JP2011505378A - 生体外増殖させたcd4+cd25+制御性t細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減するための方法 - Google Patents
生体外増殖させたcd4+cd25+制御性t細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011505378A JP2011505378A JP2010536216A JP2010536216A JP2011505378A JP 2011505378 A JP2011505378 A JP 2011505378A JP 2010536216 A JP2010536216 A JP 2010536216A JP 2010536216 A JP2010536216 A JP 2010536216A JP 2011505378 A JP2011505378 A JP 2011505378A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- regulatory
- sample
- population
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 119
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 11
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 title abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims description 99
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 32
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025074 C-C chemokine receptor-like 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 claims description 3
- -1 CLA Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 18
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 6
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 206010014025 Ear swelling Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101100438639 Homo sapiens CBS gene Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940046731 calcineurin inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本明細書では、生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を生成するための方法を開示する。本方法は、ヒトドナーから末梢血単核球を含む試料を抽出する工程を含む。抽出された細胞には、CD4+CD25+制御性T細胞である所与の数の細胞が含まれる。Treg細胞が試料中の細胞の大半を構成するようにCD4+CD25+制御性T細胞の相対集団を増強する。この後、第三者由来のTreg細胞を含み得る、濃縮されたTreg細胞の集団を増殖させて移植片対宿主病(GVHD)の治療に使用するための臨床的に有用な細胞の集団を得る。
Description
〔関連出願の相互参照〕
本願は、参照により本明細書にその全容を組み込む2007年11月30日出願の同時係属中の米国仮特許出願第60/991,301号、及び2007年12月5日出願の同第60/992,347号に基づく優先権及びその利益を主張するものである。
本願は、参照により本明細書にその全容を組み込む2007年11月30日出願の同時係属中の米国仮特許出願第60/991,301号、及び2007年12月5日出願の同第60/992,347号に基づく優先権及びその利益を主張するものである。
〔発明の分野〕
本発明は、一実施形態において、CD4+CD25+制御性T細胞を生体外増殖させるための方法に関する。本方法は、ヒトドナーから末梢血単核球を含む試料を抽出する工程を含む。抽出された細胞には、CD4+CD25+制御性T細胞である所与の数の細胞が含まれる。Treg細胞が試料中の細胞の大半を構成するようにCD4+CD25+制御性T細胞の相対集団を濃縮する。この後、第三者ドナーに由来するTreg細胞を含み得る、濃縮されたTreg細胞の集団を増殖させてGVHD(移植片対宿主病)の治療に使用するための臨床的に有用な細胞の集団を得る。
本発明は、一実施形態において、CD4+CD25+制御性T細胞を生体外増殖させるための方法に関する。本方法は、ヒトドナーから末梢血単核球を含む試料を抽出する工程を含む。抽出された細胞には、CD4+CD25+制御性T細胞である所与の数の細胞が含まれる。Treg細胞が試料中の細胞の大半を構成するようにCD4+CD25+制御性T細胞の相対集団を濃縮する。この後、第三者ドナーに由来するTreg細胞を含み得る、濃縮されたTreg細胞の集団を増殖させてGVHD(移植片対宿主病)の治療に使用するための臨床的に有用な細胞の集団を得る。
〔発明の背景〕
同種間の造血幹細胞移植(HSCT)は、血液悪性腫瘍及び遺伝性血液疾患の潜在的に有効な治療法である。臨床的HSCTにおける主要な障害かつ致死的な合併症の1つに、活性化したドナーT細胞によって宿主の組織が広範に攻撃される移植片対宿主病(GVHD)がある。低グレードの移植片対宿主効果は、悪性細胞を死滅させるうえで重要な役割を担っていると考えられるが、重篤なGVHDはHSCTを受ける患者における死亡例及び発病例の主因となっている。グレードII〜IVの急性GVHDのリスクは、同種幹細胞移植後には70%に達する。カルシニューリン阻害剤及びステロイドなどの各種の免疫抑制剤がGVHDのリスクを低減するために広く用いられているが、グレードII〜IVのGVHDの患者の50%以上で現在用いられているこうした治療法では治療効果が得られない。更に、高用量の免疫抑制剤の使用により、免疫再構築が妨げられ、T細胞により媒介される移植片対白血病(GVL)応答が消失する。従来の治療法による治療の高い失敗率のため、代替的なGVHDの治療法が望まれている。
同種間の造血幹細胞移植(HSCT)は、血液悪性腫瘍及び遺伝性血液疾患の潜在的に有効な治療法である。臨床的HSCTにおける主要な障害かつ致死的な合併症の1つに、活性化したドナーT細胞によって宿主の組織が広範に攻撃される移植片対宿主病(GVHD)がある。低グレードの移植片対宿主効果は、悪性細胞を死滅させるうえで重要な役割を担っていると考えられるが、重篤なGVHDはHSCTを受ける患者における死亡例及び発病例の主因となっている。グレードII〜IVの急性GVHDのリスクは、同種幹細胞移植後には70%に達する。カルシニューリン阻害剤及びステロイドなどの各種の免疫抑制剤がGVHDのリスクを低減するために広く用いられているが、グレードII〜IVのGVHDの患者の50%以上で現在用いられているこうした治療法では治療効果が得られない。更に、高用量の免疫抑制剤の使用により、免疫再構築が妨げられ、T細胞により媒介される移植片対白血病(GVL)応答が消失する。従来の治療法による治療の高い失敗率のため、代替的なGVHDの治療法が望まれている。
〔発明の概要〕
本発明は、その一形態において、CD4+CD25+Treg細胞の濃縮試料を生成するための方法を含む。本発明の教示に従って単離及び増殖された細胞は、GVHDの症状を治療するうえで有用である。
本発明は、その一形態において、CD4+CD25+Treg細胞の濃縮試料を生成するための方法を含む。本発明の教示に従って単離及び増殖された細胞は、GVHDの症状を治療するうえで有用である。
本発明を付属の図面を参照しつつ開示する。
精製の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
精製の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
精製の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
増殖の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
増殖の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
増殖の前後のCD4+CD25+Treg細胞の純度のグラフ。
CD4+CD25+Treg細胞の表現型の特徴を示す複数のグラフを示したもの。
長期間の増殖後のCD4+CD25+Treg細胞の特定の表現型変化を示すグラフ。
長期間の増殖後のCD4+CD25+Treg細胞の特定の表現型変化を示すグラフ。
CD4+CD25+Treg細胞のIn Vitroでの抑制活性を示すグラフ。
CD4+CD25+Treg細胞のIn Vitroでの抑制活性を示すグラフ。
CD4+CD25+Treg細胞のIn Vitroでの抑制活性を示すグラフ。
NOD/SCIDマウスにおけるDTH様の局所炎症に対するTreg細胞の影響を示す図。
NOD/SCID GVHDマウスモデルに対するTreg細胞の影響を示す図。
NOD/SCID GVHDマウスモデルに対するTreg細胞の影響を示す図。
NOD/SCID GVHDマウスモデルに対するTreg細胞の影響を示す図。
NOD/SCID GVHDマウスモデルに対するTreg細胞の影響を示す図。
NOD/SCID GVHDマウスモデルに対するTreg細胞の影響を示す図。
インビトロの抑制アッセイにおいて、増殖させたヒトTregが、同種CD4+CD25−TエフェクターT細胞の増殖及び自家CD4+CD25−TエフェクターT細胞の増殖の両方を同様に阻害したことを示すグラフ。
インビトロの抑制アッセイにおいて、増殖させたヒトTregが、同種CD4+CD25−TエフェクターT細胞の増殖及び自家CD4+CD25−TエフェクターT細胞の増殖の両方を同様に阻害したことを示すグラフ。
複数の図面を通じて、対応する参照符号は対応する部材を示す。本明細書に述べる実施例は、発明の異なる実施形態を説明するものであって、発明の範囲をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
〔詳細な説明〕
一実施形態では、本発明は、ヒトCD4+CD25+Treg細胞を健康なドナーから抽出するための方法に関する。Treg細胞(即ち、制御性T細胞)は、免疫系の活性化を抑制することによって自己免疫疾患を防止する細胞である。CD4及びCD25は、特定の細胞によって発現され得るタンパク質である。したがって、CD4+かつCD25+であるTreg細胞はTreg細胞のサブセットである。リンパ球や全血などの未処理の血液試料をドナーから抜き取る。未処理の抽出物を精製してCD4+CD25+Treg細胞の相対集団を濃縮する。濃縮された試料を生体外で増殖させてCD4+CD25+Treg細胞の相対集団を維持しつつ全細胞数を増やす。得られた細胞を患者に投与し、GVHDの症状を防止するのに役立てる。
一実施形態では、本発明は、ヒトCD4+CD25+Treg細胞を健康なドナーから抽出するための方法に関する。Treg細胞(即ち、制御性T細胞)は、免疫系の活性化を抑制することによって自己免疫疾患を防止する細胞である。CD4及びCD25は、特定の細胞によって発現され得るタンパク質である。したがって、CD4+かつCD25+であるTreg細胞はTreg細胞のサブセットである。リンパ球や全血などの未処理の血液試料をドナーから抜き取る。未処理の抽出物を精製してCD4+CD25+Treg細胞の相対集団を濃縮する。濃縮された試料を生体外で増殖させてCD4+CD25+Treg細胞の相対集団を維持しつつ全細胞数を増やす。得られた細胞を患者に投与し、GVHDの症状を防止するのに役立てる。
健康なドナーからのヒト末梢血単位は、商業的な血液銀行(commercial blood blanks)から購入するか、従来の技術を用いてドナーから直接得ることができる。最初に末梢血単核球(PBMC)を、Ficoll Hypaque(アマシャム社(Amersham))を用いて密度勾配遠心分離によって血液試料から単離する。標準的な単離用キット(例、ミルテニー・バイオテック社(Miltenyi Biotec)(カリフォルニア州オーバーン)より販売されるヒトCD4+CD25+制御性T細胞を使用したautoMACSなど)を製造者の指示に従って使用し、単離されたPBMCからCD4+CD25+Treg細胞を精製する。例えば、最初に、ヒトCBS、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRY/6及びCD235aに対するモノクローナル抗体の混合物によって非CD4細胞を枯渇させることによってCD4+T細胞をPMBCからネガティブ単離する。次いで、濃縮されたCD4+T細胞集団から、抗ヒトCD25抗体接合マイクロビーズを用いてヒトCD4+CD25+Tregをポジティブ単離する。必要に応じて、精製後にフローサイトメトリーによって単離細胞の純度を求めてもよい。
精製したヒトCD4+CD25+Tregは、組み換えヒトIL−2(rhIL−2、1000U/mL、R&Dシステムズ社(R&Dsystems))の存在下、CD3/CD28 T Cell Expander Dynalbeads(インビトロジェン(Invitrogen)社)を用い、市販の細胞培養バッグ(ミルテニー・バイオテック社(Miltenyi Biotec)及びLIFECELL、バクスター社(Baxter))又は細胞培養プレート中で生体外で活性化及び増殖させる。CD4+CD25+Tregは、10%熱不活化ヒトAB血清(ロンザ社(Lonza)、メリーランド州)、L−グルタミン、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン(ギブコ社(Gibco))を添加したX−VIVO(商標)15培地中で培養した。rhIL−2を含む新鮮な培地を週に2〜3回加えた。2週間後、CD3/CD28ビーズをTregから除去し、この後、増殖させたTregを1〜2日間、低濃度のIL−2(50U/mL)を含む培地中でインビトロキャラクタリゼーション及び機能分析を行うまで休ませた。ラパマイシン及び/又はDRBなどの特定の添加物は試料を濃縮し、増殖過程の間に高い純度を維持するうえで有用である。
<ヒトTreg細胞の生体外増殖の実施例>
ヒトCD4+CD25+Tregを、正常なドナー(n=16)の全血構成成分(whole blood units)又はleukopakから得たPBMCから、autoMACS及びヒトCD4+CD25+制御性T細胞単離キットにより精製した。単離したCD4+CD25+Tregの純度を細胞内Foxp3染色により求めた。CD4陽性細胞は、これらの精製細胞の90%〜98%を構成し、その内、平均で55%がFoxp3陽性であった(40%〜78%の範囲)(図1B、1C)。これらの結果は、Foxp3+Tregが集団のわずか約1%、又はCD4+T細胞の10%を構成するPBMCから、ヒトTregが大幅に濃縮され得ることを示すものであった(図1A、1C)。Tregの収率はPBMCの約0.5%であった。試験を行った6人の正常ドナーのleukopak(2〜6×109個のPBL)において、各ドナーから少なくとも1×107個のTregを得ることができた。これらの結果は、ClinMACS(ミルテニー・バイオテック社(Miltenyi Biotec)(カリフォルニア州))を用いた大規模な精製においても確認された。有利な点として、増殖期間が約2週間である場合には細胞の全体の組成に対するCD4+CD25+細胞の集団は大きく変化しなかった。機能的な観点からは、増殖させた集団は、治療目的で使用される際に所望の生物学的効果を維持するうえで充分な組成を有することが望ましい。一実施形態では、相対集団は約10%よりも大きく変化することはない。
ヒトCD4+CD25+Tregを、正常なドナー(n=16)の全血構成成分(whole blood units)又はleukopakから得たPBMCから、autoMACS及びヒトCD4+CD25+制御性T細胞単離キットにより精製した。単離したCD4+CD25+Tregの純度を細胞内Foxp3染色により求めた。CD4陽性細胞は、これらの精製細胞の90%〜98%を構成し、その内、平均で55%がFoxp3陽性であった(40%〜78%の範囲)(図1B、1C)。これらの結果は、Foxp3+Tregが集団のわずか約1%、又はCD4+T細胞の10%を構成するPBMCから、ヒトTregが大幅に濃縮され得ることを示すものであった(図1A、1C)。Tregの収率はPBMCの約0.5%であった。試験を行った6人の正常ドナーのleukopak(2〜6×109個のPBL)において、各ドナーから少なくとも1×107個のTregを得ることができた。これらの結果は、ClinMACS(ミルテニー・バイオテック社(Miltenyi Biotec)(カリフォルニア州))を用いた大規模な精製においても確認された。有利な点として、増殖期間が約2週間である場合には細胞の全体の組成に対するCD4+CD25+細胞の集団は大きく変化しなかった。機能的な観点からは、増殖させた集団は、治療目的で使用される際に所望の生物学的効果を維持するうえで充分な組成を有することが望ましい。一実施形態では、相対集団は約10%よりも大きく変化することはない。
次いで、濃縮されたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregを、rhIL2及び10%の熱不活化ヒト男性AB血清を含むX−VIVO15(商標)培地中、1/3の比でCD3/28 T cell expanderビーズを用いて活性化及び増殖させた。小規模な培養プレートでは、ヒトTregは2週間後におよそ100倍に増殖し、細胞内Foxp3染色によって測定される純度は維持された(n=15、図1D、1E)。より大規模な細胞バッグ培養(n=10、4バッチの100mLのMiltenyi T cell増殖バッグ、及び6バッチの0.3〜3LのLIFECELL培養バッグ)では、ヒトCD4+CD25+FOXP3+Tregは2〜3週間で100倍以上に増殖し、これは約10兆個の細胞に相当した(図1F)。14日間増殖させた試料では、これは約30〜約300倍の増加の倍数変化を表わす。これらの結果は、大規模な生体外増殖培養によって臨床的に有効な数のヒトTreg細胞を得ることができることを示すものであった。
2週目の増殖ヒトTregの純度を上述したような細胞内Foxp3染色を用いて評価した。10個の細胞バッグ培養において、平均で57.3%のFoxp3陽性細胞が得られた(それぞれ、37%、39%、45%、51.8%、62%、65%、68%、68%、68%及び70%)。更に、これらの細胞では、CD27、CD25、CTLA4、GITR、HLA−DR、CD39、CD62L、CCR4、CD49d、intergrinp7の強い発現が認められ、OX40、グランザイムB、CCR7の部分的な発現が認められたが、CCR5、CCR6、CCR8、CLA、CD106については陰性であった(図2)。これらの結果は、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregが、ヒトTregの表現型の特徴の多くを維持していることを示すものである。2週間の培養では、これらのマーカーの発現は、Foxp3+集団とFoxp3−集団との間で有意な差は認められなかった(データは示さず)。しかしながら、3週目の培養では、Foxp3+細胞においてCD27、CD62L、CD25、及びCCR7が選択的に発現していた。Foxp3+細胞では、Foxp3−細胞と比較してCTLA−4、HLA−DRの発現も高率で認められた(図3A、3B)。
<生体外増殖させたTregがインビトロで能力を維持することを示す実施例>
生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregのインビトロでの抑制機能を評価するため、抗原提示細胞として同種樹状細胞(DC)を生成し、自家のCD4+CD25−T細胞を応答細胞として用いた。図4A及び4Bに示されるように、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregは、MLR及びOKT3−誘導T細胞増殖アッセイの両方においてインビトロで強い抑制活性を示した。いずれのアッセイにおいても、増殖させたヒトTregは用量依存的にT細胞の増殖を阻害した(図4A、B)。生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregの大半のバッチでは、両アッセイにおいて、1/10〜1/27のTreg/Tエフェクター比で50%よりも高いT細胞増殖の阻害率を示した(図4)。更に、増殖させたヒトTregは、OKT3アッセイにおいてIFNyの生成を阻害した(図4C)。これらの結果は、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregは強力なIインビトロ抑制活性を維持することを示すものであった。同時に、増殖させたヒトTreg細胞は、自家のCD4+CD25−T細胞増殖と比較して、同種CD4+CD25−T細胞の増殖を同等に阻害する能力を示した(図7A、7B)。
生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregのインビトロでの抑制機能を評価するため、抗原提示細胞として同種樹状細胞(DC)を生成し、自家のCD4+CD25−T細胞を応答細胞として用いた。図4A及び4Bに示されるように、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregは、MLR及びOKT3−誘導T細胞増殖アッセイの両方においてインビトロで強い抑制活性を示した。いずれのアッセイにおいても、増殖させたヒトTregは用量依存的にT細胞の増殖を阻害した(図4A、B)。生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregの大半のバッチでは、両アッセイにおいて、1/10〜1/27のTreg/Tエフェクター比で50%よりも高いT細胞増殖の阻害率を示した(図4)。更に、増殖させたヒトTregは、OKT3アッセイにおいてIFNyの生成を阻害した(図4C)。これらの結果は、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregは強力なIインビトロ抑制活性を維持することを示すものであった。同時に、増殖させたヒトTreg細胞は、自家のCD4+CD25−T細胞増殖と比較して、同種CD4+CD25−T細胞の増殖を同等に阻害する能力を示した(図7A、7B)。
ヒト樹状細胞(DC)を、接着細胞又はPBMCからCD14ビーズで精製した単核細胞から生成し、10%FCS、組み換えヒトGM−CSF(50ng/mL、R&Dシステムズ社(R&Dsystems))及びIL−4(25ng/mL、R&Dシステムズ社(R&Dsystems))の存在下、RPMI1640培地で培養した。サイトカイン及び培地は1日置きに交換した。5〜6日目にDCを収穫してインビトロ抑制アッセイで使用した。
本発明の教示に従って単離した、生体外増殖させたヒトTregのインビトロ抑制活性を、混合リンパ球反応(MLR)及び抗CD3抗体誘導T細胞増殖アッセイにおいて測定した。MLRアッセイでは、CD4+CD25−Tエフェクター細胞(1×105細胞/ウェル)を96穴U底プレートで同種ヒト樹状細胞(1×104細胞/ウェル)と培養した。
増殖させたヒトTregを連続希釈し、異なるTreg/Tエフェクター比で各培養に加え、細胞を6日間培養した。培養の最後の16時間において、3H−チミジン(1μCi/ウェル)を加えた。各プレートの細胞を収穫し、3H−チミジンの取り込み率をTopcount(パーキンエルマー社(Perkin Elmer))によりカウントした。3重の培養の1分当たりの平均のカウント数(cpm)及び標準偏差を計算した。増殖の阻害率(%)を次のように計算した。阻害率(%)=[(応答細胞のcpm−応答Tregのcpm)/(応答細胞のcpm)]×100
抗ヒトCD3抗体(OKT3、エビオサイエンス社(Ebioscience))誘導T細胞増殖アッセイ(OKT3アッセイ)では、CD4+CD25−T細胞及び同種DCを抗ヒトCD3抗体(1μg/mL、OKT3)の存在下、96穴プレートで培養した。増殖させたヒトTregを連続希釈し、異なるTreg/Tエフェクター比で各培養に加え、細胞を4日間培養した。抑制活性の読み取り値及び計算値は、MLRアッセイにおけるものと同様であった。
<NOD/SCIDマウスにおける異種GVHD治療の実施例>
生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregのインビボ活性を、NOD/SCID(非肥満糖尿病/重度複合免疫不全症)マウスでヒトPBLにより誘導した異種GVHDのモデルにおいて更に評価した。異種GVHDは、調整したNOD/SCIDマウスにヒトPBLを脾臓内注射することによって誘導した。図6A〜6Cに示されるように、ヒトPBLの移植後、レシピエントNOD/SCIDマウスは、例えば曲がった背中、下痢及び体重の減少といったGVHD様の症状を呈し、マウスは通常4週間以内に死亡した。
生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Tregのインビボ活性を、NOD/SCID(非肥満糖尿病/重度複合免疫不全症)マウスでヒトPBLにより誘導した異種GVHDのモデルにおいて更に評価した。異種GVHDは、調整したNOD/SCIDマウスにヒトPBLを脾臓内注射することによって誘導した。図6A〜6Cに示されるように、ヒトPBLの移植後、レシピエントNOD/SCIDマウスは、例えば曲がった背中、下痢及び体重の減少といったGVHD様の症状を呈し、マウスは通常4週間以内に死亡した。
生体外増殖させたTregを、NOD/SCIDマウスの脾臓にPBLと同時移植した場合、NOD/SCIDマウスの生存率は大幅に向上した(図6A)。増殖させたTregとともにヒトPBLを投与した8頭のマウスの内、1ヶ月以内に死亡したのが1匹のみであったに対して、ヒトPBLのみを投与した6頭のNOD/SCIDマウスの内、5匹が1ヶ月以内に死亡した。同時に、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3 Tregは更に、NOD/SCIDマウスにおいて曲がった背中及び体重減少といったGVHDの症状を大幅に低減させた(図6B、6C)。更に、増殖させたヒトTregは、hu−PBL−NOD/SCIDマウスにおいてヒトIgG及びIgMの血清レベルを阻害した。ヒト細胞の注射の2週間後、増殖させたヒトTregを同時移植したhu−PBL−NOD/SCIDマウス(n 7)の血清中におけるヒトIgG及びIgMの平均濃度が、それぞれ63.04pg/mL及び4.548pg/mLであったのに対して、ヒトTregを移植しないhu−PBL−NOD/SCIDマウス(n 5)では1163pg/mL及び16.398pg/mLであった(図6D、6E)。この結果は、増殖させたTregがヒトB細胞の活性化及び増殖を阻害したことを示唆するものである。同時に、この実験では、増殖させたヒトTreg及びPBLは異なるドナーに由来するものを使用したが、このことは、第三者に由来するヒトTregがhu−PBL−NOD/SCIDモデルにおいてGVHDを防止したことを示唆するものである。
OKT3により活性化した正常なドナーのPBMCをNOD/SCIDマウスの右耳に皮下注射することによってDTH(遅延型過敏症)様の局所炎症を誘導した。DTHの強度を、細胞移植の24時間後に測定した耳の厚さによって判定した。図5に示されるように、OKT3で活性化した正常ドナーのPBMCは、同量のPBSを投与したネガティブコントロールの耳と比較して顕著なDTHを誘導した。生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Treg(PBMCとは異なるドナーに由来するもの)を1/2のTreg/PBMC比で、活性化させた正常ドナーPBMCとともに同時注射すると、増殖させたヒトTregは、OKT3で活性化したPBMCによって誘導される耳の腫れを顕著に阻害した(図5)。しかしながら、同量の増殖させない非Treg(CD4+CD25−T細胞)を、活性化したPBMCと同時注射した場合には耳の腫れを阻害しなかった。この結果は、生体外で増殖させたヒトTregが養子移植による局所的DTH反応を阻害したことを示すものであり、増殖させたTregが局所的な組織環境においてその免疫抑制活性を維持していることを示すものである。
ヒトPBMCをNOD/SCIDマウスに養子移植することによって誘導したDTH(反応)を、Xuらによる報告(19)に基づいた改変プロトコールによって発展させた。簡単に述べると、ヒトPBMC(1×107細胞)を、生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Treg(5×106細胞)の存在下又は非存在下で抗ヒトCD3抗体(OKT3、マウス1頭当たり10μg、エビオサイエンス社(Ebioscience))と混合し、NOD/SCIDマウスの右耳に25μLの最終容量で皮下(s.c.)注射した。同じ容量のPBSを同じマウスの左耳に内部コントロールとして注射した。養子移植されたヒトPBLの活性化によって誘導されるDTH様の局所炎症である耳の腫れを、Series1010 Starrett カリパーにより細胞注射の24時間後に測定した。細胞注射の前に測定した耳の厚さを基準コントロールとして用いた。
ヒト細胞を移植する1日前に、NOD/SCIDマウスに放射線を照射した(300radのγ線放射)。この後、マウスに20μLの抗アシアロGMI抗体(和光純薬工業、日本・大阪)を、ヒト細胞の移植後−1、7、14、及び21日目に腹腔内(i.p.)注射した。健康な正常ドナーから得たヒトPBL(1×107細胞/マウス)を単独で、又は生体外増殖させたヒトCD4+CD25+Foxp3+Treg(1×107細胞/マウス)と混合して、調整したNOD/SCIDマウスの脾臓に注射するか、調整したNOD/SCIDマウスに静脈内注射した。ヒト細胞の脾臓内移植の詳細な手順については、デプラテレ(Depraetere)Sらにより以前に述べられている(Depraetere S et al. J. lmmunol. 2001:166:2929-2936)。マウスの生存率、並びに曲がった背中、下痢、及び体重といったGVHDの症状を毎日観測した。細胞の移植後、キメラNOD/SCIDマウスから血漿を毎週回収し、ELISAキット(アルファ・ダイアグノスティック・インターナショナル(Alpha Diagnostic International)テキサス州)を用いてヒトIgG及びIgMレベルを求めた。
以上、本発明を特定の実施形態に照らして説明したが、当業者であれば、発明の範囲を逸脱することなく、特定の状況に適合するように様々な変更を行うことが可能であり、発明の要素を均等物に置き換えることが可能であることは理解されるであろう。したがって、本発明は、本発明を実施するうえで考えられる最良の態様として開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、付属の請求項の範囲及び趣旨に包含されるすべての実施形態を含むものである。
〔実施の態様〕
(1) 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
CD4+CD25+制御性T細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、
前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
(2) 前記制御性T細胞を濃縮する工程が、全血から前記末梢血単核球を分離する工程を含む、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記末梢血単核球を分離する工程が、密度勾配遠心分離を含む、実施態様2に記載の方法。
(4) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗体を用いて非CD4細胞を除去することによってCD4+細胞をネガティブ単離する工程を含む、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗ヒトCD25抗体を用いてCD4+CD25+細胞をポジティブ単離する工程を含む、実施態様4に記載の方法。
(6) 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、実施態様6に記載の方法。
(8) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程により、濃縮試料が生成され、該濃縮試料は、前記濃縮試料中の全細胞集団に対してCD4+CD25+制御性T細胞が40%〜78%であるような濃縮試料である、実施態様1に記載の方法。
(9) 前記集団を増殖させる工程の後に、前記試料が全細胞集団に対して40%〜78%のCD4+CD25+制御性T細胞を含む、実施態様8に記載の方法。
(10) 前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の濃度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、実施態様8に記載の方法。
(1) 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
CD4+CD25+制御性T細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、
前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
(2) 前記制御性T細胞を濃縮する工程が、全血から前記末梢血単核球を分離する工程を含む、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記末梢血単核球を分離する工程が、密度勾配遠心分離を含む、実施態様2に記載の方法。
(4) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗体を用いて非CD4細胞を除去することによってCD4+細胞をネガティブ単離する工程を含む、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗ヒトCD25抗体を用いてCD4+CD25+細胞をポジティブ単離する工程を含む、実施態様4に記載の方法。
(6) 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、実施態様6に記載の方法。
(8) 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程により、濃縮試料が生成され、該濃縮試料は、前記濃縮試料中の全細胞集団に対してCD4+CD25+制御性T細胞が40%〜78%であるような濃縮試料である、実施態様1に記載の方法。
(9) 前記集団を増殖させる工程の後に、前記試料が全細胞集団に対して40%〜78%のCD4+CD25+制御性T細胞を含む、実施態様8に記載の方法。
(10) 前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の濃度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、実施態様8に記載の方法。
(11) 前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞が、第三者由来のヒトTreg細胞を含む、実施態様1に記載の方法。
(12) 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
試料中のCD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記分離されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程であって、前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の純度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
(13) 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、実施態様12に記載の方法。
(14) 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、実施態様13に記載の方法。
(15) 前記集団を増殖させる工程が、30倍の増加以上から300倍の増加以下の範囲の細胞集団の倍数変化をもたらすだけの充分な期間にわたって行われる、実施態様12に記載の方法。
(16) 前記倍数変化が、80倍の増加以上かつ150倍の増加以下である、実施態様15に記載の方法。
(17) 前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞が、第三者由来のヒトTreg細胞を含む、実施態様12に記載の方法。
(18) 少なくとも40%がCD4+CD25+制御性T細胞である、複数個の細胞を含む、生体外細胞試料。
(19) 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、Foxp3を発現する、実施態様18に記載の細胞試料。
(20) 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、CD27、CD25、CTLA4、GITR、HLA−DR、CD39、CD62L、CCR4、CD49d、及びintergrinp7を発現する、実施態様19に記載の細胞試料。
(12) 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
試料中のCD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記分離されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程であって、前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の純度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
(13) 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、実施態様12に記載の方法。
(14) 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、実施態様13に記載の方法。
(15) 前記集団を増殖させる工程が、30倍の増加以上から300倍の増加以下の範囲の細胞集団の倍数変化をもたらすだけの充分な期間にわたって行われる、実施態様12に記載の方法。
(16) 前記倍数変化が、80倍の増加以上かつ150倍の増加以下である、実施態様15に記載の方法。
(17) 前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞が、第三者由来のヒトTreg細胞を含む、実施態様12に記載の方法。
(18) 少なくとも40%がCD4+CD25+制御性T細胞である、複数個の細胞を含む、生体外細胞試料。
(19) 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、Foxp3を発現する、実施態様18に記載の細胞試料。
(20) 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、CD27、CD25、CTLA4、GITR、HLA−DR、CD39、CD62L、CCR4、CD49d、及びintergrinp7を発現する、実施態様19に記載の細胞試料。
(21) 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、CCR5、CCR6、CCR8、CLA、及びCD106を発現しない、実施態様20に記載の細胞試料。
Claims (21)
- 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
CD4+CD25+制御性T細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、
前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。 - 前記制御性T細胞を濃縮する工程が、全血から前記末梢血単核球を分離する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記末梢血単核球を分離する工程が、密度勾配遠心分離を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗体を用いて非CD4細胞を除去することによってCD4+細胞をネガティブ単離する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程が、抗ヒトCD25抗体を用いてCD4+CD25+細胞をポジティブ単離する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、請求項6に記載の方法。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞を濃縮する工程により、濃縮試料が生成され、該濃縮試料は、前記濃縮試料中の全細胞集団に対してCD4+CD25+制御性T細胞が40%〜78%であるような濃縮試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記集団を増殖させる工程の後に、前記試料が全細胞集団に対して40%〜78%のCD4+CD25+制御性T細胞を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の濃度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、請求項8に記載の方法。
- 前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞が、第三者由来のヒトTreg細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 生体外で増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
試料中のCD4+CD25+制御性T細胞を濃縮することによって、濃縮CD4+CD25+制御性T細胞を生成する工程と、
前記分離されたCD4+CD25+制御性T細胞の集団を増殖させる工程であって、前記試料中の前記CD4+CD25+制御性T細胞の純度が、増殖の前後の両方において約10%の範囲内で等しい、工程と、
前記増殖させたCD4+CD25+制御性T細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。 - 前記集団を増殖させる工程が、少なくとも1週間にわたり、かつ3週間未満で行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記集団を増殖させる工程が、約2週間にわたり行われる、請求項13に記載の方法。
- 前記集団を増殖させる工程が、30倍の増加以上から300倍の増加以下の範囲の細胞集団の倍数変化をもたらすだけの充分な期間にわたって行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記倍数変化が、80倍の増加以上かつ150倍の増加以下である、請求項15に記載の方法。
- 前記濃縮されたCD4+CD25+制御性T細胞が、第三者由来のヒトTreg細胞を含む、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも40%がCD4+CD25+制御性T細胞である、複数個の細胞を含む、生体外細胞試料。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、Foxp3を発現する、請求項18に記載の細胞試料。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、CD27、CD25、CTLA4、GITR、HLA−DR、CD39、CD62L、CCR4、CD49d、及びintergrinp7を発現する、請求項19に記載の細胞試料。
- 前記CD4+CD25+制御性T細胞が、CCR5、CCR6、CCR8、CLA、及びCD106を発現しない、請求項20に記載の細胞試料。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US99130107P | 2007-11-30 | 2007-11-30 | |
US99234707P | 2007-12-05 | 2007-12-05 | |
PCT/US2008/085117 WO2009073599A1 (en) | 2007-11-30 | 2008-12-01 | Process for reducing effects of graft versus host disease using ex vivo expanded cd4+cd25+ regulatory t cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011505378A true JP2011505378A (ja) | 2011-02-24 |
Family
ID=40394411
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010536216A Pending JP2011505378A (ja) | 2007-11-30 | 2008-12-01 | 生体外増殖させたcd4+cd25+制御性t細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減するための方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090142317A1 (ja) |
EP (1) | EP2225365A1 (ja) |
JP (1) | JP2011505378A (ja) |
KR (1) | KR20100094997A (ja) |
CN (1) | CN101970643A (ja) |
BR (1) | BRPI0819975A2 (ja) |
CA (1) | CA2706458A1 (ja) |
MX (1) | MX2010005863A (ja) |
WO (1) | WO2009073599A1 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013054470A1 (ja) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Sbiファーマ株式会社 | 移植臓器生着促進剤 |
JP2015513403A (ja) * | 2012-03-02 | 2015-05-14 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 同種抗原反応性の制御性t細胞を増大させる方法 |
US9399029B2 (en) | 2012-07-13 | 2016-07-26 | Sbi Pharmaceuticals Co., Ltd. | Immune tolerance inducer |
JP2016532865A (ja) * | 2013-07-31 | 2016-10-20 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | エフェクターtレグ細胞を同定するための方法及びキット |
JP2018518975A (ja) * | 2015-07-03 | 2018-07-19 | インセルム(インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル) | 制御性t細胞を得る方法およびその使用 |
JP2019508067A (ja) * | 2016-03-11 | 2019-03-28 | トリゼル ゲーエムベーハー | 新しい免疫調節細胞およびその製造方法 |
JP2021526526A (ja) * | 2018-06-14 | 2021-10-07 | フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド4D Pharma Research Limited | 細菌株を含む組成物 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013168876A1 (ko) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 이식 후 면역 상태를 모니터링 하는 키트 및 이를 이용한 면역 상태의 모니터링 방법 |
CN107164324B (zh) * | 2017-07-17 | 2020-03-27 | 沃昕生物科技(深圳)有限公司 | 一种脐血Treg细胞的体外扩增方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007538000A (ja) * | 2004-01-08 | 2007-12-27 | リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・カリフオルニア | 制御性t細胞は自己免疫を抑制する |
CA2585462A1 (en) * | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Benaroya Research Institute At Virginia Mason | Methods of generating antigen-specific cd4+cd25+ regulatory t cells, compositions and methods of use |
WO2008144518A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | University Of Kansas | Preparation of regulatory t cells using icam-1 co-stimulation |
-
2008
- 2008-12-01 JP JP2010536216A patent/JP2011505378A/ja active Pending
- 2008-12-01 CA CA2706458A patent/CA2706458A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-01 WO PCT/US2008/085117 patent/WO2009073599A1/en active Application Filing
- 2008-12-01 BR BRPI0819975-2A patent/BRPI0819975A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-12-01 EP EP08855810A patent/EP2225365A1/en not_active Withdrawn
- 2008-12-01 MX MX2010005863A patent/MX2010005863A/es unknown
- 2008-12-01 KR KR1020107013955A patent/KR20100094997A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-12-01 CN CN2008801186087A patent/CN101970643A/zh active Pending
- 2008-12-01 US US12/325,464 patent/US20090142317A1/en not_active Abandoned
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013054470A1 (ja) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Sbiファーマ株式会社 | 移植臓器生着促進剤 |
US9314443B2 (en) | 2011-10-12 | 2016-04-19 | National Center For Child Health And Development | Enhancer of survival of transplanted organ |
US9901558B2 (en) | 2011-10-12 | 2018-02-27 | National Center For Child Health And Development | Enhancer of survival of transplanted organ |
US9937138B2 (en) | 2011-10-12 | 2018-04-10 | National Center For Child Health And Development | Enhancer of survival of transplanted organ |
JP2015513403A (ja) * | 2012-03-02 | 2015-05-14 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 同種抗原反応性の制御性t細胞を増大させる方法 |
US9399029B2 (en) | 2012-07-13 | 2016-07-26 | Sbi Pharmaceuticals Co., Ltd. | Immune tolerance inducer |
JP2016532865A (ja) * | 2013-07-31 | 2016-10-20 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | エフェクターtレグ細胞を同定するための方法及びキット |
JP2018518975A (ja) * | 2015-07-03 | 2018-07-19 | インセルム(インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル) | 制御性t細胞を得る方法およびその使用 |
US10724001B2 (en) | 2015-07-03 | 2020-07-28 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods for obtaining regulatory T cells and uses thereof |
JP2019508067A (ja) * | 2016-03-11 | 2019-03-28 | トリゼル ゲーエムベーハー | 新しい免疫調節細胞およびその製造方法 |
JP2021052774A (ja) * | 2016-03-11 | 2021-04-08 | トリゼル ゲーエムベーハー | 新しい免疫調節細胞およびその製造方法 |
JP2021526526A (ja) * | 2018-06-14 | 2021-10-07 | フォーディー ファーマ リサーチ リミテッド4D Pharma Research Limited | 細菌株を含む組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2706458A1 (en) | 2009-06-11 |
US20090142317A1 (en) | 2009-06-04 |
BRPI0819975A2 (pt) | 2015-06-16 |
CN101970643A (zh) | 2011-02-09 |
MX2010005863A (es) | 2010-06-23 |
KR20100094997A (ko) | 2010-08-27 |
WO2009073599A1 (en) | 2009-06-11 |
EP2225365A1 (en) | 2010-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2011505378A (ja) | 生体外増殖させたcd4+cd25+制御性t細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減するための方法 | |
Ezzelarab et al. | Tolerogenic dendritic cells and their role in transplantation | |
AU2018219968B2 (en) | Expansion of alloantigen-reactive regulatory t cells | |
EP1883414B1 (en) | Preventing rejection of transplanted tissue using regulatory t cells | |
US20100291678A1 (en) | Regulatory T Cells and Their Use in Immunotherapy and Suppression of Autoimmune Responses | |
Ma et al. | Adoptive transfer of CD4+ CD25+ regulatory cells combined with low-dose sirolimus and anti-thymocyte globulin delays acute rejection of renal allografts in Cynomolgus monkeys | |
Zwang et al. | Cell therapy in kidney transplantation: focus on regulatory T cells | |
US6685941B1 (en) | Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig | |
JP2021052774A (ja) | 新しい免疫調節細胞およびその製造方法 | |
Cao et al. | Ex vivo expanded human CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells prevent lethal xenogenic graft versus host disease (GVHD) | |
WO1994028912A1 (en) | Cd28 pathway immunosuppression | |
He et al. | Prolonged survival effects induced by immature dendritic cells and regulatory T cells in a rat liver transplantation model | |
Tsang et al. | The potency of allospecific Tregs cells appears to correlate with T cell receptor functional avidity | |
Alzhrani et al. | Identification, selection, and expansion of non-gene modified alloantigen-reactive Tregs for clinical therapeutic use | |
Oberholtzer et al. | Adoptive transfer of regulatory immune cells in organ transplantation | |
US20150110738A1 (en) | Methods and compositions for generating and using allogeneic suppressor cells | |
Park et al. | Effect of in vitroexpanded CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cell therapy combined with lymphodepletion in murine skin allotransplantation | |
WO2010090997A1 (en) | Method to expand ntreg cells using p70 s6 kinase antagonist | |
Luke et al. | Prolongation of allograft survival by administration of anti-CD45RB monoclonal antibody is due to alteration of CD45RBhi: CD45RBlo T-cell proportions | |
US20220204931A1 (en) | Bead-free ex-vivo expansion of human regulatory t cells | |
CA2529244C (en) | Rapamycin resistant t cells and therapeutic uses thereof | |
Blazar | Immune regulatory cell biology and clinical applications to prevent or treat acute graft-versus-host disease | |
US20020055170A1 (en) | Process for producing and multiplying lymphocytes | |
AU2004256154A1 (en) | Autologous self-tolerance inducing cells of monocytic origin and their use in pharmaceutical proparations | |
CA2251889C (en) | Process for producing and multiplying lymphocytes |