CN109072194A - 免疫细胞组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在某些实施方案中，免疫抑制细胞是调节性T细胞。另一方面，本文提供了调节性T细胞，其重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。细胞可以被抗原敏化，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。另外提供了使用这样的细胞治疗有需要的对象的免疫介导的障碍的方法。

Description

免疫细胞组合物及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月9日提交的第62/265,246号美国临时申请和2015年12月9日提交的第62/265,411号美国临时申请的权益，将其各自的全部内容以引用方式并入本文。
电子提交的序列表的引用
本申请以引用方式将序列表作为ASCII文本文件并入本申请，其标题为“13542-037-228_SL.txt”，创建于2016年12月6日，大小为59,345字节。
2.领域
本发明一般涉及免疫介导的障碍的治疗，并且更具体地涉及用于治疗免疫介导的障碍的免疫疗法。
3.背景
免疫系统具有识别和防御微生物病原体多样性同时避免自身反应性的挑战(Paul,Fundamental Immunology,第5版,Lippincott Williams&Wilkins,New York(2003))。尽管免疫系统具有防御微生物病原体的强大能力，但免疫系统也具有抑制某些免疫应答的机制，以保护宿主免受其自身免疫系统的攻击。
在用于抑制某些免疫应答的机制中，抑制细胞，也称为调节性细胞，如调节性T细胞，具有抑制(inhibit)或抑制(suppress)其他免疫细胞的能力(Paul，同上，2003)。因此，调节性T细胞为宿主提供抑制(inhibit)或抑制(suppress)其他免疫细胞的功能的活性的能力，以保护宿主免受病原体侵害。调节性T细胞在维持免疫系统对自身抗原无应答和免疫耐受的能力中发挥重要作用(Sakaguchi等人，Cell 133:775-787)。
在某些病理情况下，宿主免疫系统可以发动针对自身抗原的攻击，在这种情况下宿主可以患上自身免疫障碍。在其他情况下，例如在器官移植排斥中，宿主细胞的免疫系统会针对移植器官发动攻击，导致器官移植排斥。在其中宿主细胞的免疫系统在宿主中针对自身抗原或移植器官产生病理性免疫应答的这些情况下，期望的是宿主的免疫系统在自身免疫障碍的情况下产生对自身抗原的耐受，或在器官移植排斥的情况下产生对移植器官的抗原的耐受。
已经发现Foxp3表达在显示供者特异性耐受的同种异体移植物内特异性上调，并且在PD-L1阻断后其频率降低(Tanaka等人,J.Immunol.179:5204-5210(2007))。有趣的是，PD-1 mRNA在CD4+CD25+调节性T细胞中高度表达，表明PD-1可能参与调节性T细胞耐受的几种手段(Tanaka等人，同上，2007)。另一项研究表明，PD-1:PD-L1相互作用对于通过气管内递送同种异体抗原诱导调节性细胞是必不可少的(Aramaki等人,Transplantation 77:6-12(2004))。
已经证明，通过调节性T细胞免疫疗法的慢性同种异体移植物排斥的长期预防涉及宿主表达Foxp3的T细胞(Pasquet等人,Blood 121:4303-4310(2013))。已经描述了增强CD8+调节性T细胞抑制功能的类似方法用于增强在实体器官移植中的器官保存(Guillonneau等人,Curr.Opin.Organ Transplant 15:751-756(2010))。
当身体的免疫系统攻击并破坏健康的机体组织时，发生自身免疫障碍。这当免疫系统不区分健康组织和抗原时发生，导致针对体内细胞和组织的病理性免疫应答。T细胞运输的调节涉及趋化因子的特定模式的协同表达和T细胞膜上同源趋化因子受体的相互表达，并且趋化因子受体表达的特定模式可与自身免疫疾病中的疾病活性相关(Strazza等人,Disc.Med.19:117-125(2015))。
在患有白癜风的患者中，调节性T细胞的百分比降低并且PD-1+调节性T细胞的百分比增加(Tembhre等人,Br.J.Immunol.172:940-950(2015))。在小鼠狼疮模型中，用抗PD-1抗体治疗增强了CD4+调节性T细胞的产生，并延缓了活动性疾病早期阶段的疾病进展(Wong等人,J.Immunol.190:5402-5410(2013))。
还发现CD4(+)CXCR5(+)Foxp3(+)滤泡调节性T细胞(T(FR)细胞)抑制由CD4(+)CXCR5(+)Foxp3(-)滤泡辅助T细胞(T(FH)细胞)介导的体液免疫(Sage等人,Nat.Immunol.14:152-161(2013))。缺乏PD-1及其配体PD-L1的小鼠淋巴结中的T(FR)细胞丰度较高，且这些T(FR)细胞具有增强的抑制能力。在小鼠血液中发现了大量T(FR)细胞群，并证明血液中的T(FR)细胞归巢到淋巴结并有效地抑制体内T(FH)细胞(Sage，同上，2013)。血液中的T(FR)细胞需要通过共刺激受体CD28和ICOS进行信号转导，但被PD-1和PD-L1抑制(Sage，同上，2013)。
多发性硬化是特征在于由慢性炎症和胶质增生(瘢痕形成)引起的影响脑、视神经和脊髓的炎症和脱髓鞘区域的病症(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.2106-2113,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,第14版,pp.2409-2418,McGraw-Hill,San FranciscoCA(1998))。
1型糖尿病是其中胰腺β细胞被自身免疫攻击逐渐破坏，导致胰岛素分泌活性丧失的障碍(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1258-1277,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,第14版,pp.2060-2081,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。已从1型糖尿病患者中分离多克隆调节性T细胞，离体扩增，并在1期临床试验中向患者施用(Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015))。
类风湿性关节炎是主要影响动关节和通常其他器官的慢性全身性炎性疾病(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1459-1466,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles of Internal Medicine,第14版,pp.1880-1888,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
原发性胆汁性肝硬化是一种免疫介导的障碍，其特征在于肝内胆管的渐进性破坏和抗线粒体抗体的存在(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.791-792,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,第14版,pp.1707-1709,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
重症肌无力是其中病原性自身抗体诱导运动终板的乙酰胆碱受体(AChR)缺乏的自身免疫障碍(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.2171-2173,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,第14版,pp.2469-2472,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
白癜风是在身体孔道周围和遍及骨性隆起(膝盖、肘、手)以对称分布渐进扩大的无黑色素斑的病症(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,p.316,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,第14版,pp.316-317,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。黑素细胞不存在于白斑病斑中。在患有白癜风的患者中，观察到调节性T细胞的百分比降低并且PD-1+调节性T细胞的百分比增加(Tembhre等人,Br.J.Immunol.172:940-950(2015))。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种可产生发热、皮疹、脱发、关节炎，胸膜炎、心包炎、肾炎、贫血、白细胞减少症、血小板减少症和中枢神经系统疾病的可变组合的疾病(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1475-1483,W.B.Saunders,PhiladelphiaPA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles of Internal Medicine,第14版,pp.1874-1880,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。在鼠科狼疮模型中，用抗PD-1抗体治疗增强了CD4+调节性T细胞的产生，并在活动性疾病的早期阶段延缓了疾病进展(Wong等人,J.Immunol.190:5402-5410(2013))。
过敏性障碍，也称为超敏反应，是免疫系统识别过敏原并发动免疫应答的病症。免疫系统产生称为免疫球蛋白E(IgE)的抗体(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1408-1417,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,第14版,pp.1860-1869,McGraw-Hill,San FranciscoCA(1998))。通常用由逐渐增加剂量的过敏原组成的特异性免疫治疗(SIT)治疗过敏性障碍(Smarr等人,Crit.Rev.Immunol.33:389-414(2013))。该程序可导致对抗原的抗原特异性耐受(Smarr等人,同上,2013)。
母体免疫系统对胎儿的耐受通过涉及外周和母胎界面局部的不同免疫细胞的各种机制进行调节(Tripathi等人,Biomed.J.38:25-31(2015)；Erlebacher,Nat.Rev.13:23-33(2013)；Guerin等人,Hum.Reprod.Update 15:517-535(2009))。母体T淋巴细胞识别父系胎儿抗原，并且在妊娠期间的子宫中维持动态T细胞稳态的状态，其涉及抗原特异性调节性T细胞增殖的增加、抗原特异性效应T细胞凋亡的增加和在成功植入后对过度炎症的抑制，以确保对胎儿的耐受(Tripathi等人,同上,2015)。调节性T细胞在妊娠期间耐受性的维持中起重要作用。在女性中，调节性T细胞在蜕膜中积聚，并在妊娠早期在母体血液中升高(Guerin等人，同上，2009)。父系抗原特异性调节性T细胞的消耗和过继转移导致再吸收的调节(Tripathi等人，同上，2015)。调节性T细胞的数量不足或其功能缺陷与不孕、流产和先兆子痫相关(Guerin等人，同上，2009)。已显示PD-1/PD-L1途径在调节调节性T细胞应答在维持母胎界面的耐受性和免疫力之间的良好平衡方面发挥重要作用(Tripithi等人，同上，2015)。
阿尔茨海默氏病是由大脑区域中神经元群体的进行性和选择性变性引起的(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1992-1994,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles of Internal Medicine,第14版,pp.2348-2356,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。阿尔茨海默氏病与淀粉样蛋白斑的形成有关(Huang等人,Cell 148:1204-1222(2012))。与健康对照相比，具有轻度认知损害和阿尔茨海默氏病的患者的调节性T细胞和PD-1+调节性T细胞二者都增加(Saresella等人,J.Alzheimer’s Dis.21:927-938(2010))。PD-1-调节性T细胞，具有最强抑制能力的调节性T细胞亚群，仅在轻度认知损害患者中显著增强(Saresella等人，同上，2010)。在这些患者中，与阿尔茨海默氏病患者和健康对照二者相比，淀粉样蛋白-β-刺激的T细胞增殖减少，并且调节性T细胞介导的抑制更有效。
关节炎是一种涉及关节疼痛、僵硬和炎症或肿胀的病症。除类风湿性关节炎外，关节炎障碍包括例如骨关节炎和银屑病性关节炎。骨关节炎是以疼痛和功能限制为特征的动关节障碍(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.2171-2173,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,第14版,pp.1935-1941,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。骨关节炎的放射学特征是骨赘和关节间隙变窄，组织病理学特征是软骨完整性的改变。
银屑病性关节炎是影响银屑病患者百分比的慢性炎性关节炎(Bennett等人,Cecil Textbook of Medicine,第20版,pp.1471-1472,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci等人,Harrison’s Principles of Internal Medicine,第14版,pp.1949-1950,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。三种主要类型的银屑病性关节炎是不对称炎性关节炎、对称性关节炎和银屑病性脊柱炎。
对提供免疫介导的障碍如自身免疫障碍、器官移植排斥和其他障碍的改进的治疗的疗法存在需要。本发明的目的是满足这种需要。
4.发明概述
本发明涉及一种细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式，以及涉及使用这样的细胞的方法。
一方面，本文提供了细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在某些实施方案中，所述免疫抑制细胞是调节性T细胞。在一个具体实施方案中，所述调节性T细胞是人CD4+CD25+T细胞。在另一个具体实施方案中，所述调节性T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。在另一个具体实施方案中，所述免疫抑制细胞是滤泡调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，所述细胞是FoxP3+。在另一个具体实施方案中，所述免疫抑制细胞是调节性B细胞。在另一个实施方案中，本文提供了如上所述的免疫抑制细胞的群体。
另一方面，本文提供了人调节性T细胞的多克隆群体，该人调节性T细胞为CD4+CD25+，并且重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在一个具体实施方案中，细胞的多克隆群体包括人调节性T细胞，所述人调节性T细胞是CD127lo/-。
另一方面，本文提供了调节性T细胞，其重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在某些实施方案中，所述调节性T细胞是人CD4+CD25+T细胞。在一个具体实施方案中，所述调节性T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。在某些实施方案中，所述免疫抑制细胞是滤泡调节性T细胞。
在本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞-活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160。在一个具体实施方案中，所述抑制剂优选为PD-1。在某些实施方案中，所述抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
在如上所述的本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，所述细胞识别抗原并且被抗原敏化，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。在如上所述的本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，所述细胞还表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR结合于抗原，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。
在如上所述的本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，所述显性负性形式是包含以下的多肽：(a)免疫检查点抑制剂的细胞外结构域的至少部分，其中所述部分包含配体结合区，和(b)跨膜结构域。在如上所述的本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，其中所述共刺激信号转导结构域是显性负性形式的跨膜结构域的羧基末端。在一个具体实施方案中，显性负性形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。在表达还包含与共刺激信号转导结构域的融合的显性负性形式的免疫抑制细胞的某些实施方案中，所述细胞还表达包含共刺激信号转导结构域的CAR。在这样的细胞的某些实施方案中，显性负性形式的共刺激信号转导结构域不同于所述CAR的共刺激信号转导结构域。在一个具体实施方案中，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。在一个具体实施方案中，显性负性形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。
在表达CAR的本发明的免疫抑制细胞的某些实施方案中，免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮和过敏性障碍。在一个具体实施方案中，免疫介导的障碍是器官移植排斥。在一个具体实施方案中，所述移植器官是肺。在其中移植器官是肺的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。在一个具体实施方案中，所述移植器官是肾脏。在其中移植器官是肾脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、纤连蛋白、IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、波形蛋白、血管紧张素II-1型受体(AGTR1)、基底膜聚糖和聚集蛋白。
在一个具体实施方案中，所述移植器官是肝脏。在其中移植器官是肝脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白和V型胶原蛋白。在一个具体实施方案中，所述移植器官是心脏。在其中移植器官是心脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、心肌肌球蛋白、波形蛋白、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。在一个具体实施方案中，所述移植器官是胰腺。在其中移植器官是胰腺的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHCII类、胰岛细胞自身抗体(ICA)抗原、胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)。
在本发明的具体实施方案中，所述免疫介导的障碍是自身免疫障碍。在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是多发性硬化。在其中自身免疫障碍是多发性硬化的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自髓磷脂、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、星形胶质细胞蛋白、胶质纤维蛋白(GFAP)和S100β。在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是1型糖尿病。在其中自身免疫障碍是1型糖尿病的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自β细胞抗原、胰岛素、胰岛素B链、胰岛素原、前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶-65(GAD65)、胰岛相关抗原2、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、锌转运蛋白8(ZnT8)、胰岛抗原2(IA-2)、热休克蛋白60(HSP60)和嗜铬粒蛋白A。
在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是类风湿性关节炎。在其中自身免疫障碍是类风湿性关节炎的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自dnaJ(热休克蛋白)、瓜氨酸化波形蛋白和人软骨糖蛋白-39。在一个具体实施方案中，所述自身免疫疾病是原发性胆汁性肝硬化。在其中自身免疫障碍是原发性胆汁性肝硬化的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自线粒体组分；丙酮酸脱氢酶(线粒体)；丙酮酸脱氢酶的E2组分；支链2-酮酸脱氢酶的E2组分；2-酮戊二酸脱氢酶复合体的E2组分；二氢硫辛酰胺脱氢酶的E3结合蛋白；核组分；核蛋白sp100；核孔复合体蛋白gp120；和着丝粒。在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是重症肌无力。在其中自身免疫障碍是重症肌无力的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自乙酰胆碱受体(AChR)、水通道蛋白-4(AQP-4)、CTLA-4、ICAM、LFA-3、CD40/CD154、ICOS/ICOSL、CD52、活化T细胞的核因子(NFAT)、磷脂酶C(PLC)、CD25、Janus激酶、B细胞活化因子(BAFF)、增殖诱导配体(APRIL)、IL6R、IL17、IL12/IL23、整合蛋白和鞘氨醇受体。
在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是白癜风。在其中自身免疫障碍是白癜风的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原是黑素细胞抗原。在一个具体实施方案中，所述自身免疫障碍是狼疮，例如系统性红斑狼疮。在其中自身免疫障碍是狼疮的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自toll样受体、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、MyD88和IL-1R相关激酶(IRAK)。
在某些实施方案中，所述免疫介导的障碍是过敏性障碍。在一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原是与所述过敏性障碍相关的过敏原。
在本发明的某些实施方案中，本发明的细胞还重组表达自杀基因。在一个具体实施方案中，所述自杀基因包含可诱导的半胱天冬酶9。在本发明的某些实施方案中，所述细胞源自人。在一个具体实施方案中，所述细胞是从胎盘分离的。在一个具体实施方案中，所述细胞源自具有轻度认知损害的人。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体；药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合；和药学上可接受的载体。
又一方面，本文提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体。在另一个实施方案中，本文提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。
另一方面，本文提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合。另一方面，本文提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用包含表达显性负性形式的这样的细胞的药物组合物，所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合。在某些实施方案中，所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。
另一方面，本文提供了降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。又一方面，本文提供了降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体包括以下的过程的产物：从所述受者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
另一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。再一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在某些实施方案中，所述自身免疫障碍选自多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风和狼疮。
另一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。又一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在某些实施方案中，施用所述细胞对患者有选自以下的作用：减少特异性免疫治疗的持续时间，增加特异性免疫治疗的功效，和延长特异性免疫治疗的作用。
另一方面，本文提供了降低有需要的妊娠雌性的母胎不耐受的方法，包括向所述妊娠雌性施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从妊娠雌性的前次妊娠的胎盘分离调节性T细胞，并转导所述调节性T细胞，使得其重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在一个具体实施方案中，所述调节性T细胞是从正在接受母胎不耐受治疗的妊娠雌性的胎盘分离的。在另一个具体实施方案中，所述分离的调节性T细胞是父系抗原特异性的。
另一方面，本文提供了在具有轻度认知损害的患者中降低进展成阿尔茨海默氏病的风险的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
另一方面，本文提供了在有需要的患者中提高自身耐受性或重建对自身抗原的免疫耐受性的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述细胞是对自身抗原具有特异性(识别自身抗原)的调节性T细胞，或所述群体包括对自身抗原具有特异性(识别自身抗原)的调节性T细胞。
在本发明的方法的某些实施方案中，施用本发明的细胞是通过胸膜内施用、静脉内施用、皮下施用、结内施用、鞘内施用、腹膜内施用、颅内施用、气管内施用、关节内施用、子宫内施用、眼内施用、鼻内施用、脊柱内施用、硬膜外施用、在腱附着端部位直接施用或接施用于胸腺。在优选的实施方案中，所述施用是通过静脉内施用。
另一方面，本发明提供了治疗有需要的患者的关节炎的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述细胞或群体关节内施用或直接在关节炎关节的腱附着端部位施用。
在本发明的方法的某些实施方案中，所述细胞以每千克体重的患者、受者或妊娠雌性104至1010个细胞的剂量施用。在某些实施方案中，所述细胞或群体以每千克体重的患者、受者或妊娠雌性1x105至1x108个细胞的剂量施用。在本发明的方法的某些实施方案中，所述患者、受者或妊娠雌性是人类。
另一方面，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括从所述患者分离调节性T细胞，在细胞培养物中体外扩增所述调节性T细胞，并以治疗有效量向所述患者施用扩增的调节性T细胞，其中所述分离的调节性T细胞被转导以表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
另一方面，本发明提供了如上所述的本发明的方法，其中所述方法还包括施用重组表达嵌合抗原受体(CAR)和转换受体的免疫抑制细胞，其中所述CAR包含共刺激信号转导结构域，并且其中所述转换受体是以氨基到羧基末端顺序包含以下的融合蛋白:(i)免疫检查点抑制剂的至少细胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。在一个实施方案中，所述转换受体的共刺激信号转导结构域不同于在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR的共刺激信号转导结构域。在一个具体实施方案中，在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR的所述共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。在一个具体实施方案中，所述转换受体的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。在涉及降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法的具体实施方案中，在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。在涉及治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法的具体实施方案中，在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在涉及治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法的具体实施方案中，在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。
另一方面，本发明提供了一种降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述细胞表达显性负性形式和CAR，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，并且其中所述CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。
另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述细胞表达显性负性形式和CAR，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，并且其中所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。
另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的如上所述的本发明的细胞或群体，其中所述细胞表达显性负性形式和CAR，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，并且其中所述CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。
5.附图说明
图1A-1E显示在初始抗原刺激时，具有CD28或4-1BB共刺激的嵌合抗原受体(CAR)在体外显示等效的效应细胞因子分泌和增殖。图1A.第一代和第二代CAR。图1B.间皮素(MSLN)靶向的CAR包含单独的CD3ζ内结构域(Mz，第一代CAR)或与CD28(M28z)或4-1BB(MBBz)共刺激结构域组合的CD3ζ内结构域(第二代CAR)。具有CD28共刺激的针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR(P28z)以及表达PSMA的靶标(PSMA+)作为阴性对照包括在实验中。CYT，胞浆结构域；LS，前导序列；LTR，长末端重复序列；SA，剪接受体；SD，剪接供体；TM，跨膜。图1C-1E.CAR转导的T细胞的抗原特异性效应子功能。图1C.通过铬释放试验测量的表达MSLN的靶标(MSLN+)而不是PSMA+靶标的溶解。图1D.在CAR T细胞与MSLN+细胞共培养后，通过Luminex试验评估的4-1BB和CD28共刺激增强细胞因子分泌。图1E.在用MSLN+细胞刺激后，M28z和MBBz CAR促进稳健的T-细胞积聚。数据表示三次重复的平均值±SEM(图1C、1E)或绘制为单个点(图1D)。***P<0.001，通过学生t检验将共刺激的CAR T细胞(M28z或MBBz)与第一代受体(Mz)比较；使用Bonferroni校正来确定多次比较的显著性。
图2显示人T细胞表达Mz、M28z和MBBz CAR的有效逆转录病毒转导。(上图)显示了基因转移4天后的代表性FACS分析。在活/死染色排除非活细胞后，使用荧光扣除染色以设置阳性门限。所有实验使用具有50％至70％CAR转导效率的T细胞；T细胞群之间的转导百分比在彼此的5％以内。(下图)CD4+和CD8+ T细胞亚群二者均被有效转导。显示了门限CAR T细胞之后的CD4+和CD8+百分比。
图3A-3D显示CAR T细胞在体内抗原暴露后被耗尽，但MBBz CAR T细胞优先保持效应细胞因子分泌和细胞毒性。图3A.在胸膜内施用CAR T细胞六天后，从肿瘤和脾脏中分离M28z和MBBz CAR T细胞并进行离体抗原刺激。图3B.离体刺激时的铬释放试验显示M28z减少但MBBz细胞溶解功能持续(E:T比为1:5)。图3C.细胞因子分泌测量结果表明CAR T细胞的效应细胞因子分泌减少，但MBBz CAR T细胞能更好地保持分泌。图3D.收获的CAR T细胞的GzB、IFN-γ和IL-2表达的RT-PCR测量结果与蛋白水平测量结果良好相关。数据表示相对于未刺激的M28z CAR T细胞体外mRNA表达的倍数变化。数据表示每个条件下三个单独孔的平均值±SEM。进行学生t检验，并使用Bonferroni校正来确定多次比较的统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。结果在用于两次实验中的每一个的两个单独的小鼠同期群组中重现。在图3B-3D的每一个中，每对条形图从左到右显示M28z、MBBZ。
图4A-4E显示CAR T细胞在体外反复抗原刺激时被耗尽，但是MBBz CAR T细胞优先保留效应细胞因子分泌和体外细胞毒性，以及在体内肿瘤再激发时被耗尽。图4A.M28z和MBBz CAR T细胞二者在重复抗原刺激时保留体外增殖能力。还通过铬释放试验测试了T细胞的细胞毒性，以及通过Luminex试验测试了T细胞的细胞因子分泌(图4B-4D)。图4B.CAR T细胞在第一次刺激时显示相等的杀伤力(左图)，并在重复抗原刺激时丧失细胞溶解功能，但是通过铬释放试验测量，MBBz CAR T细胞能更好地保留细胞溶解功能(圆形，MZ；三角形，M28z；菱形，MBBz)。图4C.通过CD107a表达测量的细胞毒性颗粒释放(在第三次刺激时显示)与铬释放试验(图4B)相关。数据表示相对于未刺激的CAR T细胞的CD107a MFI的倍数变化的平均值±SD(一式三份)(每对条形图从左到右显示M28z、MBBz)。图4D.细胞因子分泌测量结果类似地显示在重复抗原遭遇时丧失CAR T-细胞效应子功能；此外，MBBz CAR T细胞能够更好地保持其功能(“Stim 1”、“Stim 2”和“Stim 3”上方的每组符号从左到右依次为Mz、M28z、MBBz)。图4E.虽然同样持久，但MBBz CAR T细胞显示优越的功能持久性。胸膜肿瘤根除28天后(在单剂量的1e5CAR T细胞后)，将1e6MSLN+肿瘤细胞注射到胸膜腔中(肿瘤再激发)。MBBz CAR T细胞阻止了所有小鼠的肿瘤生长，而在最初用M28z CAR T细胞处理的4只小鼠中，有2只观察到肿瘤生长和死亡。进行学生t检验，并使用Bonferroni校正来确定统计学显著性(*P<0.05；***P<0.001)。数据表示三次重复的平均值±SEM或绘制为单个点。
图5显示与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达更少耗尽的、更有效的表型。用重复抗原刺激扩增4-1BB-和CD28-共刺激的T细胞，并在第三次刺激20h后提取mRNA并进行RT-PCR分析。数据以相对于CD4+未转导的T细胞的mRNA表达的倍数变化表示。MBBz CART细胞表达较高水平的EOMES(脱中胚蛋白)和TBX21(T-bet)，和较低水平的PDCD1(PD-1)和FOXP3(Foxp3)。所有比较在P<0.001时均显著。结果在使用不同供者的3次独立实验中相似。每组条形图从左到右显示UT(用作对照的未转导的T细胞)、M28z、MBBz。
图6A-6F显示PD-1受体和其配体在体内上调(图6A-6D，收获的T细胞；图6E-6F，肿瘤细胞)。图6A.肿瘤浸润的M28z和MBBz CAR T细胞在其施用6天后表达抑制受体，但MBBzCAR T细胞表达更低水平的PD-1。图6B.在胸膜内施用6天后，肿瘤浸润的CAR T细胞(TIL)的PD-1受体表达的平均荧光强度(MFI)。图6C.在胸膜内施用6天后，肿瘤浸润的CAR T细胞的CD4和CD8亚群中的PD-1 mRNA的相对表达。数据以相对于未刺激的M28z T细胞的PD-1 mRNA表达的倍数变化表示(对于每对条形图，M28z，左图，MBBz，右图)。图6D.从进展中的肿瘤中分离的肿瘤浸润的M28z CAR T细胞表达抑制受体PD-1、Tim-3和Lag-3。图6E.从用M28z CART细胞处理的小鼠收获的单细胞肿瘤悬液表达高水平的PD-1结合配体。图6F.体外培养的间皮瘤肿瘤细胞表达PD-1受体的配体(PD-L1、PD-L2)，并且在与IFN-γ和TNF-α孵育24h后，表达进一步上调。
图7显示M28z和MBBz CAR T细胞共表达PD-1以及其他抑制受体。向荷胸膜肿瘤小鼠胸膜内施用6天后，收获肿瘤浸润的M28z和MBBz CAR T细胞。细胞与PD-1的抗体一起针对LAG-3(左图)或TIM-3(右图)共染色，并通过流式细胞术分析。使用同种型染色对照(上图)建立阳性门限。
图8A-8D显示PD-L1抑制CAR T-细胞效应子功能。图8A.将3T3成纤维细胞转导以单独表达间皮素(MSLN+，左图)或除了PD-L1以外共表达MSLN(MSLN+ PD-L1+，右图)。图8B-8D.在用3T3 MSLN+或MSLN+ PD-L1+靶标刺激后，评估M28z和MBBz CAR T-细胞效应子功能。PD-L1在重复抗原刺激时抑制M28z和MBBz CAR T-细胞积聚(图8B)，在用MSLN+ PD-L1+肿瘤细胞刺激两次后抑制细胞溶解功能(图8C)，并且在第一次刺激时抑制Th1效应细胞因子分泌(图8D)。数据表示三次重复的平均值±SEM或绘制为单个点。
图9A-9E显示PD-1显性负性受体(PD-1 DNR)的共转导从PD-1配体介导的体外和体内抑制拯救M28z CAR T细胞。图9A.(左图)CD28-共刺激的T细胞通过内源性PD-1受体(传递共抑制信号)或缺乏抑制信号转导结构域的共转导的PD-1 DNR结合肿瘤配体的示意图。(右图)对于体外和体内实验，用空载体(EV；SFG-mCherry)或PD-1 DNR(SFG-2A-PD-1 DNR)共转导M28z CAR T细胞。然后，分选用于mCherry表达的CAR T细胞与用IFN-γ和TNF-α处理以上调PD-1配体的MSLN+肿瘤细胞孵育24h。M28z PD-1 DNR CAR T细胞在重复抗原刺激时显示积聚的小的但统计学显著的提高(图9B；三角形，M28z EV；正方形，M28z PD-1 DNR)，在用MSLN+ PD-L1+肿瘤细胞第三次刺激时显示通过铬释放试验测量的增强的细胞溶解功能(图9C；三角形，M28z EV；正方形，M28z PD-1 DNR)，和在初始刺激时显示Th1上清液细胞因子的升高的表达(图9D)。进行学生t检验，并使用Bonferroni校正来确定多次比较的统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。数据表示三次重复的平均值±SEM或绘制为单个点。图9E.比较胸膜施用的单剂量的5e4 M28z EV(n＝19)或M28z PD-1 DNR(n＝16)的体内功效的肿瘤BLI(左图)和Kaplan-Meier生存分析(右图)。显示的数据是两次独立实验的组合。符号表示死亡。中位生存以天数显示。使用对数秩和检验(log-rank test)分析生存曲线(P＝0.001)。每次独立实验的对数秩和检验对于P<0.05水平显著；组合两次实验用于说明。尽管重复肿瘤再激发，但该实验中的小鼠同期群组(M28z PD-1 DNR)生存超过450天，表明用PD-1 DNR转导的CAR T细胞的“功能持久性”。
图10A-10E显示靶向PD-1受体的shRNA的共转导从PD-L1/PD-1介导的体外抑制拯救M28z CAR T细胞。图10A.(左图)在有或没有靶向PD-1的shRNA的共表达的情况下，CD28-共刺激的T细胞通过内源性PD-1受体结合肿瘤表达的PD-L1的示意图。(右图)所有实验均包括用两种靶向PD-1的shRNA之一(共表达dsRED报告基因的sh1或sh2)或用靶向细菌序列(KanR)的shRNA共转导的M28z CAR T细胞。图10B.与KanR-转导的细胞相比，用靶向PD-1的shRNA共转导的M28z CAR T细胞在用植物凝集素刺激时显示60％至70％的PD-1受体蛋白表达的敲低(图表从左到右对应于430、722、813和1411)。细胞与过表达PD-L1的3T3成纤维细胞(3T3 MSLN+ PD-L1+)或用IFN-γ和TNF-α处理以上调PD-L1和PD-L2的间皮瘤肿瘤细胞一起孵育。M28z PD1 shRNA CAR T细胞在重复抗原刺激时显示增强的积聚(图10C)，在低效应子与靶标比率下显示通过剩余活肿瘤细胞的荧光素酶活性测量的增强的细胞溶解功能(图10D；每组条形图从左到右为Sh1、Sh2、ShK)，和显示增加的Th1细胞因子分泌(图10E；每组条形图从左到右为Sh1、Sh2、ShK)(**P<0.01；***P<0.001)。进行学生t检验，并使用Bonferroni校正来确定多次比较的统计学显著性。数据表示三次重复的平均值±SEM。
图11显示PD-1 DNR与融合到Fc结构域的PD-L1和PD-L2重组蛋白的粘附试验。将用mCherry标记且用PD-1 DNR转导的T细胞暴露于用融合到Fc的PD-L1(“PD-L1 Fc”)、融合到Fc的PD-L2(“PD-L2 Fc”)或对照同种型Fc(“Iso Fc”)包被的板。在存在PD-1抗体(“+PD-1Ab”)或缺乏PD-1抗体的情况下，结合到板的T细胞测量为绝对mcherry+ T细胞计数。条形图从左到右显示对各包被的板中每一个的结合，从左到右为单独的T细胞(“T细胞”)、在PD-1抗体存在下的T细胞(T细胞+PD-1 ab”)、用PD-1 DNR转导的T细胞(“PD-1 DNR T细胞”)和在PD-1抗体的存在下用PD-1 DNR转导的T细胞(“PD-1 DNR T细胞+PD-1 Ab”)。
图12A-12D显示抑制PD-L1或PD-L2介导的T细胞活化的抑制的PD-1 DNR可以被转化成阳性共刺激信号。图12A显示说明CAR和PD-1 DNR的共表达的示意图。图12B显示说明CAR和PD-1 DNR的共表达的示意图，所述PD-1 DNR通过将共刺激结构域(以4-1BB为例)融合到跨膜结构域转化成共刺激构建体，所述跨膜结构域融合到PD-1的配体结合结构域。图12C显示在用M28z CAR、M28z CAR加PD-1 DNR，或M28z CAR加PD-1 4-1BB转换受体构建体转导的T细胞中，第0天和第7天的CAR T细胞的积聚。条从左到右分别为：M28z CAR、M28z CAR+PD-1 DNR和M28z CAR+PD-1 4-1BB转换受体构建体。图12D显示用M28z CAR、M28z CAR加PD-1 DNR，或M28z CAR加PD-1 4-1BB转换受体构建体转导的T细胞中的干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子分泌。条从左到右分别为：M28z CAR,M28z CAR+PD-1 DNR和M28z CAR+PD-1 4-1BB转换受体构建体。
6.发明详述
本发明涉及用于治疗免疫介导的障碍的组合物。这样的障碍包括但不限于，器官移植排斥、自身免疫障碍、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。如本文所述，免疫抑制细胞可以被基因工程改造以固有表达蛋白，所述蛋白为显性负性突变体并且抑制限制免疫抑制细胞的免疫抑制作用的阻断。通过抑制阻断，基因工程改造的免疫抑制细胞被允许提供针对免疫介导的障碍中的病理性免疫应答更有效的免疫抑制活性。
一方面，本文提供了细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。另一方面，本文提供了人调节性T细胞的群体(优选地，多克隆群体)，该人调节性T细胞的群体为CD4+CD25+，并且重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在一个具体实施方案中，所述多克隆群体是被纯化的。在一个具体实施方案中，所述多克隆群体是离体的。在一个具体实施方案中，所述多克隆群体存在于富集多克隆群体的群体中。另一方面，本文提供了调节性T细胞，所述调节性T细胞重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。另一方面，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的细胞或群体；和药学上可接受的载体。
又一方面，本文提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的细胞或群体。在某些实施方案中，所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、关节炎(例如，类风湿性关节炎或其他类型的关节炎)、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。另一方面，本文提供了在有需要的患者中提高自身耐受性或重建对自身抗原的免疫耐受性的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的细胞或群体，其中所述细胞是病理性自身抗原特异性调节性T细胞，或所述群体包含病理性自身抗原特异性调节性T细胞。另一方面，本发明提供了治疗有需要的患者的关节炎的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的细胞或群体，其中所述细胞或群体关节内施用或直接在关节炎关节的腱附着端部位施用。另一方面，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括从所述患者分离调节性T细胞，在细胞培养物中体外扩增所述调节性T细胞，并以治疗有效量向所述患者施用扩增的调节性T细胞，其中所述分离的调节性T细胞被转导以表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
6.1细胞
本发明提供了细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式(下文称为“DN形式”)，优选地免疫抑制细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在一个实施方案中，所述免疫抑制细胞识别抗原并且被抗原敏化，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性(或不期望的)免疫应答的靶标。这样的细胞可以例如从具有这样的免疫介导的障碍的患者，特别是人类患者分离。在另一个实施方案中，表达DN的免疫抑制细胞形成另外重组表达结合于抗原的CAR，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。这样的细胞可以例如从具有这样的免疫介导的障碍的患者，特别是人类患者分离。重组细胞可以用于治疗免疫介导的障碍。优选地，所述细胞源自人(在进行重组之前具有人类来源)(并且人源细胞特别优选用于在本发明的治疗方法中向人施用)。
本发明的免疫抑制细胞可以是淋巴谱系的细胞。可以用作免疫抑制细胞的淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括调节性T细胞、滤泡调节性T细胞、调节性B细胞等。本发明的免疫抑制细胞表达细胞介导的免疫应答的抑制剂，例如，免疫检查点抑制剂途径受体，例如PD-1(虽然不期望被机理束缚，但主张的是，DN形式在细胞中的表达抑制细胞介导的免疫应答的抑制剂，以促进细胞的持续活化)。
免疫抑制细胞可通过本领域熟知的方法分离，包括商业上可用的分离方法(参见例如，Rowland-Jones等人,Lymphocytes:A Practical Approach,Oxford UniversityPress,New York(1999))。其免疫抑制细胞的来源包括但不限于，外周血、脐带血、骨髓或淋巴谱系的细胞的其他来源。可以采用各种技术分离细胞以分离或富集所需的免疫抑制细胞。例如，负选择方法可用于去除不是期望免疫抑制细胞的细胞。另外，可以使用正选择方法来分离或富集期望的免疫抑制细胞，或者可以采用正选择和负选择方法的组合。单克隆抗体(MAb)对于确定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物是特别有用的，并且可以用作用于正选择和负选择二者的试剂。可以基于各种细胞表面标志物或标志物的组合，或标志物的缺乏分离特定类型的免疫抑制细胞，包括但不限于用于正选择的CD4和/或CD8与用于负选择的CD127组合，如本领域熟知的(参见Kearse,T Cell Protocols:Developmentand Activation,Humana Press,Totowa NJ(2000)；De Libero,T Cell Protocols,Methods in Molecular Biology,第514卷,Humana Press,Totowa NJ(2009)；Su等人,Methods Mol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara等人,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu等人,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki等人,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena等人,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen等人,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam等人,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam等人,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013))。在一个具体实施方案中，例如使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒分离CD4+CD25+调节性T细胞(Dynal brand,Invitrogen,Carlsbad,CA)(参见Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011))。也已经描述了调节性T细胞(iTregs)的体外产生(参见例如，Lan等人,J.Mol.Cell.Biol.4:22-28(2012)；Yamagiwa等人,J.Immunol.166:7282-7289(2001)；Zheng等人,J.Immunol.169:4183-4189(2002))。之前已经描述了用于分离可用于重组表达CAR的免疫细胞的各种方法(Sadelain等人,Nat.Rev.Cancer 3:35-45(2003)；Morgan等人,Science 314:126-129(2006)；Panelli等人,J.Immunol.164:495-504(2000)；Panelli等人,.J Immunol.164:4382-4392(2000)；Dupont等人,Cancer Res.65:5417-5427(2005)；Papanicolaou等人,Blood 102:2498-2505(2003)；MacDonald等人,J.Clin.Invest.126:1413-1424(2016))。
用于分离和扩增调节性T细胞的方法是本领域熟知的(参见例如，Su等人,MethodsMol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara等人,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu等人,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki等人,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena等人,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen等人,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam等人,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam等人,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011)；MacDonald等人,J.Clin.Invest.126:1413-1424(2016))。也已经描述了调节性T细胞(iTregs的体外产生(参见例如，J.Mol.Cell.Biol.4:22-28(2012)；Yamagiwa等人,J.Immunol.166:7282-7289(2001)；Zheng等人,J.Immunol.169:4183-4189(2002))。一般地，本发明的调节性T细胞是CD4+，例如CD4+CD25+，特别是CD4+CD127lo/-CD25+。这样的调节性T细胞表达Foxp3(叉头框P3)，该Foxp3在转录因子的叉头/翼状螺旋家族中(Bluestone等人,J.Clin.Invest.125:2250-2260(2015)；Riley等人,Immunity 30:656-665(2009))。作为本发明的免疫抑制细胞的调节性T细胞还可以是CD8+调节性T细胞(Guillonneau等人,Curr.Opin.OrganTransplant.15:751-756(2010))。用于分离和扩增调节性T细胞的方法也是商业上可得的(参见例如，BD Biosciences,San Jose,CA；STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver,Canada；eBioscience,San Diego,CA；Invitrogen,Carlsbad,CA)。本发明的免疫抑制细胞也可以是滤泡调节性T细胞(T(FR))(Sage等人,Nat.Immunol.14:152-161(2013))。在一个具体实施方案中，本发明的滤泡调节性T细胞是CD4+CXCR5+，并且表达Foxp3(Sage等人，同上，2013)。
在一些实施方案中，本发明的免疫抑制细胞是调节性B细胞。调节性B细胞具有在B细胞中产生白介素10(IL10)的独特能力(参见例如，Lykken等人,InternationalImmunol.27:471-477(2015)；Miyagaki等人,International Immunol.27:495-504(2015))。已经描述了分离调节性B细胞的方法(参见例如，Masson等人,Regulatory BCells:Methods and Protocols,Vitale和Mion编,Chapter 4,pp.45-52,Humana Press,New York(2014))。这样的方法基于表面标志物，如CD24高CD38高的表达，以及IL10的表达(Masson等人，同上，2014)。调节性B细胞的其他标志物包括CD24hiCD27+(参见Lykken等人，同上，2015)。
用于分离细胞的程序包括但不限于密度梯度离心，与改变细胞密度的颗粒偶联，用抗体包被的磁珠磁性分离，亲和层析；与单克隆抗体(mAb)结合或联合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素，和用连接到固体基质(例如，板或芯片)的抗体淘选，淘洗，流式细胞术，或任何其他方便的技术(参见例如，Recktenwald等人,Cell SeparationMethods and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1998))。应当理解，用于本发明的方法中的免疫抑制细胞可以是基本纯的或可以是多克隆群体(参见例如，Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015))。在一些实施方案中，多克隆群体可以富集期望的免疫抑制细胞。这样的富集可以在基因工程改造细胞以根据需要表达DN形式或CAR和DN形式之前或之后进行。
免疫抑制细胞对于其在本发明的治疗方法中施用的对象可以是自体的或非自体的。从待施用重组表达DN形式或CAR和DN形式的工程改造的细胞的对象中分离自体细胞。任选地，所述细胞可以通过白细胞去除术获得，其中从抽出的血液中选择性地除去白细胞，进行重组，然后回输到供者中。供选择地，可以使用来自不是对象的非自体供者的同种异体细胞。在非自体供者的情况下，如本领域所熟知的，将细胞分型并与人白细胞抗原(HLA)匹配以确定适当的相容性水平。对于自体和非自体细胞，可以任选地将细胞冷冻保存直至准备用于基因操作和/或使用本领域熟知的方法向对象施用。
在一个实施方案中，本发明提供了调节性T细胞，其识别抗原并且被抗原敏化，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标，并且所述调节性T细胞还重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式。因为这样的调节性T细胞已经是抗原特异性的以使调节性T细胞靶向抗原，所以所述细胞可以但不必表达与抗原结合的CAR，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。识别抗原并且被抗原敏化的T细胞可以通过已知方法获得，例如，从已暴露于并且正在发动与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的对象获得。用于从对象中分离抗原特异性调节性T细胞的方法是本领域熟知的(参见例如，Noyan等人,Eur.J.Immunol.44:2592-2602(2014)；Brusko等人,PLoS One5(7)e11726(doi:10.1371)(2010)；Bacher等人,Mucosal Immunol.7:916-928(2014)；Koenen等人,J.Immunol.174:7573-7583(2005))。可以使用如上所述的用于分离免疫抑制细胞的熟知技术分离抗原特异性调节性T细胞，包括但不限于流式细胞术、磁珠、固相淘选等。
在一个具体实施方案中，离体基因工程改造分离的免疫抑制细胞用于重组表达DN形式和CAR。在一个具体实施方案中，离体基因工程改造抗原特异性的分离的调节性T细胞用于重组表达DN形式。可以通过本领域熟知的方法对细胞进行基因工程改造用于重组表达。在其中从体内来源分离敏化的调节性T细胞的实施方案中，不言而喻的是对已经敏化的调节性T细胞进行基因工程改造。
免疫抑制细胞可以经受有利于维持或扩增免疫抑制细胞的条件(参见Kearse,TCell Protocols:Development and Activation,Humana Press,Totowa NJ(2000)；DeLibero,T Cell Protocols,Methods in Molecular Biology,第514卷，Humana Press,Totowa NJ(2009)；Parente-Pereira等人,J.Biol.Methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；Movassagh等人,Hum.Gene Ther.11:1189-1200(2000)；Rettig等人,Mol.Ther.8:29-41(2003)；Agarwal等人,J.Virol.72:3720-3728(1998)；Pollok等人,Hum.Gene Ther.10:2221-2236(1999)；Quinn等人,Hum.Gene Ther.9:1457-1467(1998)；Su等人,Methods Mol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara等人,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu等人,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki等人,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena等人,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen等人,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam等人,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam等人,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011)；MacDonald等人,J.Clin.Invest.126:1413-1424(2016))。免疫抑制细胞或抗原敏化的调节性T细胞可以任选地在离体基因工程改造之前或之后扩增。细胞的扩增对于增加向对象施用的细胞数量是特别有用的。用于扩增免疫抑制细胞的这样的方法在本领域是熟知的(参见Kaiser等人,Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015)；Wolfl等人,Nat.Protocols 9:950-966(2014)；Su等人,Methods Mol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone等人,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara等人,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu等人,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki等人,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena等人,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen等人,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam等人,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam等人,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011))。此外，细胞可以任选地在分离和/或基因工程改造，和/或基因工程改造的细胞扩增之后冷冻保存(参见Kaiser等人，同上，2015)。用于冷冻保存细胞的方法是本领域熟知的(参见例如，Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechniques,第4版,Wiley-Liss,New York(2000)；Harrison and Rae,GeneralTechniques of Cell Culture,Cambridge University Press(1997))。
关于产生重组表达DN形式或CAR和DN形式的细胞，使用合适的表达载体将编码DN形式或CAR和DN形式的一种或多种核酸引入免疫抑制细胞中。免疫抑制细胞(例如，调节性T细胞或调节性B细胞)优选用一种或多种编码DN形式或CAR和DN形式的核酸转导。在表达CAR和DN形式二者的情况下，编码CAR和DN形式的核酸可以根据需要在不同的载体上或在相同的载体上。例如，编码本发明的CAR或DN形式的多核苷酸可以被克隆到合适的载体，如逆转录病毒载体中，并使用熟知的分子生物学技术引入免疫抑制细胞中(参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。可以使用适用于在本发明的细胞中表达的任何载体，特别是人免疫抑制细胞。载体包含合适的表达元件，如提供免疫抑制细胞中的编码的核酸的表达的启动子。在逆转录病毒载体的情况下，细胞可以任选地被活化以提高转导效率(参见Parente-Pereira等人,J.Biol.Methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；Movassagh等人,Hum.GeneTher.11:1189-1200(2000)；Rettig等人,Mol.Ther.8:29-41(2003)；Agarwal等人,J.Virol.72:3720-3728(1998)；Pollok等人,Hum.Gene Ther.10:2221-2236(1998)；Quinn等人,Hum.Gene Ther.9:1457-1467(1998))。用于在调节性T细胞中表达多肽例如CAR的方法可以是本领域已知的任何方法，例如在Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011)中描述的。
在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒或慢病毒载体，其用于将CAR或DN形式引入免疫抑制细胞中。对于基因修饰细胞以表达CAR和/或DN形式，逆转录病毒载体通常用于转导。然而，应理解，可以使用任何合适的病毒载体或非病毒递送系统。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种兼嗜病毒细胞系，包括但不限于PA12。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人,Mol.Cell.Biol.5:431-437(1985))；PA317(Miller等人,Mol.Cell.Biol.6:2895-2902(1986))；和CRIP(Danos等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460-6464(1988))。非双嗜性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜假型化的颗粒和本领域已知的其他任何颗粒(Relander等人,Mol.Therap.11:452-459(2005))。可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞直接共培养(例如，Bregni等人,Blood 80:1418-1422(1992))，或单独用病毒上清液或用含有或不含适宜生长因子和聚合阳离子的浓缩载体原液培养(参见例如，Xu等人,Exp.Hemat.22:223-230(1994)；Hughes,等人J.Clin.Invest.89:1817-1824(1992))。
通常，选择的载体表现出高感染效率以及稳定整合和表达(参见例如，Cayouette等人,Human Gene Therapy 8:423-430(1997)；Kido等人,Current Eye Research 15:833-844(1996)；Bloomer等人,J.Virol.71:6641-6649(1997)；Naldini等人,Science 272:263267(1996)；和Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319-10323(1997))。可以使用的其它病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体，牛痘病毒，牛乳头瘤病毒源性载体或疱疹病毒，如EB病毒(参见例如，Miller,Hum.Gene Ther.1(1):5-14(1990)；Friedman,Science 244:1275-1281(1989)；Eglitis等人,BioTechniques 6:608-614(1988)；Tolstoshev等人,Current Opin.Biotechnol.1:55-61(1990)；Sharp,Lancet 337:1277-1278(1991)；Cornetta等人,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.36:311-322(1989)；Anderson,Science 226:401-409(1984)；Moen,Blood Cells 17:407-416(1991)；Miller等人,Biotechnology 7:980-990(1989)；Le Gal La Salle等人,Science 259:988-990(1993)；和Johnson,Chest 107:77S-83S(1995))。逆转录病毒载体得到特别好的开发，并且已经被用于临床环境中(Rosenberg等人,N.Engl.J.Med.323:370(1990)；Anderson等人，第5,399,346号美国专利)。
对于表达本发明的CAR和/或DN形式的特别有用的载体包括已经用于人类基因治疗的载体。在一个非限制性实施方案中，载体是逆转录病毒载体。已经描述了逆转录病毒载体用于在T细胞或其他免疫细胞，包括工程改造的CAR T细胞中表达的用途(参见Scholler等人,Sci.Transl.Med.4:132-153(2012；Parente-Pereira等人,J.Biol.Methods 1(2):e7(1-9)(2014)；Lamers等人,Blood 117(1):72-82(2011)；Reviere等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6733-6737(1995))。在一个实施方案中，载体是SGF逆转录病毒载体，如SGFγ-逆转录病毒载体，其为基于莫洛尼鼠白血病的逆转录病毒载体。之前已经描述了SGF载体(参见例如，Wang等人,Gene Therapy 15:1454-1459(2008))。
本发明的载体使用合适的启动子以在特定宿主细胞中表达。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。在一个具体实施方案中，表达载体的启动子在免疫抑制细胞，如调节性T细胞或调节性B细胞中提供表达。也可以使用非病毒载体，只要载体含有用于在免疫抑制细胞中表达的合适的表达元件即可。一些载体，如逆转录病毒载体，可以整合到宿主基因组中。如果需要，可通过同源重组等，使用诸如核酸酶，转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和/或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)等技术实施靶向整合(Gersbach等人,Nucl.Acids Res.39:7868-7878(2011)；Vasileva,等人Cell DeathDis.6:e1831.(Jul 23 2015)；Sontheimer,Hum.Gene Ther.26(7):413-424(2015))。
载体和构建体可以任选地被设计以包含报告基因。例如，载体可以被设计成表达报告蛋白，所述报告蛋白可以用于确定包含载体或载体上提供的核酸(如已经整合到宿主染色体中的核酸)的细胞。在一个实施方案中，报告基因可以表达为具有CAR或DN形式的双顺反子或多顺反子表达构建体。示例性的报告蛋白包括但不限于，荧光蛋白，如mCherry；绿色荧光蛋白(GFP)；蓝色荧光蛋白，例如EBFP、EBFP2、Azurite和mKalama1；青色荧光蛋白，例如ECFP、Cerulean和CyPet；和黄色荧光蛋白，例如YFP、Citrine、Venus和YPet。在另外的实施方案中，载体构建体可以包含P2A序列，其提供报告基因分子的任选的共表达。P2A是自切割肽序列，其可用于蛋白序列的双顺反子或多顺反子表达(参见Szymczak等人,ExpertOpin.Biol.Therapy 5(5):627-638(2005))。
可以使用常规分子生物学技术，用试验确定CAR和/或DN形式的转导效率。如果构建体中包括标志物，如荧光蛋白，则可以通过定量转导的(例如GFP+)免疫抑制细胞如调节性T细胞或调节性B细胞的分数的FACS分析，和/或通过定量PCR来监测基因转移效率。
如果需要，可以对编码用于基因工程改造本发明的细胞的多肽(如DN形式或CAR)的核酸进行密码子优化以提高免疫抑制细胞中的表达效率。密码子优化可用于在给定细胞中实现更高水平的表达。蛋白表达的不同阶段涉及的因素包括密码子适应性、mRNA结构和转录和翻译中的各种顺式元件。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术来修饰编码多肽的多核苷酸。这样的密码子优化方法是熟知的，包括商业上可获得的密码子优化服务，例如，OptimumGeneTM(GenScript；Piscataway,NJ)、Encor优化(EnCorBiotechnology；Gainseville FL)、Blue Heron(Blue Heron Biotech；Bothell,WA)，等等。任选地，可以基于不同的算法进行多个密码子优化，并且优化结果被混杂以产生编码多肽的密码子优化的核酸。
可以向本发明的免疫抑制细胞引入另外的修饰。例如，可以修饰细胞以解决免疫学并发症和/或通过CAR靶向表达相同靶抗原的非靶组织。例如，可以将自杀基因引入细胞中以在需要时提供细胞的消耗。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、可诱导的半胱天冬酶9自杀基因(iCasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。向已经施用包含自杀基因的细胞的对象施用药剂以促进细胞死亡，包括但不限于用于hsv-tk的更昔洛韦(GCV)(Greco等人,Frontiers Pharmacol.6:95(2015)；Barese等人,Mol.Therapy 20:1932-1943(2012))，用于iCasp-9的AP1903(Di Stasi等人,N.Engl.J.Med.365:1673-1683(2011))，和用于EGFRt的西妥昔单抗(第8,802,374号美国专利)。在一个实施方案中，施用设计成活化自杀基因的前药，例如，可以活化iCasp-9的前药如AP1903，触发自杀基因活化的细胞的细胞凋亡。在一个实施方案中，iCasp9由具有F36V突变的人FK506-结合蛋白序列(FKBP12；GenBank号，AH002818(AH002818.1，M92422.1，GI:182645；AH002818.2，GI:1036032368))组成，所述F36V突变通过Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQID NO:28)接头连接到编码人半胱天冬酶9的基因(CASP9；GenBank号，NM001229(NM_001229.4,GI:493798577))，所述iCasp9的内源性半胱天冬酶活化和募集结构域缺失。FKBP12-F36V以高亲和力结合于在其他方面生物惰性的小分子二聚化试剂AP1903。在AP1903的存在下，iCasp9前分子(promolecule)二聚化并活化内在的凋亡途径，导致细胞死亡(Di Stasi等人,N.Engl.J.Med.365:1673-1683(2011))。在另一个实施方案中，自杀基因是EGFRt多肽。EGFRt多肽可通过施用抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗为细胞消除做准备。自杀基因可以在单独的载体上表达，或任选地在编码CAR或DN形式的载体内表达，并且可以是与编码CAR或DN形式的核酸连接的双顺反子或多顺反子构建体。
6.2嵌合抗原受体(CAR)
由本发明的细胞重组表达的CAR具有结合抗原的抗原结合结构域，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。在具体实施方案中，CAR可以是“第一代”、“第二代”或“第三代”CAR(参见例如，Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade等人,CancerRes.65:9080-9088(2005)；Maher等人,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw等人,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,Curr.Opin.Immunol.21(2):215-223(2009)；Hollyman等人,J.Immunother.32:169-180(2009))。
“第一代”CAR通常由细胞外抗原结合结构域构成，例如，与跨膜结构域融合的单链可变片段(scFv)，所述跨膜结构域与T细胞受体链的胞浆/细胞内结构域融合。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其是来自内源性T细胞受体(TCR)的信号的主要递质(参见图1A中的示例性第一代CAR)。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别并通过其单个融合分子中的CD3ζ链信号转导结构域引起T细胞活化，而不依赖于HLA介导的抗原呈递。用于本发明的“第二代”CAR包含与能够活化免疫抑制细胞的细胞内信号转导结构域融合的抗原结合结构域和设计用于增强免疫细胞(如T细胞)效力和持久性的共刺激结构域(Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。因此，CAR设计可以将抗原识别与信号转导结合，这两种功能在生理上由两种独立的复合物TCR异二聚体和CD3复合物承担。“第二代”CAR包括来自CAR的胞质尾区中的各种共刺激分子的细胞内结构域，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40等，以向细胞提供另外的信号(参见图1A中的示例性第二代CAR)。“第二代”CAR既例如通过CD28或4-1BB结构域提供共刺激，又例如通过CD3ζ信号转导结构域提供活化。“第三代”CAR例如通过包含CD28和4-1BB结构域二者提供多种共刺激，以及例如通过包含CD3ζ活化结构域提供活化。
在本文公开的实施方案中，CAR通常包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，如上所述，其中细胞外抗原结合结构域结合于抗原，所述抗原为与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。在特定的非限制性实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。
如本文所公开的，本发明的方法涉及施用细胞，所述经过工程改造以表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式(“DN形式”)或共表达抑制剂的DN形式和结合抗原的CAR，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。CAR的细胞外抗原结合结构域通常源自单克隆抗体(mAb)或或源自受体或其配体。
CAR的设计在本领域中是熟知的(参见例如，Sadelain等人的综述,CancerDiscov.3(4):388-398(2013)；Jensen等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)，和其中引用的参考文献)。可以使用熟知的用于设计CAR的方法产生针对期望抗原的CAR，包括本文所述的那些。通过将抗原结合活性(例如针对抗原的scFv抗体)与免疫细胞信号转导结构域(如T细胞受体胞浆/细胞内结构域)融合，可以容易地设计CAR，无论是第一代、第二代还是第三代CAR。如上所述，CAR通常具有细胞表面受体的结构，其具有抗原结合活性，例如scFv，作为细胞外结构域的至少一部分，与跨膜结构域融合，所述跨膜结构域与在免疫抑制细胞中具有细胞信号转导活性的细胞内结构域融合。CAR可以包括共刺激分子，如本文所述。本领域技术人员可以容易地选择如本文所述和本领域已知的合适的跨膜结构域，以及细胞内结构域，以在本发明的免疫抑制细胞中提供期望的信号转导能力。
用于本发明的CAR包含细胞外结构域，其包括结合抗原的抗原结合结构域，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。这样的抗原结合结构域通常源自抗体。在一个实施方案中，抗原结合结构域可以是scFv或Fab，或抗体的任何合适的抗原结合片段(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。许多抗体或源自结合期望抗原的抗体的抗原结合结构域是本领域已知的。供选择地，可通过常规方法产生这样的抗体或抗原结合结构域。产生抗体的方法是本领域熟知的，包括产生单克隆抗体或筛选文库以获得抗原结合多肽的方法，包括筛选人Fab的文库的方法(Winter和Harris,Immunol.Today14:243-246(1993)；Ward等人,Nature 341:544-546(1989)；Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Hilyard等人,Protein Engineering:A practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck,AntibodyEngineering,第2版，(Oxford University Press 1995)；Huse等人,Science 246:1275-1281(1989))。对于CAR，源自抗体的抗原结合结构域根据需要可以是人的、人源化的、嵌合的，CDR-移植的等。例如，如果小鼠单克隆抗体是用于产生CAR的抗原结合结构域的源抗体，则可以通过将小鼠抗体的CDR移植到人框架上来人源化该抗体(参见Borrabeck，同上，1995)，其可以有利于向人对象施用CAR。在优选的实施方案中，抗原结合结构域是scFv。scFv的产生在本领域中是熟知的(参见例如，Huston,等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Ahmad等人,Clin.Dev.Immunol.2012:ID980250(2012)；第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号美国专利；和第20050196754号和第20050196754号美国专利公开)。
关于获得抗原结合活性，本领域技术人员可以使用任何熟知的用于产生和筛选如本文所述的结合于期望抗原的抗体的方法，容易地获得合适的抗原结合活性，如抗体，所述方法包括产生结合于抗原的scFv，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标，这在CAR中是特别有用的。此外，许多抗体，特别是针对表1中列出的靶抗原的单克隆抗体，是可商购的，并且还可以用作抗原结合活性的来源，例如scFv，以产生CAR。
作为使用源自抗体的抗原结合结构域的供选择方案，CAR细胞外结构域可以包含配体或受体的细胞外配体结合结构域(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8:337-350(2015))。在该情况下，配体或受体的细胞外配体结合结构域为CAR提供使表达CAR的细胞靶向相应受体或配体的能力。选择配体或细胞外配体结合结构域，使得表达CAR的细胞靶向期望的作用位点，如靶组织(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8:337-350(2015)，和其中引用的参考文献)。在本发明的一个实施方案中，选择配体或细胞外配体结合结构域以结合作为相应受体或配体的抗原(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。
对于针对抗原的CAR，选择CAR的抗原结合结构域以结合在靶细胞上或在与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答部位表达的抗原。这样的抗原可以在靶细胞上独特地表达，或者抗原可以相对于非靶细胞或组织在靶细胞中过表达。选择将被CAR结合的靶抗原以提供优于非靶细胞或组织的表达CAR的细胞的靶向。在用于治疗障碍的本发明方法的一个实施方案中，免疫抑制细胞被设计成通过在细胞中表达如本文所述的CAR以及DN形式来治疗患者，所述CAR结合于合适的抗原以靶向患者中的期望位点。
可以基于待治疗的障碍的类型选择任何合适的靶抗原。应理解，所选择的靶抗原以这样的方式表达，使得抗原可被CAR结合。通常，将由表达CAR的细胞靶向的抗原在靶细胞的细胞表面上表达，或者是由于在与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答部位的细胞溶解而变得可用的细胞内抗原。应理解，任何可与CAR结合的靶抗原都适合于将表达CAR的细胞靶向靶细胞或靶位点。下表1中提供了作为与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标的示例性抗原以及示例性障碍。
表1.免疫介导的障碍和作为与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标的抗原
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合适的抗原包括但不限于表1中描述的或本领域已知的那些(参见表1的参考文献1-11，和例如，Snir等人,Arthritis Rheum.63:2873-2883(2011)；Yamagiwa等人,WorldJ.Gastroenterol.20:2606-2612(2014)；Mallone等人,Clin.Develop.Immunol.2011:513210(doi:10.1155/2011/513210)(2011)；Pihoker等人,Diabetes 54:Suppl 2:S52-61(2005))。应理解，靶向与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的这些或其他抗原可用于与CAR一起靶向抗原。
如上所述，CAR还包含在表达CAR的其免疫抑制细胞中起作用的信号转导结构域。这样的信号转导结构域可以例如，源自CDζ或Fc受体γ(参见Sadelain等人,CancerDiscov.3:388-398(2013))。通常，信号转导结构域将在本发明的转导的免疫抑制细胞中诱导持久性、运输和/或效应子功能(Sharpe等人,Dis.Model Mech.8:337-350(2015)；Finney等人,J.Immunol.161:2791-2797(1998)；Krause等人,J.Exp.Med.188:619-626(1998))。在CDζ或Fc受体γ的情况下，信号转导结构域对应于相应多肽的细胞内结构域，或对应于足以进行信号转导的细胞内结构域的片段。以下更详细地描述示例性信号转导结构域。
本文参考GenBank号、GI号和/或SEQ ID NOS描述了示例性多肽。应理解，本领域技术人员可以通过参考序列来源容易地确定同源序列，所述序列来源包括但不限于GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和EMBL(embl.org/)。
CD3ζ.在一个非限制性实施方案中，CAR可以包含源自CD3ζ多肽的信号转导结构域，例如，源自CD3ζ的细胞内结构域的信号转导结构域，其可以活化或刺激本发明的免疫抑制细胞。CD3ζ包含3个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，并且在抗原结合后将活化信号传递给细胞，例如淋巴谱系的细胞，如T细胞。CD3ζ多肽可以具有对应于具有GenBank号NP_932170(NP_932170.1，GI:37595565；见下文)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CD3ζ多肽具有以下提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164的氨基酸序列或其片段，其对于信号转导活性是足够的。示例性CAR是Mz，其具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，所述CD3ζ多肽包含以下提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164。另一种示例性CAR是M28z，其具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，所述CD3ζ多肽包含以下提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164。又一种示例性CAR是MBBz，其具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，所述CD3ζ多肽包含以下提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164。再一种示例性CAR是P28z，其具有源自CD3ζ多肽的细胞内结构域。参见GenBank NP_932170以参考CD3ζ内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至30；跨膜结构域，氨基酸31至51；细胞内结构域，氨基酸52至164。
应理解，“CD3ζ核酸分子”是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，编码包含在CAR的细胞内结构域中的CD3ζ多肽的CD3ζ核酸分子包含如下所示的核苷酸序列，所述CAR包括示例性CAR、Mz、M28z或MBBz。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTC
TATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGC
CGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAAT
GAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGC
CGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACC
TACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:2)
在某些非限制性实施方案中，CAR的细胞内结构域还可以包含至少一个共刺激信号转导结构域。这样的共刺激信号转导结构域可以提供免疫抑制细胞的增加的活化。共刺激信号转导结构域可以源自CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP10多肽、2B4多肽等。之前已经描述了包含细胞内结构域的CAR，所述细胞内结构域包含共刺激信号转导区，包括4-1BB，ICOS或DAP-10(参见U.S.7,446,190，其通过引用并入本文，其还描述了4-1BB、ICOS和DAP-10的代表性序列)。在一些实施方案中，CAR的细胞内结构域可以包含共刺激信号转导区，所述共刺激信号转导区包含两种共刺激分子，如CD28和4-1BB(参见Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398(2013))，或CD2和OX40，或如本文所公开的共刺激配体的其他组合。
CD28.分化簇28(CD28)是在T细胞上表达的蛋白，其为T细胞活化和存活提供共刺激信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。在一个实施方案中，CAR可以包含源自CD28的共刺激信号转导结构域。例如，如本文所公开的，CAR可以包括CD28的细胞内/胞浆结构域的至少一部分，例如可以充当共刺激信号转导结构域的细胞内/胞浆结构域(参见图1B)。CD28多肽可以具有对应于下文提供的具有GenBank号P10747(P10747.1,GI:115973)或NP_006130(NP_006130.1,GI:5453611)的序列的氨基酸序列或其片段。如果需要，除了细胞内结构域以外的CD28序列可以包括在本发明的CAR中。例如，CAR可以包含CD28多肽的跨膜区。在一个实施方案中，CAR可具有包含CD28的细胞内结构域的氨基酸序列或其片段，所述CD28的细胞内结构域对应于CD28的氨基酸180至220。在另一个实施方案中，CAR可具有包含CD28的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段，所述CD28的跨膜结构域对应于氨基酸153至179。M28z是示例性CAR，其包含对应于CD28的细胞内结构域的共刺激信号转导结构域(参见图1B)。M28z还包含源自CD28的跨膜结构域(参见图1B)。因此，M28z例示了包含来自CD28的两个结构域的CAR，所述两个结构域为共刺激信号转导结构域和跨膜结构域。在一个实施方案中，CAR具有包含CD28的跨膜结构域和细胞内结构域的氨基酸序列，并且包含CD28的氨基酸153至220。在另一个实施方案中，CAR以M28z CAR为例，并且包含CD28的氨基酸117至220。具有CD28的跨膜结构域和细胞内结构域的另一个示例性CAR是P28z(参见图1B)。在一个实施方案中，CAR可包含源自CD28多肽的跨膜结构域，所述CD28多肽包含下文提供的CD28多肽的氨基酸153至179。参见GenBank NP_006130以参考CD28内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至18；细胞外结构域，氨基酸19至152；跨膜结构域，氨基酸153至179；细胞内结构域，氨基酸180至220。应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的CD28的序列。
应理解，“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，编码包含跨膜结构域和细胞内结构域(例如共刺激信号转导区)的M28z的CD28多肽的CD28核酸分子包含如下所示的核苷酸序列。
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATC
CATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTT
TGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCC
TTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAAC
ATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGC
GACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:4)
4-1BB.4-1BB，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9，可充当肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。在一个实施方案中，CAR可包含源自4-1BB的共刺激信号转导结构域。4-1BB多肽可具有对应于具有GenBank号P41273(P41273.1,GI:728739)或NP_001552(NP_001552.2,GI:5730095)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可以具有共刺激结构域，其包含对应于氨基酸214至255的4-1BB的细胞内结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有对应于氨基酸187至213的4-1BB的跨膜结构域或其片段。示例性CAR是MBBz，其具有包含4-1BB多肽的细胞内结构域(例如，NP_001552的氨基酸214至255，SEQ IDNO:5)(参见图1B)。参见GenBank NP_001552以参考4-1BB内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至17；细胞外结构域，氨基酸18至186；跨膜结构域，氨基酸187至213；细胞内结构域，氨基酸214至255。应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的4-1BB的序列。还应理解，“4-1BB核酸分子”是指编码4-1BB多肽的多核苷酸。
OX40.OX40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4前体或CD134，是TNFR-受体超家族的成员。在一个实施方案中，CAR可以包含源自OX40的共刺激信号转导结构域。OX40多肽可以具有对应于下文提供的具有GenBank号P43489(P43489.1,GI:1171933)或NP_003318(NP_003318.1,GI:4507579)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可以具有共刺激结构域，其包含对应于氨基酸236至277的OX40的细胞内结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有氨基酸序列，其包含对应于OX40的氨基酸215至235的OX40的跨膜结构域或其片段。参见GenBank NP_003318以参考OX40内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至28；细胞外结构域，氨基酸29至214；跨膜结构域，氨基酸215 to 235；细胞内结构域，氨基酸236至277。应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的OX40的序列。还应理解，“OX40核酸分子”是指编码OX40多肽的多核苷酸。
ICOS.可诱导T-细胞共刺激分子前体(ICOS)，也称为CD278，是在活化T细胞上表达的CD28-超家族共刺激分子。在一个实施方案中，CAR可以包含源自ICOS的共刺激信号转导结构域。ICOS多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank号NP_036224(NP_036224.1,GI:15029518)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有共刺激结构域，其包含对应于ICOS的氨基酸162至199的ICOS的细胞内结构域。在另一个实施方案中，CAR可具有氨基酸序列，其包含对应于ICOS的氨基酸141至161的ICOS的跨膜结构域或其片段。参见GenBank NP_036224以参考ICOS内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至20；细胞外结构域，氨基酸21至140；跨膜结构域，氨基酸141至161；细胞内结构域，氨基酸162至199。应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的ICOS的序列。还应理解，“ICOS核酸分子”是指编码ICOS多肽的多核苷酸。
DAP10.DAP10，也称为造血细胞信号转导蛋白，是与造血细胞中的受体大家族相关的信号转导亚基。在一个实施方案中，CAR可以包含源自DAP10的共刺激结构域。DAP10多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank号NP_055081.1(GI:15826850)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可以具有共刺激结构域，其包含对应于氨基酸70至93的DAP10的细胞内结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可以具有对应于氨基酸49至69的DAP10的跨膜结构域或其片段。参见GenBank NP_055081.1以参考DAP10内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至19；细胞外结构域，氨基酸20至48；跨膜结构域，氨基酸49至69；细胞内结构域，氨基酸70至93。应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的DAP10的序列。还应理解，“DAP10核酸分子”是指编码DAP10多肽的多核苷酸。
CAR的细胞外结构域可以与引导初生蛋白进入内质网并随后转运至细胞表面的前导序列或信号肽融合。应理解，一旦包含信号肽的多肽在细胞表面表达，信号肽通常在内质网中加工多肽并转运至细胞表面期间被蛋白水解除去。因此，诸如CAR的多肽通常在细胞表面表达为缺乏信号肽的成熟蛋白，而多肽的前体形式包括信号肽。如果要将CAR糖基化和/或锚定在细胞膜中，则信号肽或前导序列可能是必需的。信号序列或前导序列是通常存在于新合成的蛋白质的N-末端的肽序列，其引导所述新合成的蛋白质进入分泌途径。信号肽与作为融合蛋白的CAR的细胞外抗原结合结构域的N-末端共价连接。在一个实施方案中，信号肽包含含有氨基酸MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:9)的CD8多肽。应理解，CD8信号肽的用途是示例性的。如本领域熟知的任何合适的信号肽可以应用于CAR以在免疫抑制细胞中提供细胞表面表达(参见Gierasch Biochem.28:923-930(1989)；von Heijne,J.Mol.Biol.184(1):99–105(1985))。特别有用的信号肽可以源自免疫抑制细胞中天然表达的细胞表面蛋白，包括本文公开的多肽的信号肽中的任一种。因此，可以使用任何合适的信号肽来引导CAR在免疫抑制细胞的细胞表面表达。
在某些非限制性实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域可以包含连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区的接头序列或肽接头。在一个非限制性实例中，接头包含具有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)中所示的序列的氨基酸。
在某些非限制性实施方案中，CAR还可以包含将CAR的结构域彼此连接的间隔区或序列。例如，间隔区可以包含在信号肽和抗原结合结构域之间，在抗原结合结构域和跨膜结构域之间，在跨膜结构域和细胞内结构域之间，和/或在细胞内结构域内的结构域之间，例如，在刺激域和共刺激域之间。间隔区可以是足够灵活的以允许各结构域与其他多肽的相互作用，例如，以允许抗原结合结构域具有取向灵活性以促进抗原识别。间隔区可以是例如，来自IgG的铰链区，免疫球蛋白的CH2CH3(恒定)区，和/或CD3(分化簇3)的部分，或适合作为间隔区的一些其他序列。
CAR的跨膜结构域通常包含跨越膜的至少一部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。在抗原识别后，受体聚集并将信号传递给细胞。在一个实施方案中，CAR的跨膜结构域可以源自CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA或在免疫抑制细胞中表达的具有跨膜结构域的其他多肽，包括本文公开的其他多肽。任选地，跨膜结构域可以源自不在免疫抑制细胞中天然表达的多肽，只要跨膜结构域可以在将信号从结合于CAR的抗原转导到细胞内信号转导和/或共刺激结构域中起作用。应理解，包含多肽的跨膜结构域的多肽的部分可以根据需要包含来自多肽的另外的序列，例如，邻近跨膜结构域的N-末端或C-末端的另外的序列，或多肽的其他区域。
CD8.分化簇8(CD8)是跨膜糖蛋白，其充当T细胞受体(TCR)的共同受体。CD8结合于主要组织相容性复合物(MHC)分子，并且对I类MHC蛋白具有特异性。在一个实施方案中，CAR可以包含源自CD8的跨膜结构域。CD8多肽可以具有对应于下文提供的具有GenBank号NP_001139345.1(GI:225007536)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可以具有包含对应于氨基酸183至203或其片段的CD8的跨膜结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，示例性CAR是Mz，其具有源自CD8多肽的跨膜结构域(参见图1B)。在另一个实施方案中，示例性CAR是MBBz，其具有源自CD8多肽的跨膜结构域(参见图1B)。在一个非限制性实施方案中，CAR可以包含源自包含氨基酸183至203的CD8多肽的跨膜结构域。此外，CAR可以包含铰链结构域，其包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137-182。在另一个实施方案中，CAR可包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137-203。在又一个实施方案中，CAR可以包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137至209。参见GenBank NP_001139345.1以参考CD8内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至182；跨膜结构域氨基酸，183至203；细胞内结构域，氨基酸204至235。应理解，如果需要，可以在CAR中包含氨基酸183至203的跨膜结构域以外的CD8的另外的序列。还应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的CD8的序列。还应理解，“CD8核酸分子”是指编码CD8多肽的多核苷酸。
CD4.分化簇4(CD4)，也称为T细胞表面糖蛋白CD4，是在免疫细胞表面上发现的糖蛋白，所述免疫细胞如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。在一个实施方案中，CAR可包含源自CD4的跨膜结构域。CD4以各种同种型存在。应理解，可选择任何同种型以实现期望功能。示例性同种型包括同种型1(NP_000607.1,GI:10835167)、同种型2(NP_001181943.1,GI:303522479)、同种型3(NP_001181944.1,GI:303522485；或NP_001181945.1,GI:303522491；或NP_001181946.1,GI:303522569)等等。下面提供一种示例性同种型序列，同种型1。在一个实施方案中，CAR可以具有氨基酸序列，其包含对应于氨基酸397至418的CD4的跨膜结构域或其片段。参见GenBank NP_000607.1以参考CD4内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至25；细胞外结构域，氨基酸26至396；跨膜结构域氨基酸，397至418；细胞内结构域，氨基酸419至458。应理解，如果需要，可以在CAR中包含氨基酸397至418的跨膜结构域以外的CD4的另外的序列。还应理解，如果需要，可以在CAR中包含比具体描述的结构域更短或更长的CD4的序列。还应理解，“CD4核酸分子”是指编码CD4多肽的多核苷酸。
如本文所公开的，间皮素CAR例示了可以靶向抗原的CAR，并且可以使用类似的方法和本领域熟知的其他方法产生针对其他抗原的CAR，如上所述。应当理解，本文所述多肽的结构域可用于CAR中，可用于提供期望功能，如信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域和/或共刺激结构域。例如，可以根据需要选择结构域，如信号肽、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域或其他结构域，以向本发明的CAR提供特定功能。可能的期望功能可以包括但不限于提供信号肽和/或跨膜结构域。
6.3.细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式
根据本发明，免疫抑制细胞被工程改造成表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式(DN形式)。已经显示PD-1活化抑制调节性T细胞的抑制功能(Amaranth等人,Sci.Transl.Med.3(111)(111ra120.doi:10.1126/scitranslmed.3003130)(2011))。细胞介导的免疫应答的抑制剂(如PD-1或本文公开的另一种抑制剂)的DN形式可以被转导到免疫抑制细胞，如本文公开的调节性T细胞或其他免疫抑制细胞，以增强抗原特异性或非特异性免疫抑制应答。如本文所述，用细胞介导的免疫应答的抑制剂(如PD-1)的DN形式转导的细胞可以具有增强的免疫抑制作用，其可以使患有许多免疫介导的障碍的患者受益。这样的免疫介导的障碍如本文所述，并且包括但不限于，器官移植排斥，自身免疫障碍，多发性硬化，1型糖尿病，关节炎，包括类风湿性关节炎或其他形式的关节炎，原发性胆汁性肝硬化，重症肌无力，白癜风，狼疮，过敏性障碍，母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式的本发明的免疫抑制细胞可以容易地转化到临床。在不受特定机制或理论的束缚的情况下，本发明的免疫抑制细胞可以向患有免疫介导的障碍的患者施用而不增加毒性，因为DN形式简单地结合(消耗)由对应于抑制剂分子(例如，在PD-1的情况下为PD-L1)的配体诱导的负信号，并且避免下游信号转导。
免疫抑制细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂是指起到抑制(inhibit)或抑制(suppress)由免疫抑制细胞产生的免疫应答的作用的分子。在一个实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂，也称为检查点阻断。
在一个实施方案中，本发明提供了免疫抑制细胞，其共表达CAR和免疫抑制细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式，例如，在免疫检查点抑制剂途径中起作用的受体。免疫检查点途径是抑制免疫抑制细胞的免疫应答的抑制途径。该途径向免疫抑制细胞递送负信号并减弱TCR介导的信号，导致减少的细胞增殖、细胞因子产生和细胞周期进展(参见Pardoll,Nat.Rev.12:252-264(2012)；Wu等人,Int.J.Biol.Sci.8:1420-1430(2012))。免疫检查点抑制剂途径通常涉及配体-受体对。示例性免疫检查点抑制剂途径受体包括例如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG-3、CD160、TIGIT、LAIR1、2B4等(参见Chen等人,Nat.Rev.Immunol.13(4):227-242(2013))。这些受体的相应配体包括例如，PD-L1(对于PD-1)；PD-L2(对于PD-1)；CD80,CD86(对于CTLA-4)；HVEM(对于BTLA)；半乳糖凝集素-9，HMGB1(对于TIM-3)；MHC II(对于LAG-3)；HVEM(对于CD160)；CD155、CD112、CD113(对于TIGIT)；C1q，胶原蛋白(对于LAIR1)；CD48(对于2B4)等等(Chen等人，同上，2013)。DN形式在免疫抑制细胞中的表达提供细胞固有的检查点抑制剂途径的抑制。
通过使受体的一些部分缺失以阻止细胞内信号转导，从而抑制免疫检查点途径并维持免疫抑制细胞的活化，可以产生细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式，其为细胞表面受体，如免疫检查点抑制剂途径受体。在一个具体实施方案中，本发明的DN形式是包含以下的多肽：(a)免疫检查点抑制剂的细胞外结构域的至少部分，其中所述部分包含配体结合区，和(b)跨膜结构域，其中所述多肽是免疫检查点抑制剂的显性负性形式。通常，免疫检查点抑制剂途径受体的抑制剂的DN形式保留受体的大部分或全部细胞外结构域，使得细胞外结构域保留足够的结合其相应配体的蛋白相互作用活性。因此，在一个具体实施方案中，编码DN形式的多肽包含免疫检查点抑制剂的基本上所有细胞外结构域。应理解，包含“基本上所有”细胞外结构域的多肽包括以下多肽，所述多肽包含整个细胞外结构域或细胞外结构域的部分，其中从细胞外结构域的N-末端和/或C-末端缺失一个至数个氨基酸，例如从N-末端和/或C-末端缺失1、2、3、4或5个氨基酸，只要细胞外结构域的剩余部分保留足够的结合其相应配体的蛋白相互作用活性。本发明的DN形式通常还缺少信号转导结构域(如细胞内/胞浆结构域)的一些部分或全部，使得DN形式对免疫检查点途径中的信号转导具有降低的活性或无活性。在不受特定机制或理论的束缚的情况下，配体与DN形式的结合降低了配体与完整内源性受体，和/或具有信号转导分子的DN形式复合物，包括内源性受体的结合，导致免疫检查点途径的信号转导降低。
本发明的DN形式通常具有某些功能特征，包括但不限于在免疫抑制细胞的细胞表面表达的能力，结合其相应配体的能力，以及传播免疫检查点途径的细胞内信号的能力丧失或能力降低。通过工程改造抑制剂以具有这样的功能特征，本领域技术人员可以容易地产生细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式。在一个实施方案中，构建DN形式以保留细胞介导的免疫应答的抑制剂的细胞外结构域，或保留至少足够的细胞外结构域部分以保留配体结合活性。在一个示例性实施方案中，可以使用细胞介导的免疫应答的抑制剂的细胞外结构域构建DN形式，包括但不限于如本文所公开的PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG-3、CD160、TIGIT、LAIR1、2B4的细胞外结构域。本领域技术人员将容易理解，只要配体结合活性得以保留，就不需要保留细胞介导的免疫应答的抑制剂的整个细胞外结构域，并且可以引入来自细胞外结构域的N-末端和/或C-末端的缺失。基于受体序列的分析，本领域技术人员可以容易地确定这种N-末端和/或C-末端缺失的适宜性，以确定已知提供配体结合活性的蛋白基序(参见例如，ExPASy(expasy.org)，特别是PROSITE(prosite.expasy.org))。另外或供选择地，合适的N-末端和/或C-末端缺失可以通过在多肽中引入缺失并测量相应配体的结合活性来凭经验确定。因此，本领域技术人员可以容易地确定细胞介导的免疫应答的抑制剂的适宜序列，以向本发明的DN形式提供配体结合活性。
应理解，无论是整个细胞外结构域还是受体的细胞外结构域的部分以DN形式使用，可以任选地在DN形式的细胞外结构域中包含另外的序列。这些另外的序列可以源自DN形式的亲本多肽，或者该另外的序列可以源自不同的多肽。这样的包含来自亲本多肽和不同多肽的序列的多肽是非天然存在的嵌合多肽。例如，通常包含信号肽或前导肽，使得DN形式将在免疫抑制细胞的细胞表面表达。应理解，一旦包含信号肽的多肽在细胞表面表达，则信号肽通常在内质网中加工多肽并转运至细胞表面期间被蛋白水解除去。因此，诸如DN形式的多肽通常在细胞表面表达为缺乏信号肽的成熟蛋白，而多肽的前体形式包括信号肽。信号肽可以是天然存在的受体的信号肽，或者供选择地，可以源自不同的蛋白。本文描述了示例性信号肽，包括本文描述的适用于CAR的那些。为了在细胞表面另外提供表达，DN形式将通常包括跨膜结构域，其为DN形式在细胞表面的保留做准备。跨膜结构域可以是天然存在的受体的跨膜结构域，或者供选择地可以源自不同的蛋白。在一个具体实施方案中，源自另一种蛋白的跨膜结构域源自在免疫抑制细胞的细胞表面上表达的另一种受体。本文描述了示例性跨膜结构域，包括本文描述的适用于CAR的那些。
在免疫检查点途径受体的情况下，通常信号转导结构域位于细胞内/胞浆结构域内。免疫检查点途径受体的信号转导活性通常由与(多种)细胞表面受体和/或细胞内信号转导分子的蛋白-蛋白相互作用介导。在一个实施方案中，DN形式缺乏在传播免疫检查点途径的信号中起作用的整个细胞内结构域或其部分。应理解，只要使细胞内信号转导结构域的足够部分缺失以抑制或降低来自DN形式的信号转导，就不必使受体的整个细胞内结构域缺失。另外或供选择地，可以将突变引入细胞内信号转导结构域以抑制或降低来自DN形式的信号转导。另外或供选择地，不具有信号转导活性的异源序列可以取代受体的细胞内信号转导结构域以产生DN形式。本领域技术人员将容易理解，这些和其他熟知的方法可用于产生本发明的DN形式。
免疫检查点抑制剂的显性负性形式的一个示例性实施方案是PD-1的显性负性形式。PD-1的显性负性形式是细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式的示例，包括免疫检查点抑制剂。应理解，如本文所公开的PD-1 DN形式是示例性的。
如本文所述，细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式被设计成具有降低的或抑制的细胞内信号转导。本发明的DN形式通常基于免疫检查点途径的受体的抑制，所述免疫检查点途径起到抑制免疫抑制细胞活化的作用，例如抑制细胞增殖、细胞因子产生和/或细胞周期进程，特别是本发明的免疫抑制细胞的免疫抑制功能。本发明的DN形式被设计成去除细胞内信号转导结构域或其部分，使得受体的信号转导能力降低或被抑制。DN形式还起到抑制内源性受体信号转导的作用。在一个具体实施方案中，降低或抑制的信号转导使检查点阻断无效，导致免疫抑制细胞的持续信号转导和活化。应理解，只要与不存在DN形式相比，活性的部分降低足以实现提供免疫抑制细胞的增强的活化，DN形式的信号转导活性就可以被完全敲除或部分敲除。此外，DN形式不必引起来自内源性受体的信号转导的完全失活，但可以降低足以使检查点阻断无效并允许活化免疫抑制细胞的内源性受体的活化。本领域技术人员可以使用本领域熟知的试验方法，包括使用体内模型，如动物模型的试验，来评估DN形式对表达CAR的细胞的有效性的影响，从而容易地确定DN形式对亲本受体活性的影响。
与用于本发明的CAR一样，任选的接头或间隔区序列可以包含在DN形式中，例如，信号肽和细胞外配体结合结构域之间的接头或间隔区，特别是当融合异源序列时。接头或间隔区也可以任选地包含在细胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间。类似地，接头或间隔区可以任选地包含在跨膜结构域和任何剩余的细胞内结构域之间。本文描述了这样的任选的接头或间隔区。此外，这种接头或间隔区可以源自异源序列。例如，如上所述，源自异源多肽的跨膜结构域可以任选地在源自异源多肽的N-末端和/或C-末端包含另外的序列。这样的另外的序列可充当接头或间隔区。
在一个实施方案中，本发明的显性负性形式可以任选地还包含与共刺激信号转导结构域的融合，其中所述共刺激信号转导结构域是显性负性形式的跨膜结构域的羧基末端。这样的DN形式在本文中也称为“转换受体”。这样的DN形式或转换受体包含至少细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的细胞外区域的配体结合结构域，如免疫检查点抑制剂，其与跨膜结构域融合，所述跨膜结构域与免疫刺激分子的共刺激结构域(即，胞浆信号转导结构域)融合，从而将配体结合时的活性从细胞免疫活性的抑制转变为细胞免疫活性的刺激(参见例如，Liu等人,Cancer Res.76:1578-1590(2016))。因为免疫检查点抑制剂的信号转导结构域已经缺失，所以还包含与共刺激结构域(即，转换受体)的融合的DN形式也在这样的构建体中充当显性负性形式。在一个实施方案中，还包含与共刺激信号转导结构域的融合的DN形式在免疫抑制细胞中表达。在另一个实施方案中，还包含与共刺激信号转导结构域的融合的DN形式在免疫抑制细胞中与CAR共表达。
DN形式融合多肽中的共刺激信号转导结构域可以源自例如，受体的胞浆信号转导结构域，如用于CAR中的本文所述的共刺激分子，包括但不限于4-1BB多肽、CD28多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP10多肽和2B4多肽。在包含与共刺激信号转导结构域的融合的DN形式中，跨膜结构域可以源自共刺激结构域所来源的多肽，源自DN形式的细胞外配体结合结构域所来源的多肽，或其可以是来自另一种多肽的跨膜结构域，其与可以用于产生CAR或DN形式的跨膜结构域的本文的描述类似。
在一个实施方案中，本发明提供了重组表达DN形式的免疫抑制细胞，其中所述DN形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，其中所述共刺激信号转导结构域与DN形式的跨膜结构域的羧基末端融合。在本发明的某些实施方案中，本发明的细胞或群体重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式，其中所述显性负性形式还包含共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域与显性负性形式的跨膜结构域融合(其转而与包含显性负性形式的配体结合区的免疫检查点抑制剂的细胞外结构域的至少部分融合)。这样的细胞可以用于治疗如本文公开的免疫介导的障碍。本发明提供免疫抑制细胞重组表达转换受体(即，还包含共刺激信号转导结构域的DN形式)，所述转换受体包含(i)免疫检查点抑制剂的至少细胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。本发明还提供免疫抑制细胞重组表达CAR和DN形式二者，所述DN形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合(转换受体)，其包含(i)免疫检查点抑制剂的至少细胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。应理解，在共表达CAR和还包含与共刺激信号转导结构域(转换受体)的融合的DN形式的这样的免疫抑制细胞中，所述CAR结合于待治疗的相同疾病或障碍的抗原。在共表达CAR和包含与共刺激信号转导结构域的融合的DN形式的细胞的一个实施方案中，DN形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。在一个具体实施方案中，DN形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。在另一个具体实施方案中，在共表达CAR和还包含与共刺激信号转导结构域的融合的DN形式的免疫抑制细胞中，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。在另一个具体实施方案中，本发明提供了共表达CAR和还包含与共刺激信号转导结构域和CAR的融合的DN形式的免疫抑制细胞，其中DN形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。
以下更详细地描述了免疫检查点抑制剂的示例性DN形式。还设想了基本上由所述序列组成的DN形式。
PD-1.程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是活化T细胞在与内源性巨噬细胞和树突细胞上表达的其相应配体PD-L1和PD-L2结合时的负免疫调节剂。PD-l是268个氨基酸的I型膜蛋白。PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，其为B7家族的成员。蛋白的结构包括细胞外IgV结构域，随后是跨膜区和细胞内尾区。细胞内尾区包含两个磷酸化位点，其位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序。PD-1负调节TCR信号。在配体结合时，SHP-1和SHP-2磷酸酶与PD-1的胞质尾区结合。PD-L1的上调是肿瘤细胞用于逃避宿主免疫系统的一种机制。在临床前和临床试验中，拮抗性抗体对PD-1的阻断诱导通过宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤应答。
PD-1多肽可具有对应于如以下提供的GenBank号NP_005009.2(GI:167857792)氨基酸或其片段。参见GenBank NP_005009.2以参考PD-1内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至20；细胞外结构域，氨基酸21至170；跨膜结构域，氨基酸171至191；细胞内结构域，氨基酸192至288。应理解，“PD-1核酸分子”是指编码PD-1多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了细胞介导的免疫应答的抑制剂，其为PD-1显性负性形式(DN形式)。在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含PD-1的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含PD-1的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，PD-1 DN形式包含PD-1的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的PD-1 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，PD-1细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，PD-1 DN形式是嵌合序列。例如，PD-1细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地为异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，PD-1 DN形式可以包含跨膜结构域，所述跨膜结构域任选地为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。尽管本文的实施例中例示的PD-1 DN形式包含与PD-1的细胞外结构域融合的异源序列，但是应理解，PD-1 DN形式可以仅包含PD-1序列。
在一个实施方案中，本发明提供了PD-1 DN形式，其包含PD-1的细胞外结构域，或其配体结合部分，例如，对应于PD-1(GenBank NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的细胞外结构域的氨基酸21至170。表达这样的PD-1 DN形式的细胞应缺乏在PD-1免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，PD-1 DN形式是缺失突变体，其具有细胞内结构域或其部分缺失，使得由PD-1介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制，所述细胞内结构域例如，PD-1(GenBank NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸192至288。PD-1的DN形式的另外的实施方案如下所述。
在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与CD8的跨膜结构域和铰链结构域融合的PD-1的细胞外结构域。在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸21至165。这样的PD-1 DN形式包含PD-1的细胞外结构域。在另一个实施方案中，本发明提供了PD-1 DN形式，其包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1至165(前体形式)或氨基酸21至165(成熟形式)。这样的DN形式包含PD-1的信号肽(氨基酸1至20)和细胞外结构域(氨基酸21至165)，而成熟形式缺乏信号肽。在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸21至151。在另一个实施方案中，本发明提供了PD-1 DN形式，其包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1至151(前体形式)或氨基酸21至151(成熟形式)。任选地，PD-1 DN形式包含细胞外配体结合结构域，其从PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸21开始，到氨基酸151至165之间的氨基酸。在另一个实施方案中，PD-1 DN形式包含CD8的跨膜结构域，即CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸183至203。这样的实施方案代表嵌合DN形式，其包含来自不同(异源)多肽的跨膜结构域。如上所述，包含异源结构域(如跨膜结构域)的DN形式可以任选地包含来自异源多肽的另外的序列。在一个这样的实施方案中，提供了DN形式，其包含来自跨膜结构域的异源多肽N-末端的另外的序列。在一个实施方案中，DN形式包含CD8的铰链结构域。在一个具体实施方案中，异源序列包含CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸137至182的另外的N-末端序列，或任选地从氨基酸138或139开始。在另一个实施方案中，提供了DN形式，其包含来自跨膜结构域的异源多肽C-末端的另外的序列。在一个具体实施方案中，异源序列包含来自CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸204至209的另外的C-末端序列。在一个实施方案中，PD-1 DN形式包含CD8的跨膜结构域(氨基酸183至203)、任选地包含氨基酸137至182(或任选地从氨基酸138或139开始)的铰链结构域和/或包含氨基酸204至209的另外的C-末端序列。在本发明的一个具体实施方案中，提供了PD-1 DN形式，其包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1至165，和CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸137至209，任选地在氨基酸138或139处开始。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了包含下文提供的序列的PD-1DN形式，其中下划线序列源自PD-1，斜体序列源自CD8。
在另外的实施方案中，本发明的DN形式任选地包含P2A序列，其提供报告基因分子的任选的共表达。P2A是自切割肽序列，其可用于蛋白序列的双顺反子或多顺反子表达(参见Szymczak等人,Expert Opin.Biol.Therapy 5(5):627-638(2005))。示例性P2A序列是GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM(SEQ ID NO:15)。在另外的实施方案中，本发明的DN形式与报告蛋白共表达。在一个具体实施方案中，报告蛋白是mCherry荧光蛋白。在一个具体实施方案中，mCherry多肽序列如以下所提供。应理解，mCherry仅仅是示例性的，并且如本文所述，可以包含任何期望的报告基因分子，如荧光蛋白作为报告基因。
MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK(SEQ ID NO:16)
在另一个具体实施方案中，PD-1 DN形式表达为如下提供的多肽构建体，其中下划线序列源自PD-1，斜体序列源自CD8，P2A序列带双下划线，mCherry序列加下划线和斜体。
在一个具体实施方案中，下文提供了编码PD-1 DNR形式构建体的核酸，其中下划线序列编码源自PD-1 DN的氨基酸，斜体序列编码源自CD8的氨基酸，编码P2A的序列加双下划线，编码mCherry的序列加下划线和斜体，Kozak序列用虚线下划线加粗，限制位点Age I和Xho I分别在5'和3'端用点线加下划线。
CTLA-4.细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)是一种由活化T细胞表达的抑制性受体，当其与其相应的配体(分别为CD80和CD86；B7-1和B7-2)结合时，介导活化T细胞抑制或无反应性。在临床前和临床研究中，通过全身抗体输注的CTLA-4阻断增强了内源性抗肿瘤反应，尽管在临床环境中具有显著的无法预料的毒性。CTLA-4包含细胞外V结构域、跨膜结构域和胞质尾区。已经表征了编码不同同种型的替代剪接变体。膜结合的同种型起到通过二硫键相互连接的同源二聚体的作用，而可溶性同种型起到单体的作用。细胞内结构域类似于CD28的细胞内结构域，因为它没有内在的催化活性，并且含有一个能够结合PI3K、PP2A和SHP-2的YVKM(SEQ ID NO:29)基序和一个能够结合含SH3的蛋白的富脯氨酸的基序。CTLA-4在抑制T细胞应答中的一个作用似乎是直接通过TCR-近端信号转导蛋白如CD3和LAT的SHP-2和PP2A去磷酸化。CTLA-4还可通过与CD28竞争CD80/86结合而间接影响信号转导。CTLA-4还显示与PI3K、CD80、AP2M1和PPP2R5A结合和/或相互作用。
CTLA-4多肽可具有对应于GenBank号AAH69566.1(GI:46854814)或NP_005205.2(GI:21361212)的氨基酸序列，即如下提供的序列，或其片段。参见GenBank NP_005205.2以参考CTLA-4内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至35；细胞外结构域，氨基酸36至161；跨膜结构域，氨基酸162至182；细胞内结构域，氨基酸183至223。应理解，“CTLA-4核酸分子”是指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了CTLA-4 DN形式。在一个实施方案中，CTLA-4 DN形式包含CTLA-4的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，CTLA-4 DN形式包含CTLA-4的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，CTLA-4DN形式包含CTLA-4的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的CTLA-4 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，CTLA-4细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，CTLA-4 DN形式是嵌合的。例如，CTLA-4细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，CTLA-4 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，CTLA-4 DN形式可以包含CTLA-4的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于CTLA-4(GenBank NP_005205.2；SEQ ID NO:19)的细胞外结构域的氨基酸36至161。表达这种CTLA-4 DN形式的细胞应缺乏CTLA-4免疫检查点途径中的信号转导能力或信号转导能力降低。在一个实施方案中，CTLA-4 DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如CTLA-4(GenBank NP_005205.2；SEQ ID NO:19)的氨基酸183至223，或其部分，使得由CTLA-4介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
BTLA.在T细胞活化期间诱导B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)表达，并且BTLA在Th1细胞上而不是Th2细胞上保持表达。BTLA与B7同源物B7H4相互作用。BTLA通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)，而不仅是与细胞表面受体B7家族的相互作用显示T细胞抑制。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，也称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。已经显示BTLA活化抑制人CD8+癌症特异性T细胞的功能。BTLA也被指定为CD272(分化簇272)。
BTLA多肽可以具有对应于GenBank号AAP44003.1(GI:31880027)或NP_861445.3(GI:145580621)的同源物的氨基酸序列，即如下提供的序列，或其片段。参见GenBank NP_861445.3以参考BTLA内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至30；细胞外结构域，氨基酸31至157；跨膜结构域，氨基酸158至178；细胞内结构域，氨基酸179至289。应理解，“BTLA核酸分子”是指编码BTLA多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了BTLA DN形式。在一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的BTLA DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，BTLA细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，所述BTLA DN形式是嵌合的。例如，BTLA细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，BTLA DN形式可以包含跨膜结构域，其任选地是异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，BTLA DN形式可以包含BTLA的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于BTLA(GenBank NP_861445.3；SEQ ID NO:20)的细胞外结构域的氨基酸31至157。表达这样的BTLA DN形式的细胞应缺乏在BTLA免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，BTLA DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如BTLA(GenBank NP_861445.3；SEQ ID NO:20)的氨基酸179至289或其部分，使得由BTLA介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
TIM-3.T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2前体，是调节巨噬细胞活化的Th1特异性细胞表面蛋白。Tim-3首先被确定为在产生IFN-γ的CD4+T辅助细胞1(Th1)和CD8+ T细胞毒性1(Tc1)T细胞上选择性表达的分子。TIM-3具有V型的N-末端Ig结构域，然后是粘蛋白结构域。
TIM-3多肽可以具有对应于GenBank号NP_116171.3(GI:49574534)的氨基酸序列，即下文提供的序列或其片段。参见GenBank NP_116171.3以参考TIM-3内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至202；跨膜结构域，氨基酸203至223；细胞内结构域，氨基酸224至301。应理解，“TIM-3核酸分子”是指编码TIM-3多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了TIM-3 DN形式。在一个实施方案中，TIM-3 DN形式包含TIM-3的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TIM-3 DN形式包含TIM-3的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，TIM-3 DN形式包含TIM-3的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的TIM-3 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，TIM-3细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，TIM-3 DN形式是嵌合的。例如，TIM-3细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，TIM-3 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，TIM-3 DN形式可以包含TIM-3的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于TIM-3(GenBank NP_116171.3；SEQ ID NO:21)的细胞外结构域的氨基酸22至202。表达这样的TIM-3 DN形式的细胞应缺乏在TIM-3免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，TIM-3 DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如TIM-3(GenBank NP_116171.3；SEQ ID NO:21)的氨基酸224至301或其部分，使得由TIM-3介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
LAG-3.淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)是免疫细胞的负免疫调节剂。LAG-3属于免疫球蛋白(Ig)超家族，含有4个细胞外Ig样结构域。LAG3基因含有8个外显子。序列数据、外显子/内含子组织和染色体定位均表明LAG-3与CD4的密切关系。LAG-3也被命名为CD223(分化簇223)。
LAG-3多肽可以具有对应于GenBank号CAA36243.3(GI:15617341)或NP_002277.4(GI:167614500)的氨基酸序列，即下文提供的序列或其片段。参见GenBank NP_002277.4以参考LAG-3内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至22；细胞外结构域，氨基酸23至450；跨膜结构域，氨基酸451至471；细胞内结构域，氨基酸472至525。应理解，“LAG-3核酸分子”是指编码LAG-3多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了LAG-3 DN形式。在一个实施方案中，LAG-3 DN形式包含LAG-3的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，LAG-3 DN形式包含LAG-3的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，LAG-3 DN形式包含LAG-3的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的LAG-3 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，LAG-3细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，LAG-3 DN形式是嵌合的。例如，LAG-3细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，LAG-3 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，LAG-3 DN形式可以包含LAG-3的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于LAG-3(GenBank NP_002277.4；SEQ ID NO:22)的细胞外结构域的氨基酸23至450。表达这样的LAG-3 DN形式的细胞应缺乏在LAG-3免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，LAG-3 DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如LAG-3(GenBank NP_002277.4；SEQ ID NO:22)的氨基酸472至525或其部分，使得由LAG-3介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
TIGIT.具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是抑制T细胞活化的细胞表面蛋白。其属于免疫球蛋白(Ig)蛋白的脊髓灰质炎病毒受体(PVR)家族，其在其N-末端Ig结构域中共享3个保守序列基序。TIGIT多肽可以具有对应于GenBank号NP_776160.2(GI:256600228)的氨基酸序列，即下文提供的序列或其片段。参见GenBank NP_776160.2以参考TIGIT内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至141；跨膜结构域，氨基酸142至162；细胞内结构域，氨基酸163至244。应理解，“TIGIT核酸分子”是指编码TIGIT多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了TIGIT DN形式。在一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的TIGIT DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，TIGIT细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，TIGIT DN形式是嵌合的。例如，TIGIT细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，TIGIT DN形式可以包含跨膜结构域，其任选为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，TIGIT DN形式可以包含TIGIT的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于TIGIT(GenBank NP_776160.2；SEQ ID NO:23)的细胞外结构域的氨基酸22至141。表达这样的TIGIT DN形式的细胞应缺乏在TIGIT免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，TIGIT DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如TIGIT(GenBank NP_776160.2；SEQ ID NO:23)的氨基酸163至244或其部分，使得由TIGIT介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
LAIR1.白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)是一种抑制性受体，其对自然杀伤(NK)细胞、B细胞和T细胞的细胞溶解功能起组成型负调节作用。LAIR以各种同种型存在。应理解，可选择任何同种型以实现期望的功能。示例性同种型包括同种型a(NP_002278.2,GI:612407859)、同种型b(NP_068352.2,GI:612407861)、同种型c(NP_001275952.2,GI:612407867)、同种型e(NP_001275954.2,GI:612407869)、同种型f(NP_001275955.2,GI:612407863)、同种型g(NP_001275956.2,GI:612407865)等。下面提供一种示例性同种型序列，同种型a。在一个实施方案中，LAIR1多肽可具有对应于NP_002278.2的氨基酸序列，即下文提供的序列或其片段。参见GenBank NP_002278.2以参考LAIR1内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至165；跨膜结构域，氨基酸166至186；细胞内结构域，氨基酸187至287。应理解，“LAIR1核酸分子”是指编码LAIR1多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了LAIR1 DN形式。在一个实施方案中，LAIR1 DN形式包含LAIR1的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，LAIR1 DN形式包含LAIR1的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，LAIR1 DN形式包含LAIR1的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的LAIR1 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，LAIR1细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，LAIR1 DN形式是嵌合的。例如，LAIR1细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，LAIR1 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选为异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，LAIR1 DN形式可以包含LAIR1的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于LAIR1(GenBank NP_002278.2；SEQ ID NO:24)的细胞外结构域的氨基酸22至165。表达这样的LAIR1 DN形式的细胞应缺乏在LAIR1免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，LAIR1 DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如LAIR1(GenBank NP_002278.2；SEQ ID NO:24)的氨基酸187至287或其部分，使得由LAIR1介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
2B4.自然杀伤细胞受体2B4(2B4)介导NK细胞和T细胞亚群的非MHC限制性细胞杀伤。认为2B4-S同种型是活化受体，并且认为2B4-L同种型是免疫细胞的负免疫调节剂。2B4在结合其高亲和力配体CD48时起作用。2B4含有基于酪氨酸的转换基序，一种允许蛋白与各种磷酸酶结合的分子转换。2B4也被称为CD244(分化簇244)。
2B4多肽可以具有对应于GenBank号NP_001160135.1(GI:262263435)的氨基酸序列，即以下提供的序列，或其片段。参见GenBank NP_001160135.1以参考2B4内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至18；细胞外结构域，氨基酸19至229；跨膜结构域，氨基酸230至250；细胞内结构域，氨基酸251至370。应理解，“2B4核酸分子”是指编码2B4多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了2B4 DN形式。在一个实施方案中，2B4 DN形式包含2B4的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，2B4 DN形式包含2B4的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，2B4 DN形式包含2B4的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的2B4 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，2B4细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，所述2B4 DN形式是嵌合的。例如，2B4细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，2B4 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选地是异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，2B4 DN形式可以包含2B4的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于2B4(GenBank NP_001160135.1；SEQ ID NO:25)的细胞外结构域的氨基酸19至229。表达这样的2B4 DN形式的细胞应缺乏在2B4免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，2B4 DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如2B4(GenBank NP_001160135.1；SEQ ID NO:25)的氨基酸251至370或其部分，使得由2B4介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导降低或被抑制。
CD160.CD160是糖基磷脂酰肌醇锚定的分子，其含有单个IgV样结构域，其与HVEM结合并在T细胞上起到共抑制受体的作用。CD160多肽可以具有对应于GenBank NP_008984.1(GI:5901910)的氨基酸序列，即以下提供的序列，或其片段。参见GenBank NP_008984.1以参考CD160内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至26；细胞外结构域，氨基酸27至159。应理解，“CD160核酸分子”是指编码CD160多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了CD160 DN形式。在一个实施方案中，CD160 DN形式包含CD160的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，CD160 DN形式包含CD160的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，CD160 DN形式包含CD160的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的CD160 DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，CD160细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，所述CD160 DN形式是嵌合的。例如，CD160细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，CD160 DN形式可以包含跨膜结构域，其任选地是异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
在本发明的一个实施方案中，CD160 DN形式可以包含CD160的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于CD160(GenBank NP_008984.1；SEQ ID NO:26)的细胞外结构域的氨基酸27至159。表达这样的CD160 DN形式的细胞应缺乏在免疫检查点途径中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，CD160 DN形式包含CD160的细胞外结构域或其配体结合部分，和源自异源多肽的跨膜结构域，包括但不限于本文所述的跨膜结构域中的一种。在一个非限制性实施方案中，CD160 DN形式包含CD8的跨膜结构域。在表达CD160 DN形式的细胞中，由CD160介导的免疫检查点途径的细胞内信号转导应降低或被抑制。
TGF-β受体2型.TGF-β受体2型结合于TGF-β和I型受体二聚体，与配体形成异源四聚体复合物。TGF-β受体2型多肽可以具有对应于GenBank号NP_001020018.1(GI:67782326)的氨基酸序列，即以下提供的序列，或其片段。参见GenBank NP_001020018.1以参考TGF-β受体2型内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至22；细胞外结构域，氨基酸23至191；跨膜结构域，氨基酸192至212；细胞内结构域，氨基酸213至592(还参见UniProtKB-P37173中的注释)。应理解，“TGF-β受体2型核酸分子”是指编码TGF-β受体2型多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了TGFβ受体DN形式。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如，成熟形式)。在另一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如，前体形式)。本发明还提供了本发明的TGF-β受体DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，TGFβ受体细胞外配体结合结构域与一条或多条异源多肽序列融合，也就是说，所述TGFβ受体DN形式是嵌合的。例如，TGFβ受体细胞外配体结合结构域可以在其N-末端与信号肽融合，所述信号肽任选地是异源信号肽，包括本文所述的各种信号肽。此外，TGFβ受体DN形式可以包含跨膜结构域，其任选地是异源跨膜结构域，包括本文所述的各种跨膜结构域中的任一种。
之前已经描述了TGFβ受体DN形式(参见例如，Bottinger等人,EMBO J.16:2621-2633(1997)，描述了包含TGFβ受体细胞外和跨膜结构域的DN形式；Foster等人,J.Immunother.31:500-505(2008)；Bollard等人,Blood 99:3179-3187(2002)；Wieser等人,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247(1993))。在本发明的一个实施方案中，TGFβ受体DN形式可以包含TGFβ受体的细胞外结构域或其配体结合部分，例如，对应于TGFβ受体(GenBankNP_001020018.1,SEQ ID NO:27)的细胞外结构域的氨基酸23至191。表达这样的TGFβ受体DN形式的细胞缺乏在细胞中信号转导的能力或具有降低的信号转导的能力。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式是具有细胞内结构域缺失的缺失突变体，例如TGFβ受体(GenBankNP_001020018.1,SEQ ID NO:27)的氨基酸213至592或其部分，使得由TGFβ受体介导的细胞内信号转导降低或被抑制(还参见Bottinger等人,EMBO J.16:2621-2633(1997)；Foster等人,J.Immunother.31:500-505(2008)；Bollard等人,Blood 99:3179-3187(2002)；Wieser等人,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247(1993))。
应理解，任选地，细胞介导的免疫应答的抑制剂的第二种DN形式，如免疫检查点抑制剂，可以在本发明的细胞中表达。在这种情况下，可能需要在同一细胞中抑制多于一种的细胞介导的免疫应答。因此，细胞可以表达两种或更多种DN形式，每种形式针对细胞介导的免疫应答的不同抑制剂，包括如上所述的那些。例如，根据需要，PD-1的DN形式可以在具有TGF-β受体的DN形式的细胞中共表达，PD-1的DN形式可以与CTLA-4的DN形式共表达，CTLA-4DN形式可以与TGF-β的DN形式共表达，等等，包括上述任何DN形式的组合。
6.4.治疗方法
本发明还涉及使用本发明的免疫抑制细胞治疗障碍，如免疫介导的障碍的方法。所述方法用于治疗患有免疫介导的障碍的患者。本发明的方法涉及使用本发明的免疫抑制细胞抑制病理性免疫应答。这样的病理性免疫应答包括但不限于，器官移植排斥、自身免疫障碍、过敏性障碍、母胎不耐受、阿尔茨海默氏病、关节炎等。应理解，病理性免疫应答不一定是障碍、疾病或病症的主要原因。免疫介导的障碍是指与病理性免疫应答相关的障碍、疾病或病症。示例性免疫介导的障碍包括但不限于，器官移植排斥、自身免疫障碍、过敏性障碍、母胎不耐受、阿尔茨海默氏病等，如下面更详细地讨论的。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞对抗原具有特异性(被抗原敏化或识别抗原)，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与抗原结合，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。
器官移植排斥.为了响应外来器官移植，宿主免疫系统通常对移植器官发起免疫攻击，这可能导致器官的最终排斥。同种异体抗原的T细胞识别是器官移植排斥中的中心和主要事件，其最终导致移植物排斥(Briscoe等人,Nat.Med.8:220-222(2002))。为了防止实体器官排斥(肝脏、肺、肾脏、胰腺、小肠等)，使用终身免疫抑制剂作为标准治疗来抑制针对移植器官的宿主效应免疫应答。已经确定了导致器官排斥的抗原特异性应答(参见例如，表1)。
用细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式(DN形式)，例如PD-1转导免疫抑制细胞，如调节性T细胞，可用于促进移植器官内的免疫抑制并减少器官移植排斥。此外，移植器官特异性抗原应答免疫抑制细胞，如调节性T细胞，可以作为抗原应答细胞分离，用细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式转导，并离体培养，或免疫抑制细胞可以用细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式和靶向器官移植的抗原的CAR共转导，以产生免疫抑制细胞，如抗原特异性的调节性T细胞。转导的免疫抑制细胞，如调节性T细胞，可以提供移植器官特异性免疫抑制，从而增强免疫耐受的先天能力，以代替常规的免疫抑制方法。
在一个实施方案中，本发明提供了降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。在另一个具体实施方案中，用于所述方法的免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从受者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。示例性器官移植靶抗原描述于表1中。在一个具体实施方案中，从移植器官或从围绕移植器官的区域分离免疫抑制细胞。例如，在肝移植期间，可以收获例如来自移植肝脏的调节性T细胞，用细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式转导，并向患者，即器官受者施用，以减少或防止移植肝脏的排斥。
在一个具体实施方案中，移植器官是肺。在其中移植器官是肺的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。在一个具体实施方案中，移植器官是肾脏。在其中移植器官是肾脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、纤连蛋白、IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、波形蛋白、血管紧张素II-1型受体(AGTR1)、基底膜聚糖和聚集蛋白。
在一个具体实施方案中，移植器官是肝脏。在其中移植器官是肝脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白和V型胶原蛋白。在一个具体实施方案中，移植器官是心脏。在其中移植器官是心脏的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、心肌肌球蛋白、波形蛋白、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。在一个具体实施方案中，移植器官是胰腺。在其中移植器官是胰腺的一个具体实施方案中，细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自MHC I类、MHC II类、胰岛细胞自身抗体(ICA)抗原、胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)。
自身免疫障碍.细胞介导的免疫应答(如PD-1)的DN形式在免疫抑制细胞，如调节性T细胞中的转导可以用于治疗自身免疫障碍。在一个具体实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂(如PD-1)的DN形式可以被转导到免疫抑制细胞中以提高其抑制能力，所述免疫抑制细胞是滤泡调节性T细胞。这样的细胞可以用于抑制自身抗体产生，同时使患有自身免疫障碍的患者中的免疫系统的其他免疫保持完整。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在一个具体实施方案中，自身免疫障碍选自多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风和狼疮，例如，系统性红斑狼疮。
在一个实施方案中，本发明提供了在有需要的患者中提高自身耐受性或重建对自身抗原的免疫耐受性的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞，其中所述细胞是病理性自身抗原特异性调节性T细胞，或所述细胞群体包含病理性自身抗原特异性调节性T细胞。这样的方法可以用于减轻自身免疫障碍的病理学作用。
多发性硬化.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是多发性硬化，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自髓磷脂、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、星形胶质细胞蛋白、胶质纤维蛋白(GFAP)和S100β。
1型糖尿病.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是1型糖尿病，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自β细胞抗原、胰岛素、胰岛素B链、胰岛素原、前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶-65(GAD65)、胰岛相关抗原2、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、锌转运蛋白8(ZnT8)、胰岛抗原2(IA-2)、热休克蛋白60(HSP60)和嗜铬粒蛋白A。
类风湿性关节炎.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是类风湿性关节炎，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自dnaJ(热休克蛋白)、瓜氨酸化波形蛋白和人软骨糖蛋白-39。
原发性胆汁性肝硬化.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是原发性胆汁性肝硬化，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自线粒体组分；丙酮酸脱氢酶(线粒体)；丙酮酸脱氢酶的E2组分；支链2-酮酸脱氢酶的E2组分；2-酮戊二酸脱氢酶复合体的E2组分；二氢硫辛酰胺脱氢酶的E3结合蛋白；核组分；核蛋白p100；核孔复合体蛋白gp120；和着丝粒。
重症肌无力.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是重症肌无力，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自乙酰胆碱受体(AChR)、水通道蛋白-4(AQP-4)、CTLA-4、ICAM、LFA-3、CD40/CD154、ICOS/ICOSL、CD52、活化T细胞的核因子(NFAT)、磷脂酶C(PLC)、CD25、Janus激酶、B细胞活化因子(BAFF)、增殖诱导配体(APRIL)、IL6R、IL17、IL12/IL23、整合蛋白和鞘氨醇受体。调节性T细胞天然积聚在胸腺中。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞，如调节性T细胞，在胸腺中积聚并且可以有助于重症肌无力的治疗。
白癜风.在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是白癜风，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞或多个细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原是黑素细胞抗原。
系统性红斑狼疮。在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，所述免疫介导的障碍是狼疮，特别是系统性红斑狼疮，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞群体，或包含这样的细胞的药物组合物。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。在又一个实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原选自toll样受体、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、MyD88和IL-1R-相关激酶(IRAK)。
过敏性障碍.在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的免疫抑制细胞或这样的细胞的群体。在一个具体实施方案中，免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在另一个具体实施方案中，免疫抑制细胞表达CAR，所述CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。在又一个具体实施方案中，免疫抑制细胞识别并被其敏化或CAR所结合的抗原是与过敏性障碍相关的过敏原。
在一个具体实施方案中，在经历特异性免疫治疗(SIT)连同皮下注射少量但渐增剂量的(多种)过敏原肽的患者中，识别并被抗原(所述抗原为过敏原)敏化，或表达结合于过敏原的CAR的免疫抑制细胞可以与(多种)过敏原肽共同注射。在一个具体实施方案中，例如，使用过敏原作为特异性抗原，这可以对患者产生以下作用：减少特异性免疫治疗的持续时间，增加特异性免疫治疗的功效，和/或延长特异性免疫治疗的作用，提供可延长多年的临床改善。例如，患者可以经历针对黄蜂毒液或单剂过敏(例如屋尘螨)的SIT。在一个具体实施方案中，施用本发明的免疫抑制细胞对患者具有选自以下的作用：减少SIT的持续时间，增加SIT的功效，和/或延长SIT的作用。因此，利用本发明的免疫抑制细胞的本发明的方法可以用于用过敏原改善特异性免疫治疗(SIT)的有效性。
母胎不耐受.可以从流产的胎盘收获对父系抗原特异(被其敏化)的调节性T细胞。这些对父系抗原特异性的调节性T细胞用细胞介导的免疫应答的抑制剂(如PD-1)的DN形式转导，培养，并在随后的妊娠中再输注，导致胎儿着床增加和减少胎儿丢失(fetal loss)。
在一个实施方案中，本发明提供了降低有需要的妊娠雌性的母胎不耐受的方法，包括向所述妊娠雌性施用治疗有效量的免疫抑制细胞或细胞群体，所述细胞或细胞群体是包括以下的过程的产物：从妊娠雌性的前次妊娠的胎盘分离调节性T细胞，并转导所述调节性T细胞，使得其重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。在一个具体实施方案中，调节性T细胞是从正在接受母胎不耐受治疗的妊娠雌性的胎盘分离的。在另一个实施方案中，分离的调节性T细胞是父系抗原特异性的。所述方法可用于增加胎儿着床的可能性并降低胎儿丢失的可能性。
阿尔茨海默氏病.PD-1负调节性T细胞在轻度认知损害患者中增加的观察结果证实了阿尔茨海默氏病的炎症起源，并支持PD-1负调节性T细胞在轻度认知损害中的有益作用，该作用在患有完全阿尔茨海默氏病的患者中丧失。
在一个具体实施方案中，从患有轻度认知损害的患者收获调节性T细胞，并且用细胞介导的免疫应答的抑制剂(如PD-1)的DN形式转导细胞。将细胞再输注到患者中以预防或减缓阿尔茨海默氏病的进展。
已经描述了用于诊断轻度认知损害的标准(Saresella等人,J.Alzheimer’sDisease 21:927-938(2010)；Petersen,J.Int.Med.256:183-194(2004)；Winblad等人,J.Int.Med.256:240-246(2004))。示例性标准包括报告的认知下降、认知功能受损、基本上正常的功能活动和排除痴呆。
在一个实施方案中，本发明提供了在具有轻度认知损害的患者中降低进展成阿尔茨海默氏病的风险的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞或细胞或细胞群体，其中所述免疫抑制细胞是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。在一个具体实施方案中，从具有轻度认知损害的患者分离调节性T细胞。
关节炎.目前，在患有关节炎和剧烈疼痛的患者中，局部施用类固醇注射剂，其减轻炎症应答并缓解疼痛。与杀死炎症细胞的类固醇不同，调节性T细胞通过抑制抵抗炎症，PD-1 DNR增加抑制作用。在一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的患者的关节炎的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的免疫抑制细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞局部施用到关节炎关节中，例如，关节内施用或直接在关节炎关节的腱附着端部位施用。在一个具体实施方案中，所治疗的关节炎是骨关节炎。在另一个具体实施方案中，所治疗的关节炎是银屑病性关节炎，其可以是但不限于不对称炎性关节炎、对称性关节炎和银屑病性脊柱炎。在一个实施方案中，施用非抗原特异性调节性T细胞或未针对特定抗原特异性选择的调节性T细胞。
剂量和施用.在本发明的方法中，向需要治疗的对象或患者施用本发明的免疫抑制细胞。对象或患者可以是哺乳动物，特别是人。优选地，对象或患者是人。人可以是儿童或成年人。
对于治疗，施用量是有效产生期望作用的量。有效量或治疗有效量是足以在治疗时提供有益或期望的临床结果的量。可以在单次施用或一系列施用(一次或多次剂量)中提供有效量。可以通过推注或通过连续灌注提供有效量。就治疗而言，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展或以其他方式减少疾病的病理后果的量。医生可以针对特定对象确定有效量。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑几个因素。这些因素包括对象的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重程度以及所施用的本发明的细胞的形式和有效浓度。
本发明的细胞通常以基于细胞个数每千克(细胞个数/千克)体重的待施用所述细胞的对象的剂量施用。通常，根据施用方式和部位，细胞剂量在约104至约1010个细胞/kg体重，例如，约105至约109、约105至约108、约105至约107或约105至106个细胞/千克的范围内。通常，在全身施用的情况下，使用比在局部施用中更高的剂量，其中本发明的免疫抑制细胞在病理性免疫应答区域施用。示例性剂量范围包括但不限于，1x104至1x108、2x104至1x108、3x104至1x108、4x104至1x108、5x104至1x108、6x104、to 1x108、7x104至1x108、8x104至1x108、9x104至1x108、1x105至1x108、例如，1x105至9x107、1x105至8x107、1x105至7x107、1x105至6x107、1x105至5x107、1x105至4x107、1x105至3x107、1x105至2x107、1x105至1x107、1x105至9x106、1x105至8x106、1x105至7x106、1x105至6x106、1x105至5x106、1x105至4x106、1x105至3x106、1x105至2x106、1x105至1x106、2x105至9x107、2x105至8x107、2x105至7x107、2x105至6x107、2x105至5x107、2x105至4x107、2x105至3x107、2x105至2x107、2x105至1x107、2x105至9x106、2x105至8x106、2x105至7x106、2x105至6x106、2x105至5x106、2x105至4x106、3x105至3x106个细胞/千克等。这样的剂量范围对于局部施用特别有用。在一个具体实施方案中，以1x105至1x108，例如1x105至1x107、1x105至1x106、1x106至1x108、1x106至1x107、1x107至1x108、1x105至5x106、1x105至3x106或3x105至3x106个细胞/千克的剂量提供细胞，用于局部施用。示例性剂量范围还可以包括但不限于，5x105至1x108、例如，6x105至1x108、7x105至1x108、8x105至1x108、9x105至1x108、1x106至1x108、1x106至9x107、1x106至8x107、1x106至7x107、1x106至6x107、1x106至5x107、1x106至4x107、1x106至3x107个细胞/千克等。这样的剂量对于全身施用特别有用。在一个具体实施方案中，以1x106至3x107个细胞/千克的剂量提供细胞，用于全身施用。示例性细胞剂量包括但不限于，在约104至约1010个细胞/千克的范围内的1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109等的剂量。此外，还可以调整剂量以考虑是否正在施用单剂量或是否正在施用多剂量。如上所述，精确确定被认为是有效剂量的剂量可以基于每个对象的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和特定对象的病症。基于本文的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员可以容易地确定剂量。
在一个具体实施方案中，用于人施用的剂量在1x105至1x108个细胞/千克体重的人的范围内。
本发明的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于胸膜施用、静脉内施用、皮下施用、结内施用、鞘内施用、胸膜内施用、腹膜内施用、颅内施用、气管内施用、关节内施用、子宫内施用、眼内施用、鼻内施用、脊柱内施用、硬膜外施用、在腱附着端部位直接施用和直接施用到胸腺。在一个实施方案中，本发明的细胞可以使用熟知的方法局部递送至期望部位，包括但不限于肝动脉泵或主动脉泵；肢体、肺或肝脏灌注；在门静脉中；通过静脉分流；在期望部位附近的腔或静脉中等，使得本发明的细胞被递送到区域，如器官移植部位或免疫介导的障碍的病理性免疫应答部位。例如，在诸如关节炎的病症的情况下，本发明的细胞可以使用在腱附着端部位直接施用的关节内施用在关节中施用。在另一个实施方案中，本发明的细胞可以全身给药。在优选的实施方案中，细胞在期望部位局部施用。本领域技术人员可基于待治疗的免疫介导的障碍的类型选择合适的施用方式。可以通过注射或导管引入细胞。在一个实施方案中，通过静脉内输注施用细胞。任选地，可以在施用细胞之前、期间或之后向对象施用扩增和/或分化剂，以增加本发明的细胞的体内产生。
本发明细胞的增殖通常在向对象施用之前离体进行，并且在向对象施用后可以有利地在体内进行(Kaiser等人,Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015))。细胞增殖应伴随细胞存活以允许细胞扩增和存留。细胞分离和/或扩增可以使用本领域已知的任何方法进行，例如，如Lee等人,Cancer Res.71:2871-2881(2011)中所述。
本发明的方法还可以包括在用本发明的细胞治疗之前、期间或之后与其组合的辅助治疗。因此，本发明的细胞治疗方法可以与其他标准治疗和/或疗法一起使用，用于治疗与本发明细胞的施用相容的特定障碍。
任选地，施用本发明细胞的方法可另外包括联合治疗，其包括宿主的免疫调节以促进本发明的施用细胞的有效性。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法还可以包括施用至少一种免疫调节剂。免疫调节剂的非限制性实例包括免疫抑制剂。
在一个实施方案中，表达DN形式的本发明的免疫抑制细胞可以与共表达CAR和转换受体的免疫抑制细胞共同施用。在待与不包含共刺激结构域(即，不为转换受体)的表达DN形式的免疫抑制细胞共同施用的这样的共表达CAR和转换受体的免疫抑制细胞中，CAR结合于所治疗的相同疾病或障碍的抗原。在另一个实施方案中，转换受体可以被转导到其中转导CAR和DN形式的相同细胞中，以使细胞重组表达所有三种构建体。供选择地和优选地，转换受体被转导到其中转导CAR而不是DN形式的细胞中，以便于产生表达转换受体和CAR二者的细胞，所述细胞可以与表达DN形式或CAR和DN形式二者而不表达转换受体的细胞一起用于联合治疗。在这种情况下，向对象施用两种类型的细胞，即表达DN形式的细胞和表达CAR和转换受体的细胞，或表达CAR和DN形式的细胞和表达CAR和转换受体的细胞。通常，两种类型的细胞同时施用，但也可以根据需要依次施用，例如，彼此在1或2小时内，或在1或2天内，或在同一天施用。在一个具体实施方案中，CAR的共刺激信号转导结构域不同于在相同细胞中表达的转换受体的共刺激信号转导结构域。这应在相同细胞中产生两个共刺激信号转导结构域以及增强用于免疫细胞疗法的细胞的功效。在认为所施用的免疫抑制细胞将在所治疗的对象中充分增殖使得不需要施用额外剂量的细胞的情况下，可能合适的是，在免疫细胞疗法开始时施用本发明的免疫抑制细胞。任选地，根据需要，本发明的免疫抑制细胞，包括任选的表达转换受体的免疫抑制细胞，可以多次施用。
在与表达DN形式的本发明的免疫抑制细胞的联合治疗中，施用免疫调节剂或表达CAR和转换受体的细胞可以与施用本发明的免疫抑制细胞同时发生，例如当免疫细胞治疗开始时同时发生，或根据需要，可以在免疫细胞治疗期间的任何时间依次发生。本领域技术人员可以基于所治疗对象的需要容易地确定用于在联合治疗中施用本发明的细胞和免疫调节剂，或表达CAR和转换受体的细胞的适宜方案，包括用于联合治疗的免疫调节剂的时机和剂量。
6.5.药物组合物
本发明另外提供了包含本发明的细胞的药物组合物。药物组合物包含有效量的本发明的细胞和药学上可接受的载体。本发明的细胞和包含所述细胞的组合物可以在无菌液体制剂中，例如通常是具有细胞悬液的等渗水溶液，或任选地作为通常将其缓冲至选定的pH的乳液、分散体等便利地提供。所述组合物可包含载体，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等，其对于细胞的完整性和活力，和对于施用细胞组合物是合适的。
根据需要，通过将本发明的细胞与各种量的其他成分在合适量的适宜溶剂中混合，可以制备无菌可注射溶液。这样的组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等，其适用于与细胞组合物一起使用并且适用于向对象例如人施用。用于提供细胞组合物的合适缓冲剂是本领域熟知的。使用的任何溶媒、稀释剂或添加剂都与保持本发明的细胞的完整性和活力相容。
组合物通常是等渗的，即它们具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明的细胞组合物的期望等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂如右旋糖、硼酸、酒石酸钠或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠特别优选用于含有钠离子的缓冲剂。一种特别有用的缓冲剂是盐水，例如生理盐水。本领域技术人员将认识到，组合物的组分应选择为化学惰性的，并且将不会影响本发明的细胞的活力或功效，并且将与向对象(如人)施用相容。技术人员可以容易地确定在本发明的方法中施用的组合物中的细胞和任选的添加剂、溶媒和/或载体的量。
本发明的细胞可以在任何生理学上可接受的溶媒中施用。本文描述了合适的施用剂量。包含本发明的细胞的细胞群体可以包含纯化的细胞群体。如本文所述，本领域技术人员可以使用各种熟知的方法容易地确定细胞群体中细胞的百分比。包含本发明的基因修饰细胞的细胞群体中的纯度范围可为约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量；例如，纯度降低可能要求剂量增加。
本发明还提供了用于制备本发明的细胞的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种用于产生基因工程改造的免疫抑制细胞(如调节性T细胞)的载体，所述免疫抑制细胞(如调节性T细胞)表达DN形式或共表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的CAR和DN形式。所述试剂盒可用于由源自对象的自体细胞或由非自体细胞产生基因工程改造的免疫抑制细胞，以施用于相容的对象。在另一个实施方案中，试剂盒可包含本发明的细胞，例如自体或非自体细胞，用于向对象施用。在具体实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的本发明的免疫抑制细胞。
应理解，在本文提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的各种实施方案的活性的修饰。因此，以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
7.实施例
该实施例描述了表达CAR和显性负性PD-1突变体的T细胞的构建和使用。虽然该实施例涉及不为调节性T细胞的CD4+T细胞和CD8+T细胞增强免疫应答的用途，而非涉及调节性T细胞提供免疫抑制的用途，但其描述了可以应用于本发明的方法。此外，虽然在CD4+T细胞和CD8+T细胞的情况下，但是下面描述的结果显示PD-1的显性负性形式可以充当显性负性并且可以维持表达PD-1的显性负性形式的T细胞的活性。
7.1.方法和程序
实验程序由纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter，MSKCC)的机构动物护理和使用委员会批准。每个实验使用不同的供者T细胞进行多次。为了避免混淆变量—如由于转导效率引起的差异、供者相关的变化性和E:T比率—数据使用代表性实验提供，样品重复3次以上。
细胞系.将MSTO-211H人胸膜间皮瘤细胞(ATCC,Manassas,VA)逆转录病毒转导以表达GFP和萤火虫荧光素酶融合蛋白(MSTO GFP-ffLuc+)。然后用亚克隆到SFG逆转录病毒载体中的人MSLN变体1转导这些细胞以产生MSTO MSLN+GFP-ffLuc+。类似地，用单独的人MSLN变体1转导A549细胞和3T3鼠成纤维细胞以产生A549 MSLN+和3T3 MSLN+细胞系。还用PD-L1共转导3T3细胞以产生3T3 MSLN+PDL1+细胞。
γ-逆转录病毒载体构建和病毒产生.为了产生MSLN-特异性CAR，对连接到人CD8前导序列结构域和CD8/CD3ζ、CD28/CD3ζ或CD8/4-1BB/CD3ζ结构域的编码对MSLN特异性的全人scFv m912的cDNA(由D.Dimitrov,National Cancer Institute，Frederick提供)(Feng等人,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))如前所述进行工程改造(Zhong等人,Mol.Ther.18(2):413-420(2010))。使用先前表征的PSMA靶向scFv，类似地产生对照PSMA特异性CAR(Gade等人,Cancer Res.65(19):9080-9088(2005))。为了构建PD-1 DNR，使用商业基因合成来编码与CD8跨膜和铰链结构域融合的PD-1受体的细胞外部分(氨基酸1-151)。将CAR序列插入SFGγ-逆转录病毒载体(由I.Riviere,MSKCC提供)，并与P2A序列连接以诱导LNGFR报告基因(截短的低亲和力神经生长因子受体)的共表达，或在PD-1 DNR的情况下，诱导mCherry荧光蛋白报告基因的共表达(Markley等人,Blood 115(17):3508-3519(2010)；Papapetrou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(31):12759-12764(2009))。然后将CAR和PD-1 DNR编码质粒转染到293T H29包装细胞系中以产生逆转录病毒，如前所述(Hollyman等人,J.Immunother.32(2):169-180(2009))。
T-细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离.根据机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者供者的血液中分离外周血白细胞。通过在Lymphoprep(Stem细胞Technology,Vancouver,Canada)上低密度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，并用植物凝集素(2μg/mL；Remel,Lenexa,KS)活化。分离后两天，用293T RD114产生的编码CAR和PD-1 DNR的逆转录病毒颗粒转导PBMC，并在包被有纤维连接蛋白(retronectin)(15μg/mL；r-纤连蛋白,Takara,Tokyo,Japan)的板上以3000rpm旋转接种1h。1天后，将转导的PBMC保持在IL-2(20UI/mL；Novartis,Basel,Switzerland)中。通过流式细胞术分析确定转导效率。纯的CD4+和CD8+CAR+ T细胞群体，或表达mCherry阳性PD-1 DNR和表达mCherry阳性EV的CAR+ T细胞群体，通过基于流式细胞术的分选获得(BD Aria Sorter；BD Biosciences,San Jose,CA)。
流式细胞术.使用藻红蛋白或别藻蓝蛋白缀合的抗人MSLN大鼠IgG2a(R&DSystems,Minneapolis,MN)检测人MSLN表达。使用以下抗体分析肿瘤细胞上共刺激或抑制蛋白的表达：4-1BBL(PE，克隆5F4；BioLegend，San Diego，CA)、MHC HLA-DR(PE，克隆L203；R&D Systems)、PD-L1(APC，克隆MIH1；eBioscience，San Diego，CA)、PD-L2(APC，克隆MIH18；eBioscience)和半乳糖凝集素-9(APC，克隆9M13；BioLegend)。用CD3、CD4、CD8和CD69m LNGFR的单克隆抗体测定T细胞表型和转导效率。使用PD1(APC,eBioJIU5；eBioscience)、TIM-3(PE，克隆344823；R&D Systems)和Lag-3(PE，克隆C9B7W；BioLegend)分析T细胞抑制性受体的表达。使用BD LSRII流式细胞仪(BD,Franklin Lakes,NJ)和FlowJo分析软件(FlowJo,Ashland,OR)分析细胞染色。
T-细胞功能试验.通过标准51Cr-释放试验测定用CAR或载体对照转导的T细胞的细胞毒性，如前所述(McCoy等人,National Cancer Institute Monograph 37:59-67(1973))。为了进行荧光素酶活性试验，将表达MSLN和萤火虫荧光素酶的CAR+ T细胞和MSTO-211H细胞以不同的E:T比孵育18h。在每孔加入100μL D-荧光素(15mg/mL)后，使用IVIS 100/lumina II，通过BLI测定肿瘤细胞数量，并将其与单独的肿瘤细胞发出的信号进行比较。在效应细胞和辐照的MSTO-211H MSLN肿瘤细胞在24孔板中以5:1的比例孵育18h后，进行CD107a和细胞内染色。对于CD107a试验，在刺激时加入5μL CD107a-PeCy7抗体(BDBiosciences,San Jose,CA)和Golgi STOP(4μL/6mL；BD Biosciences)。对于细胞内染色，在刺激时加入Golgi Plug(1μL/1mL；BD Biosciences)。孵育后，针对CD4、CD8、LNGFR和CD3标志物对效应细胞进行染色，然后根据制造商的说明书(Cytofix/Cytoperm Kit；BDBiosciences)进行固定和透化。使用颗粒酶B-APC、穿孔素-PE和IFN-γ–FITC抗体(BDBiosciences)进行细胞内细胞因子的染色。
通过一式三份在96孔圆底板中的200μL培养基中以1:1至5:1的比例共培养3×104至5×103个T细胞与靶细胞来进行细胞因子释放试验。共培养6至24h后，收集上清液。使用多重珠人细胞因子检测试剂盒，根据制造商的说明书(Millipore,Darmstadt,Germany)测定细胞因子水平。
为了分析T细胞的增殖能力，在有或没有MSLN表达的情况下(在3T3的情况下是在有或没有PD-L1的情况下)，在经辐照的MSTO-211H或3T3细胞上刺激1×106个CAR+ T细胞。在不存在外源IL-2的情况下进行增殖试验。每7天对细胞进行计数，然后覆盖在经辐照的靶细胞上以进行重复刺激。针对每个T细胞组绘制CAR+ T细胞数对时间的曲线。
原位胸膜间皮瘤动物模型和离体实验.为了产生胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，使用4至6周龄的雌性NOD/SCIDγ小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine)。所有程序均在批准的机构动物护理和使用委员会协议下进行。使用吸入的异氟醚和氧气麻醉小鼠，施用布比卡因用于镇痛。通过右胸切口直接胸膜内注射在200μL无血清培养基中的1×105至1×106个肿瘤细胞以建立原位MPM肿瘤，如前所述(Adusumilli等人,ScienceTranslational Medicine 6(261):261ra151(2014)；Servais等人,Clin.Cancer Res.18(9):2478-2489(2012)；Servais等人,in Current Protocols in Pharmacology,Enna编,第14章(Unit14 21),John Wiley&Sons(2011))。总共将3×104至1×105个转导的T细胞(在200μL无血清培养基中)过继转移到荷瘤小鼠中，通过直接胸膜内注射转移到胸腔中或通过尾静脉注射转移到全身。在单次腹膜内剂量的D-荧光素(150mg/kg；Perkin Elmer,Waltham,MA)后20分钟监测肿瘤生长并通过BLI体内定量。使用Living Image软件(版本2.60；Perkin Elmer)分析BLI数据；BLI信号报告为总通量(每秒光子数)，其表示腹侧和背侧通量的平均值。为了分析离体CAR T细胞的功能能力，如下处理肿瘤组织和小鼠脾脏：将组织称重并收获到冰冷的RPMI 1640中。用解剖刀手动地将组织颗粒化，然后通过40至100μm的过滤器机械解聚。接下来，通过FACS(荧光活化细胞分选)分析样品用于分型，或者使用FACS Aria分选仪分选CAR+CD4+或CD8+ T细胞，然后在含有IL-2(60UI/mL)的RPMI中静置24h，并如上所述进行51Cr-释放和细胞因子释放试验。
组织学分析和免疫染色.在对石蜡包埋的4％多聚甲醛固定的组织样品进行苏木精和曙红(H&E)染色后，进行肿瘤的组织病理学评价。用小鼠抗人MSLN免疫球蛋白G对人MSLN进行免疫组织化学分析，如前所述(Kachala等人,Clin.Cancer Res.20(4):1020-1028(2014)；Rizk等人,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.21(3):482-486(2012)；Tozbikian等人,PLoS One 9(12):e114900(2014)))。
定量实时PCR.提取来自CD4+ LNGFR+或CD8+LNGFR+分选的T细胞的mRNA，并使用μMACS One-Step cDNA试剂盒(MACS molecular,Miltenyi Biotech Inc,Auburn,USA)逆转录到cDNA中。使用Applied7500系统(Foster,CA,USA)、UniversalPCR Mastermix和用6-羧基荧光素(FAM-MBG)标记并由Life Technologies(Carlsbad,CA)设计的以下探针，使用方法进行定量实时PCR(RT-PCR)：Tbet(Hs00203436_m1)；Eomes(Hs00172872_m1)；颗粒酶B(Hs01554355_m1)；IFN-γ(Hs00989291_m1)；IL-2(Hs00174114_m1)；PD-1(Hs01550088_m1)。使用目标基因的比较阈值循环(CT)，并使用下式相对于β2m管家基因归一化：ΔCt(样品)＝Ct(目标基因)-Ct(β2m)。然后，使用2-ΔΔCt方法分析与对照条件相比的相对倍数变化表达，并计算如下：2-ΔΔCt＝2^-(ΔCt(样品)-ΔCt(对照))。
统计方法.使用Prism(6.0版；GraphPad Software,La Jolla,CA)软件分析数据，并以平均值±SEM表示，如图例中所述。使用非配对学生t检验(双尾)分析结果，适用时，使用Bonferroni校正用于多重比较。使用对数秩和检验分析生存曲线。统计学显著性定义为P<0.05。所有统计分析均使用Prism软件进行。
7.2.具有CD28或4-1BB共刺激的CAR在初始抗原刺激时显示等价的效应细胞因子分泌和体外增殖
构建三种CAR，其掺入人MSLN特异性scFv(Feng等人,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))和CD3ζ、CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζ信号转导结构域中任一种(Mz、M28z、MBBz)(图1A和1B)。对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有特异性的P28z CAR充当控制同种异体反应性和异种反应性的负效应物。使用SFG-逆转录病毒载体(50％-70％转导)有效转导CD4+和CD8+人外周血T淋巴细胞(图2)。MSLN转导的MSTO-211H细胞(MSLN+)和PSMA转导的EL-4小鼠淋巴瘤细胞(MSLN-)在体外实验中充当MSLN阳性和阴性靶标。Mz-、M28z-和MBBz-转导的T细胞在体外显示类似的MSLN特异性溶解(图1C)。P28z CAR T细胞不溶解MSTO MSLN+细胞，并且MSLN靶向的CAR不溶解EL4 PSMA+细胞，证明溶解是抗原特异性的。在验证共刺激信号转导的功能时(Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13(18Pt 1):5426-5435(2007))，当在不存在外源IL-2的情况下与Mz相比，M28z和MBBz CAR T细胞分泌高2至15倍水平的Th1细胞因子(图1D)，并在重复暴露于MSLN+细胞时实现了高14倍的T细胞积聚(图1E)。在已经建立了抗原特异性并验证了共刺激信号转导结构域的功能后，对MSLN靶向的CAR T细胞在荷有已建立的胸膜肿瘤的小鼠中的治疗潜力进行评价。
这些结果证明具有CD28或4-1BB共刺激的CAR在初始抗原刺激时显示等价的效应细胞因子分泌和体外增殖。
7.3.间皮素CAR T细胞在体内抗原暴露后变得耗尽
为了评估是否存在对CAR T细胞的持续免疫抑制并比较M28z和MBBz CAR T细胞克服肿瘤介导的免疫抑制的相对能力，将1×106个CAR T细胞注射到荷MSTO MSLN+肿瘤小鼠的胸膜腔中，允许有足够的时间重复抗原遭遇和T细胞活化(通过前向和侧向散射以及活化标志物CD69的上调证实)，然后对具有MSLN+靶标的收获的CD4或CD8 CAR肿瘤浸润的T细胞或脾脏T细胞进行离体刺激(示意图显示在图3A中)。未注射的体外静息T细胞(“输注前细胞”)用于建立功能的基线水平(在抗原暴露之前)。与静息M28z CD8+ CAR T细胞相比，暴露于体内MSLN抗原的T细胞具有更低水平的溶细胞功能(图3A)(输注前细胞裂解，20.5％；肿瘤浸润的T-细胞裂解，13.1％；脾脏T细胞裂解，8.7％)。相反，MBBz CAR T细胞保留溶细胞功能(输注前细胞裂解，18.3％；肿瘤浸润的T-细胞裂解，37.2％；脾脏T细胞裂解，22.2％)。分选的CD4+ CAR T细胞显示出类似的结果模式。
还在离体刺激肿瘤浸润的和脾脏CAR T细胞时测量细胞因子水平，并观察到体内暴露于MSLN+抗原的CD4+ M28z CAR T细胞的Th1细胞因子分泌减少。CD4+ MBBz CAR T细胞也显示Th1细胞因子分泌减少，但是与M28z CAR T细胞相比，这些细胞能够更好地保留细胞因子分泌(图3B)。与CD4+ T细胞上清液相比，CD8+ T细胞上清液含有显著更低水平的细胞因子(Adusumilli等人,Science Translational Medicine 6(261):261ra151(2014)先前观察到的发现结果)。CD8+ T细胞在体内抗原暴露时也具有降低的分泌细胞因子的能力；CD8+ MBBz CAR T细胞优先保留其分泌IFN-γ的能力。评估施用后第3天从肿瘤和脾脏收获的T细胞的mRNA水平，发现除了在CD8+亚群中的IL-2表达以外，CD4+和CD8+ MBBz CAR T细胞的GzB、IL-2和IFN-γ的体内表达水平比M28z CAR T细胞更高(图3C)。
这些结果表明，在体内抗原暴露后，间皮素CAR T细胞变得耗尽。
7.4.MBBz CAR T细胞显示延迟的体内耗尽
在已经显示在体内暴露于抗原的共刺激的CAR T细胞中细胞溶解功能和效应细胞因子分泌二者的抑制的情况下，有理由认为重复抗原刺激可以与慢性感染模型类似，在T细胞抑制中发挥作用，并且认为在重复抗原遭遇时保留功能的不同能力可能解释了MBBz CART细胞的增强功效。因此，测试Mz、M28z和MBBz CAR T细胞在体外模型系统中经受重复抗原遭遇的能力，其中每7天在MSLN+抗原刺激时评估细胞的增殖、细胞溶解功能和细胞因子分泌。M28z和MBBz CAR T细胞在连续MSLN+刺激时具有相似的扩增能力，扩增至比Mz CAR T细胞高14倍的水平；它们在第三次刺激后丧失扩增能力(图4A)。尽管MBBz CAR T细胞能够更好地保留溶解功能，但MBBz和M28z CAR T细胞在重复抗原刺激时均丧失细胞溶解功能。虽然在第一次刺激时三种T细胞群之间的溶解是相同的，但通过第三次刺激，M28z溶解功能被抑制到更显著的水平，使得MBBz CAR T细胞在多个E:T比率下具有增强的肿瘤溶解(图4B，右图)。在第三次刺激时的溶解功能(通过测量CD107a表达的脱粒试验评估)与铬释放试验的结果相关(图4C)。
接下来，测量Th1细胞因子分泌。在第一次刺激时注意到M28z和MBBz CAR T细胞之间的相似水平，以及在每次刺激的情况下连续降低。与细胞毒性一样，MBBz CAR T细胞优先保留细胞因子分泌；当比较第一次和第二次刺激时的水平时，M28z的细胞因子浓度降低>30倍，MBBz CAR T细胞的细胞因子浓度仅降低约2倍(图4D)。通过在第二次刺激时测量细胞因子的细胞内水平来证实细胞因子产生的差异。抗原刺激时CAR T细胞的逆转录酶PCR分析显示，与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达与较低水平的耗尽和抑制相关的标志物；MBBz CAR T细胞表达较高水平的Tbet和脱中胚蛋白和较低水平的PD1和FoxP3(图5)。测试了已经暴露于肿瘤抗原的持久性的CAR T细胞的体内功能。虽然M28z和MBBz CAR T细胞之间的定量持久性相等，但是认为MBBz CAR T细胞在肿瘤再激发时表现出增强的功能。向具有已建立的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠胸膜内施用M28z或MBBz CAR T细胞(剂量为1×105个，E:T比例为1:3000)以根除胸膜肿瘤(图4E)。在初始T细胞注射后20天，通过将MSLN+肿瘤细胞(1×106个)注射到生存者的胸膜腔中来进行肿瘤再激发；使用BLI监测肿瘤负荷。持久的MBBz CAR T细胞能够更好地控制肿瘤负荷(4只MBBz处理的小鼠中有4只具有在基线水平的BLI信号，而4只M28z处理的小鼠中有2只)(图4E)。
这些结果表明MBBz CAR T细胞在体内显示出延迟的耗尽。
7.5.肿瘤细胞PD-L1抑制间皮素CAR T细胞效应子功能
已经确定CAR T细胞被体内肿瘤环境抑制并且MBBz CAR T细胞能够更好地克服该抑制，至少部分是因为它们在重复抗原遭遇时能够保持功能(参见上文)，接下来，我们试图评估抑制性受体和配体途径在模型中的作用。在具有肿瘤进展的M28z处理的小鼠中，肿瘤浸润的T细胞被染色以表达熟知的抑制途径。发现PD-1、Tim-3和LAG-3的高水平表达(图6A)。施用6天后收获的肿瘤浸润的MBBz CAR T细胞也显示出抑制性受体的上调，但是它们在蛋白和mRNA水平均表达显著较低水平的PD-1受体(图6B-D)。与CD8+ T细胞相比，CD4+ T细胞表达更高水平的PD-1。还观察到显著部分的M28z和MBBz CAR T细胞二者共表达PD-1和LAG-3或PD-1和Tim-3，表明多种抑制途径可同时起作用(图7)。接下来，评估肿瘤表达的配体：PD-L1和PD-L2(PD-1的配体)、半乳糖凝集素-9(Tim-3的配体)和MHC II类(LAG-3的配体)。PD-1配体仅在胸膜内施用M28z CAR T细胞后收获的胸膜肿瘤细胞上表达(图6E)。如其他地方所报道的(McGray等人,Mol.Ther.22(1):206-218(2014)；Spranger等人,ScienceTranslational Medicine 5(200):200ra116(2013))，肿瘤细胞与IFN-γ和TNF-α的共培养(浓度与图1和图4中的T细胞分泌的浓度相似)导致肿瘤细胞上相似水平的PD-L1和PD-L2表达的上调(图6F)，反映了肿瘤细胞抵抗免疫攻击的适应性(“适应性免疫抗性”)。PD-1受体和配体在体内的表达的独特存在表明该途径可以发挥显著的抑制作用。
由于一些研究表明，共刺激可能足以克服PD-1的抑制作用(Carter等人,Eur.J.Immunol.32(3):634-643(2002)；Freeman等人,J.Exp.Med.192(7):1027-1034(2000)；Koehler等人,Cancer Res.67(5):2265-2273(2007))，因此接下来评估过表达的PD-L1是否能够在PD-L1介导的免疫抑制的体外模型中抑制CAR T细胞功能(使用用单独的MSLN(MSLN+)或用MSLN和PD-L1(MSLN+PD-L1+)转导的3T3小鼠成纤维细胞)(图8A)。在M28z和MBBz CAR T细胞二者中，PD-L1过表达导致连续刺激(图8B)和Th1效应细胞因子分泌(图8D)时积聚减少。尽管在初始刺激时肿瘤细胞溶解未被抑制，但是在针对MSTO MSLN+肿瘤细胞的两次刺激之后用3T3s作为靶标进行的铬释放试验显示M28z和MBBz CAR T细胞中的溶解功能均降低，M28z CAR T的降低程度更高(图8C)。该结果可能是由于在暴露于MSTO MSLN+肿瘤细胞后，M28z和MBBz CAR T细胞上PD-1的差异上调。
这些结果显示肿瘤细胞PD-L1抑制间皮素CAR T细胞效应子功能。
7.6.细胞内在PD-1抗性拯救M28z CAR T-细胞的体内功能
上述结果表明PD-1途径是肿瘤介导的免疫抑制的功能机制，并且在重复抗原刺激后的PD-1上调降低了CAR T细胞功效。因此，检查点阻断与CD28共刺激信号转导相结合。由于目标是提供不依赖于全身施用的抗体的重复给药的CAR T细胞特异性检查点阻断，因此研究集中于克服免疫抑制的基因工程改造方法。构建PD-1显性负性受体(DNR)，其含有与CD8跨膜结构域融合的受体的细胞外配体结合结构域。由于PD-1 DNR缺乏任何信号转导结构域，因此认为充分过表达的受体通过使PD-1配体饱和，从而通过内源性PD-1受体阻断信号转导来增强T细胞功效。将M28z CAR T细胞用通过P2A元件连接到mCherry报告基因(PD-1DNR)的PD-1 DNR或仅含有报告基因(EV)的空载体共转导(图9A)。用PD-1 DNR共转导的M28zCAR T细胞在增殖能力方面具有轻微但统计学上显著的优势(图9B)，在多个E:T比率下增强的细胞毒性(图9C)，以及增加的IL-2和IFN-γ分泌水平(图9D)。
接下来，评估用基因工程改造的PD-1抗性共转导的M28z CAR T细胞的胸膜内施用是否将提供体内优势。向具有已建立的胸膜MSLN+表达肿瘤的小鼠施用单次胸膜内剂量的5×104个CAR+M28z EV或M28z PD-1 DNR T细胞，并通过肿瘤负荷测量(使用连续BLI)和中位生存来监测治疗应答。用M28z PD-1 DNR T细胞处理的小鼠具有显著增强的肿瘤负荷控制和延长的中位生存(图9E)；然而，仅一些小鼠(7/16，44％)具有长期无肿瘤生存，表明存在必须克服的冗余免疫抑制机制。尽管有重复肿瘤再激发，但该实验中的同期群组的小鼠(M28z PD-1 DNR)存活超过450天，表明用PD-1 DNR转导的CAR T细胞的“功能持久性”。这些结果表明，通过注射50,000个CAR T细胞，不仅消除了大的肿瘤负荷，而且尽管在超过15个月有多次肿瘤再激发，仍然阻止了肿瘤复发。
为了研究克服PD-1介导的免疫抑制的供选择的遗传策略，用表达靶向PD-1的shRNA的载体共转导M28z CAR T细胞(图10A)，其在蛋白水平产生>60％的PD-1受体敲低(图10B)。与用靶向非哺乳动物基因的shRNA(M28z KanR)共转导相比，在M28z CAR T细胞中，用PD-1 shRNA共转导增强了MSLN+抗原刺激时的增殖功能(图10C)，增强细胞毒性(图10D)，并且在用间皮瘤细胞或MSLN+ PDL1+ 3T3小鼠成纤维细胞刺激时增强细胞因子分泌(图10E)。M28z PD-1 shRNA转导的T细胞没有比M28z KanR T细胞实现更高的体内肿瘤排斥功效，但值得注意的是，体内敲低水平显著低于体外。因此，PD1 DNR被证明是比RNA干扰方法更有效的体内策略。
这些结果表明细胞内在的PD-1抗性拯救M28z CAR T细胞体内功能。
7.7 PD-1 DNR与PD-L1和PD-L2均有效结合
为了测试PD-1 DNR与配体PD-L1和PD-L2的结合，将用mCherry标记并用PD-1 DNR转导的T细胞暴露于包被有与Fc融合的PD-L1(“PD-L1 Fc”)、与Fc融合的PD-L2(“PD-L2Fc”)或对照同种型Fc(“iso Fc”)的板。用mCherry构建体转导人T细胞，以用mCherry标记T细胞，基本上如7.6节所述。PD-L1 Fc融合体、PD-L2 Fc融合体和对照Fc是商购的。
将包被有PD-L1 Fc融合蛋白、PD-L2 Fc蛋白或对照同种型Fc的板暴露于单独的mCherry标记的T细胞、在PD-1抗体存在下的mCherry标记的T细胞、用PD-1 DNR转导的mCherry标记的T细胞和在PD-1抗体存在下用PD-1 DNR转导的mCherry标记的T细胞。
如图11所示，与具有mCherry且没有PD-1 DNR转导的对照T细胞相比，用PD-1 DNR转导的T细胞与PD-L1和PD-L2二者有效结合。这些结果表明PD-1 DNR与PD-L1和PD-L2二者结合。由于一些肿瘤细胞表达PD-L1或PD-L2，并且由于一些免疫细胞(T细胞和非T细胞，如巨噬细胞等)表达PD-L1或PD-L2，因此明显的是，PD-1 DNR与PD-L1和PD-L2二者结合。因此，用PD-1 DNR转导的T细胞可以中和PD-L1和PD-L2二者。
7.8向PD-1 DNR增加细胞内4-1BB信号转导改善CAR T细胞效率
抑制PD-L1或PD-L2介导的T细胞活化抑制的PD-1 DNR可以转化为正共刺激信号。用具有CD28和CD3ζ结构域(M28z)的间皮素特异性(MSLN特异性)CAR转导人T细胞(也参见上文第7.2节中对m28z的描述)。为了抵消PD-1/PD-L1抑制，通过用与跨膜结构域融合的PD-1显性负性受体(PD-1 DNR)转导M28z CAR T细胞来评价细胞内在基因工程策略，所述跨膜结构域与4-1BB细胞内信号转导结构域融合，所述4-1BB细胞内信号转导结构域也称为转换受体。
图12A显示说明CAR和PD-1 DNR的共表达的示意图。图12A的下部表示表达与靶细胞上的抗原结合的CAR的T细胞，在图12A中例示为表达肿瘤细胞抗原间皮素(MSLN)的肿瘤细胞。表达肿瘤细胞抗原特异性CAR的T细胞与表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的结合导致T细胞的活化。PD-1 DNR的共表达抑制通过PD-L1或PD-L2与野生型PD-1结合介导的免疫检查点抑制剂途径。图12B显示说明CAR和PD-1 DNR的共表达的示意图，其中PD-1 DNR通过将共刺激分子(例如4-1BB)与跨膜结构域融合而转化为共刺激构建体，所述跨膜结构域与PD-1的配体结合结构域融合。这种构建体是本文称为转换受体的构建体的实例(参见Liu等人,Cancer Res.76:1578-1590(2016))。4-1BB结构域充当T细胞活化的第二共刺激信号。
用M28z CAR，M28z CAR和PD-1 DNR二者，或M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体二者转导人T细胞。将转导的细胞进行抗原刺激并分析培养物中的T细胞积聚。如图12C所示，M28z CAR T细胞积聚在第7天增加，并且当用PD-1 DNR或PD-1/4-1BB转换受体构建体转导表达M28z CAR的T细胞时，积聚增强。
图12D显示在用M28z CAR，M28z CAR和PD-1 DNR二者，或M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体二者转导的人T细胞中的干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子分泌。基本上如以上第7.1节所述进行细胞因子分泌试验。如图12D所示，相对于在表达M28z CAR的细胞或共表达M28zCAR和PD-1 DNR的细胞中观察到的细胞因子分泌，在表达M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体的细胞中，IFN-γ、IL-2、TNF-α和GM-CSF的分泌增强。这些结果表明PD-L1(或PD-L2)抑制可以通过在T细胞中用M28z CAR共转导PD-1/4-1BB转换受体构建体而转化为正共刺激信号，导致增加的细胞因子分泌和T细胞积聚。
7.9.实验结果概述和讨论
如上所述，CAR T细胞疗法和PD-1检查点阻断已被证明是实体肿瘤模型中的合理组合。进行体外和离体刺激试验以评估PD-1/PD-L1抑制对间皮素CAR T细胞功能的影响。为了直接抵消PD-1介导的抑制，使用逆转录病毒载体将CAR介导的共刺激与PD-1 DNR组合。由该组合策略(共刺激和检查点阻断)提供的最佳信号转导在肿瘤编码的PD-L1表达的存在下增强T细胞功能，导致在单次低剂量的CAR T细胞后的长期无肿瘤存活。这些研究与过继性T细胞治疗的临床实践相关，并且由于以下原因立即转化：(1)测试的共刺激信号转导结构域—CD28和4-1BB—是正在进行的临床试验中使用的两个共刺激结构域(NCT02414269、NCT02159716、NCT01583686)，(2)胸膜间皮瘤模型概括了人类疾病，并利用大的、临床相关的肿瘤负荷来阐明T细胞耗尽的相关性(Adusumilli等人,Science TranslationalMedicine 6(261):261ra151(2014)；Servais等人,Clin.Cancer Res.18(9):2478-2489(2012)；Servais等人,Current Protocols in Pharmacology,Enna编.,第14章(Unit1421),John Wiley&Sons(2011)；Servais等人,PLoS One 6(10):e26722(2011))，和(3)通过基因编码的检查点阻断来增强CAR T细胞的策略使用可以容易地应用于临床的人序列(Adusumilli等人,Science Translational Medicine 6(261):261ra151(2014)；Feng等人,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))。
在M28z CAR T细胞中相对较高的PD-1表达导致集中于CD28刺激的CAR T细胞。在该分析的基础上，寻求遗传策略以抵消PD-1抑制性信号转导，例如产生PD-1显性负性受体(PD-1 DNR)和靶向PD-1的shRNA。当以足够的水平表达时，PD-1 DNR与内源性PD-1受体竞争结合PD-1配体(PD-L1和PD-L2)。用PD-1 DNR共转导的CD28共刺激的T细胞显示出增强的体外T细胞功能和体内T细胞功效，表明PD-1信号转导是肿瘤细胞在肿瘤模型中逃避CAR T细胞的重要机制。尽管仅有靶向PD-1的shRNA显示体外功效，但体内功效的缺乏可能与通过多次体内抗原遭遇后诱导的大量PD-1转录物饱和shRNA机制有关，该结论得到PD-1敲低在体内显著低于体外这一发现的支持。上述发现指出了过继转移的T细胞的治疗有效性，所述T细胞经基因工程改造以抵抗肿瘤介导的免疫抑制。靶向TGF-β的DNR已在临床前模型中得到验证，目前正在临床试验中进行测试(Foster等人,J.Immunother.31(5):500-505(2008)；Bollard等人,Blood 99(9):3179-3187(2002))。
尽管其他人已经在体内或体外将T细胞疗法与PD-1阻断抗体组合，但是在以上实验中描述的用于共抑制阻断的遗传策略的加入克服了限制抗体疗法的几个主要障碍，包括(1)依赖于抗体的重复施用，和(2)免疫相关的不良事件的发生率。因此，T细胞疗法优于抗体疗法，因为它可以建立经程序化以用于抵抗单剂量后的抑制的T细胞的长期植入，并且因为它提供了限于肿瘤靶向T细胞库的抑制途径的阻断，所述细胞库可以限制由更广泛应用的抗体检查点阻断导致的自身免疫。此外，PD-L1阻断抗体可能可以进一步延长M28z和M28zPD-1 DNR CAR T细胞的功效。
上述研究已经确定了负责CAR T细胞的抑制机制之一，并突出了抵抗免疫抑制的共刺激策略的能力的差异。其他抑制途径也可以起到潜在地限制T细胞功能的作用。用PD-1DNR共转导的M28z CAR T细胞处理的一部分小鼠死于肿瘤进展，这表明其他抑制机制的作用。此外，关于慢性感染的文献表明存在细胞内在和细胞外在的其他抑制机制，在肿瘤靶向的T细胞疗法中评估所述机制(Moon等人,Clin.Cancer Res.20(16):4262-4273(2014)；Riese等人,Cancer Res.73(12):3566-3577(2013))。关于抑制性信号转导的另外的研究可以使用免疫活性模型，其包括诸如髓源性抑制细胞和内源性T细胞的元件，其已经显示在肿瘤免疫逃避中起重要作用。
上述结果已经确定了肿瘤介导的CAR T细胞效应子功能抑制的重要性。通过对T细胞效应子功能进行全面分析，已经确定的是，尽管表现出增强的持久性，但是甚至共刺激的CAR T细胞在体外和肿瘤微环境内在重复抗原遭遇时均会经历抑制。所描述的结果显示CART细胞疗法可以用于抵消抑制性信号转导，并提供工程改造信号转导结构域的灵活性，所述信号转导结构域提供最佳共刺激并直接抵消抑制信号，如PD-1。此外，在正在进行的CAR T细胞疗法临床试验中，对于显示T细胞浸润但临床反应有限的患者，可以在利用CAR T细胞疗法后组合PD-1/PD-L1阻断来提高CAR T细胞疗法的功效。从临床试验获得的知识和本文提出的策略对于改善使用CAR T细胞的免疫治疗方法是非常有价值的，所述方法特别用于治疗实体瘤。因此，上述结果例示了可以在临床环境中应用以改善CAR T细胞疗法的功效的方法。
如上所述，模拟低水平肿瘤浸润，并且发现CAR T细胞可以对肿瘤细胞介导的免疫抑制敏感，导致T细胞功能受损和肿瘤排斥减弱。经工程改造以抵抗PD-1信号转导的T细胞显示出增强的抗肿瘤效力。在晚期肿瘤的单次低剂量CAR T细胞治疗后，观察到响应于CART细胞分泌的细胞因子，肿瘤细胞上调PD-L1，导致CAR T细胞抑制和肿瘤复发。为了直接克服PD-L1介导的免疫抑制，设计了缺乏细胞内抑制信号转导结构域的PD-1显性负性受体(PD-1 DNR)。用CAR共转导PD-1 DNR增强CAR T细胞功能，导致单次低剂量CAR T细胞后的长期无癌生存。免疫检查点途径受体DNR与CAR的共表达可立即转化到临床，因为可将DNR添加到任何CAR而不抑制CAR功能或增加毒性。不受特定理论的束缚，认为DNR简单地结合(消耗)由其相应配体诱导的负信号(例如，在PD-1的情况下为PD-L1)并且避免下游信号转导。
表达CAR和免疫检查点抑制剂的显性负性形式的免疫细胞的有效性也可以通过转换受体的表达来增强，其中细胞内共刺激信号转导结构域与跨膜结构域融合，所述跨膜结构域与免疫检查点抑制剂(如PD-1)的细胞外配体结合结构域融合。上述结果显示，与融合于4-1BB的胞浆结构域的跨膜结构域融合的PD-1细胞外结构域的表达增加了细胞因子的产生并增加了CAR T细胞的积聚。在表达CAR的免疫细胞中表达转换受体可以改善用于免疫疗法的免疫细胞的功效。供选择地，转换受体可以在没有CAR的细胞中表达，在这种情况下，转换受体起显性负性的作用。表达CAR和转换受体的免疫细胞可以与以下同时或依次施用：表达免疫检查点抑制剂的显性负性形式(其不包含共刺激信号转导结构域，因此不是转换受体)的免疫细胞，或共表达CAR和免疫检查点抑制剂的显性负性形式(其不包含共刺激信号转导结构域，因此不是转换受体)的细胞，以增强使用这样的免疫细胞的免疫疗法的有效性。
8.引用的参考文献
本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请出于所有目的被具体和单独地指出通过引用整体并入。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅以实例方式提供，并且本发明仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等价方案的全部范围的限制。
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Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc c 321
<210> 5
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 6
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 7
<211> 199
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro
165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
<210> 8
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成肽"
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成接头肽"
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
115 120 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
<210> 12
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys
20 25 30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
35 40 45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50 55 60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
65 70 75 80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
85 90 95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
100 105 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
115 120 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130 135 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
165 170 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
180 185 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
195 200 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210 215 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225 230 235 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
260 265 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
275 280 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290 295 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305 310 315 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
325 330 335
Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
340 345 350
Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
355 360 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370 375 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile
385 390 395 400
Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile
405 410 415
Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met
420 425 430
Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro
435 440 445
His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
450 455
<210> 13
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 14
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Ala Ala Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
165 170 175
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
180 185 190
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
195 200 205
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
210 215 220
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
225 230 235 240
Arg Arg Ile Gln
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成肽"
<400> 15
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
20
<210> 16
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成多肽"
<400> 16
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 17
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成多肽"
<400> 17
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Ala Ala Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
165 170 175
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
180 185 190
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
195 200 205
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
210 215 220
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
225 230 235 240
Arg Arg Ile Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
245 250 255
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Lys Gly Glu
260 265 270
Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His
275 280 285
Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly
290 295 300
Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr
305 310 315 320
Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe
325 330 335
Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp
340 345 350
Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met
355 360 365
Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu
370 375 380
Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe
385 390 395 400
Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala
405 410 415
Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile
420 425 430
Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val
435 440 445
Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr
450 455 460
Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr
465 470 475 480
Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly
485 490 495
Met Asp Glu Leu Tyr Lys
500
<210> 18
<211> 1726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 18
accggtggta cctcaccctt accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac 60
taagaaccta gaacctcgct ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc 120
cctcaaagta gacggcatcg cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc 180
cgggggtgga ccatcctcta gactggccac catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt 240
cgtctgggcg gtgctacaac tgggctggcg gccaggatgg ttcttagact ccccagacag 300
gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg gtgaccgaag gggacaacgc 360
caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc gtgctaaact ggtaccgcat 420
gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgctttcccc gaggaccgca gccagcccgg 480
ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg cgtgacttcc acatgagcgt 540
ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt ggggccatct ccctggcccc 600
caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg gtgacagaga gaagggcaga 660
agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc ggccaggcgg ccgcacccac 720
cacgacgcca gcgccgcgac caccaacccc ggcgcccacg atcgcgtcgc agcccctgtc 780
cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 840
cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cctggccggg acttgtgggg tccttctcct 900
gtcactggtt atcacccttt actgcaacca caggcggatc caaggatctg gagcaacaaa 960
cttctcacta ctcaaacaag caggtgacgt ggaggagaat cccggcccca tggtgagcaa 1020
gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga 1080
gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga 1140
gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga 1200
catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat 1260
ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt 1320
cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat 1380
ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa 1440
gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg 1500
cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac 1560
cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt 1620
ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg 1680
ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa ctcgag 1726
<210> 19
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 20
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
165 170 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
180 185 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
245 250 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
260 265 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
275 280 285
Ser
<210> 21
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 22
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 23
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 24
<211> 287
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Thr Ile His Thr Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Glu Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val
35 40 45
Cys Arg Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Asp Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ser Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala
85 90 95
Gly Leu Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln
100 105 110
Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro
130 135 140
Ser Asp Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys
145 150 155 160
Ala Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Gly Val Ser Val Val Phe Leu Phe
165 170 175
Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys Leu His Arg Gln Asn Gln Ile
180 185 190
Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu Glu Gln Lys Pro Gln Gln
195 200 205
Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala
210 215 220
Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala
225 230 235 240
Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His
245 250 255
Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala Val Ser Pro Gln Ser Thr
260 265 270
Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala Ala Val Ala Arg His
275 280 285
<210> 25
<211> 370
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val
1 5 10 15
Tyr Gln Gly Lys Gly Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Val Pro Leu Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val
35 40 45
Asp Ser Ile Ala Trp Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His
50 55 60
His Ile Leu Lys Trp Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Phe Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala
85 90 95
Ala Gln Gln Gln Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile
100 105 110
Ser Gly Lys Val Gln Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser
115 120 125
Leu Leu Pro Asp Lys Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys
130 135 140
Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser
145 150 155 160
Arg Asp Gly Asn Val Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn
180 185 190
Gly Thr His Thr Tyr Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu
195 200 205
Ser His Thr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu
210 215 220
Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu
260 265 270
Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala
340 345 350
Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val
355 360 365
Tyr Ser
370
<210> 26
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His
35 40 45
Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg
50 55 60
Ser Gly Asp Cys Ser Pro Glu Thr Ser Leu Lys Gln Leu Arg Leu Lys
65 70 75 80
Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Gln Val Thr Pro Leu His Ser Gly Thr Tyr Gln Cys
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe
115 120 125
Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr Thr Val Thr Gly Leu Lys
130 135 140
Gln Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser
145 150 155 160
Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val
165 170 175
Ala Leu Gln Ala Leu
180
<210> 27
<211> 592
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn
35 40 45
Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
50 55 60
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
85 90 95
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
115 120 125
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
145 150 155 160
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
180 185 190
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
195 200 205
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
210 215 220
Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His
225 230 235 240
Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys
245 250 255
Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp
260 265 270
Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe
290 295 300
Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser
305 310 315 320
Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu
325 330 335
Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe
340 345 350
His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser
355 360 365
Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala
370 375 380
His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile
385 390 395 400
Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu
405 410 415
Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr
420 425 430
Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg
435 440 445
Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val
450 455 460
Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp
465 470 475 480
Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu
485 490 495
Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met
500 505 510
Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe
515 520 525
Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu
530 535 540
Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala
545 550 555 560
Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser
565 570 575
Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
580 585 590
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述：合成肽"
<400> 28
Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Tyr Val Lys Met
1

Claims (96)

1.一种细胞，其为免疫抑制细胞，所述细胞重组表达细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述免疫抑制细胞是调节性T细胞。
3.权利要求2所述的细胞，其中所述调节性T细胞是人CD4+CD25+T细胞。
4.权利要求2所述的细胞，其中所述调节性T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
5.权利要求1所述的细胞，其中所述免疫抑制细胞是滤泡调节性T细胞。
6.权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中所述细胞是FoxP3+。
7.权利要求1所述的细胞，其中所述免疫抑制细胞是调节性B细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的免疫抑制细胞的群体。
9.一种人调节性T细胞的多克隆群体，该人调节性T细胞为CD4+CD25+，并且重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
10.权利要求9所述的细胞的多克隆群体，其中所述人调节性T细胞是CD127lo/-。
11.一种调节性T细胞，所述调节性T细胞重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
12.权利要求11所述的细胞，其中所述调节性T细胞是人CD4+CD25+T细胞。
13.权利要求11所述的细胞，其中所述调节性T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
14.权利要求11所述的细胞，其中所述免疫抑制细胞是滤泡调节性T细胞。
15.权利要求1-14中任一项所述的细胞或群体，其中所述抑制剂是免疫检查点抑制剂。
16.权利要求15所述的细胞或群体，其中所述免疫检查点抑制剂选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞-活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160。
17.权利要求16所述的细胞或群体，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1。
18.权利要求1-14中任一项所述的细胞或群体，其中所述抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
19.权利要求1-18中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体识别抗原并且被抗原敏化，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。
20.权利要求1-18中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体还表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR结合于抗原，所述抗原是与免疫介导的障碍相关的病理性免疫应答的靶标。
21.权利要求20所述的细胞或群体，其中所述显性负性形式是包含以下的多肽：(a)免疫检查点抑制剂的细胞外结构域的至少部分，其中所述部分包含配体结合区，和(b)跨膜结构域。
22.权利要求21所述的细胞或群体，其中所述显性负性形式还包含与共刺激信号转导结构域的融合，其中所述共刺激信号转导结构域是显性负性形式的跨膜结构域的羧基末端。
23.权利要求22所述的细胞或群体，其中所述共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。
24.权利要求22所述的细胞或群体，其中所述CAR包含共刺激信号转导结构域。
25.权利要求24所述的细胞或群体，其中所述显性负性形式的共刺激信号转导结构域不同于所述CAR的共刺激信号转导结构域。
26.权利要求24或25所述的细胞或群体，其中所述CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。
27.权利要求24-26中任一项所述的细胞或群体，其中所述显性负性形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。
28.权利要求19或20所述的细胞或群体，其中所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮和过敏性障碍。
29.权利要求28所述的细胞或群体，其中所述免疫介导的障碍是器官移植排斥。
30.权利要求29所述的细胞或群体，其中所述移植器官是肺。
31.权利要求30所述的细胞或群体，其中所述抗原选自MHC I类、MHC II类、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。
32.权利要求29所述的细胞或群体，其中所述移植器官是肾脏。
33.权利要求32所述的细胞或群体，其中所述抗原选自MHC I类、MHC II类、纤连蛋白、IV型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、波形蛋白、血管紧张素II-1型受体(AGTR1)、基底膜聚糖和聚集蛋白。
34.权利要求29所述的细胞或群体，其中所述移植器官是肝脏。
35.权利要求34所述的细胞或群体，其中所述抗原选自MHC I类、MHC II类、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白和V型胶原蛋白。
36.权利要求29所述的细胞或群体，其中所述移植器官是心脏。
37.权利要求36所述的细胞或群体，其中所述抗原选自MHC I类、MHC II类、心肌肌球蛋白、波形蛋白、V型胶原蛋白、Kα1微管蛋白和MHC I类相关链A(MICA)。
38.权利要求29所述的细胞或群体，其中所述移植器官是胰腺。
39.权利要求38所述的细胞或群体，其中所述抗原选自MHC I类、MHC II类、胰岛细胞自身抗体(ICA)抗原、胰岛素和谷氨酸脱羧酶(GAD)。
40.权利要求28所述的细胞或群体，其中所述免疫介导的障碍是自身免疫障碍。
41.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是多发性硬化。
42.权利要求41所述的细胞或群体，其中所述抗原选自髓磷脂、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、星形胶质细胞蛋白、胶质纤维蛋白(GFAP)和S100β。
43.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是1型糖尿病。
44.权利要求43所述的细胞或群体，其中所述抗原选自β细胞抗原、胰岛素、胰岛素B链、胰岛素原、前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶-65(GAD65)、胰岛相关抗原2、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、锌转运蛋白8(ZnT8)、胰岛抗原2(IA-2)、热休克蛋白60(HSP60)和嗜铬粒蛋白A。
45.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是类风湿性关节炎。
46.权利要求45所述的细胞或群体，其中所述抗原选自dnaJ(热休克蛋白)、瓜氨酸化波形蛋白和人软骨糖蛋白-39。
47.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是原发性胆汁性肝硬化。
48.权利要求47所述的细胞或群体，其中所述抗原选自线粒体组分；丙酮酸脱氢酶(线粒体)；丙酮酸脱氢酶的E2组分；支链2-酮酸脱氢酶的E2组分；2-酮戊二酸脱氢酶复合体的E2组分；二氢硫辛酰胺脱氢酶的E3结合蛋白；核组分；核蛋白sp100；核孔复合体蛋白gp120；和着丝粒。
49.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是重症肌无力。
50.权利要求49所述的细胞或群体，其中所述抗原选自乙酰胆碱受体(AChR)、水通道蛋白-4(AQP-4)、CTLA-4、ICAM、LFA-3、CD40/CD154、ICOS/ICOSL、CD52、活化T细胞的核因子(NFAT)、磷脂酶C(PLC)、CD25、Janus激酶、B细胞活化因子(BAFF)、增殖诱导配体(APRIL)、IL6R、IL17、IL12/IL23、整合蛋白和鞘氨醇受体。
51.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是白癜风。
52.权利要求51所述的细胞或群体，其中所述抗原是黑素细胞抗原。
53.权利要求40所述的细胞或群体，其中所述自身免疫障碍是狼疮。
54.权利要求53所述的细胞或群体，其中所述抗原选自toll样受体、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、MyD88和IL-1R相关激酶(IRAK)。
55.权利要求28所述的细胞或群体，其中所述免疫介导的障碍是过敏性障碍。
56.权利要求55所述的细胞或群体，其中所述抗原是与所述过敏性障碍相关的过敏原。
57.权利要求1-21和28-56中任一项所述的细胞或群体，其中所述细胞或群体还重组表达自杀基因。
58.权利要求57所述的细胞或群体，其中所述自杀基因包含可诱导的半胱天冬酶9。
59.权利要求1-21和28-58中任一项所述的细胞或群体，其源自人。
60.权利要求11-14中任一项所述的细胞，其中所述细胞是从胎盘分离的。
61.权利要求中任一项所述的细胞11-14，其中所述细胞源自具有轻度认知损害的人。
62.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-21和28-61中任一项所述的细胞或群体；和药学上可接受的载体。
63.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求22-27中任一项所述的细胞或群体；和药学上可接受的载体。
64.一种治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-21和28-61中任一项所述的细胞或群体。
65.一种治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用权利要求62所述的药物组合物。
66.权利要求64或65所述的方法，其中所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。
67.一种治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求22-27中任一项所述的细胞或群体。
68.一种治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括向所述患者施用权利要求63所述的药物组合物。
69.权利要求67或68所述的方法，其中所述免疫介导的障碍选自器官移植排斥、自身免疫障碍、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风、狼疮、过敏性障碍、母胎不耐受和阿尔茨海默氏病。
70.一种降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的权利要求1-21、28-39和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。
71.一种降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的权利要求1-19和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述受者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
72.一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-21、28、40-54和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。
73.一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-19和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
74.权利要求72或73所述的方法，其中所述自身免疫障碍选自多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、白癜风和狼疮。
75.一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-21、28和55-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体表达CAR，所述CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。
76.一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-19和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
77.权利要求75或76所述的方法，其中施用所述细胞对患者有选自以下的作用：减少特异性免疫治疗的持续时间，增加特异性免疫治疗的功效，和延长特异性免疫治疗的作用。
78.一种降低有需要的妊娠雌性的母胎不耐受的方法，包括向所述妊娠雌性施用治疗有效量的权利要求1-19和57-59中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从妊娠雌性的前次妊娠的胎盘分离调节性T细胞，并转导所述调节性T细胞，使得其重组表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
79.权利要求78所述的方法，其中所述调节性T细胞是从正在接受母胎不耐受治疗的妊娠雌性的胎盘分离的。
80.权利要求79所述的方法，其中所述调节性T细胞是父系抗原特异性的。
81.一种在具有轻度认知损害的患者中降低进展成阿尔茨海默氏病的风险的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-19、57-59和61中任一项所述的细胞或群体，所述细胞或群体是包括以下的过程的产物：从所述患者分离调节性T细胞，和在细胞培养物中扩增所述分离的调节性T细胞。
82.一种在有需要的患者中提高自身耐受性或重建对自身抗原的免疫耐受性的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-21、28、40-54和57-59中任一项所述的细胞或群体，其中所述细胞是对自身抗原具有特异性的调节性T细胞，或所述群体包括对自身抗原具有特异性的调节性T细胞。
83.权利要求64-66和70-82中任一项所述的方法，其中所述施用是通过胸膜内施用、静脉内施用、皮下施用、结内施用、鞘内施用、腹膜内施用、颅内施用、气管内施用、关节内施用、子宫内施用、眼内施用、鼻内施用、脊柱内施用、硬膜外施用、在腱附着端部位直接施用或直接施用于胸腺。
84.权利要求83所述的方法，其中所述施用是通过静脉内施用。
85.一种治疗有需要的患者的关节炎的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-18和57-59中任一项所述的细胞或群体，其中所述细胞或群体关节内施用或直接在关节炎关节的腱附着端部位施用。
86.权利要求64-66和70-85中任一项所述的方法，其中所述细胞或群体以每千克体重的患者、受者或妊娠雌性104至1010个细胞的剂量施用。
87.权利要求86所述的方法，其中所述细胞或群体以每千克体重的患者、受者或妊娠雌性1x105至1x108个细胞的剂量施用。
88.权利要求64-66和70-87中任一项所述的方法，其中所述患者、受者或妊娠雌性是人类。
89.一种治疗有需要的患者的免疫介导的障碍的方法，包括从所述患者分离调节性T细胞，在细胞培养物中体外扩增所述调节性T细胞，并以治疗有效量向所述患者施用扩增的调节性T细胞，其中所述分离的调节性T细胞被转导以表达调节性T细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性负性形式。
90.权利要求64-66和70-87中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用重组表达嵌合抗原受体(CAR)和转换受体的免疫抑制细胞，其中所述CAR包含共刺激信号转导结构域，并且其中所述转换受体是以氨基到羧基末端顺序包含以下的融合蛋白:(i)免疫检查点抑制剂的至少细胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。
91.权利要求90所述的方法，其中所述转换受体的共刺激信号转导结构域不同于在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR的共刺激信号转导结构域。
92.权利要求90或91所述的方法，其中在同样表达所述转换受体的细胞中表达的CAR的所述共刺激信号转导结构域是CD28的细胞内信号转导结构域。
93.权利要求90-92中任一项所述的方法，其中所述转换受体的共刺激信号转导结构域是4-1BB的细胞内信号转导结构域。
94.一种降低有需要的器官移植受者的器官移植排斥风险的方法，包括向所述受者施用治疗有效量的权利要求22-27中任一项所述的细胞或群体，其中所述CAR结合于与器官移植排斥相关的器官移植的抗原。
95.一种治疗有需要的患者的自身免疫障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求22-27中任一项所述的细胞或群体，其中所述CAR结合于自身免疫障碍的自身免疫抗原。
96.一种治疗有需要的患者的过敏性障碍的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求22-27中任一项所述的细胞或群体，其中所述CAR结合于与过敏性障碍相关的过敏原。
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