MXPA06010764A - Metodos y composiciones de proteinas quimicamente modificadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona ampliamente con el campo de la modificacion de las proteinas y mas especificamente, con polimeros de bloque hidrosolubles, su union a farmacos asi como metodos de elaboracion.

Description

describen en pesos moleculares, por ejemplo, desde unos cientos de Daltons a 40-50 kiloDaltons o más. La PEGilación puede extender la vida media sérica de una proteina terapéutica aumentando así la duración de su efectividad y reduciendo la frecuencia de la dosificación. Un mecanismo mediante el cual el PEG aumenta la vida media sérica de un fármaco basado en proteínas mediante la protección contra proteólisis, Sada et al., J. Fermentation Bioenineering 71: 137-139 (1991) . Ciertamente, la modificación química con un solo polímero de 20 kDa de polietilenglicol (PEG) en la N-terminal de leptina da como resultado la necesidad de menor cantidad de leptina administrada y aumenta la solubilidad en relación con la proteína natural sin modificar; ver, por ejemplo, PCT WO 96/40912. Para un repaso, ver Abuchowski et\al., Enzymes and Drugs. (J.S. Holcerberg y J. Roberts, eds . Pp. 367-383 (1981) ) . Ciertamente, PEG se conjuga a varias proteínas terapéuticas comerciales y los ejemplos incluyen PEG-adenosin deaminasa (Adagen®) para el tratamiento contra enfermedades severas combinadas de inmunodeficiencia; Neulasta™ (pegfilgrastima) para el tratamiento contra neutropenia; Definity® Vial (microesfera lipídica de Perflutreno) suspensión inyectable ) PEG) ; Somavert® (pegvisomant) para el tratamiento contra acromegalia; PEG-L-asparaginasa (Oncaspar®) para el tratamiento contra leucemia linfoblástica o linfoma no Hodgkin y PEGASYS® (pegintergeron alfa-2a) y PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b) para el tratamiento contra hepatitis . Sin embargo, hay limitaciones asociadas con estas modificaciones químicas. Por ejemplo, el uso de estos conjugados en aplicaciones crónicas y/o en cantidades relativamente elevadas puede dar como resultado la acumulación de polímeros de elevado peso molecular debido a su resistencia a la degradación. Además, los conjugados PEG- fármaco se acumulan en las vacuolas renales cuando se administran regularmente durante cierto período de tiempo a elevadas dosis; ver por ejemplo, Conover et al., Artificial Organs, 21(5): 369-378 (1997); Bendele et al., Toxicological Sciences, 42_: 152 (1998) . Aunque no se sabe si estas vacuolas son nocivas para la salud de la persona, se prefiere que la administración del fármaco no tenga anormalidades asociadas . Por lo tanto, es ventajoso tener un polímero hidrosoluble conjugado en el fármaco, donde el polímero hidrosoluble puede eliminarse del cuerpo del paciente sin acumulación indeseada, por ejemplo, como puede cuantificarse mediante la formación de vacuolas renales . Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona con polímeros de bloque hidrosolubles ligados a grupos de enlace lábil, con métodos para elaborarlos y utilizarlos. En consecuencia, un - aspecto de la invención comprende un polímero covalentemente unido a otro igual (homopolímero de bloque) o diferentes polímeros (copolímero de bloque) a través de un ligador y con métodos para utilizarlos, donde la estructura polímero- ligador puede unirse repetitivamente a otro polímero-ligador para lograr la longitud necesaria del polímero en bloque. En una modalidad, A representa el polímero y B representa el ligador. En consecuencia, el homopolímero de bloque tiene la estructura de (A-B)n, donde n es un número entero que representa la cantidad deseada de unidades repetidas . En otra modalidad, un polímero está representado por A y el ligador por B y un segundo polímero heterólogo está representado por C. En este ejemplo de copolímero en bloque, el polímero completo puede contener indistintamente las unidades deseadas A-B o C-B y estas unidades pueden alternarse, por ejemplo, (A-B-C-B)n donde n tiene un valor de 1 a 1,000 o el copolímero de bloque puede tener cada tipo de polímero en cantidades variables en relación con los demás dentro del polímero. En otra modalidad, el ligador lábil es hidrolíticamente y/o proteolíticamente más sensible que los enlaces moleculares internos del polímero hidrosoluble. En consecuencia, el polímero en bloque es soluble y conjugado a un fármaco, cuando se administra repetidamente y/o crónicamente, demuestra una mayor vida media sérica y/o menor antigenicidad consistente con las ventajas proporcionadas con la formulación a los polímeros hidrosolubles tradicionales, por ejemplo después de la PEGilación pero disminuye o elimina la acumulación indeseada como se cuantifica mediante la formación de vacuolas renales.

Como se describe con mayor detalle a continuación, la presente invención tiene una variedad de aspectos que se relacionan con fármacos químicamente modificados incluyendo proteínas o sus análogos. En ciertos aspectos, la presente invención se relaciona con la conjugación de polímeros de bloque hidrosolubles conjugados a una proteína terapéutica. En aspectos particulares, la proteína terapéutica se selecciona de leptina, un receptor de factor de necrosis tumoral soluble (sTNFR) y un péptido designado como Ll-7. Como se utiliza aquí, el polímero en bloque hidrosoluble se elabora a partir de fragmentos de polímeros más pequeños desde 500 Daltons hasta 3,000 Daltons teniendo ligadores entre los bloques poliméricos que son hidrolíticamente o proteolíticamente sensibles a la degradación. Un polímero representativo es un polietilenglicol (PEG) y un enlace representativo se hace a través de un grupo amida. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Muestra la formación de vacuolas renales luego de la inyección crónica de 1, 2 o 20 kDa de leptina PEGilada.

En el eje Y, O significa que no hay vacuolas visibles, 0.5 son pequeñas vacuolas raras con distribución esporádica, 1.0 es el lecho mínimo de pequeñas vacuolas bajo el borde de cepillo de células en el túbulo, 1.5 son pequeñas vacuolas de apariencia obvia, que están dispersas y no afectan cada célula o túbulo, 3.0 es una cantidad leve de vacuolas sin se obvias dentro del túbulo con una apariencia carcomida, 2.5 es más severo que las vacuolas pero no afectan aún todo el volumen celular, 3.0 es una cantidad moderada y obvia de grandes vacuolas visibles en menos del 50% de los túbulos, 3.5 es una cantidad obvia de vacuolas ) como en 3.0), y también degeneración nuclear, 4.0 es una vacuolización notoria de más de 50% de los túbulos con degeneración nuclear . Figura 2. Se muestra la pérdida de peso de ratones tratados con veinte kiloDaltons de leptina PEGilada en comparación con la leptina PEGilada con los polímeros de bloque de elevado, mediano o bajo peso molecular de la invención (el cuadrado representa datos de 20 kDa leptina PEGilada, X representa datos de conjugados de leptina-polímero en bloque de bajo eso molecular, X con una raya a través representa datos de conjugados de leptina y polímero en bloque de bajo peso molecular, + representa datos de conjugados de leptina y polímeros de bloque de elevado peso molecular y los diámetros representan datos de un control PBS. Figura 3. La formación de vacuolas renales se mide en ratones tratados según la Figura 2. Figura . Los datos muestran los resultados de una sola inyección de conjugados elaborados en el Ejemplo 2. La clave para los datos es igual que la Figura 2 , con la adición de triángulos para proteínas de fusión Fc-leptina. Figura 5. La formación de vacuolas renales se mide en ratones tratados según la Figura 3. Figura 6. Muestra la inflamación de la parte y el efecto de sTNFRl conjugado ya sea con un PEG polímero de bloque o PEG de 20 kDa. Descripción Detallada de la Invención La conjugación de fármacos, especialmente proteínas terapéuticas con polímeros hidrosolubles como polietilenglicol (PEG) confiere importantes beneficios terapéuticos una menor antigenicidad y aumento de vida media sérica. Sin embargo, la administración crónica o de elevadas dosis de polímeros de mayor peso molecular, por ejemplo, mayores a 5 kDa PEG, puede dar como resultado una eliminación retardada del paciente como se inhibe mediante la acumulación de polímeros en, por ejemplo, vacuolas renales. A diferencia, se ha descubierto que la forma de polímeros de menor peso molecular, por ejemplo menores a 2 kDa PEG, se eliminan del suero sin acumularse en las vacuolas renales. De hecho, existe la tendencia de una mayor vacuolización con el mayor peso molecular de PEG (Figura 1) . En restos experimentos, se demostró que cuando una masa igual de PEG de peso molecular variable, es decir 1,2 y 20 kDa, se mono-PEGiló en una molécula de leptina, solo el conjugado de PEG-leptina de 1 kDa no mostró una formación cuantxficable de vacuolas renales a diferencia de los conjugados PEG-leptina de 2 y 20 kDa que no induce una formación de vacuolas renales. La tendencia de peso molecular que se mantiene para estas leptinas poliPEGiladas así como también cuando la leptina se PEGiló múltiples veces con PEG de 1 kDa la puntuación de las vacuolas renales fue comparable a los controles PBS o leptinas sin modificar. Más aún, se demostró que 1 kDa de leptina PEGilada tiene una actividad igual a la leptina in vivo, es más soluble a un pH fisiológico y no causa reacciones en el sitio de inyección a elevadas concentraciones y no muestra evidencia de vacuolización renal. Sin embargo, cuando se conjuga una PEG de menor tamaño, por ejemplo menor a 5 kDa con un fármaco, no se proporciona una mayor vida media sérica como se descubrió con los conjugados PEG de mayor tamaño, por ejemplo, 20 kDa PEG. En consecuencia, los inventores de la presente invención han descubierto que al enlazar bloques de moléculas hidrosolubles que tienen alrededor de 1 kDa ya sea a bloques homólogos o heterólogos por medio de un enlace lábil, de manera que el tamaño total del polímero de bloque sea mayor a 10 kDa, se puede aumentar la vida media del suero. De manera importante, este aumento es comparable a la conjugación de un polímero que no es de bloques y la acumulación de vacuolas renales encontradas en la dosificación crónica de proteínas tradicionalmente PEGiladas se reduce o elimina. Por lo tanto, la presente invención se relaciona con polímeros de bloque, los métodos para elaborar y utilizar estas moléculas y con polímeros de bloque conjugados con estos fármacos . Está contemplado que los polímeros de bloque de la invención muestran los beneficios farmacológicos de los polímeros de mayor peso molecular, por ejemplo un aumento de la vida media en suero y disminución de la inmunogenicidad pero también son más degradables y en consecuencia no tienen propiedades indeseadas. A continuación, se proporcionan ejemplos funcionales de fármacos conjugados a, por ejemplo, un polímero en bloque de la invención con similares propiedades farmacocinéticas a moléculas terapéuticas que están N-terminalmente monoPEGiladas con 20 kDa PEG. Sin embargo, se demuestra además, que las moléculas conjugadas con polímeros de bloque idrosolubles son menos propensas a inducir la formación de vacuolas renales al momento de administrarse crónicamente a diferencia de aquellas PEGiladas con polímeros de 20 kDa.

El tamaño de los polímeros de bloque es preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 kDa, con mayor preferencia 15 a 40 kDa y aún más preferiblemente 15 a 30 kDa con un tamaño representativo de 20 kDa. El experto en la técnica puede entender con facilidad que los diferentes polímeros hidrosolubles tienen cierta variabilidad en cuanto a propiedades y por lo tanto el tamaño ideal no necesita determinarse para el uso con los fármacos para conjugar. La experimentación para determinar la composición ideal y también el tamaño de los bloques en el polímero en bloque y el tamaño del polímero en bloque son simplemente experimentos rutinarios en vista de la descripción de la presente. Como se utiliza aquí, se entiende que un "enlace lábil" es más susceptible a su ruptura ya sea mediante una degradación hidrolítica o por proteasas que los enlaces moleculares normales encontrados en un polímero hidrosoluble.

Para las actuales composiciones de polímeros de bloque, se pueden seleccionar a partir de una variedad de polímeros hidrosolubles (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de polímeros hidrosolubles con respecto a moléculas de fármaco en la mezcla de la reacción, el tipo de reacción de conjugación que se va a llevar a cabo, el método para obtener el fármaco conjugado seleccionado y el tipo de fármaco que se va a utilizar. El polímero en bloque puede ser hidrosoluble para que el fármaco con el cual se une no se precipite en un ambiente acuoso, como un ambiente fisiológico. El polímero puede ser ramificado o sin ramificación. De preferencia, para uso terapéutico de la preparación del producto final, el producto es farmacéuticamente aceptable. El experto en la técnica es capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en tales consideraciones como si el conjugado polímero/proteína sea utilizado terapéuticamente y si es así, la dosificación deseada, tiempo de circulación, resistencia a proteólisis y otras consideraciones . Los polímeros hidrosolubles típicos adecuados para la conjugación a fármacos incluyen, entre otros, polietilenglicoles , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, poli 1 , 3-dioxolano, poli 1,3,6-trioxano, copolímero de anhídrido etileno/maleico, poliaminoácidos , dextrano o poli (n-vinilpirrolidona) , copolímeros de propilenglicol, polímeros de propilenóxido/etilenóxido, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico . Se ha demostrado que varias de estas formulaciones de conjugados de polímero-fármaco tienen propiedades farmacológicas mejoradas, por ejemplo, una mejor vida media sérica, estabilidad mejorada, también se ha descubierto una solubilidad y/o reducción de inmunogenicidad (Trakas et al., J. Neuroimmunology, 120(1-2): 42-9 (2001).

Para los polímeros hidrosolubles útiles para los bloques en los polímeros de bloque de la presente invención, los pesos moleculares se encuentran entre aproximadamente 500 Daltons y aproximadamente 3,000 Daltons. Como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" indica que las preparaciones de polímeros hidrosolubles, algunas moléculas pesarán más, algunas menos que el peso molecular indicado y que el peso molecular indicado simplemente un promedio obtenido a partir de la preparación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación prolongada deseada, sus efectos si es que hay sobre actividad biológica, la facilidad de manejo, liberado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de polietilenglicol con una proteína terapéutica o su análogo) . En consecuencia, está contemplado que los polímeros de aproximadamente 500 Daltons, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 900, aproximadamente 1,000, aproximadamente 1,100, aproximadamente 1,200, aproximadamente 1,300, aproximadamente 1,400, aproximadamente 1,500, aproximadamente 1,600, aproximadamente 1,700, aproximadamente 1,800, aproximadamente 1,900 o aproximadamente 2,000 pueden utilizarse según la invención. Los siguientes ejemplos implican el uso de PEG 1,000, que se seleccionó por su facilidad de purificación y por proporcionar un sistema adecuado de modelo experimental.

En una modalidad particular, el polímero hidrosoluble de la invención es un polímero de bloque basado en PEG con utilidad como un portador de fármacos. En este ejemplo, el polímero puede sintetizarse durante un polimerización de poliadición en un solo paso de PEG diaminas bifuncionales de bajo peso molecular (es decir, menores a 3,000 Daltons) y un ácido bifuncional para producir un polímero en bloque ligado por medio de grupos amida. Se formó un grupo terminal de polímero reactivo a tiol mediante la reacción de NHS éster de ácido maleimidopropionico con un grupo terminal amino . En una modalidad, el ligador del polímero de la invención es un diácido, por ejemplo oxalilcloruro . Más particularmente, en un ejemplo, el conjugado de fármaco-polímero de bloque tiene la siguiente fórmula: R'-[-HN- (CH2CH20)n-CH2CH2NH-C (=0) -C (=0) - ] X-NH~R-NHC (=0) CH2CH2-maleimida-S-fármaco, donde R' es un grupo bifuncional como maleimida, R es una molécula separadora y produce un carbono, metileno u otro grupo que no interrumpa la estructura y función de la molécula, n tiene un valor de 10 a 500 y x tiene un valor de a 25. En otro ejemplo, el ligador lábil-polímero de bloque tiene la fórmula R' -CH2CH2C (=0) NH-R-NH-C (=0) (CH2) 3C (=0) - [-0 (CH2CH20)n-CH2CH20-C (=0) (CH2) 3-C (=0) -]X-NH-R-NH-C (=0) CH2CH2-maleimida-fármaco, donde el fármaco puede ser una proteína o un péptido y donde x tiene un valor de 10 a 1,000 y R y R' son grupos enlazantes . En otra modalidad, el polímero de bloque tiene la siguiente fórmula: R- [-C (=0) -PEG1K-C (=0) -NH- PEGl -NH]n-C (=0) -CH2CH2-maleimida-S-fármaco, donde n tiene un valor de 3 a 30, con mayor preferencia 5 a 25, con mayor preferencia 7 a 20 y más preferiblemente 10 a 15. En ambos casos, los grupos R no pueden ser cualquier grupo de remate adecuado. En ambos ejemplos, la maleimida se hace reaccionar con un tiol libre para formar un enlace tioéter con el fármaco. Está contemplado que los polímeros de la invención sean conjugados a un fármaco que sea una proteína y que contenga un residuo cisterna al cual se une el polímero. En los siguientes ejemplos, los polímeros de bloque basados en PEG conjugado con un receptor soluble de factor de necrosis tumoral (sTNFR) , un péptido Ll-7 y una molécula de leptina que contiene una cisterna libre para producir un conjugado de fármaco-polímero en bloque. Sin embargo, se entiende que los polímeros de la invención pueden conjugarse con cualquier molécula terapéutica incluyendo proteínas, péptidos (por ejemplo, péptidos y/o proteínas sintéticas, mutadas, de fusión, recombinantes , purificadas y naturales) y otras moléculas ¦ siempre que tengan un grupo enlazante apropiado para conjugarse con el polímero. Los ejemplos representativos de proteínas y péptidos útiles en la presente incluyen, entre otros, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , eritropoyetina (EPO) , anticuerpos, incluyendo IgGl, IgG2 y otros isotipos, péptidos antagonistas Bl, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , hormona luteinizante (LH) , ormona folículoestimulante (FSH) , gonadotropina coriónica humana (HCG) , motilina, interferones (alfa, beta, gamma) , interleucinas (IL-1 o IL-12) , factor de necrosis tumoral (TNF) , proteína de unión al factor de necrosis tumoral (TNF-bp) , factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) , factor neurotrofico derivado de la glial (GDNF) , factor 3 neurotrofico (NT3) , factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor neurotrofico de crecimiento (NGF) , factores de crecimiento óseo como la osteoprotegerina (OPG) , factores de crecimiento similares a insulina (IGF) ; factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) , factor estimulante de colonia de macrófagos granulocxticos (GM-CSF) , factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF) , factor de crecimiento de gueratinocitos (KGF) , trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF) , factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSF) , proteína morfogenética ósea (BMP) , superóxido de dismutasa (SOD) , activador de plasminógeno tisular (TPA) , urocinasa, estreptocinasa y calicreína. Se entiende que los métodos aplicables para la unión de polímeros hidrosolubles como PEG también son adecuados para la unión de los polímeros de bloque descritos aquí . Por lo tanto y en general, las moléculas hidrosolubles como el polietilenglicol se conectan a fármacos por medio de un grupo reactivo encontrado en el fármaco. Los grupos amino, como aquellos en los residuos de lisina o en la N-terminal de proteínas, son convenientes para esta unión. Por ejemplo, Royer (Patente de EE.UU. No. 4,002,531 anterior) indica que se utilizó la alquilación reductiva para la unión de moléculas de polietilenglicol en una enzima. El documento EP 0 539 167 indica que los péptidos y compuestos orgánicos con grupos amino libres son modificados con un derivado intermedio de PEG o polímeros orgánicos hidrosolubles relacionados. La Patente de EE.UU. No. 4,904,584 por Shaw, presentada el 27 de febrero de 1990, se relaciona con la modificación de la cantidad de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilenglicol por medio de grupos amina reactivos . Están disponibles métodos adicionales para la unión de polímeros hidrosolubles. Ver por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 4,179,337 y Patente de EE.UU. No. 4,002,531. La Patente de EE.UU. No. 5,824,784 describe proteínas N-terminalmente monopegiladas donde "N-terminalmente monopegiladas" indica que la entidad de proteína tiene unida una sola entidad de polietilenglicol en el N-terminal y que demuestra, ínter alia, una vida media sérica aumentada y estabilidad mejorada.

Incluso en otra modalidad, el fármaco se conjuga a más de un polímero. Por lo tanto, se pueden unir varias cantidades de entidades de polímeros de bloque en el fármaco (es decir, di-, tri-, tetra-, etc.). Asimismo, se puede combinar en una sola mezcla una combinación de conjugados de polímero-fármaco . La publicación de patente europea EP 0 401 384 describe materiales y métodos para preparar G-CSF a donde se unen moléculas de polietilenglicol . Un método general de PEGilación específica N-terminal de proteínas terapéuticas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso, se muestra en la Patente de EE.UU. No. 5,985,265. Además, la IL-6 PEGilada que se muestra en la Patente de EE.UU. No. 5,264,209 que describe moléculas de polietilenglicol conjugadas a IL-6. Además, la solicitud internacional No. WO/8503868 indica cómo hacer reaccionar una linfocina con un aldehido de polietilenglicol.

En términos generales, los fármacos útiles en la práctica de esta invención pueden ser una forma aislada de procedimientos químicos sintéticos o aisladas de organismos mamíferos nativos o, alternativamente, de una expresión de hospedero procariota o eucariota de secuencias de ADN exógeno obtenidas mediante clonación genómica o de ADNc o mediante síntesis de ADN. Los hospederos procariotas adecuados incluyen diversas bacterias (por ejemplo, E. coli) ; los hospederos eucariotas adecuados incluyen levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) y células de mamífero (por ejemplo, células de ovario de hámster chino, células de primate) . Por ejemplo, proteínas que son el producto de una secuencia de ADN exógeno expresada en células pueden tener, como resultado de expresión, un residuo N-terminal de metionilo con un grupo alfa-amino. Como se indica anteriormente, se incluyen los péptidos así como peptidomiméticos y otras proteínas modificadas. Dependiendo de la célula hospedera empleada, el producto de expresión de proteínas puede glicosilarse con carbohidratos de mamífero o eucariotas, o no puede estar glicosilada . El producto de la expresión proteica también puede incluir un residuo inicial de aminoácido de metionina (en la posición 1) y puede escindirse posterior a la traducción en forma madura, por ejemplo, una proteína secretada que comprende un solo péptido puede tener escindido el péptido de señalización. Los análogos de proteína y las proteínas que no ocurren naturalmente, por ejemplo, el interferón de consenso también son adecuadas para los métodos de la presente descritos en la Patentes de EE.UU. Nos. 5,824,784 y 5,985,265. Generalmente, la utilidad de fármacos y análogos de los mismos en la presente invención puede asegurarse llevando a la práctica los procedimientos de modificación química como se proporcionan aquí para modificar químicamente el fármaco y probar el producto resultante para determinar la característica deseada como pueden ser las valoraciones sobre actividad biológica. En el caso de proteínas, si se desea al estar tratando mamíferos no humanos, se puede utilizar proteínas no humanas recombinantes como proteína recombinante de murino, bovino, etc. Ver documentos PCT WO 9105798 y PCT WO 8910932. Además, las presentes composiciones y métodos incluyen la formulación de composiciones farmacéuticas, métodos de tratamiento y elaboración de medicamentos. La proporción de polímeros de bloque con respecto a moléculas de fármaco varía, así como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima se determina mediante el peso molecular del polímero seleccionado. Además, un ejemplo implica la PEGilación no específica y purificación posterior de los tipos deseados de polímero-fármaco, la proporción puede depender de la cantidad de grupos reactivos de amina disponibles (normalmente grupos amino) de grupos libres de tiol que se encuentran disponibles. Un ejemplo de una proporción de reacción de fármacos con respecto a moléculas de polímero para obtener un material monopolimérico es de 1.5 moléculas de polímero por molécula de fármaco. Esta proporción es particularmente útil en las conjugaciones de proteínas con PEG. Un método útil para enlazar un polímero hidrosoluble, por ejemplo un polímero de bloque como se describe aquí, con una proteína que implica grupos no enlazante entre la entidad de polímero y la entidad de proteína se describe en Francis et al., (Eds. Ahern, T. y Manning, M. C.) Plenum, Nueva York, 1991. También, Delgado et al., Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Saystems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y. , 1989 pp. 211-213, involucra el uso de cloruro tresilo, que da como resultado en que no hay un grupo de enlace entre la entidad de polietilenglicol y la entidad proteínica. Este método puede ser difícil de utilizar para productos terapéuticos ya que el uso de cloruro de tresilo puede producir subproductos tóxicos . Una alternativa es el uso de ésteres de N-hidroxisuccinimidilo de polietilenglicol de carboximetilmetoxilo . Puede ser necesario separar una especie particular de polímero en bloque hidrosoluble ligado al fármaco, por ejemplo, aislamiento de un proteína N-terminal conjugada, de otras entidades si es que es necesario. Esta purificación implica la separación a partir de una población de molécula de proteínas conjugadas. Por ejemplo, un ejemplo es cuando la proteína conjugada se separa mediante cromatografía de intercambio iónico para obtener un material que tiene una característica de carga de material monoconjugado (puede haber presente otros materiales muíticonjugados que tengan la misma carga aparente) y luego los materiales monoconjugados se separan usando una cromatografía por exclusión de tamaños. De otra forma, la proteína N-terminalmente conjugada puede separarse de otras especies monoconjugadas , así como de otras especies muíticon ugadas . Se mencionan otros métodos similares. Por ejemplo, el documento PCT WO 90/04606, publicado el 3 de mayo de 1990 muestra un proceso para la fraccionación de una mezcla de aductos de proteína-polímero hidrosoluble que comprende separar los conjugados en un sistema bifásico acuoso que contenga el polímero. En otro aspecto, se conjuga un polímero hidrosoluble con una proteína seleccionada en el N-terminal. Esto incluye la modificación mediante alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina con respecto al N-terminal) disponibles para la derivatizacion en una proteína en particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se logra una derivatizacion sustancialmente selectiva de la proteína en el N-terminal con un grupo carbonilo que contiene el polímero. La reacción se lleva a cabo a un pH, que permite que se tome ventaja de los diferenciales de pKa entre los grupos alfa-amino de los residuos de lisina y el grupo alfa-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante esta derivatizacion selectiva la unión de un polímero hidrosoluble con una proteína puede controlarse: la conjugación con el polímero ocurre predominantemente en el N-terminal de la proteína y no ocurre una modificación significativa de otros grupos reactivos como la cadena secundaria de lisina de grupos amino . Según este método, el el conjugado monopolímero/proteína tiene una entidad polimérica ubicada en el N-terminal, pero no en los grupos amino secundarios como aquellos para lisina. Preferiblemente la preparación es mayor que 80% conjugado de monopolímero/proteína y con mayor preferencia más de 95% de conjugado de monopolímero/proteína.

Para la alquilación reductiva, el agente reductor deberá ser estable en solución acuosa y preferiblemente ser capaz de reducir solamente la base Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductiva. Los agentes reductores preferidos pueden seleccionarse del grupo que comprende borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borato de dimetilamina, borato de trimetilamina y borato de piridina.

Moléculas de Leptina La leptina adecuada para usarse en la presente invención puede seleccionarse de proteínas recombinantes de metionilo humano y de murino . Una forma particularmente útil de leptina es cuando las cisteínas naturales han sido mutadas en la posición 78 ha sido cambiada a cisteína, dejando solo una cisterna como sitio de reacción para una maleimida de polímero hidrosoluble . A continuación se proporcionan las secuencias de leptina natural para humano y ratón.

Leptina de humano : M V P I Q K V Q D D T K T L I K T I : V T R I N DI S H T Q S V S A K Q R V T G L D F I P G L H P I L S L S K M D Q T L A V Y Q Q V L T S L P S Q N V L Q I AN D L E N L R D L L H L L A F S K S C S L P Q T S G L Q K P E S L D G V L E A S L Y S T E V V A L S R L Q G s L Q D I L Q Q L D V S P E C Leptina de murino : M V P I Q K V Q D D T K T L I K T I V T R I N DI S H T Q S V S S K Q R V T G L D F I P G L H P I L T L S K M D Q T L A V Y Q Q I L T S M P S R N V L Q I S N D L E N L R D L L H V L A F S K S C H L P W A S G L E T L D S L G G V L E A S G Y S T E V A L S R L Q G S L Q D M L W Q L D L S P G C Además, las leptinas adecuadas incluyen aquellas que carecen de residuo glutaminilo en la posición 28, donde la posición 1 se contempla como la primera Valina y la primera Metionina es la posición -1 (Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994); ver también Correction at Nature 374: 479 (1995)). El producto génico de leptina humana recombinante es una proteína madura, de 1746 aminoácidos que carecen de Metionina N-terminal. La proteína de murino es sustancialmente análoga a la proteína de humano, particularmente como proteína madura y además, particularmente en el N-terminal . Se puede preparar un análogo de la proteína humana recombinante alterando (como mediante la sustitución de residuos de aminoácidos) , en la secuencia humana recombinante, los aminoácidos que difieren de la secuencia de murino. Debido a que la proteína humana recombinante tiene una actividad biológica en ratones, es probable que este análogo sea activo. Las proteínas que carecen de un residuo de metionilo N-terminal como aquellas que se producen mediante expresión eucariota, también están- disponibles para usarse.

Proteínas de unión al factor de necrosis tumoral soluble Para el propósito de la invención, las moléculas descritas en las siguientes referencias se relacionan a inhibidores TNF y los sTNFR y las variantes y derivados de sTNFR y las moléculas descritas en las referencias (ver a continuación) se llaman colectivamente "inhibidores TNF-alfa" . Estos incluyen formas solubles del receptor tipo I o tipo II de TNF. Como se utiliza en los siguientes ejemplos, se observa que la proteína de unión al TNF es la que se utiliza pero sin embargo, está contemplado que sean útiles polipéptidos adicionales con las composiciones y en los métodos descritos aquí. Las proteínas representativas de unión a TNF se describen en las Patentes de EE.UU. Nos. 6,541,620, 6,271,346 y 6,143,866. La Patente de EE.UU. No. 6,541,620, muestra las secuencias del receptor soluble TNF tipo I (también conocido como sTNFR-I o inhibidor TNF de 30 kDa) y el receptor soluble de TNF tipo II (también conocido como sTNFR-II o inhibidor TNF de 40 kDa), colectivamente llamados "sTNFR" , así como sus formas modificadas (por ejemplo, fragmentos, derivados funcionales y variantes). Además, el documento EP 393 408 muestra un inhibidor TNF de 40 kDa llamado D51 y un inhibidor TNF de 40 kDa llamado D53, que son versiones truncadas de la proteína inhibidora TNF de 40 kDa recombinante y de cadena completa en donde 51 o 53 residuos de aminoácidos, respectivamente en el término carboxilo de la proteína madura han sido retirados. sTNFR-I y sTNFR-II son miembros de la superfamilia de receptores del receptor TNF/familia del receptor de crecimiento de nervios que incluye el receptor de receptor del factor de crecimiento de nervios (NGF) , el antígeno CD40 de células B, 4-1BB, el antígeno OX40 de células T, el antígeno Fas y los antígenos CD27 y CD30 (Smith t al. (1990), Science, 248: 1019-1023). La solicitud PCT No. PCT/US97/12244 muestra las formas truncadas de sTNFR-I y sTNFR-II que no contienen el cuarto dominio (residuos de aminoácidos Thrl27-Asnl61 de sTNFR-I y residuos de aminoácidos Prol41-Thrl79 de sTNFR-II) ; una porción del tercer dominio (residuos de aminoácidos Asnlll- Cysl26 de TBFR-I y residuos de aminoácidos Prol23-Lysl40 de sTNFR-II) ; y opcionalmente, que no contienen una porción del primer dominio (residuos de aminoácidos Aspl-Cysl9 de sTNFR y residuos de aminoácidos Leul-Cys32 de sTNFR-II) . El sTNFR truncado útil en la presente invención incluye las proteínas representadas por la fórmula Rl- [Cysl9-Cysl03 ] -R2 y R4- [Cys32-Cysll5] -R5. estas proteínas son formas truncadas de sTNFR-I y sTNFR-II, respectivamente y proporcionan la oportunidad de una modificación dual en los grupos secundarios de tiol proporcionados por los aminoácidos cisteína. Mediante el término "Rl- [Cysl9-Cysl03 ] -R2 " se da a entender una o más proteínas donde [Cysl9-Cysl03 ] representa residuos 19 al 103 de sTNFR-I, el residuo aminoácido; donde Rl representa un grupo amino metionilado o no metionilado de Cysl9 o de residuos de aminoácidos de amino-terminal seleccionados de cualquiera de Cysl8 a Aspl y en donde R2 representa un grupo carboxi de Cysl03 o de residuos de aminoácidos carboxiterminales seleccionados de cualquiera de Phel04 a LeullO. El sTNFR-I truncado ejemplificante de la presente invención incluye las siguientes moléculas (colectivamente llamadas sTNFR-I de 2.6D) : NH2- [Aspl-Cysl05] -COOH (también referidas como sTNFR-I 2.6D/C105); NH2- [Aspl-Leul08] -COOH (también referidas como sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-[Aspl~ Asnl05]-COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/N105]; NH2- [Tyr9-Leul08]-COOH (también referida como sTMFR-I 2.3D/d8); NH2- [Cysl9-Leul08] -COOH (también referida como sT FR-I 2;3D/dl8); y H2- [Serl6-Leul08] -COOH (también referida como sTNFR-I 2.3D/dl5), ya sea metioniladas o no metioniladas y sus variantes y derivados . En la técnica se describen los inhibidores TNF-alfa de diversos tipos , incluyendo las siguientes referencias Patentes de EE .UU. Nos . 5,136,021 5,929,117; 5,948, 638 , 807, 862, 5, 695,953; 5, 834, 435; 5, 817, 822 ; 8, 830, 742 , 834,435; 5, 851, 556; 5, 853, 977; 5,359, 037; 5,512, 544 , 695, 953 ; 5, 811, 261; 5, 633, 145; 5, 863, 926; 5, 866, 616 , 641, 673 j: 5, 869, 677; 5,869,511; 5, 872, 146; 5, 854, 003 , 856, 161; 5, 877,222; 5, 877, 200; 5, 877, 151; 5, 886, 010 , 859, 660; 5, 859,207; 5,891,883; 5, 877, 180,· 5,955,480 ,955, 476; 5,955,435; 5,994,351; 5,990,119; 5,952,320 ,962,481. Las porciones relevantes de estas descripciones se incorporan aquí por referencia.

Métodos de Tratamiento Incluso en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan los métodos de tratamiento y elaboración de un medicamento. Las condiciones que se alinean o regulan mediante la administración del actual conjugado de fármaco-polímero de bloque depende del fármaco que está conjugado. Por ejemplo, cuando el fármaco es leptina, las condiciones que pueden aliviarse o regularse mediante la administración de los actuales conjugados de leptina/polímeros de bloque son aquellas en donde la leptina es aplicable e incluye obesidad. Los siguientes ejemplos de trabajo muestran que la leptina químicamente modificada con un polímero de bloque de la invención es aproximadamente tan activa como la leptina químicamente modificada con una molécula PEG. Asimismo, un sT FR conjugado a un polímero de bloque de la invención demuestra ser efectivo en el tratamiento contra un estado inflamatorio siendo al mismo tiempo menor propensa a inducir la formación de vacuolas renales. Se puede utilizar un receptor por factor de necrosis tumoral soluble conjugado a un polímero de bloque de la invención para el tratamiento contra condiciones asociadas a la sobreexpresión de TNF, por ejemplo inflamación. Una lista no exclusiva de enfermedades agudas y crónicas mediadas por TNF que pueden tratarse con las composiciones inhibitorias de TNF de la invención incluye, ente otras las siguientes: caquexia/anorexia; cáncer (por ejemplo, leucemia) ; síndrome de fatiga crónica; indicaciones y estados coronarios, incluyendo falla cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto al miocardio, disfunción del miocardio (por ejemplo, relacionada con sépsis) e injerto de derivación de arteria coronaria; diabetes incluyendo manifestación juvenil de tipo I, diabetes mellitus y la resistente a insulina (por ejemplo, asociada con obesidad); endometriosis , endometritis y estados relacionados; fibromialgia o analgesia; rechazo de hospedero contra injerto; hiperalgesia; enfermedades inflamatorias del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y diarrea asociada con Clostridium difficile; isquemia, incluyendo isquemia cerebral (lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía, cada una puede conllevar a una degeneración) ; enfermedades pulmonares (por ejemplo, síndrome de aflicción respiratoria en adultos, asma y fibrosis pulmonar) ; esclerosis múltiple; enfermedades neuroinflamatorias ; estados y enfermedades oculares, incluyendo el trasplante de córnea, degeneración ocular y uveítis; dolor, incluyendo dolor relacionado con cáncer; pancreatitis; enfermedades periodontales ; Pitiriasis rubra pilaris (PRP) ; prostatitis (bacteriana o no bacteriana) y estados relacionados; psoriasis y condiciones relacionadas; fibrosis pulmonar; lesión por reperfusión; enfermedades reumáticas incluyendo artritis reumatoide. Osteoartritis , artritis juvenil (reumatoide) , poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiocitis , dermatomicitis , escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis (por ejemplo, enfermedad de Kawasaki) , vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("séptica") , síndrome de Sjórgen, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes) ; choque séptico; efectos secundarios de terapia con radiación; lupus sistémico eritematoso (SLE) ; enfermedad de articulación temporomandibular; tiroiditis; trasplante de tejidos o estados inflamatorios resultantes de esguince, terceduras, daño al cartílago o trauma, cirugía ortopédica, infección (por ejemplo, VIH, Clostridium difficile y tipos relacionados) u otros procesos de enfermedad. Otro aspecto descrito aquí son las composiciones farmacéuticas de los anteriores. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser para su administración por inyección, oral, pulmonar, nasal, otras formas de administración. Por lo general, la invención comprende composiciones f rmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de productos de conjugado proteína/monopolímero junto con diluyentes, conservadores, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables . Estas composiciones incluyen diluyentes con diverso contenido de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) , fuerza iónica y pH; aditivos como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias para conferir volumen (por e emplo, lactosa, mannitol) ; la incorporación de material en preparaciones particuladas de compuestos como ácido poliláctico, ácido poliglicólico o liposomas. Estas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de eliminación in vivo de las presentes proteínas químicamente modificadas. Ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición (1990, Mack Publishing Co . , Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorpora aquí por referencia . Conforme se llevan a cabo otros estudios, emergerá información concerniente con los niveles de dosificación apropiados contra las diversas condiciones y estados en diversos pacientes y el trabajador experto ordinario, considerando el contexto terapéutico, la edad y salud general del receptor, será capaz de determinar con precisión la dosificación apropiada. En términos generales, para inyección o infusión, la dosis será entre 0.01 g/kg peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin la modificación química) y 100 µg kg (basándose en lo mismo) . Los siguientes ejemplos ilustran los diversos aspectos mencionados con anterioridad.

E emplo 1 (PEG1K + GLUT-Poliéster) -Leptina Materiales Se seca en un horno de vacío (50-60°C) durante la mnoche antes de usarse un polietilenglicol con dos grupos terminales hidroxilo (PEGlK-diol) de Mw = 1,000 kDa (Aldrich) . Se utilizan conforme se van recibiendo, cloruro de glutarilo (Fluka) , cloroformo anhidro (Aldrich) , diéter anhidro (J.T. Baker), isopropanol anhidro (Aldrich) , 2,2'- (etilendioxi)bis (etilamina) (Fluka), trietilamina (99%+, B y J) , N, -diciclohexilcarbodiimida (DCC, Lancaster) y agua estéril (Baxter) .

Instrumentos Se utilizan para concentración, purificación o intercambio de amortiguador, filtros Pall Filtron (membranas con punto de corte de peso molecular nominal de 3 kDa) y casetes Slide-A-Lyzer (Pierce, límite de peso molecular nominal de 7 kDa) . Se lleva a cabo GPC utilizando patrones de poli (etilenglicol ) con componentes lógicos (Software) Millenium32 utilizando un automuestreador Waters System 717, Bomba 510, detector de longitud de onda múltiple 490E y un refractómetro diferencial 410; columnas Alpha Series (TSK) 2500 y 4000 con una fase móvil de 20 mM LiBr en metanol. Se llevó a cabo FPLC (Pharmacia) en una columna de intercambio catiónico HiLoad SP 26/10 eluyéndose a 2.5 ml/min con 20 mM acetato de sodio pH 4.0 con un gradiente de 0-55% de 20 mM acetato sódico pH 4.0 más 0.5 M NaCl . Se lleva a cabo cromatografía de capa fina (TLC) en 100 placas de EM Science (TLC 60° F254) desarrollada con metanol/cloruro de metileno (1:4) y se visualizaron con vapor de iodo y aerosol de ninhidrina .

Polimerización Se disuelve en cloroformo anhidro (60 mi) PEGlK-diol (24.06 g, 24.06 mmol) y se agrega trietilamina (4.87 g, 48.12 mmol) . La mezcla de reacción se agita en un baño helado y se agrega gota a gota cloruro de glutarilo (4.07 g, 24.08 mol) en 5 mi de cloroformo anhidro durante un período de 5-6 horas. La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. El peso molecular del producto se sigue mediante GPC hasta obtener el intervalo deseado (20-50 kDa) en cuyo momento se agrega una cantidad de 0.5M cloruro de glutarilo (2.03 g, 12.01 mmol) y la reacción se deja a temperatura ambiente durante la noche. Para rematar, el polímero con aminas, se agrega gota a gota en la mezcla dé reacción una cantidad cinco veces en exceso de 2,2'-(etilendioxi) bis (etilamina) (17.83 g, 120 mmol) en 200 mi de cloroformo anhidro. La reacción de remate o coronación se monitoriza hasta que la mancha TLC del polímero positivo para ninhidrina no mostró más cambios. El precipitado se precipitó con una mezcla fría de solvente (4°C) de cloroformo : éter : isopropanol (400ml: 1333ml: 667ml) . El precipitado se filtra y seca a presión reducida.

Activación Se somete a tratamiento una solución de ácido maleimidopropiónico (Sigma, 0.738 g, 4.36 mmol) y trietilamina (3.05 g, 30.1 mmol) en 100 mi de diclorometano con DCC (18.77 mg, 90.96 mmol) durante una hora y luego se agrega el polímero anterior protegido con amina (3.055 g, 152.8 µ????, Mw = 20K, polidispersidad = 1.3-1.5). La reacción se mantiene a 4°C durante 2 días. Se retira mediante filtración la diclohexilurea precipitada. El producto filtrado se diluye con una mezcla de cloroformo : éter : isopropanol (120ml: 800ml: 400ml) y el precipitado se retira mediante filtración. El producto filtrado se seca bajo presión reducida lo que produce 1.863 g (61.0%) de producto crudo que luego se somete a diálisis contra 2 L de 20 mM fosfato, 5 mM EDTA y pH 6.5 en un caset Slide-A-Lyzer . Con ugación La solución de polímero (1.8269 g, 90 µp???) en 20 mM amortiguador fosfato, pH 6.5 que contiene 5 mM EDTA y Leptina S78C (97 mg, 6.0 µ???) se agrega para proporcionar una concentración final de proteína de 1 mg/ml . La reacción se incuba a 4°C durante la noche.

Purificación La mezcla de la reacción del conjugado de polímeros se somete a un ajuste de pH 3.5 y luego se purifica mediante FPLC usando una columna HiLoad SP 26/10. Se combinan las fracciones 18-27 como el conjugado de peso molecular alto, las fracciones 28-30 se combinan como el conjugado de peso molecular medio y las fracciones 31-32 se combinan como el conjugado de peso molecular bajo. Para preparar las muestras para de la biovaloración, se concentran las agrupaciones de peso molecular alto, medio y bajo en concentradores centrífugos Pall Filtron (MWCO 3.5 kDa) y luego cada mezcla se somete a diálisis dos veces contra PBS (1L) a 4°C durante un período de 24 horas utilizando la membrana MWCO de 3.5 kDa. Finalmente, las muestras se concentran a 2 mg/ml y se filtran a través de filtros Acrodic Syringe (25 mm, 0.2 ¡im membrana HT Tuffryn, Gelman Laboratory) en viales estériles con capacidad de 5 mi .

Resultados Se analiza para su resistencia in vitro a hidrólisis y eficacia para inducir la pérdida de peso en animales como se muestra en las Figuras 1 y 2, PEGlK-GLUT-Poliéster-Leptina. Los datos muestran que los ratones tratados con leptina PEGilada y leptina PEGilada con los polímeros de bloque de la invención pierden peso (Figura 2) y la formación de las vacuolas renales en los conjugados de polímero de bloque- leptina se reduce sustancialmente de manera que no se detectaron vacuolas renales (Figura 3).

E emplo 2 PEG1 + OXL-Leptina Materiales Se seca en un horno de vacío a 50°C-60°C durante la noche un polietilenglicol con dos grupos terminales amina (PGlK-diamina) de Mw = 1 KDa (Shearwater Polymer Inc.), luego se enfría a temperatura ambiente. Luego se va utilizando según se recibe cloruro de oxalilo (99+%, Fluka) , dielorómetaño (calidad HPLC, Mallinckrodt) , dietiléter anhidro (J T Baker) , metanol (calidad HPLC, J T Baker) , acetonitrilo anhidro (Aldrich) , 2,2'- (etilendioxi) bis (etilamina) (Fluka), trietilamina (> 99.9%, Romil Ltd.) y agua estéril (Baxter).

Instrumentos Se utilizaron para purificación ultrafiltradores con agitación Amicon con membranas ??-3 y YM-10 (punto de corte de peso molecular nominal de 3,000 y 10,000 KDa) . Se llevó a cabo una GPC usando patrones de poli (etilenglicol) con soporte lógico informático Millenium32 utilizando un automuestreador System 717, Bomba 510, detector de longitud de onda múltiple 409E y un refractómetro diferencial 410; columnas Alpha Series de 2500 y 4000 (TSK) con una fase móvil de 20 mM LiBr en metanol . Se llevó a cabo FPLC (Pharmacia) usando una columna de intercambio catiónico HiLoad SP 26/10 eluyéndose a 2.5 ml/min con 20 mM acetato de sodio pH 4.0 con un gradiente de 0-55% a 25 CVs, 20 mM acetato de sodio pH 4.0 más 0.5 M NaCl . Se llevó a cabo cromatografía en capa fina (TLC) en 100 placas de EM Science (TLC 60° F254) desarrolladas con metanol/cloroformo (1:4) y visualizadas con vapor de yodo y aerosol de ninhidrina.

Polimerización Se disuelve PEGlK-diamina (7.10 g, 7.10 mmol) en acetonitrilo anhidro (110 mi) y se agrega trietilamina (1.44 g, 14.20 mmol). La mezcla de reacción se agita en un baño de hielo seco y se agrega gota a gota durante 3-4 horas cloruro de oxalilo (0.9 g, 14.20 mmol) en 10 mi de acetonitrilo anhidro y luego se agita a temperatura ambiente durante la noche. El peso molecular del producto es seguido mediante GPC hasta obtener el intervalo deseado (20-50 kDa) en cuyo momento se agrega 2 , 2 ' - (etilendioxi) bis (etilamina) (1.05 g, 0.2 mmol) en 70 mi de acetonitrilo anhidro. La reacción protegida se siguió hasta que la mancha TLC del polímero positivo a ninhidrina no mostró más cambios. El acetonitrilo se evapora a presión reducida usando un rotoevaporador que deja un residuo aceitoso. El residuo aceitoso se disuelve en 20 mi de agua estéril y se purifica con 2L de agua estéril en un ultrafiltrador de agitación empleando una membrana YM-10. Se retiró el volumen de agua por evaporación y el resto se retiró mediante destilación azeotrópica (tres veces con 100 mi de tolueno) usando un rotoevaporador. El residuo se precipita con 200 mi de dietiléter anhidro y se seca en vacío. El peso del producto es de 5.18 g (64.7% en peso).

Activación El polímero anterior protegido con amina (5.18 g, 287 µp???, Mn = 18K, polidispersidad = 1.35) se disuelve en acetonitrilo anhidro (30 mi) y se somete a tratamiento con trietilamina (48.2 mg, 476 µ????) y NHS éster del ácido maleimidopropiónico (Bioscience, 0.2287 g, 859 jomol) . La reacción de activación fue seguida hasta que la mancha TLC de polímero positivo a ninhidrina dio negativo para ninhidrina. Se descubrió que la reacción estuvo completa después de una hora. El solvente se evaporó y el producto se purificó con 1L de agua estéril en un ultrafiltrador de agitación empleando una membrana YM-10. Se retiró el volumen de agua mediante evaporación y el resto se retiró azeotrópicamente (3 x 30 mi de tolueno) y luego se secó en vacío durante la noche. El producto pesó 3.59 g (-69% por peso).

Conjugación Se disolvió polímero (610 mg, 33.8 µ????) en 20 mM fosfato, 5 mM EDTA pH 6.5. Se agregó leptina S78C (100 mg, 6.2 -mol) . La reacción se incuba a 4°C durante la noche.

Purificación La solución del conjugado de polímero se ajustó para obtener un pH de 3.5 antes de cargarse en la columna. El conjugado fue purificado mediante FPLC empleando 20 mM acetato de sodio pH 4 y 20 mM acetato de sodio más 0.5 mM NaCl como eluyente . Las fracciones 32-50 se combinaron como el conjugado de peso molecular elevado, las fracciones 51-60 se combinaron como el conjugado de peso molecular medio y las fracciones 61-68 se combinaron como el conjugado de peso molecular bajo. Para preparar la muestra para su biovaloración, las mezclas de pesos moleculares alto, medio y bajo se concentraron en ultrafiltradores con agitación Amicon (membrana YM-3) y luego cada mezcla se sometió a diálisis contra PBS dos veces (1L) a 4°C durante un período de 24 horas usando una membrana de MWCO de 3.5 kDa. Finalmente, las muestras se concentran hasta 2 mg/ml y se filtran (25 mm, 0.2 um, filtros Acrodic syringe, membrana HT Tuffryn, Gelman Laboratory) en viales estériles de 5 mi.

Resultados Los ratones se inyectaron con una sola dosis de polímeros de bloque PEG de bajo, medio y alto peso molecular conjugados a leptina (descritos en este ejemplo con anterioridad) , la proteína de fusión Fc-leptina o leptina PEGilada de 20 kDa. Los resultados de la pérdida de peso de a partir estas inyecciones se muestran en la Figura 4 y la formación de vacuolas renales se tabula en la Figura 5. Estos resultados demuestran claramente un mejoramiento de los polímeros de bloque conjugados a una proteína en comparación con polímeros PEG regulares conjugados con la misma proteína.

Ejemplo 3 PEG1K + PEG1K-Leptina Materiales Un polietilenglicol con dos grupos terminales amina (PEG1 -diamina) de Mw = 1,000 KDa (Shearwater Polymer Inc.) y un polietilenglicol con dos grupos terminales de ácido carboxílico (PEGlK-diácido) de Mw = 1,056 KDa (Shearwater Polymer Inc.) se secan azeotrópicamente cada uno en un rotoevaporador (50°C-60°C, 3X, 30 mi tolueno) . Se utilizan según se van recibiendo dielorómetaño (calidad HPLC, Mallinckrodt) , cloruro de tionilo (99% bajo en hierro, Aldrich) , N, N-dimetilformamida (99.8%, Aldrich) , metanol (calidad HPLC, J T Baker) , acetonitrilo anhidro (Aldrich) , 2, 2 ' - (etilendioxi)bis (etilamina) (Fluka) , trietilamina (99.9%, Romil Ltd) y agua estéril (Baxter).

Instrumentos Para la purificación se utilizan Ultrafiltradores de Agitación Amicon con membranas YM-3 e YM-10 (puntos de corte de peso molecular nominal de 3,000 y 10,000 kDa). Se llevó a cabo GPC usando estándares de poli (etilenglicol) con componentes lógicos informáticos Millenium32 usando un automuestreador Waters Systems 717, Bomba 510, detector de longitud de onda múltiple 490E y un refractometro diferencial 410, columnas Alpha Series 2500 y 4000 con una fase móvil de 20 M LiBr y 0.1% trietilamina en metanol. Se llevó a cabo FPLC (Pharmacia) en una columna de intercambio catiónico HiLoad SP 26/10 eluyéndose a 2.5 ml/min con 20 mM acetato de sodio pH 4.0 con un gradiente de 0-55% de 20 mM acetato de sodio pH 4.0 más 0.5 M NaCl . Se llevó a cabo cromatografía en capa fina (TLC) en 100 placas de EM Science (TLC 60° F254) desarrollados con metanol/cloroformo (1:4) y visualizados con vapor de yodo y nebulización de ninhidrina.

Cloruro PEGlK-diácido Se introducen lentamente en un matraz de fondo redondo con capacidad de 100 mi que contiene PEGlK-diácido (4.7289 g, 4.478 mmol), cloruro de tionilo destilado (2.13 g, 17.91 mmol) y DMF (0.142 g, 1.94 mmol) en 35 mi de tolueno. Se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 1-2 horas adicionales y luego se concentra en un rotoevaporador (50- 60°C) dejando un residuo aceitoso de cloruro PEGlK-diácido, que se almacena en gas argón.

Polimerización Se disuelve PEGlK-diamina (4.52 g, 4.52 mmol) en acetonitrilo anhidro (50 mi) y se agrega trietilamina (0.9145 g, 9.04 mmol) . La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente y se agregó gota a gota durante 3-4 horas cloruro de PEGlK-diácido (4.7289 g, 4.478 mmol) en 30 mi de acetonitrilo anhidro y luego la reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. El peso molecular del producto se sigue mediante GPC hasta obtener el intervalo deseado (20-50 kDa) en cuyo momento se agrega 2, 2 ' - (etilendioxi)bis (etilamina) (0.034 g, 0.23 mmol). La reacción protegida se monitoriza hasta que la mancha TLC de polímero positiva a ninhidrxna no mostró más cambios . El acetonitrilo se evapora a presión reducida en un rotoevaporador usando un residuo aceitoso. El producto aceitoso se disuelve en 20 mi de agua estéril y se purifica con 2L de agua estéril en un ultrafiltrador con agitación empleando una membrana YM-10. La solución se concentra y se retira el agua residual mediante destilación azeotrópica (tres veces con 100 mi de tolueno) en un rotóevaporador . El peso del producto es de 3.7 g (40% de producción) .

Activación El polímero anterior protegido con amina (3.76 g, 188 ¡imol, Mn = 20 kDa, polidispersidad = 1.64) se disuelve en acetonitrilo anhidro (40 mi) y se somete a tratamiento con trietilamina (28.55 mg, 282 µ????) y HS éster del ácido maleimidopropiónico (Bioscience, 76.8 mg, 288 µ?a??) . Se descubrió que la reacción está completa mediante TLC (negativo para ninhidrina) después de una hora. El solvente se evapora y se purifica con 1L de agua estéril ultrafiltrada con agitador empleando una membrana YM-3. Se concentró la solución y se secó azeotropicamente (3 x 30 mi tolueno) y se secó al vacío durante la noche. El producto pesó 3.13 g (8 .7% en peso) .

Conjugación El polímero activado de maleimida (3.13 g) se disuelve en 50 mi de 20 mM fosfato, 5 mM EDTA y amortiguador pH 6.5. Se agrega Leptina S78C (126 mg, 7.798 jumol) . La concentración final de la reacción es de 2 mg/ml de la proteína (65 mi de amortiguador total) . La mezcla de reacción se deja a 4°C durante la noche.

Purificación Se ajusta el pH del polímero conjugado a 3.5 y se diluye a 1 mg proteína/ml . La conjugación se purifica mediante FPLC usando 20 mM acetato de sodio pH 4 y 20 mM acetato de sodio más 0.5 M NaCl como eluyentes . Las fracciones se analizan en 4-20% de try-gly minigeles (Novex, colorante Azul de Coomasie) . Las fracciones 29-49 se combinaron como el conjugado de elevado peso molecular, las fracciones 50-57 se combinaron como el conjugado de mediano peso molecular y las fracciones 58-65 se combinaron como el conjugado de bajo peso molecular. Para preparar las muestras de biovaloración, se concentraron las mezclas de elevado, medio y bajo preso molecular y el amortiguador se intercambió por PBS en un ultrafiltrador de agitación Amicon (membrana YM-3) a 4°C hasta obtener una concentración de 5 mg/ml. Las muestras se diluyen a 2 mg/ml y se filtran 0.2 mg/ml a través de filtros Acrodic Syringe (25 mm, 0.2 um membrana HT Tuffryn, Gelman Laboratory) en viales estériles con capacidad de 5 mi.

Conclusiones de Ejemplos 1 - 3 Los polímeros de amida-leptina descritos anteriormente se formulan e inyectan en ratones y se mide la pérdida de peso durante un período controlado. Los ratones inyectados con PBS se utilizaron como testigos y sus pesos se utilizaron para calcular una línea basal de cero. Una fusión de Fc- leptina a 10 mg/kg en una sola dosis en el día cero induce un pico de pérdida de peso del 11% en el día cuatro regresando el peso casi a la línea basal en el día ocho. Asimismo, los conjugados PEGlk+oxl de alto peso molecular, conjugados de mediano peso molecular, conjugados de bajo peso molecular con leptina también a 10 mg/kg en una dosis única, indujeron un pico de pérdida de peso aproximadamente en los días cuatro o cinco. Sin embargo, a diferencia de Fc-leptina, la leptina conjugada de mediano peso molecular PEGlk+oxl y los conjugados de leptina de elevado peso molecular PEGl+oxl mantuvieron la pérdida de peso más allá del período de prueba del día catorce por arriba del 2%. También se administró un conjugado de mono PEG-leptina de 20K a 10 mg/kg en una sola dosis para inducir un pico de pérdida de peso en el día tres del 9% y los animales ganaron peso para regresar dentro del 1% de la línea basal para el día ocho y luego estuvo por debajo de la línea basal antes del día once (Figura 4) . Estos experimentos se repitieron con resultados comparables. En un experimento por separado, se identificaron las vacuolas renales luego de inyectar los conjugados y luego se obtuvo una puntuación utilizando la siguiente escala de valores. La calificación cero significa que no hay vacuolas renales . La calificación 1+ significa que las vacuolas renales mínimas están representadas por pequeñas vacuolas raras. La calificación 2+ significa leves vacuolas renales representadas por cantidades moderadas de aproximadamente vacuolas con 3 micrómetros de diámetro. La calificación 3+ significa una cantidad moderada de vacuolas renales representadas por grandes cantidades de vacuolas con diámetros de aproximadamente 3 a 5 mieras. La calificación 4+ significa una notable cantidad de vacuolas renales con lo que son una elevada cantidad y de tamaño grande, es decir, más de 5 mieras de diámetro. El epitelio tubular renal fue el sitio principal analizado para la formación de vacuolas . Se inyectaron ratones C57BL/6 con una dosis diaria de 10 o 25 mg/kg conjugado o testigo ya sea por siete a catorce días. La leptina conjugada de elevado peso molecular PEGlk+oxl no indujo vacuolas en el epitelio tubular renal luego de la inyección subcutánea diaria en ya sea en el día siete o catorce. La leptina conjugada de mediano peso molecular PEGlk+oxl indujo vacuolas de epitelio renal luego de inyecciones diarias a 25 mg/kg durante siete días con calificación 1+ o catorce días con calificación 2+ e indujo una cantidad mínima de vacuolas renales (calificación 1+) luego de 10 mg/kg de inyecciones diarias durante catorce días. No se hubo vacuolas renales detectadas cuando se inyectaron diariamente 10 mg/kg durante siete días con este conjugado. La leptina conjugada de bajo peso molecular PEGlk+oxl indujo vacuolas renales luego de inyecciones subcutáneas diarias con 25 mg/kg durante siete días (calificación 2+) o catorce días (calificación 3+) . También se observaron lesiones después de la administración de 10 mg/kg/día durante siete días (calificación 2+) o catorce días (calificación 2+) . El control positivo, mono PEG leptina de 20 indujo vacuolas renales después de la inyección de 10 mg/kg/día o 25 mg/kg/día con un mínimo . de calificación 3+ de vacuolas renales sin importar el período de dosificación.

Ejemplo 4 Péptido PEG1K+OXL/L1-7 Se agregó a una solución de péptido Ll-7 5.39 mg, 1.5 micromóles) en 50 mM fosfato, 5 mM EDTA pH 6.5, el polímero PEG1K + OXL (MSW = 15 KDa, 96.29 mg, (6.4 micromoles) ) . La concentración final del péptido es de 2.5 mg/ml . La solución se incuba a 4°C durante la noche. La separación del conjugado en grupos de distintos pesos moleculares se lleva a cabo por medio de FPLC usando una columna de 1 mi Hi-Trap SP HP. La columna se esquilibró con 5 CV de 20 mM acetato de sodio pH 4.0 y el conjugado se eluye con 1 mi de fracción con 30 CV de 20 mM acetato de sodio más 500 mM cloruro de sodio pH 4.0. se formó una mezcla de elevado peso molecular a partir de las fracciones 1-4 y una mezcla de bajo peso molecular a partir de las fracciones 9-39. Ambas mezclas se concentraron y el amortiguador se intercambió por PBS .

Ejemplo 5 PEG1 + OXL-ST F Materiales Se seca en un horno de vacío a 50°C-60°C durante la noche, y luego se enfría a temperatura ambiente polietilenglicol con dos grupos terminales amina (PEGiK-diamina) de Mw = 1 KDa (Shearwater Polymer Inc.) . Se agregan según se va recibiendo, oxalilcloruro (99+%, Fluka) , diclorometano (calidad HPLC, Mallinckrodt) , dietiléter anhidro (J T Baker) , metanol (calidad HOLC, J T Baker) , acetonitrilo - anhidro (Aldrich) , 2,2'- (etilendioxi)bis (etilamina) (Fluka), trietilamina (> 99.9%, Romil Ltd. ) y agua estéril (Baxter) .

Instrumentos Se utilizaron para purificación Ultrafiltradores con Agitación Amicon con membranas YM-3 e YM-10 (puntos de corte con peso molecular nominal de 3000 y 10,000 KDa) . Se llevó a cabo GPC usando patrones de poli (etilenglicol) con componentes lógicos informáticos Millenium32 usando un automuestreador Water Systems 717, Bomba 510, un detector de longitud de onda múltiple 490E y un refractómetro diferencial 410; columnas Alpha Seris 2500 y 4000 (TSK) con fase móvil de 20 mM LiBr en metanol . Se llevó a cabo FPLC (Pharmacia) en una columna de intercambio catiónico HiLoad SP 26/10 eluyéndose a 2.5 ml/min con 20 mM acetato de sodio pH 4.0 con gradiente de 0-55% de 20 mM acetato de sodio pH 4.0 más 0.5 M NaCl . Se llevó a cabo cromatografía en capa fina (TLC) en 100 placas de EM Science (TLC 60° F254) desarrollado con metanol/cloroformo (1:4) y visualizado con vapor de yodo y nebulización de ninhidrina.

Polimerización PEGlK-diamina (7.10 g, 7.10 iranol) se disolvió en acetonitrilo anhidro (110 mi) y se agrega trietilamina (1.44 g, 14.20 mmol) . La mezcla de reacción se agita en un baño de hielo seco o y se agrega gota a gota durante un período de 3-4 horas oxalilcloruro (0.9 g, 7.10 mmol) en 10 mi de acetonitrilo anhidro y luego se agita a temperatura ambiente durante la noche. El peso molecular del producto es seguido mediante GPC hasta lograr el intervalo deseado (20-50 kDa) y luego se agrega nuevamente 2 , 2 ' - (etilendioxi) bis (etilamina) (1.05 g, 0.2 mmol) en 70 mi de acetonitrilo anhidro. La reacción protegida se sigue hasta que la mancha TLC del polímero positivo para ninhidrina no mostró más cambios. El acetonitrilo se evaporó a presión reducida con un rotoevaporador dejando solo un residuo aceitoso. El residuo aceitoso se disuelve en 20 mi de agua estéril en una membrana. Se retiró el volumen de agua mediante evaporación y el resto se retiró mediante destilación azeotrópica (tres veces con 100 mi de tolueno) usando un rotoevaporador. El residuo se precipitó con 200 mi de dietiléter anhidro y se secó en vacío. El peso del producto es de 5.18 g (64.7% en peso) .

Activación En el polímero anterior protegido con amina (5.18 g, 287 µ????, Mn = 18K, polidispersidad = 1.35) se disuelve en acetonitrilo anhidro (30 mi) y se trata con trietilamina (48.2 mg, 476 jimol) y NHS éster del ácido maleimidopropionico (Bioscience, 0.2287 g, 859 jumol) . La reacción de activación fue seguida hasta que la mancha TLC del polímero positivo para ninhidrina se hizo negativo a ninhidrina. Se descubrió que la reacción estuvo completa después de una hora. El solvente se evaporó del producto purificado con 1L de agua estéril en un ultrafiltrador con agitación empleando una membrana YM-10. Del volumen de agua se retiró mediante evaporación y el resto se retiró azeotrópicamente (3 x 30 mi de tolueno) y luego se seco en vacío durante la noche. El producto pesó 3.59 g (-69% en peso) .

Conjugación Se disolvió el polímero (549 mg, 30.5 ¡imol) en 20 mM fosfato, 5 mM EDTA y se agregó receptor sTNF (65.5 mg, 5.4 umol) a pH 6.5. La reacción se incubó a 4°C durante la noche.

Purificación La solución de conjugado polimérico se ajustó a pH 3.5 antes de cargarse en la columna, el conjugado se purificó mediante FPLC usando una columna Sepharose SP HR empleando 20 mM acetato de sodio pH 4 y 20 mM acetato de sodio más 0.5 mM NaCl como eluyentes . Se agruparon y concentraron las fracciones número 70-80 que contienen sTNF libre conjugado. La mezcla se cargó en una columna S300 SEC 26/60 Sephacryl . La conjugación se recolectó en dos grupos como conjugado de alto peso molecular y conjugado de bajo peso molecular. Para preparar las muestras para la biovaloración, los grupos de alto y bajo peso molecular se concentraron en ultrafiltradores con agitación Amicon (membrana YM-3) y luego cada grupo se sometió a diálisis contra PBS dos veces (1L) a 4°C durante un período de 24 horas utilizando una membrana MWCO con peso molecular de 3.5 kDa. Finalmente, las muestras se concentraron a 2 mg/ml y se filtraron (25 mm, filtros de jeringa Acrodic de 0.2 um, membrana HT Tuffryn, Gelman Laboratory) en viales estériles de 5 mi.

Experimentos in vivo de los conjugados en el Ejemplo 5 Se analizaron para determinar la eficacia los conjugados solubles TNF-RI en el tratamiento contra inflamación en un modelo experimental en ratón. Se inyectaron ratas Lewis con artritis inducida por colágeno (CIA) con conjugados elaborados como se describe anteriormente y llamados sTNF/PEG+OXL . La cadena polimérica consiste en moléculas PEG de 1 kDA que se ligan al polímero. Se obtuvieron 90 ratas hembra de 80 a 100 g y se indujo artritis de la siguiente manera. Se disolvió colágeno porcino tipo II en 0.1 N ácido acético (2 mg colágeno/mi de ácido acético) . Se utilizó una aguja de emulsificación calibre 16 a 1:1 con adyuvante. Las ratas se inyectaron intradérmicamente con 100 microlitros de emulsión en diez sitios diferentes sobre la superficie dorsal o las almohadillas plantares . Se definió la manifestación de enfermedad como por hinchamiento de la pata y ocurrió en el día 11. Los conjugados se inyectaron en 4 mg/kg subcutáneamente comenzando al inicio de la enfermedad y se inyectaron diariamente durante tres días . Hubieron cinco grupos como testigos normales (N = 5), testigos sin tratamiento (N = 8), PEG-r-metHu-sTNF-rl (N = 8), sTNF/PEG + OXL-14 ( O 8) y sTNF-RI (N = 8) . Los ratones testigo con artritis tuvieron hinchamiento de patas, como se midió utilizando calibres diariamente desde la manifestación de enfermedad hasta la conclusión del estudio mediante aproximadamente 1 mm en el día tres (promedio +/- SE; n = 8) . Los ratones tratados con sTNF-Rl tuvieron un hinchamiento de la pata de aproximadamente 0.5 mm en el día tres. A diferencia, ambos polímeros PEG y PEWG + OXL inhibieron el hinchamiento de la pata en el punto de ser casi indetectable durante el período de tres días (Figura 6) . Aunque que la presente invención ha sido descrita en términos de modalidades preferidas, se entiende que pueden ocurrir las variaciones y modificaciones por los expertos en la técnica. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas estas variaciones equivalentes que vienen dentro del alcance de las reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polímero en bloque caracterizado porque comprende un primer polímero hidrosoluble menor a 2,000 Daltons, un enlazador lábil y un segundo polímero hidrosoluble menor a 2, 000 Daltons.
2. 2. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que comprende un polietilenglicol , un copolímero de etilenglicol , un copolímero de propilenglicol , una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1 , 3-dioxolano, un poli-1,3,6-trioxano, un copolímero anhídrido de etileno/maleico, un poliaminoácido, una n-vinilpirrolidona dextrán, una poli n-vinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado y un alcohol polivinílico .
3. 3. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el peso molecular total es menor que 40 kDa.
4. 4. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque el peso molecular total es aproximadamente 20 kDa.
5. 5. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una estructura de copolímero de bloque.
6. 6. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende una mezcla de al menos dos polímeros.
7. 7. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una estructura de homopolímero de bloque.
8. 8. El homopolímero de bloque de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende los bloques de polietilenglicol .
9. 9. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el 90% de los polímeros de bloque son menores a 2,000 Daltons.
10. 10. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la mayoría de los bloques de polímeros son de aproximadamente 1,000 Daltons.
11. 11. El polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el enlazador proteolíticamente sensible comprende un enlace amida.
12. 12. Una formulación que comprende un polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque está conjugada a un fármaco y a un portador farmacéuticamente aceptable . aceptable .
13. 13. Un método caracterizado porque es para hacer el polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1.
14. 14. Un método para el tratamiento de un paciente, caracterizado porque comprende administrarle un polímero de bloque de conformidad con la reivindicación 1.