LRRC32 (Leucine-rich repeatcontaining protein 32) est un récepteur membranaire liant la molécule LAP (latencyassociated peptide). Ils agissent en maintenant une forte expression de FoxP3 et sont des marqueurs de cellules Treg fonctionnelles. Les CD4 activés exprimant la molécule GARP s'orientent vers des CD4 régulateurs exprimant fortement FoxP3 pour induire des cellules Treg actives et fonctionnelles. Nous avons démontré que le marqueur GARP est également très exprimé en intra-cytoplasmique, et beaucoup plus modérément en membranaire, ainsi que la molécule LAP, après induction des cellules Treg avec le mélange Thymoglobuline®+IL2+IL15+Rapamycine.
Exemple 3: Les cellules Treg induites par Thymoglobuline® inhibent la réaction allogénique (RLM) Lorsque nous réalisons un mélange des cellules répondeuses avec des cellules Treg CD4+CD25++Foxp3+ induites par Thymoglobuline® (CD4 ATG), nous observons une inhibition de la RLM de façon dose-dépendante de la quantité de cellules Treg (CD4 ATG) ajoutée à la réaction. On obtient une inhibition de 80% pour un ratio cellules répondeuses/ CD4 ATG de 1/5 (Figure 1).
Exemple 4 : Les cellules Treg peuvent être induites par Thymoglobuline® à partir de sang de cordon ombilical Des transplantations de cellules issues de sang de cordon ombilical sont couramment utilisées pour le traitement des hémopathies. Il a été vérifié que le protocole décrit à l'exemple 1 est capable de produire des cellules Treg à partir de CD4 naïfs du sang de cordon ombilical.
Exemple 5: Les cellules Treg induites par Thymoglobuline® peuvent être produites en grand volume dans des flacons de 2, 5, 25, et 75 ml sans modification de leurs propriétés Pour vérifier que nous puissions produire ces cellules Treg en grandes quantités, pour des essais d'immunothérapie, nous avons produit ces cellules dans des flacons de 2 à 75 ml, après ensemencement à raison de 2.106 cellules CD4+ par mL et 10 jours de culture, avec changement de milieu et réensemencement à 1.106 cellules par mL à J1 et J5. Nous constatons que le volume de culture n'altère pas la qualité des cellules produites (Figure 2). En outre, les cellules Treg induites par Thymoglobuline® peuvent être congelées et décongelées sans altération de leurs propriétés fonctionnelles.
Exemple 6 : Comparaison de la capacité de Thymoglobuline® à induire des cellules Treg avec celle d'une autre préparation d'immunoglobulines anti-thymocytes humains La capacité des deux produits Thymoglobuline® et Lymphoglobuline® (immoglobulines équines anti-thymocytes humains, Genzyme) à induire des cellules T régulatrices CD4+CD25+Foxp3+, dans des conditions de culture identiques (Thymoglobuline® ou Lymphoglobuline® à 0, 10, 50 ou 100 pg/mL dans le milieu RPMI avec 10% d'un pool de sérum humain AB inactivé par chauffage, additionné de 2 mM de glutamine,100 Ul/ml de pénicilline, et 100 pg/ml de streptomycine) a été comparée après 24 heures de culture. Les résultats obtenus sont montrés dans le Tableau 3.
Tableau 3 : comparaison Thymoglobuline® et Lymphoglobuline® Concentration (µg/mL) % de cellules CD4 CD25+Foxp3+ Contrôle 0 1 Thymoglobuline® 10 10 50 52 100 80 Lymphoglobuline® 10 2 50 8 100 30 200 30
Claims (20)
- REVENDICATIONS1. Méthode ex vivo de préparation de cellules T régulatrices (Treg), ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules T CD4+ dans un milieu de culture contenant des immunoglobulines anti-thymocytes ; b) cultiver les cellules obtenues à l'étape a) dans un milieu de culture contenant des immunoglobulines anti-thymocytes thymocytes et au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation ; et c) récolter les cellules CD4+CD25+Foxp3+ obtenues à l'étape b), les cellules CD4+CD25+Foxp3+ étant des cellules Treg.
- 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle aux étapes a) et b) lesdites immunoglobulines anti-thymocytes sont des immunoglobulines de lapin ou de cheval anti- thymocytes humains.
- 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle aux étapes a) et b) lesdites immunoglobulines anti-thymocytes sont les immunoglobulines de lapin anti-thymocytes humains Thymoglobuline® ou les immunoglobulines de cheval anti-thymocytes humains Lymphoglobuline®.
- 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle les cellules T CD4+ sont cultivées à l'étape a) pendant 12 à 48 h.
- 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le milieu de culture de l'étape b) contient des immunoglobulines anti-thymocytes et au moins une cytokine et un inhibiteur de la protéine kinase TOR.
- 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite au moins une cytokine est IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 ou IL21.
- 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ladite au moins une cytokine est IL2 et IL15.
- 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ledit inhibiteur de la protéine kinase TOR est la rapamycine.
- 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle culture selon l'étape b) est effectuée pendant 1 à 14 jours.
- 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, qui comprend les étapes de : a) cultiver pendant 23 à 25 heures des cellules T CD4+ dans un milieu de culture contenant les immunoglobulines anti-thymocytes à une concentration de 50 à 60 pg/mL, ; b) cultiver pendant 5 à 9 jours, les cellules issues de l'étape a) dans un milieu de culture contenant lesdites immunoglobulines anti-thymocytes à une concentration de 50 à 60 pg/mL, et de l'IL2 à une concentration de 180-220 UI/mL, de l'IL15 à une concentration de 7,5 à 15 ng/mL, et de la rapamycine à une concentration de 9 à 11 ng/mL ; et c) récolter les cellules CD4+CD25+Foxp3+ obtenues à l'étape b), les cellules CD4+CD25+Foxp3+ étant des cellules Treg.
- 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle les cellules CD4+CD25+Foxp3+ récoltées à l'étape c) sont des cellules CD4+CD25+Foxp3+ GARP+LAP+.
- 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle les cellules CD4+ sont des cellules CD4+ d'un sujet destiné à recevoir une greffe de tissu(s) ou d'organe(s), ou d'un sujet affecté d'une maladie autoimmune ou d'une allergie.
- 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle les cellules CD4+ sont des cellules CD4+ de cordon ombilical.
- 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, qui comprend, après l'étape c), une ou plusieurs étapes supplémentaires consistant à laver, et/ou concentrer, et/ou congeler les cellules T régulatrices ; et/ou mettre les cellules T régulatrices en suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 30
- 15. Cellules T régulatrices CD4+CD25+Foxp3+ susceptibles d'être obtenues par la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
- 16. Composition pharmaceutique comprenant des cellules T régulatrices 35 CD4+CD25+Foxp3+ selon la revendication 15 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 5
- 17. Cellules T régulatrices CD4+CD25+Foxp3+ selon la revendication 15 pour leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention de la maladie du greffon contre l'hôte, du rejet de tissus ou d'organe(s) après greffe, d'une maladie autoimmune, d'un diabète de type 1 ou d'une allergie chez un sujet.
- 18. Cellules T régulatrices pour leur utilisation selon la revendication 17, les cellules T régulatrices étant des cellules autologues du sujet à traiter.
- 19. Cellules T régulatrices pour leur utilisation selon la revendication 18, les cellules T 10 régulatrices étant utilisées en combinaison, pour une administration simultanée ou séquentielle, avec un autre traitement immunosuppresseur.
- 20. Trousse pour l'amplification de cellules T régulatrices comprenant : - des immunoglobulines anti-thymocytes ;et 15 - un ou des moyens de purification de cellules CD4+ et/ou - au moins une cytokine et/ou un inhibiteur de la protéine kinase TOR et/ou un agent de différenciation ; et/ou - un ou plusieurs marqueurs pour la sélection de cellules CD4+CD25+Foxp3+GITR+CTLA4+CD62L+CCR4+GARP+LAP+. 20
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