JP2007503382A6 - 高分子量プロドラッグの活性化の可能性 - Google Patents

Abstract

【課題】マスキング基および／または安定化基が大きい場合に、高い作用特異性、低い毒性、ならびに血液および／または血清、有利には哺乳動物における安定性を維持しつつ、その立体障害現象を除き、オリゴペプチドの切断を可能にするかあるいは促進させるプロドラッグ構造を提供する。
【解決手段】マスキング基および／または安定化基（例えばＰＥＧ）の間に“分子腕”または“分子スペーサー”を挿入する。

Description

本発明は、プロドラッグの分野に関し、さらに特に、癌性腫瘍および／または炎症反応の治療および／または診断を目的とするプロドラッグの分野に関する。

プロドラッグとは、その構造の化学的または酵素的修飾の後にｉｎ ｖｉｖｏで医薬品（活性な治療薬）へと変換され得る、薬理学的に不活性な分子のことである。プロドラッグは医薬品、即ちプロドラッグが変換されて生じる医薬品を、循環組織または非−標的組織ではなく、作用部位または標的組織へ放出することができる。また、プロドラッグはアントラサイクリン（例えばドキソルビシン）やビンカアルカロイドのような抗癌剤あるいはメトトレキサートのように抗炎症作用を有する抗癌剤等の治療薬のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療指数（活性対毒性の比）を向上させることができる。それ故これまでにも、血液中および／または血清中での高い作用特異性、低い毒性ならびに改良された安定性を得る目的で、数種類のプロドラッグが開発されてきた。

従来より、治療薬の以下に示す基本構造を有するプロドラッグ、標的細胞の細胞外環境に存在する酵素により切断され得るオリゴペプチド、安定化基またはマスキング基は記載されている。

国際公開第９６／０５８６３号のＰＣＴ特許明細書は特に、βアラニル−ロイシル−アラニル−ロイシル−ドキソルビシン（βＡＬＡ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＤｏｘまたはβＡＬＡＬ−Ｄｏｘとも表記される）を記載している。このプロドラッグは血液中で安定、即ち血液中に含まれるペプチダーゼでは比較的切断されにくく、種々の腫瘍細胞周辺から分泌されるペプチダーゼではｉｎ ｖｉｖｏで再活性化される。このプロドラッグは腫瘍周辺の細胞外環境で連続的に加水分解されてＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘとなり、更にＬｅｕ−Ｄｏｘとなる。Ｌｅｕ−Ｄｏｘは拡散により細胞内へ進入し、そこでドキソルビシン形へと活性化される（Ｔｒｏｕｅｔ等、２００１）。上記プロドラッグのｉｎ ｖｉｖｏにおける毒性および活性を調べると、ドキソルビシンそのものの場合よりも毒性が減少し腫瘍の増殖も顕著に抑制されることが分かる。しかし、薬物動態試験では腎排泄に係る半減時間が短いことが分かる。このプロドラッグは尿路経由で速やかに排泄されると考えられる（Ｄｕｂｏｉｓ等、２００２）。

国際公開第００／３３８８８号のＰＣＴ特許明細書は、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘで表されるプロドラッグへβアラニンの陽電荷をマスクする基を付加することでその有効性を高める提案をしている。このマスキング基は例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でよい。

国際公開第０１／９１７９８号のＰＣＴ特許明細書は、改良された循環組織中で安定性を有するプロドラッグを記載している。例えば、プロドラッグはＰＥＧ化されていてよく、この場合ＰＥＧは安定化基および／またはマスキング基として使用されている。このポリマー（ＰＥＧ）の結合はプロドラッグの薬物動態および薬力学特性を改善し、分子が大きくなるため腎排泄が減少する。実際、分子が大きいほどその排泄は遅くなる（Ｈａｒｒｉｓ＆Ｃｈｅｓｓ、２００３）。

本発明を導く研究の枠内で、出願者は、異なる大きさのＰＥＧを使用してドキソルビシンのプロドラッグ（国際公開第９６／０５８６３号特許明細書に記載される）からＰＥＧ化したプロドラッグを製造し、化合物を大きくすることにより腎臓での限外濾過を減少させつつプロドラッグの特性（腫瘍細胞から分泌される酵素で再活性化される）を維持することを試みた。出願者は様々な大きさのＰＥＧ（分子量３５０〜２０，０００、その間をとって７５０、２０００および５０００）をプロドラッグβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに結合させた。このプロドラッグのＰＥＧ化誘導体の再活性化を調べるためにｉｎ ｖｉｔｒｏで切断試験を実施した。この試験の目的は、腫瘍細胞（ＬＳ−１７４ＴおよびＭＣＦ−７／６）から分泌される酵素によるＰＥＧ化誘導体の再活性化を、癌細胞を含む調整培地の存在下にＬｅｕ−Ｄｏｘへと加水分解されるβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘと比較して評価することである。これらの試験結果から、１）ＰＥＧの大きさにかかわらず、ペプチド配列（Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）の切断による薬剤の再活性化は、ＰＥＧ基を有さないプロドラッグほど効果がない、２）ＰＥＧの大きさとＰＥＧ化プロドラッグの切断との相関：結合するＰＥＧが大きいほど、標的細胞の細胞外環境中の酵素によるプロドラッグの切断は少ない、ことが分かった。出願者は、プロドラッグのペプチド結合の切断が減少するのはおそらくＰＥＧの立体障害現象のためであると仮定した。言い換えると、高分子量の安定化基またはマスキング基を含むプロドラッグであるほど再活性化されにくく、このことは半減期の長いプロドラッグの供給という課題に相反する。
国際公開第９６／０５８６３号 国際公開第００／３３８８８号 国際公開第０１／９１７９８号

本発明は特に、マスキング基および／または安定化基が大きい場合に、高い作用特異性、低い毒性、ならびに血液および／または血清、有利には哺乳動物における安定性を維持しつつ、その立体障害現象を除き、オリゴペプチドの切断を可能にするかあるいは促進させるプロドラッグ構造を提供することを目的とする。

本発明者らは、マスキング基および／または安定化基（例えばＰＥＧ）の間に“分子腕”または“分子スペーサー”を挿入し、このペプチド配列が配列に“特異的”な酵素により切断され得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の分子スペーサー（以後“スペーサー”とも記載される）は、スペーサーを構成する単位の親水性を考慮して選択された。

従って、本発明の最初の課題は、式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_m：
（式中、
−Ｉは、標的細胞に対して有利に働く活性物質であり、
−Ａは、血液循環時のＢ−Ｉの半減時間を延長させる基であり、
−Ｅ−Ｂは、ＡとＩを連結させる基であり、
−Ｂは、単独で存在する酵素または好ましくは前記標的細胞の近くに存在するかあるいは標的細胞上に存在する酵素により、選択的に切断され得る構造であり、
−Ｅは、循環組織中で安定な親水性基であり、該基がＢからＡを引き離すことにより、前記標的細胞の近くまたは前記標的細胞上でのＢの切断を可能にするか容易にし、その結果、Ｉの放出あるいは基Ｂを有するＩの放出が可能になるか容易になる、
−ｎは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ｉの全数までの、あるいは、連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ａの全数までの整数であり、
−ｍは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ａの全数までの整数であり、
−ｐは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ｉの全数までの整数であり、
ｐ＝１の場合ｎ＝ｍであり、ｍ＝１の場合ｎ＝ｐである）
で示される化合物である。

以下、本発明の実施形態について記載するが、第１の好ましい形態はｐ、ｎならびにｍが１に等しい場合である。この化合物を以下、式Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｉと記す。

本発明の第２の好ましい形態は、ｍが１に等しく、ｎとｐとが同値且つ１より大きい場合である。この化合物を以下、式（Ａ−Ｅ−Ｂ）_ｔ＞１−Ｉと記し、この際、ｔは２から基Ａ−Ｅ−Ｂ−が結合し得る反応基Ｉの全数までの整数を意味する。有利にＩは、分子上で幾つかのＡ−Ｅ−Ｂ−基が枝分かれしているＴＮＦ−αサイトカイン分子のようなポリペプチドであってよい。

本発明の第３の好ましい形態は、ｐが１に等しく、ｎとｍとが同値且つ１より大きい場合である。この化合物を以下、式Ａ−（Ｅ−Ｂ−Ｉ）_ｋ＞１と記し、この際、ｋは２から基−Ｅ−Ｂ−Ｉが結合し得る反応基Ａの全数までの整数を意味する。有利にＡは、分子上で幾つかの−Ｅ−Ｂ−Ｉ基が枝分かれしている分枝型ＰＥＧ分子のようなポリマーであってよい。

本発明の第４の好ましい形態は、ｐとｍとが１より大きく、ｎがｐおよびｍと異なっていてよい場合である。例えば、ｐ＝２、ｎ＝３、ｍ＝２の場合、化合物は以下の式で表せる：（Ｉ）−(Ｂ−Ｅ)−（Ａ）−（Ｅ−Ｂ）−（Ｉ）−（Ｂ−Ｅ）−（Ａ）。

有利な活性物質（Ｉ）は、共有結合により１つ以上の構造Ｂと直接結合していてもよく、“連結腕”を介して間接的に結合していてもよい。例えば、構造Ｂがアミノ酸配列であり、これが有利な物質Ｉと直接結合している場合、その配向性に従ってアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端、あるいはオリゴペプチドの任意の部位（例えば１つのアミノ酸の側鎖）に共有結合が形成され得る。更に、ＢとＩの間の結合が間接的である場合、連結腕は幾つかの官能基を有していてよく、その官能基によりＢ−Ｉ間の切断が容易になり、Ｂ−Ｉ間に適する化学結合手段が提供され、化合物の合成過程に改善がもたらされ、有利な物質（Ｉ）の物理的性質が向上し、有利な物質（Ｉ）の細胞内または細胞外放出に付加的なメカニズムが提供される。このような間接結合は、当業者に公知かつ任意の化学的、生化学的、酵素学的または遺伝学的結合方法により実施できる。このような連結腕として例えば、同種または異種官能性を有する架橋試薬、例えばサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）；アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド基を有する二官能または多官能薬剤；エステル、アルデヒドまたはアルキル、アリールまたはアリールアルキル酸；無水物、スルヒドリル基またはカルボキシル基、例えば安息香酸マレイミル誘導体、プロピオン酸マレイミル誘導体およびサクシンイミジル誘導体；ブロモシアンまたはクロロシアン誘導基；カルボニルジイミダゾール、サクシンイミドエステルのチオカルボニルジイミダゾールまたはスルホン酸のハロゲン化物；ホスゲン、チオホスゲン；自己転位可能な（または“自己犠牲”の）スペーサーを挙げることができる（Ｓｃｈｍｉｄｔ等、２００１）。

本発明のスペーサー（Ｅ）は、基Ａを構造Ｂへ結合させる。スペーサーは、親水性でありかつ循環組織中で安定なのが好ましい。

スペーサーの２０％未満、好ましくは１０％未満、更に好ましくは２％未満が循環血中で（特に酵素により）分解または切断される場合、あるいは３７℃のヒト血液中でスペーサーが２時間を越えて維持される場合、スペーサーは“循環組織中で安定である”とされる。有利なことに、基Ａの構造Ｂからの離隔とその好ましい親水性の特徴とから、スペーサーは標的細胞の近くまたは標的細胞上で構造Ｂが切断されるのを可能にするかまたは容易にし、それにより、Ｉの放出またはＢ基を有するＩの放出が可能になるかまたは容易になる。スペーサーは、１〜１００個のアミノ酸に相当する長さであってよい。

本発明の別の態様として、基Ａの分子量に応じてスペーサーの大きさを変えることができる。この態様では、スペーサーが大きいほどＡの分子量も大きい。

本発明のスペーサーは、以下から選択される少なくとも１つの基で構成されるかまたはそのような基を含む：アミノ酸配列；ペプチドミメティック薬剤；偽ペプチド；ペプトイド；置換アルキル、アリールまたはアリールアルキル鎖；ポリアルキルグリコール；ポリサッカライド；ポリオール；ポリカルボキシラート；およびポリ（ヒドロ）エステル。またスペーサーは、これらの基を少なくとも２つ組み合わせて含んでもよい。

本発明の有利な形態において、スペーサーは、立体配座Ｄの天然アミノ酸、遺伝学的にコードされていないアミノ酸または循環組織中に存在する酵素で切断できない合成アミノ酸、例えばβアミノ酸またはγアミノ酸等を含む群から選択される同種または異種アミノ酸１〜１００個、好ましくは１〜２０個、非常に好ましくは２〜１０個で構成されるかまたはそのようなアミノ酸を含む。“立体配座Ｄの天然アミノ酸”とは遺伝暗号で正常にコードされているアミノ酸を意味し、天然では立体配座Ｌであるにもかかわらず立体配座Ｄへ合成されたアミノ酸のことではない。通常、遺伝子学的にコードされていないアミノ酸は、合成して製造したり天然物を原料に誘導したりできる。

立体配座Ｄの天然アミノ酸のうち好ましいのは、以下から選択される親水性アミノ酸である：Ｄ−グルタミン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、特に好ましくＤ−セリンおよびＤ−スレオニン。

本発明の好ましい方法において、スペーサーは：（Ｄ−セリン）ｘまたは（Ｄ−スレオニン）ｘから選択される同種アミノ酸配列で構成されるかまたはそのようなアミノ酸配列を含み、この際、ｘは、１〜２０の整数、好ましくは２〜１０の整数、非常に好ましくは２〜６の整数である。

特に、スペーサーは以下のものである：
（Ｄ−セリン）−（Ｄ−セリン）−（Ｄ−セリン）−（Ｄ−セリン）、これはＤ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリルと表記されるのと同じである、
（Ｄ−スレオニン）−（Ｄ−スレオニン）−（Ｄ−スレオニン）−（Ｄ−スレオニン）、これはＤ−スレオニル−Ｄ−スレオニル−Ｄ−スレオニル−Ｄ−スレオニル−と表記されるのと同じである。

本発明中アミノ酸は、当業者に公知の３文字のコードまたは１文字のコードのいずれかで表記される。

基Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで、循環組織中でのＢ−Ｉの半減時間を延長する基である。この課題は、特に、Ａが有利な物質Ｉまたは化合物Ｂ−Ｉの腎排泄を減少させる場合に達成され、ここで排泄とは、大きさに応じた化合物の腎臓での限外濾過を意味する。従って、化合物が大きいほど排泄は遅くなり、少なくとも５０,０００ダルトンの分子量を有する化合物は腎排泄されない。この課題も、本発明の化合物の肝代謝による分解を減少させることにより達成できる。言い換えると、半減期を延長するには、化合物の血中平均滞留時間を延長するかあるいは血液または血漿クリアランスを低下させればよい。

“循環組織”とは、体液、特に血液を意味し、好ましくは哺乳動物の循環組織のことである。

基Ａは、親水性または両親媒性であるのが好ましい。

循環組織中で安定な基Ａ（即ち、式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mで表される化合物の２０％未満、好ましくは２％未満が循環血中で（特に酵素により）分解または切断される場合、３７℃のヒト血液中で前記化合物が２時間を越えて維持される場合）は、正常細胞に対して非毒性で、非−免疫抗原性で、非−凝集性またはマスキング性（即ち、プロドラッグから有利な物質（Ｉ）放出されるまで、細胞表面上で有利な物質（Ｉ）が作用するのを妨げる）であることが好ましい。

有利に、基Ａは、以下の特性を１つ以上有していてよい：連結基Ｅ−Ｂの非−特異的切断および／または分解を防止する；プロドラッグから有利な物質が放出されるまで有利な物質の生物学的作用を阻害する；循環組織中での化合物の安定性を向上させる；水、血液および／または血清中への式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mの化合物の可溶性（または可溶性を高める）；式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mの化合物の標的細胞へのターゲティング特性（またはターゲティングを強化する）。

“式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mで表される化合物の標的細胞へのターゲティング特性”とは、基Ａが式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mの化合物の標的細胞の近くまたは標的細胞上での蓄積を可能にすることを意味する。このような基Ａは“生物学的特異的”であると称され、即ち、このような基Ａは特異的な生物学的相互作用を展開することができるので、生活系の生物学的実体として認識される。特に、抗体、抗原またはアミノ酸基（例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ））のようなペプチドを基Ａの表面に接木することにより、本発明の化合物が特定の細胞株表面へ付着するのを選択的に増加させることができる。基Ａはまた、識別を目的とする好適な化学基により既存の高分子鎖を官能化して得られるかまたは官能性モノマーを共重合させて得られる生物学的特異的コポリマーを含んでよい。

特に、基Ａは以下から選択される：ポリペプチド（例えばポリグルタマート、ポリアスパルタート）、免疫グロブリン、アルブミン、ポリサッカライド、ポリマーまたはコポリマー。

ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチル−アスパナミド−フェノール、パルミトイル残基で置換されたポリ（エチレンオキシド）−ポリリジン、ポリ（乳酸）、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよび架橋性または両親媒性の配列型ヒドロゲルコポリマーが含まれてよい。

基Ａは、以下から選択されるのが好ましい：ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンイミンおよび塩化ビニルコポリマー。例えば、基Ａが塩化ビニルコポリマーである場合、ポリマーが凝集活性を示さないようにするには、スルホナート基またはスルホナートならびにカルボキシラートの存在が必須である。

基Ａはまた、以下から選択されるのが好ましい：ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）、マレイン酸ナトリウムおよびマレイン酸ブチル（ＭＭＢＥ）、ヒドロキシプロピルメタクリレートまたはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ）、およびポリ−［Ｎ−（ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］（ＰＨＥＡ）。

基Ａは特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。ＰＥＧの大きさは、２００〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３５０〜２０，０００Ｄａ、非常に好ましくは１，０００〜１０，０００Ｄａであってよい。このようなＰＥＧの存在により、薬物動態特性（Ｄｕｎｃａｎ等、１９９４）および薬力学的特性が向上し、その結果、本発明の化合物の腎排泄を減少することができる。さらに従来技術で知られる別の利点として、ＰＥＧが腫瘍内に良好に蓄積し得ることが挙げられる。実際、１０^４Ｄａ以上の分子量を有するＰＥＧは正常組織よりも腫瘍内で顕著に蓄積することが知られている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ等、２００３、Ｓｅｙｍｏｕｒ等、１９９５）。

基Ａはまた治療活性を有する薬剤または診断活性を有する薬剤であってよい。

有利に、診断活性を有する薬剤の特性を示す基Ａは常磁性を持つ元素、即ち、その電子層内に単一電子を有する元素、特に磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）でコントラストを強化する、ガドリニウム、マンガンおよび鉄のような元素を有してよい。例として、鉄の結合したポリスチレンスルホナートが挙げられる。

式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mで表される化合物の進行方向を標的細胞へ向けることが可能な１つ以上のターゲティング物質を利用した化合物も本発明の課題である。例えば、ターゲティング物質は、抗体、抗原およびリポソームであってよい。

ターゲティング物質は、１つ以上の基Ａで式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mの化合物と結合するのが好ましい。

本発明において、構造Ｂは、単独で存在するかまたは好ましくは標的細胞環境中に存在する酵素により選択的に切断され得る。

“標的細胞”とは特に、病理学的関与を示す細胞あるいは治療または診断の面で利点を有する細胞を意味する。このような標的細胞は、原発性または続発性（転移性）の腫瘍細胞、原発性または続発性腫瘍の間質細胞、腫瘍または転移腫瘍の血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、リンパ球または腫瘍および転移腫瘍に侵入できる多核体から成る群より選択されるのが好ましい。

“選択的に切断可能”とは特に、切断されるべき配列が切断されることを意味する。言い換えると、切断されるべき配列は標的細胞環境中に存在する酵素によって認識されるのが望ましく、循環組織中や非−標的細胞付近ではわずかに分解されるかまたは全く分解されない。“標的細胞環境中で”という表現は、酵素が単独で存在するかまたは標的細胞の近くまたは標的細胞上に存在することを意味する。たとえ切断が標的細胞の近くまたは標的細胞上のみで生じているわけではなくとも、切断がどちらかといえば（あるいは多くの場合にまたはほとんどの事例で）標的細胞の近くまたは標的細胞上で起きているという事実があれば、切断は選択的であるとされることを注記しておく。言い換えると、生体の他の部位と比べて標的細胞の近くまたは標的細胞上で酵素が高濃度である場合、切断は選択的であると称される。

更に“酵素”とは特に加水分解酵素を意味する。酵素はペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、リソソーム酵素、リパーゼおよびグリコシダーゼから成る群より選択されてよい。

本発明の好ましい方法において、酵素は腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、血管新生内皮細胞、マクロファージまたは単球に特異的なペプチダーゼである。“特異的酵素”とは、膜酵素であるかまたは標的細胞を含む細胞外培地に標的細胞のみから分泌されるかまたは大部分を標的細胞から分泌される酵素を意味する。例えば、酵素が腫瘍細胞に特異的である場合、後者はネプリリシン（ＣＤ１０）、チメトリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、レグマイン、コラゲナーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、および基質メタロペプチダーゼから成る群より選択されてよい。

構造Ｂの選択は、もちろん、標的細胞環境中に存在する酵素に依存する。従って、酵素がペプチダーゼであれば、構造Ｂはそのペプチダーゼで切断され得るアミノ酸配列（またはオリゴペプチド）を含むと考えられる；酵素がグリコシダーゼ（例えばサッカラーゼ）であれば、構造Ｂはそのグリコシダーゼで切断され得るオリゴサッカライドを含むと考えられる；酵素がリパーゼであれば、構造Ｂはそのリパーゼで切断され得る脂質鎖を含むと考えられる、等。

本発明の課題は、腫瘍細胞環境中に存在する酵素で選択的に切断され得るオリゴペプチドで構成されるかまたはそのようなオリゴペプチドを含む、好ましい構造Ｂである。このようなオリゴペプチドは２〜１０個のアミノ酸を含むのが好ましく、３〜７個であれば更に好ましい。例えば、本発明の課題は以下の配列である（立体配座Ｌが好ましい）：
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）またはβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）およびＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）。

しかし、当業者は腫瘍細胞に特異的な酵素により選択的に切断され得るその他のアミノ酸配列、例えば国際公開第９６／０５８６３号、第００／３３８８８号、第０１／６８１４５号、第０１／９１７９８号、第０１／９５９４３号、第０１／９５９４５号、第０２／００２６３号、第０２／１００３５３号、第０２／０７７７０号または第９９／２８３４５号のＰＣＴ特許明細書に記載されるアミノ酸配列を熟知している。

本発明の酵素は構造Ｂを選択的に切断できるので、Ｉの放出または基Ｂを有するＩの放出が可能となる。“基Ｂを有するＩの放出”という表現について以下に例を挙げて説明する。構造Ｂがアミノ酸配列でその配列がＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕであり、有利な物質がドキソルビシンであり（ここでＢ−ＩはＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）、酵素がＣＤ１０である場合、この酵素はＡｌａ−Ｌｅｕ−ＡｌａとＬｅｕとの間でアミノ酸配列を切断し、Ｌｅｕ−ドキソルビシンという生成物が放出されると考えられる。この生成物を“基Ｂを有するＩ”と定義する。

“血液外再活性化”または“血液外区画での再活性化”とは、式（Ａ）_p−（Ｅ−Ｂ）_n−（Ｉ）_mで表される構造を有するプロドラッグのペプチド結合Ｂが、血液以外の任意の（例えば正常なまたは腫瘍の）臓器または組織中に存在する、好ましくは標的細胞に存在する、特異的エンドペプチダーゼにより切断されることを意味する。構造Ｂ（例えばペプチド）が切断されると、有利な物質Ｉの活性形（例えば治療薬）が放出される。

“標的細胞に対して有利な活性物質（Ｉ）”とは、その作用部位が標的細胞の表面または内部に存在するかまたはその効果が標的細胞の表面または内部に影響を及ぼす物質を意味する。例えば、このような有利な物質を、化学薬品、ポリペプチド、たんぱく質、核酸（ＤＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、相補的ＤＮＡ、妨害ＲＮＡ等）、抗生物質、ウイルスまたは任意にベクター物質（例えば抗体）を結合させたマーカーから成る群より選択できる。

前記の有利な物質（Ｉ）は治療活性を有する薬剤であることが好ましく、抗−腫瘍性、抗−血管新生性または抗−炎症性の治療活性を有する薬剤であれば更に好ましい。このような薬剤は標的（例えばレセプター）を有するかまたは細胞外ないし細胞内に作用部位を有していてよい。このような薬剤はまた、貫通するペプチド配列、例えばＰＣＴ特許明細書番号ＷＯ０１／６４７３８に記載される配列を含んでいてよい。例えばＩは以下のものを含む抗−腫瘍性治療活性を有する薬剤の群から選択される：ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン；タキサンまたはタキソイド、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、１０−デアセチルタキソール、７−ｅｐｉ−タキソール、バッカチンＩＩＩ、レキシロシルタキソール；アルキル化剤、例えばイホスファミド、メルファラン、クロロアミノフェン、プロカルバジン、クロランブシル、チオホスホルアミド、ブスルファン、ダカバジン（ＤＴＩＣ）、ミトマイシンＣを含むミトマイシン、ニトロソ−ウレアおよびその誘導体（例えばエストラムスチン、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、フォテムスチン）；白金誘導体、例えばシスプラチン等（例えばカルボプラチン、オキザリプラチン）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ラルチトレキセド、シトシンアラビノシド（またはシタラビン）、アデノシンアラビノシド、ゲムシタビン、クラドリビン、ペントスタチン、フルダラビンホスファート、ヒドロキシウレア；トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、例えばカンプトテシン誘導体（例えば、イリノテカンおよびトポテカンまたは９−ジメチルアミノメチル−ヒドロキシ−カンプトテシン塩酸塩）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、アムサクリン；ミトキサントロン；Ｌ−カナバニン；抗生物質、例えばアントラサイクリン、例えばアドリアマイシンまたはドキソルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ルビダゾン、ピラルビシン、ゾルビシンおよびアクラルビシン、アントラサイクリンの類似体、例えばエピアドリアマイシン（４‘エピ−アドリアマイシンまたはエピルビシン）、ミトキサントロン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤを含むアクチノマイシン、ストレプトゾトシン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン；Ｌ−アスパラギナーゼ；ホルモン；アロマターゼの純粋な阻害剤；アンドロゲン、ＬＨ−ＲＨの類似体−拮抗剤；サイトカイン、例えばインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＩＧＦ−１拮抗剤（インシュリン様成長因子）；プロテアソーム阻害剤；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）；エポチロン；メイタンシノイド；ディスコデルモライド；フォストリエシン；ＢＨ３ペプチド；Ｐ５３ペプチド；カスパーゼ；グランザイムＢ；リボザイム；モノクローナル抗体、例えばリツキシマブ、タスツズマブ；チロシンキナーゼの阻害剤、例えばＳＴＩ５７１（イマチニブメシレート）；アンドスタチン；たんぱく質、ペプチドおよび抗炎症性サイトカイン。

“マーカー”とは、酵素、抗体、蛍光またはリン光性化学分子、シンチグラフィーで使用できる分子を意味する。例えば、クマリン、７−アミド−トリフルオロメチルクマリン、パラニトロアニリド、８−ナフチルアミドおよび４−メトキシナフチルアミド、フルオロセイン、ビオチン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ＧＦＰ（緑色蛍光たんぱく質）、放射性同位体としてシンチグラフィーで使用される薬剤、およびこれらの化合物の誘導体である。

更に本発明の課題は、製薬学的に入手可能な本発明の化合物の塩基性または酸性の付加塩、水和物、溶媒和物、前駆体、代謝物または立体異性体である。

“製薬学的に入手可能な塩”とは、本発明の化合物の遊離塩基と好適な有機酸または無機酸とを反応させることにより一般に製造可能な、本発明の化合物の非−毒性塩を意味する。これらの塩は遊離塩基の生物学的効力および特性を保持している。このような塩の代表例として以下のものが挙げられる：水溶性塩および水不溶性塩、例えばアセタート、アンソナート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホナート）、ベンゼンスルホナート、ベンゾナート、ビカルボナート、ビスルファート、ビタルトラート、ボラート、ブロミド、ブチラート、カルシウムエデタート、カンシラート、カルボナート、クロリド、シトラート、クラバラリアート、ジクロロハイドレート、エデタート、エジシラート、エストラート、エシラート、フマラート、グルセプタート、グルコナート、グルタマート、グリコリルアルサニラート、ヘキサフルオロホスファート、ヘキシルレゾルシナート、ヒドラバミン、ブロモハイドレート、クロロハイドレート、ヒドロキシナフトアート、イオジド、イソチオナート、ラクタート、ラクトビオナート、ラウラート、マラート、マレアート、マンデラート、メシラート、メチルブロミド、メチルニトラート、メチルスルファート、ムカート、ナプシラート、ニトラート、３−ヒドロキシ−２−ナフトアート、オレアート、オキサラート、パルミタート、パモアート（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトアート、エンボアート）、パントテナート、ホスファート／ジホスファート、ピクラート、ポリグルクロナート（例えばポリガラクトウロナートおよびポリグルクロナート）、プロピオナート、ｐ−トルエンスルホナート、サリチラート、ステアラート、スバセタート、サクシナート、スルファート、スルホサリチラート、スラマート、タンナート、タルトラート、テオクラート、トシラート、トリエチオジド、バレラートおよびＮ−メチルグルカミンアンモニウム塩。

本発明の課題はまた、活性成分として、本発明の化合物を少なくとも１つ含有する組成物である。更に、そのような組成物を、生物学、製薬、化粧品、農業、診断または追跡に関係のある配合品および製品に利用することも、その課題である。

さらに特に本発明の課題は、本発明の化合物を少なくとも１つ含有する製剤であり、この際、前記製剤は製薬学的に入手可能な賦形剤、ベクター、希釈剤または医薬品添加剤を組み合わされていてよい。

被験者は、本発明の化合物を製薬学的有効量で投与され得る。“製薬学的有効量”とは、従事する研究者や医者が、組織、系、動物または人間に生物学的または医学的レスポンスをもたらすことができると期待する量を意味する。

前記組成物はまた、治療法を改善し治療範囲を拡大する目的で、本発明の化合物と一緒に別の医薬活性成分を少なくとも１種または当業者に公知の補助剤（ビタミンＣ、抗酸化剤等）を少なくとも１種含有するかまたは組み合わされていてよい。

この組成物は極めて僅かな毒性しか有さないかまたは毒性が無いので非常に有用である。

本発明の製剤は例えばウイルス感染症、転移、細胞アポトーシス（変性疾患、組織虚血等）、感染症（ウイルス感染症、細菌感染症、真菌症等）、癌および異常血管新生の予防または治療の目的で、ｉｎ ｖｉｖｏで使用できる。

本発明の化合物の投与は、治療薬に可能な任意の投与方法で実施できる。そのような方法には、全身投与、例えば経口、経鼻、非経口または局所投与、例えば経皮吸収または中枢投与、例えば頭蓋内への外科的経路を介した投与、または眼内への投与が含まれる。

経口投与は、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤（遅延放出型または延長放出型製剤を含む）、ピル、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、染色剤、座剤、シロップ剤および乳剤を用いて実施できる。提示した剤形はまた、腸管バリアの通過に特に好適である。

非経口投与は、通常、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射または潅流により実施される。注射可能な組成物は一般的な剤形、すなわち懸濁剤または液剤、あるいは液体へ即時溶解できる固形剤の形に製造できる。

非経口投与では、例えば米国特許第３７１０７９５号明細書に記載されるように、一定用量を維持できる徐放型または延長放出型の系を導入してよい。

鼻腔内投与の際、適する鼻腔内用賦形剤を使用できる。

経皮吸収の際、当業者に公知の経皮性の皮膚パッチを使用できる。経皮放出システムでは持続投与が可能である。

その他の好ましい局所製剤には、クリーム、薬用軟膏製剤、ローション、エアゾールスプレーおよびゲルが含まれる。

指定の投与方法に応じ、化合物は固体、半−固体または液体であってよい。

錠剤、ピル、粉剤またはそのままの状態の顆粒またはカプセルに装入された顆粒のような固体製剤では、活性成分を医薬品添加剤と組み合わせることができる、例えば：ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムおよびカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；ｃ）結合剤、例えばマグネシウムシリカートおよびアルミニウムシリカート、でんぷんペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、必要であれば炭酸ナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドンを含むカルボキシメチルセルロース、ｄ）崩壊剤、例えばでんぷん、アガー、アルギン酸またはそのナトリウム塩、あるいは発泡剤；および／またはｅ）吸収剤、着色剤、芳香剤および甘味料。

座剤のような半−固体製剤では、医薬品添加物として、例えば脂肪性の乳濁液または懸濁液あるいはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコールをベースとする添加物を使用できる。

液体製剤、中でも注射用または軟カプセル装入用の液体製剤は、本発明の化合物を例えば、水、塩化ナトリウム（Ｎａｃｌ）生理食塩液、生理学的血清、含水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油のような製薬学的に純粋な溶剤に溶解したり分散させる等して製造できる。

本発明の化合物はまた、リポソームまたはリポプレックス型放出系の形体、例えば小さな単層小胞、大きな単層小胞および多層小胞の形体で投与できる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルクロリンを含む様々なリン脂質から形成され得る。１つの形態として、米国特許第５２６２５６４号に記載されるように、液体成分のフィルムを医薬品水溶液で水和して医薬品を封入した脂質層を形成することができる。

本発明の組成物は滅菌が可能であり且つ／または無毒性の補助剤および補助物質、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤；溶解促進剤；浸透圧を調節するための塩類および／またはバッファーを含有してよい。更に治療上の利点をもたらす別の物質を含有してもよい。組成物は、個々に、一般的な混合、造粒、被覆方法を経て製造される。

本発明の化合物の投与量は、被験体の種類、系統、年齢、体重、性別および医学的症状；治療すべき症状の重症度；投与法；被験体の腎機能および肝機能の状態および使用する化合物または塩の性質を含む、様々なｙ因子に応じて選択される。通常、経験をつんだ医師または獣医師であれば、治療すべき医学的症状の進行を防いだり、妨げたり、食い止めたりするのに必要な化合物の有効量を容易に決定し処方することができると考えられる。

前記した任意の製剤は、活性成分を０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％含有する。

例えば、所望の結果を得るために使用される本発明の化合物の経口投与量は、経口で０．０５〜５０００ｍｇ／日、好ましくは５〜１０００ｍｇ／日の範囲であると考えられ、活性成分を０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１０００．０ｍｇ含む錠剤の形体で投与されるのが好ましい。非経口投与では、本発明の化合物の有効レベルは、体重１ｋｇおよび１日あたり０．００２ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であると考えられる。

本発明の化合物は、１日１回の形式で投与してもよくあるいは１日の全体量を日に２、３ないし４回に分割して投与してもよい。

特に、本発明は、本発明の化合物の少なくとも１つから構成されるかまたは本発明の化合物の少なくとも１つを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用される、診断用医薬品に関する。本発明の化合物はさらに、有利な物質（Ｉ）としてマーカーを有する。このような診断用医薬品はｉｎ ｖｉｖｏでも使用できる。

従って、本発明の課題は、前記診断用医薬品を含む診断用キットでもある。特にこの診断用キットは、１つ以上のコンテナ中に、本発明の組成物を所定量含有する。

本発明の他の利点および特徴は以下の実施例で例証することにより明らかにされ、その際、以下の図面を参照すること。

図１は、ドキソルビシンのＰＥＧ化プロドラッグの２つの合成方法の概略を示す図である。

図２は、ＭＣＦ−７／６細胞に対するドキソルビシン、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−ＤＳｅｒ−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘの細胞毒性試験を示す図である。細胞生存率は、細胞生存試験（ＷＳＴ−１、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）で評価した。グラフ２Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、ドキソルビシン（Ａ）、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｂ）、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｃ）、ＰＥＧ_２０００−ＤＳｅｒ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｄ）およびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｅ）の濃度の対数に対するＭＣＦ７／６株細胞の生存率（コントロールに対する％）を示している。

図３は、ＬＳ−１７４−Ｔ腫瘍を持つ異種移植マウスの平均体重の変動をグラフで示している。結果は処理時に測定した体重に対するパーセンテージで表記されている：（●）ＮａＣｌ、(■)ドキソルビシン６．６９μｍｏｌ／ｋｇ、（▲）ドキソルビシン８．６μｍｏｌ／ｋｇ、（○）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ４５μｍｏｌ／ｋｇ、（＋）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ５０μｍｏｌ／ｋｇ、（×）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ １×４５；３×２５μｍｏｌ／ｋｇ、（＊）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ １×５０；３×３５μｍｏｌ／ｋｇ。

図４は、コントロール（ＮａＣｌ）に対して薬剤を処理したＬＳ−１４７−Ｔヒト結腸癌腫瘍を持つ無胸腺マウス群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値の変動を、各日処理を始めた日を基準にしたパーセンテージでグラフ表記した図である：（●）ＮａＣｌ、(■)ドキソルビシン６．６９μｍｏｌ／ｋｇ、（▲）ドキソルビシン８．６μｍｏｌ／ｋｇ、（○）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ４５μｍｏｌ／ｋｇ、（＋）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ５０μｍｏｌ／ｋｇ、（×）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ １×４５；３×２５μｍｏｌ／ｋｇ、（＊）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ １×５０；３×３５μｍｏｌ／ｋｇ。

図５は、ＮａＣｌ０．９％（ｗ／ｖ）溶液をコントロールとして、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘをそれぞれ６．６９μｍｏｌ／ｋｇ、１×５０＋３×３５μｍｏｌ／ｋｇ、５０μｍｏｌ／ｋｇで投与した場合のＬＳ−１７４Ｔ腫瘍の第１増殖期および第２増殖期の阻害を比較する図である。全てのマウスは、０、７、１４および２１日目に４回の静脈内注射を受けた。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値の最小Ｔ／Ｃ率（Ｔ／Ｃｍｉｎ．）は、最大効果の指標である。コントロール群に対して薬剤処理された群のＲＴＶの平均値の倍加時間の差（Ｔ−Ｃ）ならびにＳＧＤ（特異的増殖遅延）は、増殖期の直線回帰から算出され、ＥＯＲＴＣの定めた判断基準に沿って活性度を決定する。コントロール群に対する薬剤処理群のＲＴＶ平均値の変動の回帰勾配（Ｔ／Ｃ勾配）の直線比率は、パーセントで表記され、増殖率比較パラメータを用いて求められる。

図６は、血清培地中での、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ａ）、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｂ）およびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｃ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ中における安定性試験の図である。結果は、時間毎のＨＰＬＣで測定された複合体濃度を示している。

図７は、化合物ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ａ）、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｂ）、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｃ）およびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｄ）のヒト全血中での安定性試験の図である。結果は、時間毎のＨＰＬＣで測定された複合体および形成され得る代謝物の濃度の変動を示している。

図８は、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌腫瘍を持つ無胸腺マウスの平均体重の変動をグラフで示した図である。結果は薬剤処理時に測定した体重に対するパーセンテージで表記されている：（●）ＮａＣｌ、（＋）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ３０μｍｏｌ／ｋｇ；（▲）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ５３μｍｏｌ／ｋｇ；（＊）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ１１０μｍｏｌ／ｋｇ。

図９は、薬剤処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖阻害を示したものであり、パーセンテージ（Ｔ／Ｃ（％））で表記される。処理：（●）ＮａＣｌ、（＋）Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ３０μｍｏｌ／ｋｇ；（▲）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ５３μｍｏｌ／ｋｇ；（＊）ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ１１０μｍｏｌ／ｋｇ。

図１０は、ＨＣＴ−１１６腫瘍を持つ異種移植マウスの生存率の変動をグラフで示した図である（％で表記）。処理：ＮａＣｌ（−●−）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ２００μｍｏｌ／ｋｇ（……▲……）、３００μｍｏｌ／ｋｇ（−−▲−−）、４００μｍｏｌ／ｋｇ（−▲−）；ＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ２００μｍｏｌ／ｋｇ（……■……）、３００μｍｏｌ／ｋｇ（−−■−−）、４００μｍｏｌ／ｋｇ（――■――）。

図１１は、薬剤処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖阻害を示しており、パーセンテージ（Ｔ／Ｃ（％））で表記される。：ＮａＣｌ（−●−）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ２００μｍｏｌ／ｋｇ（……▲……）、ＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ２００μｍｏｌ／ｋｇ（……■……）。

図１２は、Ｂ１６−ＢＬ６（％）メラノーマ腫瘍を持つ移植マウスの生存率の変動をグラフで示した図である。薬剤処理：コントロールＰＢＳ（●）；（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（■）；（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ―ＴＮＦα（▲）；（ＰＥＧ_５０００）_ｎ−ＴＮＦα（◆）。

図１３は、Ｂ１６−ＢＬ６メラノーマ腫瘍を持つ移植マウスの平均体重の変動をグラフで示した図である。結果は薬剤処理時に測定した体重に対するパーセンテージで表記される。コントロールＰＢＳ（●）；（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（■）；（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（▲）；（ＰＥＧ_５０００）_ｎ−ＴＮＦα（◆）。

図１４は、薬剤処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＢ１６−ＢＬ６腫瘍の増殖阻害を示しており、パーセンテージ（Ｔ／Ｃ（％））で表記される。：コントロールＰＢＳ（●）；（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（■）；（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（▲）；（ＰＥＧ_５０００）_ｎ−ＴＮＦα（◆）。

実施例１：材料および方法
１．１）細胞株
ＭＣＦ７／６細胞：１９７０年に肺の線癌を患う患者の胸水から得たＭＣＦ−７株（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｅｎｇｅｌ等、１９７８）の変異株（Ｓｏｕｌｅ等、１９７３）。この細胞はゲントにあるマリール教授の研究室（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ゲント大学病院、ベルギー）から入手される。

ＬＮＣａｐ細胞：１９７７年にホロゼヴィック（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃ）等により、転移性の前立腺癌を患う患者の鎖骨上リンパ節の生検材料から単離された。この株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）から入手される。

ＬＳ−１７４Ｔ細胞株：結腸癌を患う女性から得たＬＳ１８０株の変異株である。この細胞は無胸腺マウスに接種すると非常に速い速度で腫瘍を形成する。この細胞はＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）から入手される。

ＨＣＴ−１１６株：ヒト結腸の癌細胞の一次培養物から樹立した細胞株。この細胞は無胸腺マウスに皮下注射すると腫瘍を形成する。この細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）から入手される。

１．２）化学療法試験に使用する抗癌剤
ドキソルビシンは、明治製菓株式会社（東京、日本）から提供され；サクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（Ｓｕ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等、２００１）、ＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは合成した。

１．３）動物
ＮＭＲＩまたはＳＷＩＳＳの雌のマウス、ヌード／ヌード（ＪＡＮＶＩＥＲ飼育施設から輸送後５週間）を使用した。
動物の取り扱いは、その使用および実験的化学療法試験中の動物の健康に関し、ＵＫＣＣＣＲ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｏｒｋｍａｎ等、１９９８）およびＦＥＬＡＳＡ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ；Ｎｉｃｋｌａｓ等、２００２；Ｒｅｈｂｉｎｄｅｒ等、２０００；Ｒｅｈｂｉｎｄｅｒ等、１９９６）の推奨する方法に従って実施した。

２）ドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体型プロドラッグの合成
ドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体型プロドラッグの合成は、２つの異なる方法“Ａ”および“Ｂ”で実施された（図１）。

２つの方法のいずれかで合成されたドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体型プロドラッグは以下のものである：
−ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン
（１）
−ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン（２）
−ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン（３）
−ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン（４）
−ＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン（５）。

化合物１、３および４は方法“Ａ”で合成され、化合物２および５は方法“Ｂ”で合成された。

注記：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンおよびβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンプロドラッグは特許明細書ＷＯ９６／０５８６３に記載されていた。

２．１）合成法“Ａ”
方法の原理は、ＮＨ_２−ペプチド−ドキソルビシン化合物の溶液中でのＰＥＧ化である。クロロホルム／メタノール混合物（４：１）に溶解したｍＰＥＧ_２０００−ＳＰＡ（ｍＰＥＧ_２０００−サクシンイミジルプロピオナートエステル）１．５ｍｏｌ等量（Ｎｅｋｔａｒ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）５μｌを、クロロホルム／メタノール混合物（４：１）に溶解したＮＨ２−ペプチド−ドキソルビシン生成物（合成法の３工程を実施後に予め得られている生成物、図１参照）へ添加する。

約４８〜７２時間後、反応の最終生成物をＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて分析する（以下の段落２．２参照）。

生成物（３）および（４）をｐＨ４（乳酸を使用）でジクロロメタンを用いて抽出する。生成物は有機相に蓄積する、これを真空蒸着により濃縮し、その後、凍結乾燥させる。

２．２）合成法“Ｂ”：Ｆｍｏｃ（フルオロエニル−Ｌメトキシカルボニル）化学による固形物質上でのペプチド合成（ＳＰＰＳ）
方法の原理は、固形ポリマー物質（Ｗａｎｇ型樹脂）上でのＰＥＧ化ペプチド配列の合成とその後のＰＥＧ_２０００−ペプチド−ＯＨ生成物とドキソルビシンの結合である。

ＳＰＰＳの原理は、所定のペプチドの様々なアミノ酸を固相物質（Ｗａｎｇ型樹脂）へ連続的に結合させることであり、当業者に公知の方法で実施される（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３および１９６５；ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ、１９６９）。

固相物質上でのペプチド合成
合成ペプチドは例えば、手動合成反応装置（ＡｎａＳｐｅｃ）中で、Ｆｍｏｃ基を用いる化学的手段を利用し、固相物質上でペプチド合成することにより取得される。固相物質上の合成で使用される全ての樹脂（ＡｎａＳｐｅｃまたはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）はＷａｎｇ型樹脂であり、この樹脂は、供給業者が最初の置換で樹脂１ｇに対して０．４〜０．７ｍｍｏｌとなるよう予め結合させた第１の保護アミノ酸を有する。Ｆｍｏｃアミノ酸はＡｎａＳｐｅｃまたはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから提供され、側鎖に保護基を有している、例えば：トリチル（Ａｓｎ，Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、およびＨｉｓ）、Ａｃｍ（Ｃｙｓ）、Ｂｏｃ（ＬｙｓおよびＴｒｐ）、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＡｓｐおよびＧｌｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）およびＰｂｆ（Ａｒｇ）。所望の分子量を有する様々なポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＳＰＡ）は、Ｎｅｋｔａｒから予め活性化したヒドロキシサクシンイミジル（ＯＳｕ）エステルの形で入手される。Ｆｍｏｃ基の脱保護はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でピペリジンを処理することにより実施される。合成時に使用される結合剤は、ＤＭＦ中のＨＣＴＵ（１Ｈ−ベンゾトリアゾイウム１−[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−５クロロヘキサフルオロホスファート（１−）の３−オキシド）またはＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，−１，３，−３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７―アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，−Ｎ，−Ｎ’，−Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）である。一般的なアミノ酸結合サイクルを以下のようにして実施する：３×３０秒、ＤＭＦで洗浄；３×２分、次に１×７分、ＤＭＦで２０％に希釈されたピペリジンを用いて脱保護；５×２０秒、ＤＭＦで洗浄；２×１５分、アミノ酸（２等量）、結合剤（２等量）およびＤＩＰＥＡ（４等量）を用いて結合、その後３×３０秒ＤＭＦで洗浄。市販時当初の樹脂が有する置換基を、所望の配列に応じて、結合すべき第１Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ ０．５〜０．３モル等量を添加することにより還元し（最終的に望ましいとされる置換基の割合は０．１〜０．２２ｍｍｏｌ／ｇ）、残るアミノ基をアセチル化する（Ｖｉｒｅｎｄｅｒ等、１９８１）。各アミノ酸の結合を、当業者に公知のカイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ等、１９７０）により確認する。全てのアミノ酸が所望の配列に応じて結合した後、２×２日間、活性エステルＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ）およびＤＩＰＥＡを結合させることにより、Ｗａｎｇ型固相物質上でＰＥＧ化が起こる。

Ｗａｎｇ型固相物質へＰＥＧ化ペプチドを結合させている共有結合の化学的切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：水：トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を９５：２．５：２．５で含む混合物を、手動合成反応装置中の完全に乾燥した樹脂へ３時間添加することにより実行される。ＰＥＧ化ペプチドを冷エタノールで沈殿させ、遠心し、エタノールで洗浄し、凍結乾燥させる。

ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分析
ＶＹＤＡＣ−タイプのカラム（逆相）（Ｃ８．５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）を用い、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水中０．１％溶液を第１溶離液（溶離液Ａ）ならびにＴＦＡのアセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％溶液を第２溶離液（溶離液Ｂ）とし、２５分間に溶離液Ｂを０％〜７０％の勾配をかけて流すことにより、酸ペプチドを分析した。

２．３）合成例：ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-ドキソルビシン（２）およびＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（５）の合成
ドキソルビシン１．２モル等量、ＤＭＦ中に溶解したＨＣｌおよびＤＩＰＥＡ３．２モル等量を、固相物質上で合成して得られたＰＥＧ_２０００−ペプチド−ＯＨ（ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨまたはＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）へ添加する。混合物を遮光し、周囲温度で１５分撹拌し、ＨＡＴＵ（結合剤、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）１．３モル等量を添加する。ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析（前記項目２．３参照）まで、反応を約３時間実施する。反応終了時、溶剤を真空蒸発させる。残った生成物を水に取り込み、ジクロロメタンで抽出する。生成物（５）は最初に水相へ回収されるが、生成物（２）はむしろ有機相へ蓄積する。生成物（２）を含む有機相を真空蒸着により濃縮し、生成物を周囲温度でエーテル中に沈殿させる。得られた沈殿物を水に溶かし、凍結乾燥させる。生成物５を含む水相を回収し、アセトンとドライアイスから成る浴中で凍結させ、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥させる前に、生成物をＨＰＬＣで分析した（前記項目２．２参照）。

３）細胞培養に用いる生成物溶液の調製
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養実験に使用する生成物はドキソルビシン、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-Ｄｏｘ（３）、ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ-Ｄｏｘ（４）、ＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（５）である。

生成物を、極僅かな水に溶解し、穴の大きさが０．２２μｍのダイ（ｄｙｅ）を通して濾過滅菌する。溶液の濃度は吸光度を測定して判断する（ドキソルビシンのモル吸光係数に基づいて４９５ｎｍで測定、ε＝１０８３７Ｍ−１ｃｍ−１）

４）細胞培養
下記の実験に使用する培地は、ウシの胎児血清１０％を含むグルタマックス−１を含有するＲＰＭＩ １６４０培地である（ＳＢＦ：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。

５）細胞毒性試験
ドキソルビシンおよび誘導体の細胞毒性試験は、ＭＣＦ−７／６細胞およびＬＮＣａＰ細胞を用いて実施した。

細胞をトリプシンで剥離し、計数し、血清培地２００μｌの入った９６穴プレートへ接種する。

細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、試験用の生成物を添加する：
ドキソルビシン、
βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、
ＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（５）、
ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４）
ＰＥＧ_２０００−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（３）
ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１）
これを血清培地で様々な濃度に希釈する。種々の化合物の存在下に４８時間インキュベートした後、細胞を最後に血清培地のみの存在下に３７℃で２４時間ポスト−インキュベートする。このインキュベートの後、細胞の生存率試験を行う（ＷＳＴ−１、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。

６）ドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体プロドラッグの安定性および加水分解試験
６．１）ドキソルビシンのプロドラッグβＡＬＡＬ−Ｄｏｘが腫瘍細胞から分泌されるペプチダーゼにより再活性化される際の、ＰＥＧ化の効果
腫瘍細胞（ＭＣＦ−７／６、ＬＳ−１７４Ｔ、ＬＮＣａＰ）を混合して継代培養したものを食塩加リン酸バッファー溶液で２回洗浄し、血清を含まずウシ血清アルブミン０．０２％を含む新しい培地を添加する（１００μｌ／ｃｍ^２）。２４時間のインキュベーションの後、調整培地を除き、３００ｇで１０分遠心し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で緩衝させ（バッファー１体積＋培地１９体積）、限外濾過で２０回濃縮する（濾過限界は１０ｋＤａ）（Ｔｒｉｓ：トリスヒドロキシメチル−アミノメタン）。

腫瘍細胞が分泌するペプチダーゼによる、ドキソルビシン誘導体（βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）のＰＥＧ化ペプチドプロドラッグの再活性化を、最初のプロドラッグであるβＡＬＡＬ−Ｄｏｘの再活性化と比較する、この際、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘは腫瘍細胞で調整された培地でインキュベートする間にＬｅｕ−Ｄｏｘとドキソルビシンとに加水分解される。化合物を調整培地で２０μｍｏｌに希釈し、恒温浴で３７℃で６〜１８時間インキュベートする。化合物の加水分解をＨＰＬＣ分析で定量化する（下記項目７．１参照）

以下のＰＥＧ化プロドラッグを使用する。
ＰＥＧ_３５０−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ
ＰＥＧ_７５０−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ
ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ
ＰＥＧ_５０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ。

６．２）培地での安定性
ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１）、ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４）およびβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（コントロール）を、ウシ胎児血清１０％を含有する培地（血清培地）５００μｌで２０μｍｏｌに希釈する。サンプルを２４穴プレートに分配し、ＣＯ_２ ５％を含む飽水雰囲気下に３７℃でインキュベートする。各生成物に関し、抽出（アセトニトリルを用いた抽出法、下記項目７．３参照）を、０時間、インキュベート後の１、２、６および２４時間の時点で、三重反復試験の形で実施する。サンプルを次にＨＰＬＣクロマトグラフィーで分析する（下記項目７．３参照）。

６．３）ヒト全血での安定性
ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（１）、ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４）、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘおよびＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘをヒト全血（採取後、５ｍｌの滅菌済みクエン酸入りチューブに４℃で保存）５００μｌで２０μｍｏｌに希釈する。サンプルを含むチューブを３７℃でインキュベートする。各生成物の抽出（アセトニトリルを用いた抽出法、下記項目７．３参照）を、０時間、インキュベート後の１、２、４および６時間の時点で、三重反復試験の形で実施する。

７）分析法
７．１）基礎的な抽出
抽出すべきサンプル２５μｌ、水５００μｌおよび内部標準（プロリル−ダウノルビシン３．４５μｍｏｌ）１００μｌを、有機クロロホルム／メタノール混合物（４：１）２．５ｍｌを含むチューブへ添加する。塩基性バッファー（０．５Ｍボラートバッファー６００μｌ、ｐＨ９．８）の添加後、チューブを速やかに５秒撹拌し、１８００ｇで１０分遠心する。

有機相を回収し、空気流の下で乾燥させる。アセトニトリル３０％およびアンモニウムホルマートバッファー（ｐＨ４）１０％を含む混合物５００μｌを添加して、サンプルを溶解する。次いでサンプルを濾過し、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで分析する（下記項目７．３参照）。

７．２）アセトニトリルによる抽出
内部標準（プロリル−ダウノルビシン）１０μｌおよび５０μｍｏｌのアセトニトリル１５０μｌを、抽出すべきサンプル５０μｌの入ったチューブへ添加する。チューブを撹拌し、１３０００ｇで１０分遠心する。上清をホルマートバッファー（ｐＨ４）で４倍希釈し、遠心し、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで分析する（下記項目７．３参照）。

７．３）ＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分析
全ての生成物サンプル（ＰＥＧ_２０００−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１）、ＰＥＧ_２０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（５）、βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘおよびＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）について、ＶＹＤＡＣ（Ｃ８．５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）のようなカラム（逆相）を用い、ＨＰ１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を利用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析を行う。ドキソルビシンおよびその誘導体は蛍光検出され（Ｌａｍｂｄａ_exc.＝２３５ｎｍ；Ｌａｍｂｄａ_eｍ.＝５６０ｎｍ）、それぞれの相対的滞留時間を内部標準と比較することにより同定される。濃度は、ＨＰＣＬクロマトグラフィーで見られるピークの積算表面を基準に算出される。

得られた安定曲線（時間に対する濃度の変動）は生成物の安定性評価を可能にし、加水分解試験では、６時間のインキュベートの後に得られるＬｅｕ−ＤｏｘおよびＤｏｘの量を総括した表を用いることで、腫瘍細胞から分泌される酵素によるＰＥＧ化誘導体の加水分解の度合いを評価できる。

８）ドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体プロドラッグの腫瘍再活性化試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ドキソルビシンのＰＥＧ化誘導体プロドラッグ（Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）の腫瘍再活性化について、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌を異種移植した無胸腺マウスで測定した。以下のＰＥＧ化誘導体を使用した：ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬＤｏｘ。

マウスに、６９μｍｏｌ／ｋｇの量で様々な化合物を、静脈内ボーラス（静脈内）注射した。動物は注射後２〜７２時間で死亡し、腫瘍内に蓄積した活性分子（Ｌｅｕ−Ｄｏｘ＋Ｄｏｘ）をＨＰＬＣクロマトグラフィーで定量化した（上記項目７．３参照）。

９）皮下に異所異種移植したモデルを用いたドキソルビシンＰＥＧ化誘導体プロドラッグの化学療法試験
ヒト起源の腫瘍ＬＳ−１７４ＴまたはＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌）を予め皮下移植した無胸腺マウスを用いて、実験的化学療法試験を行った。

腫瘍体積が等しく分布するようにマウスを選択し、異なる群へ分配した。異なる治療薬を、形成された群に無作為に割り当てた。

治療薬を尾静脈へ静脈内投与する。注射中に、動物は、一定体積の生成物１０μｌ／ｇを投与される（Ｗｏｒｋｍａｎ等、１９９８）。注射後、臨床症状を適時に追跡し（初日は１時間毎、試験終了まで１日毎）、体重と腫瘍体積（ｍｍ３）を同時に測定する。はさみ尺を用いて腫瘍の直交する２直径（“対角線”）（最長および最短の“対角線”）を測定することにより、腫瘍の増殖を週２回で監視する。

異なる群で腫瘍体積の変動を測定するために、０日目の平均腫瘍体積に対する変動として相対腫瘍体積（ＲＴＶ＝ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）の平均値を算出し、パーセント表示する。パーセント表示された薬剤処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）の平均ＲＴＶ比（Ｔ／Ｃ（％））を算出し、種々の治療薬の有効性を評価する。

Ｔ／Ｃ比の最低値は使用される生成物の最大効果を推測するための指標である。

腫瘍増殖の阻害時間は、薬剤処理群とコントロール群間のＲＴＶ平均値の倍加増殖（倍加時間＝ＤＴ＝Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）の遅延（Ｔ−Ｃ）を算出することで評価される（図５ではコントロール群の倍加時間を２００％で表示している）。特異的増殖遅延（ＳＧＤ＝Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｅｌａｙ）も、試験に関わる様々な群での平均ＲＴＶの倍加に要する時間から算出される。ＳＧＤは従って（ＤＴ処理群−ＤＴコントロール群）／（ＤＴコントロール群）に等しい。

また、試験される様々な生成物の活性は、ＥＯＲＴＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）（Ｂｏｖｅｎ等、１９９２；Ｌａｎｇｄｏｎ等、１９９４）の推奨する判断基準を基に評価され、結果を表Ｉに記載した。しかし、文献で提唱されている判断基準（Ｂｏｖｅｎ等、１９９２）は１つの直線増殖期を示す腫瘍にしか適用されないので、化合物の有効性を推定する方法は翻案である。

使用されるＬＳ−１７４−Ｔ細胞は２つの増殖期を示すのが特徴で、最終増殖期（フェーズ２）は最初の増殖期（フェーズ１）よりもかなり速い。このような理由から、増殖遅延（Ｔ−Ｃ）および特異的増殖遅延（ＳＧＤ）は、腫瘍増殖に特徴を有する異なるフェーズの直線回帰により算出された。

以下の表１は、ＥＯＲＴＣ（Ｂｏｖｅｎ等１９９２；Ｌａｎｇｄｏｎ等、１９９４）の推奨する判断基準に従って化学療法剤の有効性を評価したものである。活性レベル：−＝活性無し；（＋）＝非常に低い活性；＋＝低い活性；＋＋＝中等度の活性；＋＋＋＝顕著な活性；＋＋＋＋＝非常に顕著な活性。

１０）皮内異所移植モデルを用いたＴＮＦ-αのＰＥＧ化誘導体の化学療法試験
１０．１）細胞株
Ｂ１６−ＢＬ６細胞：マウスのメラノーマ細胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける膀胱への浸潤能および肺への高い自然転移能により選択される。この細胞は“ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ”、メリーランド、ＵＳＡから入手される。

１０．２）化学療法試験に用いる抗癌剤
ＲｈＴＮＦ−α（“組み換えヒト腫瘍壊死因子α”は、Ｈｅｎｏｇｅｎ（ゴスリー、ベルギー）から提供される。

（ＰＥＧ_５０００）ｎ−ＴＮＦα(ＰＥＧ_５０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ)ｎ−ＴＮＦαおよび（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）ｎ−ＴＮＦα複合体を合成した。“ｎ”は１〜１８である（１８はＴＮＦα分子が三量体である場合の全リジン数であり、ＴＮＦ単量体は６つのリジン残基を有することが知られている）。（ＰＥＧ-ペプチド）ｎ−ＴＮＦα誘導体の合成は以下のようにして実施される：ペプチドを固相で合成し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下に活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させてＮ−ヒドロキシサクシンイミド型とする。精製後、ＤＭＦに溶解しているＰＥＧ−ペプチド−ＯＨを当業者に公知の結合剤（例えば：ＴＳＴＵ、２−サクシンイミド−１，１，３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート）の存在下に活性化させる。次に、マンニトール１％を含有する２０ｍｍｏｌのホスフェートバッファー（ｐＨ７．４）に溶解しているｒｈＴＮＦαを添加し、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌する。結合生成物を回収し、過剰ＰＥＧ-ペプチド−ＯＨを限外濾過して除く。最終生成物の濃度をたんぱく質量から測定する。

１０．３）動物
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから輸送後５週間、フランス、飼育場）を使用する。

動物の取り扱いは、その使用および実験的化学療法試験中の動物の健康に関し、ＵＫＣＣＣＲ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｏｒｋｍａｎ等、１９９８）およびＦＥＬＡＳＡ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ；Ｎｉｃｋｌａｓ等、２００２；Ｒｅｈｂｉｎｄｅｒ等、２０００；Ｒｅｈｂｉｎｄｅｒ等、１９９６）の推奨する方法に従って実施した。

マウス起源のＢ１６−ＢＬ６腫瘍（マウスメラノーマ）を予め皮内移植された普通のＣ５７ＢＬ／６Ｊタイプの雄のマウスを用いて、実験的化学療法試験を行う。

腫瘍体積が等しく分布するようにマウスを選択し、異なる群へ分配する。異なる治療薬を、形成された群に無作為に割り当てる。

治療剤を０〜３日に静脈内投与する。注射中に動物は一定体積の生成物１０μｌ／ｇを投与される（Ｗｏｒｋｍａｎ等、１９９８）。注射後、臨床症状を適時に追跡し（初日は１時間毎、試験終了まで１日毎）、体重と腫瘍体積（ｍｍ３）を同時に測定する。はさみ尺を用いて腫瘍の直交する２直径（“対角線”）（最長および最短の“対角線”）を測定することにより、腫瘍の増殖を週２回で監視する。

抗−腫瘍効果をＴ／Ｃ比の値から定量化する（最低値は最大効果に相当する）。測定方法は前記項目９に詳細される。

実施例２：ドキソルビシンのプロドラッグβＡＬＡＬ−Ｄｏｘが腫瘍細胞から分泌されるペプチダーゼにより再活性化される際の、ＰＥＧ化の効果
化合物βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_３５０−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_７５０−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_５０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（２０μｍｏｌ）をＭＣＦ−７／６またはＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の調整培地中で６時間インキュベートした。プロドラッグの再活性化（ドキソルビシンおよびＬｅｕ−Ｄｏｘの放出）をＨＰＬＣクロマトグラフィーで測定した。

以下の表２は、プロドラッグβＡＬＡＬ−ＤｏｘとそのＰＥＧ化誘導体の加水分解を示している。結果は、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）とロイシル−ドキソルビシン（Ｌ−ＤｏｘまたはＬｅｕ−Ｄｏｘ）の濃度で表され、３回の独立実験で得られた平均値±標準偏差（ｎ＝９）で表記される。

上記表に記載される結果はプロドラッグの再活性化を示すものであり、ＰＥＧの分子量が増加すると活性分子（Ｌｅｕ−Ｄｏｘ＋ドキソルビシン）の放出が特に阻害されることが分かる。ドキソルビシンプロドラッグ（βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）のＰＥＧ化は腫瘍ペプチダーゼによるその再活性化を妨げる。この阻害はＰＥＧの大きさに関する。そこで、発明者は、このような妨害がおそらく切断部位の接触容易性が制限される立体障害現象の結果ではないかという仮説を立てた。

実施例３：ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化誘導体の腫瘍再活性に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験
ドキソルビシンプロドラッグ（βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）のＰＥＧ化誘導体のｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍再活性化について、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌腫瘍を異種移植された無胸腺マウスモデルを用いて評価した。以下の表３は試験化合物の注射後２および７２時間で腫瘍に蓄積されるＤｏｘおよびＬｅｕ−Ｄｏｘの平均濃度を示している（１８匹のマウスから得られた平均）。

上記表から、２種薬剤ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_{２００００}−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘが、コントロールであるＳｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘと比べ、ＤｏｘおよびＬｅｕ−Ｄｏｘを再活性化しないことが分かる。すなわち、ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化は、腫瘍に係る再活性化を強く抑制する。

実施例４：ドキソルビシンのＰＥＧ化プロドラッグの腫瘍細胞から分泌されるペプチダーゼによる再活性化に対してスペーサーの挿入がもたらす効果
βＡＬＡＬ−Ｄｏｘプロドラッグ（２０μｍｏｌ）をＬＳ−１７４ＴまたはＬＮＣａｐ腫瘍細胞の調整培地で６〜１８時間インキュベートした。プロドラッグの再活性化（ドキソルビシンおよびＬｅｕ−Ｄｏｘの放出）をＨＰＬＣクロマトグラフィーで測定した。

２種類のスペーサーを試験した：
−４つの親水性Ｄセリン（（ＤＳｅｒ）_４）残基
−６−アミノヘキサン酸残基（またはセリンよりも長い疎水性アミノ酸であるアミノカプロン酸）、Ａｈｘと表記、の挿入。

以下の表４は、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（コントロール）プロドラッグおよびＰＥＧ化βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ誘導体の加水分解を示す。結果は、放出されるドキソルビシンおよびＬｅｕ−Ｄｏｘをコントロールと比較してパーセンテージで表記している（ｎ＝３）。

前記表の結果は、ＰＥＧ化誘導体の加水分解が、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘの場合と比べて明らかに減少することを再度示すものである。

ＬＳ−１７４Ｔ細胞の調整培地で化合物をインキュベートした後では、ＰＥＧとβＡＬＡＬ−Ｄｏｘの間に４つのＤ−セリン残基を挿入することにより、スペーサーを有さないまたは３つのＡｈｘ残基（疎水性スペーサー基）を有するＰＥＧ_２０００のＰＥＧ化誘導体と比較して、ドキソルビシンおよびＬｅｕ−Ｄｏｘの放出は２倍に増加している。

アミノヘキサン酸残基（疎水性アミノ酸）の挿入は、スペーサーを有さない誘導体と比べても、プロドラッグのＰＥＧ化誘導体の再活性化を促進しない。

実施例５：ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化誘導体の細胞毒性試験
ＭＣＦ−７／６腫瘍細胞をドキソルビシン、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−ＤＳｅｒ−βＡＬＡＬ−ＤｏｘまたはＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘを濃度勾配をかけて含有する血清培地中で４８時間インキュベートした。次に血清培地の存在下に２４時間ポストインキュベートする。細胞の生存率試験（ＷＳＴ−１、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）により生成物の細胞毒性を調べる。

３回の独立した試験結果を図２に示す。

ドキソルビシンおよびβＡＬＡＬ−Ｄｏｘ化合物のＩＣ_５０値（５０％阻害濃度）はそれぞれ０．０４５μＭおよび１５８．４８μＭであり、これはβＡＬＡＬ−Ｄｏｘプロドラッグの性質を証明するものである。ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘが５００μｍｏｌの濃度まで細胞毒性を示さないので、βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ化合物が示すＩＣ_５０平均値の比較から、ＰＥＧ化によりプロドラッグの再活性化が阻害されることが分かる。ＰＥＧとβＡＬＡＬ−Ｄｏｘの間にＤＳｅｒを含むプロドラッグ（ＰＥＧ_２０００−ＤＳｅｒ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）は細胞毒性を示さない。これとは反対に、ＰＥＧとβＡＬＡＬ−Ｄｏｘの間に分子スペーサー（ＤＳｅｒ）_４を有するプロドラッグ（ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ）は細胞毒性を示し、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘはまさに非−ＰＥＧ化プロドラッグ、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘと同等の活性（ＩＣ５０＝２５１．１９μｍｏｌ）を有する。

この結果は、ＰＥＧとβＡＬＡＬ−Ｄｏｘの間に４つのＤ−セリン残基を挿入することがＰＥＧ化プロドラッグの再活性化を可能にすることを示している。これに対して、スペーサーを有さないＰＥＧ化プロドラッグは再活性化できない。後者プロドラッグの細胞毒性は主に血液外での再活性化によるものであり、すなわち別の試験化合物と比べてドキソルビシンを多く放出する。

実施例６：ドキソルビシンプロドラッグβＡＬＡＬ−ＤｏｘのＰＥＧ化誘導体の、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌異種移植モデルにおける有効性試験
ドキソルビシン、サクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの抗−腫瘍活性を、ＬＳ−１７４Ｔ型のヒト腫瘍を異所異種移植された無胸腺マウス（ヌード／ヌードＮＭＲＩ）モデルで試験した。生成物を静脈内注射した（１０μｌ／ｇ、１群あたりマウス６匹）。

ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘを、最初に、５０μｍｏｌ／ｋｇおよび４５μｍｏｌ／ｋｇの量で静脈内ボーラス投与した。２種類の投与量で１匹が死亡した。

投与量を７日目から減じた。ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘを３５μｍｏｌ／ｋｇおよび２５μｍｏｌ／ｋｇで注射した（週に１度、３回の注射）。別の化合物を０、７、１４および２１日目に週１回で静脈内ボーラス投与した（ドキソルビシン６．６９および８．６μｍｏｌ／ｋｇ、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ４５および５０μｍｏｌ／ｋｇ）。

図３は、各日投与の開始から平均体重の変動をパーセントで示している。ドキソルビシンとＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘを処理した群では２週間目まで顕著な体重減少は認められない。Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘを処理した群では僅かな体重減少が認められる。後者の場合、最大の体重減少は１０％で、２つの処理群で３２日目に認められる。

図４は、コントロール（Ｃ）（ＮａＣｌ）と比較した薬剤処理マウス群（Ｔ）の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値の変動を示している。最大耐量（ＭＴＤ）より少ない量を投与しているにもかかわらず、全ての試験生成物は抗−腫瘍活性を有する。

薬剤処理中、２つの腫瘍増殖期が観察された（図５）。第１増殖期では、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（１×５０＋３×３５μｍｏｌ／ｋｇ）の活性はドキソルビシン（６．６９μｍｏｌ／ｋｇ）と同等であり、サクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（５０μｍｏｌ／ｋｇ）より低い。これとは逆に、第２増殖期では、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりも活性であり、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘと同等である。全体的に、Ｓｕ−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ生成物（Ｔ／Ｃｍｉｎ＝２６．６％；特異的増殖遅延（ＳＧＤ＝３．０２））およびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｔ／Ｃｍｉｎ＝３８％；ＳＧＤ＝１．５８）はドキソルビシンよりも活性であることが分かった。

実施例７；ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化誘導体の血清培地中での安定性
βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ化合物の安定性を、ウシ胎児血清１０％を含む培地に３７℃で２４時間インキュベートした後に測定した。初生成物および形成可能な代謝物の濃度をＨＰＬＣで定量化した。３種の試験複合体は血清培地中で安定である。分解生成物は検出されなかった（図６）。

実施例８；ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化誘導体のヒト全血中での安定性
βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ、ＰＥＧ_２０００−βＡＬＡＬ−ＤｏｘおよびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ化合物をヒトのクエン酸血で２０μｍｏｌに希釈し、３７℃でインキュベートした。様々な時点で、複合体および形成可能な代謝物の濃度をＨＰＬＣにより測定した。図７は、インキュベート時間に対する生成物濃度の変動を示している。

ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ化合物をコントロールとして使用した。後者は血液中に安定ではない。１時間後、出発物質の８０％がＬｅｕ−ＤｏｘおよびＤｏｘに分解される。他の３種の試験複合体はヒト全血に６時間安定である（図７）。６時間で、βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｄｏｘ８％およびＬ−Ｄｏｘ１０％）およびＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（Ｄｏｘ５％およびＬｅｕ−Ｄｏｘ５％）はほんの僅かに加水分解されただけであった。この結果は、オリゴペプチドの末端アミンをβアラニンで置換すると、血液中のペプチダーゼによる配列の加水分解が妨げられることを示している。試験されたＰＥＧ化誘導体の安定性は、天然ではないアミノ酸の存在（β−アラニンまたはｄ−セリン）および安定化基として使用されるＰＥＧのおかげであると考えられる。

実施例９．ドキソルビシンプロドラッグのＰＥＧ化誘導体βＡＬＡＬ−Ｄｏｘの、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌異種移植モデルでの有効性試験
ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌をＳｗｉｓｓヌード／ヌードマウスに皮内移植した異種移植モデルを使って、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの抗−腫瘍効果をサクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘと比較した。動物はサクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ３０μｍｏｌ／ｋｇまたはＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ５３および１１０μｍｏｌ／ｋｇを５回（５日連続）静脈内ボーラス投与された（マウス６匹／群）。薬剤処理群では死亡が確認されなかった。図８の結果は動物の体重の変動を表している。投与量にかかわらずＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘに毒性は認められなかったが、サクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘを処理したマウスでは体重が減少した（試験終了時には約２０％減、４９日目）ことから、この群では最大耐量（ＭＴＤ）に達していることが分かる。２つの期を示すＴ／Ｃ曲線により抗−腫瘍効果を示す（図９）。第１期では（２１日まで）、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（１１０μｍｏｌ／ｋｇ）群が活性を示し、これはサクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘ（３０μｍｏｌ／ｋｇ）でも同様である。第２期では、ＰＥＧ化誘導体（１１０μｍｏｌ／ｋｇ）の活性がサクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘの活性と比べて減少する。５３μｍｏｌ／ｋｇでは、ＰＥＧ化誘導体を処理した週に腫瘍増殖を抑制するどころか腫瘍退縮を誘導している。要するに、これらの結果は、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘがサクシニル−βＡＬＡＬ−Ｄｏｘよりも低い毒性を示し、試験の第１期で活性化されることを意味している。本試験ではＰＥＧ化誘導体はＭＴＤに達していない。

実施例１０．ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌異種移植モデルにおける、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘ対ＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの化学療法試験
ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌をＳｗｉｓｓヌード／ヌードマウスに皮下移植した異種移植モデルを用いて、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの抗−腫瘍効果をＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの抗−腫瘍効果と比較した。動物は化合物を２００、３００および４００μｍｏｌ／ｋｇの量で５回（５日連続）静脈内ボーラス注射された（マウス５匹／群）。ＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘに対して、ＰＥＧ２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘは３００および４００μｍｏｌ／ｋｇで毒性を有し、体重の減少と動物の死を招く（図１０）。このような毒性はＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘの方がＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘよりも細胞外区画で顕著に再活性化されることを示唆している。１等モルの非−毒性量（２００μｍｏｌ／ｋｇ）では、ＰＥＧ_２０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ−ＤｏｘはＰＥＧ_２０００−ＡＬＡＬ−Ｄｏｘよりも強い抗−腫瘍効果を示す（図１１）。この結果は、４つのセリンを立体配座Ｄで有する分子スペーサー保持化合物がより強い腫瘍再活性化を導くという仮説を再び支持するものである。このデータは、ＰＥＧとプロドラッグの再活性化時に切断され得る配列の間に４つのＤセリンを挿入することで正の効果が得られることを明らかに実証するものである。

実施例１１：ＴＮＦ−αのＰＥＧ化誘導体の有効性試験
Ｂ１６ＢＬ６マウス腫瘍（マウスメラノーマ）を異所移植（皮内移植）されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ型の一般的な雄のマウスモデルを使用して、（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαの抗−腫瘍活性を、（ＰＥＧ_５０００）_ｎ−ＴＮＦαおよび（ＰＥＧ_５０００−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）_ｎ−ＴＮＦαと比較した。

複合体を、１ｋｇあたりＴＮＦ−α２０００μｇ等量で週に２回、１週間にわたって（０および３日）静脈内投与した。この投与量では即時的な毒性の徴候は見られなかった。

図１２は、動物の生存の変動を示す。薬剤処理群では、（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαは６日目にマウスの４０％を、１０日目に６０％を死に至らしめた。コントロール群を含む別の群の死亡率は２０％を越えず（マウス５匹のうち１匹）、これはＢ１６−ＢＬ６型腫瘍の浸潤性および転移性によるものと考えられる。

図１３は、薬剤を処理し始めてからの、時間に対する平均体重の変動を示す図である。最初の注射をした日に（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαおよび（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαを処理した群で顕著な体重減少が認められる（それぞれ１５および２８％）。２回目の注射の後、（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαを処理した群で更に体重減少が進んでいる。後者の場合、最大体重減少は６日目の３２％である。これに対して、（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦαを処理した群では、２回目の注射（３日目）の後に体重が回復している。（ＰＥＧ_５０００）_ｎ−ＴＮＦαを処理した群では体重の減少が見られなかった。

Ｔ／Ｃ（薬剤処理群（Ｔ）とコントロール群の（Ｃ）の平均ＲＴＶの比）の変動を基に得た抗−腫瘍効果を図１４に示す（パーセンテージで表記）。結果から、たんぱく質の活性型の放出に必要なＴＮＦαのプロドラッグの活性化は複合体の構造に応じて変化することがはっきりと分かる。（ＰＥＧ_５０００）_ｎ―ＴＮＦαは不活性、（ＰＥＧ_５０００−ＡＬＡＬ）_ｎ―ＴＮＦα（Ｔ／Ｃｍｉｎ＝５１．７％（ｊ３）；ＳＧＤ＝１．６６）は（ＰＥＧ_５０００−（ＤＳｅｒ）_４−ＡＬＡＬ）_ｎ−ＴＮＦα（Ｔ／Ｃｍｉｎ＝１６．７％（ｊ６）；ＳＧＤ＝３．７２）よりも低い活性を示す。この結果から複合体の活性化と毒性は相関することが分かる。ＰＥＧとＴＮＦαの間にペプチドが存在しなければ細胞毒性は低いかまたはゼロである（体重減少で判断）。これらの２つの部位の間にＡＬＡＬ結合を挿入すると生成物の毒性はより顕著になるが、これはその高い血液外再活性化を反映するものである。親水性スペーサー（ＤＳｅｒ）_４を挿入してこのペプチド（ＡＬＡＬ）を延長すると複合体の毒性は顕著に増加するが、明らかにこれは血液外区画での再活性化能が向上した結果である。

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本発明のドキソルビシンのＰＥＧ化プロドラッグの２つの合成方法の概略を示す図である。 本発明のプロドラッグのＭＣＦ−７／６細胞に対する細胞毒性試験を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＬＳ−１７４−Ｔ腫瘍を持つ異種移植マウスの平均体重の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＬＳ−１４７−Ｔヒト結腸癌腫瘍を持つ無胸腺マウスの相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の平均値の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＬＳ−１７４Ｔ腫瘍の第１増殖期および第２増殖期の阻害を比較する図である。 本発明のプロドラッグの血清培地中安定性を示す図である。 本発明のプロドラッグのヒト全血中での安定性を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌腫瘍を持つ無胸腺マウスの平均体重の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖阻害を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＨＣＴ−１１６腫瘍を持つ異種移植マウスの生存率の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖阻害を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＢ１６−ＢＬ６メラノーマ腫瘍を持つ移植マウスの生存率の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理時のＢ１６−ＢＬ６メラノーマ腫瘍を持つ移植マウスの平均体重の変動を示す図である。 本発明のプロドラッグ処理群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）のＲＴＶ平均値の比の変動からＢ１６−ＢＬ６腫瘍の増殖阻害を示す図である。

Claims (33)

1. [式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍで示される化合物であって、
   式中、
   Ｉは、標的細胞に対して有利に働く活性物質であり、
   Ａは、血液循環時のＢ−Ｉの半減時間を延長させる基であり、
   Ｅ−Ｂは、ＡとＩを連結させる基であり、
   Ｂは、単独で存在する酵素または好ましくは前記標的細胞の近くに存在するかあるいは標的細胞上に存在する酵素により、選択的に切断され得る構造であり、
   Ｅは、循環組織中で安定な親水性基であり、該基がＢからＡを引き離すことにより、前記標的細胞の近くまたは前記標的細胞上でのＢの切断を可能にするか容易にし、その結果、Ｉの放出あるいは基Ｂを有するＩの放出が可能になるか容易になる、
   ｎは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ｉの全数までの、あるいは、連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ａの全数までの整数であり、
   ｍは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ａの全数までの整数であり、
   ｐは、１から連結基Ｅ−Ｂが結合し得る反応基Ｉの全数までの整数であり、
   ｐ＝１の場合ｎ＝ｍであり、ｍ＝１の場合ｎ＝ｐである］ことを特徴とする、式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍで示される化合物。
2. Ｉが共有結合により１つ以上の構造Ｂと直接結合していることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
3. Ｉが連結腕を介して１つ以上の構造Ｂと結合していることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
4. Ｅの大きさがアミノ酸１〜１００個に等しいことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の化合物。
5. Ｅは、１〜１００個、好ましくは１〜２０個、非常に好ましくは２〜１０個の同一または異なるアミノ酸で構成されるかまたはそのようなアミノ酸を含み、前記アミノ酸は立体配座Ｄの天然アミノ酸を含む群から選択され、前記アミノ酸は遺伝学的にコードされたものではないことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の化合物。
6. 前記アミノ酸がＤ−グルタミン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リジンおよびＤ−アルギニンから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
7. Ｅが、（Ｄ−セリン）ｘ、（Ｄ−スレオニン）ｘから選択されるアミノ酸配列で構成されるかまたはそのようなアミノ酸配列を含み、ｘが１〜２０の整数、好ましくは２〜１０の整数、非常に好ましくは２〜６の整数であることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の化合物。
8. Ｅが、ペプチドミメティック薬剤、偽ペプチドまたはペプチドであることを特徴とする、請求項４または５に記載の化合物。
9. Ｅが、置換アルキル鎖、ポリアルキルグリコール、ポリサッカライド、ポリオール、ポリカルボキシラートおよびポリ（ヒドロ）エステルから選択される少なくとも１つの基で構成されるかまたはそのような基を含むことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の化合物。
10. Ａの分子量が大きくなるとＥの大きさも大きくなることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の化合物。
11. Ｅが、請求項５から８までのいずれかに記載される１つ以上のアミノ酸と請求項９または１０に記載される少なくとも１つの基とで構成されるかそのようなアミノ酸と基とを含むことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の化合物。
12. Ａが更に、式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍで示される前記化合物の、水、血液または血清への可溶化特性を示すことを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の化合物。
13. Ａが更に、式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍで示される前記化合物の、前記標的細胞へのターゲティング特性を示すことを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の化合物。
14. Ａが更に、治療活性を有する薬剤または診断活性を有する薬剤であることを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の化合物。
15. Ａが、親水性であるかまたは両親媒性であることを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の化合物。
16. Ａが、ポリペプチド、免疫グロブリン、アルブミン、ポリサッカライド、ポリマーおよびコポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の化合物。
17. Ａが、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンイミン、および塩化ビニルコポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の化合物。
18. Ａが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、スチレンスルホン酸ナトリウム（ＮａＳＳ）、マレイン酸ナトリウムおよびマレイン酸ブチル（ＭＭＢＥ）、ヒドロキシプロピルメタクリラートまたはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、メチルメタクリラート（ＭＭＡ）、ポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ）、およびポリ−［Ｎ−（ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］（ＰＨＥＡ）から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の化合物。
19. Ａが、２００〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３５０〜２０，０００Ｄａ、非常に好ましくは１，０００〜１０，０００Ｄａの大きさのポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１７に記載の化合物。
20. Ｂが、腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、腫瘍または転移腫瘍の血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、リンパ球または腫瘍および転移腫瘍に侵入できる多核体から成る群より選択される細胞環境中に存在する酵素により切断され得ることを特徴とする、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の化合物。
21. Ｂが、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、および脂質鎖から選択されることを特徴とする、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の化合物。
22. 構造Ｂが、以下のペプチド配列：Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン−Ｌ−チロシン−Ｌ−グリシン−Ｌ−グリシン−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンから選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の化合物。
23. Ｂが、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、リソソーム酵素、リパーゼ、およびグリコシダーゼから選択される酵素により切断され得ることを特徴とする、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の化合物。
24. Ｂが、腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、リンパ球または多核体の環境中に選択的に存在するペプチダーゼによって切断され得ることを特徴とする、請求項２３に記載の化合物。
25. 腫瘍細胞の特異的ペプチダーゼが、ネプリリシン（ＣＤ１０）、チメトオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、レグマイン、コラゲナーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、および基質メタロペプチダーゼから成る群より選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の化合物。
26. Ｉが、任意にベクター物質と結合している化学薬品、ポリペプチド、たんぱく質、核酸、抗生物質、ウイルスまたはマーカーから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１から２５までのいずれか１項に記載の化合物。
27. Ｉが、抗−腫瘍治療活性、抗−血管新生活性または抗−炎症活性を有する薬剤であることを特徴とする、請求項２６に記載の化合物。
28. Ｉが、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、葉酸誘導体、ビンカアルカロイド、カリケアミシン、ミトキサントロン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、フルダラビンホスファート、メルファラン、ブレオマイシン、ミトマイシン、Ｌ−カナバニン、タキソイド、カンプトテシン、９−ジメチルアミノメチル−ヒドロキシ−カンプトテシンヒドロクロリド、プロテアソーム阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、エポシロン、メイタンシノイド、ディスコデルモライド、フォストリエシン、白金誘導体、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン、エピポドフィロトキシン、ＢＨ３ペプチド、Ｐ５３ペプチド、カスパーゼ、グランザイムＢ；リボザイム、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１（ＩＬ−１），ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＧＦ−１拮抗剤から成る群より選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の化合物。
29. Ｉが、クマリン、７−アミド−トリフルオロメチルクマリン、パラニトロアニリド、８−ナフチルアミドおよび４−メトキシナフチルアミド、フルオロセイン、ビオチン、ローダミンおよびそれらの誘導体ならびにシンチグラフィーに使用される薬剤から成る群より選択されるマーカーであることを特徴とする、請求項２６に記載の化合物。
30. 更に、式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍで示される前記化合物を前記標的細胞へ向かわせることができる１つ以上のターゲティング物質を含有することを特徴とする、請求項１から２９までのいずれか１項に記載の化合物。
31. 前記ターゲティング物質が、１つ以上の基Ａ上で、式（Ａ）_ｐ−（Ｅ−Ｂ）_ｎ−（Ｉ）_ｍの化合物と結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の化合物。
32. 活性成分として、請求項１から３１までのいずれか１項に記載の化合物を少なくとも１つ含有することを特徴とする、診断用または追跡用の医薬品。
33. 化合物：
    ポリエチレングリコール−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−ドキソルビシン
    ポリエチレングリコール−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−ＴＮＦα
    ポリエチレングリコール−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−ドキソルビシン
    ポリエチレングリコール−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｄ−セリル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−ＴＮＦα
    を含む群から選択されることを特徴とする、化合物。
    

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