ES2349743T3 - Derivados de la il-21. - Google Patents

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ES2349743T3 ES04762905T ES04762905T ES2349743T3 ES 2349743 T3 ES2349743 T3 ES 2349743T3 ES 04762905 T ES04762905 T ES 04762905T ES 04762905 T ES04762905 T ES 04762905T ES 2349743 T3 ES2349743 T3 ES 2349743T3
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acid
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Florencio Zaragoza Dorwald
Anne Worsaae
Bernd Peschke
Helle Woldike
Christine Bruun Schiodt
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Novo Nordisk AS
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Abstract

Un derivado de la IL-21 humana, que comprende: (i) un polipéptido de la IL-21 humana con al menos una identidad (ii) una adición N-terminal a dicho polipéptido de IL-21 humana de 1 a 10 residuos de aminoácidos, que comprende al menos un residuo de Ser, Tyr, Lys o Cys; y (iii) uno o más grupos PEG unidos al N-terminal de dicho polipéptido de la IL-21 humana a través de dicho residuo de Ser, Tyr, Lys o Cys.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La invención se refiere a la síntesis y purificación de derivados de la interleucina 21 (IL-21) o análogos de la misma, incluyendo variantes de la IL-21 que actúan como antagonistas de la IL-21.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] La IL-21 se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO00/53761, como un estimulante del crecimiento de los linfocitos T y de la actividad de los linfocitos NK. Los derivados de la IL-21 no se han descrito previamente. Como potenciales derivados farmacéuticos con características modificadas, son interesantes en muchas aplicaciones.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0003] La invención proporciona derivados de la IL-21. La invención proporciona derivados de la IL-21 según se definen en las reivindicaciones que comprenden uno o más grupos PEG. Los derivados de la IL-21 están derivatizados en su N-terminal. [0004] En un aspecto de la invención, la derivatización se realiza en un aminoácido natural, y/o también o alternativamente en un aminoácido añadido o sustituido en el N-terminal de la secuencia de la IL-21. La variante específica SerhIL21 puede derivatizarse con una molécula polimérica. La invención también proporciona el uso de los derivados de la IL-21 definidos en las reivindicaciones para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer o de enfermedades infecciosas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN [0005] La invención proporciona diversos derivados de los péptidos de IL-21, según se define en las reivindicaciones. Los derivados incluyen péptidos modificados químicamente que comprenden un péptido de IL-21, según se define en las reivindicaciones. La modificación química puede alterar las características químicas y biológicas de una molécula, dependiendo de las características de la molécula derivatizante. El efecto de la modificación puede ser mantener la función biológica del péptido o potencialmente una menor actividad del péptido. Por ejemplo, la derivatización puede extender la semivida funcional in vivo de un péptido derivatizado, y así compensar una menor actividad. Por ejemplo, puede conseguirse un efecto de perfil prolongado de los derivados de la IL-21 mediante el acoplamiento de un péptido de IL-21 o un análogo del mismo a una fracción hidrófila que dé como resultado derivados de la IL-21 con una actividad biológica conservada. La derivatización puede proporcionar, por ejemplo, un péptido con una semivida mejorada, facilitando así la presencia continua de una cantidad terapéuticamente eficaz de la IL-21 o un derivado de la misma con el mismo efecto biológico. La cantidad requerida para la administración de una cantidad eficaz de un péptido prolongado puede ser así menor. La derivatización puede proteger la molécula frente a la degradación por enzimas e impedir su eliminación del cuerpo. La derivatización es preferiblemente no inmunógena. En un aspecto de la invención puede modificarse la solubilidad del péptido. [0006] La actividad de la IL-21 es según se define según se describe en Parrish-Novak, Nature, 408, 57-63, 2000; Brady, J., Hayakawa, Y., Smyth, M. J. y Nutt, S. L. 2004. IL-21 induces the functional maturation of murine NK cells. Journal of immunology (Baltimore, Md. 172: 2048-2058; Collins, M., Whitters, M. J. y Young,
D. A. 2003. IL-21 and IL-21 receptor: a new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity. Immunol Res 28: 131-140; Habib, T., Nelson, A. y Kaushansky,
K. 2003. IL-21: a novel IL-2-family lymphokine that modulates B, T, and natural killer cell responses. J Allergy Clin Immunol 112: 1033-1045. Sivakumar, P. V. 2004. Interleukin-21 is a T-helper cytokine that regulates humoral immunity and cell-mediated antitumour responses. Immunology 112: 177; Wang, G., Tschoi, M., Spolski, R., Lou, Y., Ozaki, K., Feng, C., Kim, G., Leonard, W. J. y Hwu, P. 2003. In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells. Cancer Res 63: 9016-9022; Wang, G. 2003. In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells. Cancer Res 63: 9016. La IL-21 y los derivados de la misma son considerados útiles en el tratamiento de alteraciones neoplásicas. Debe entenderse que alteraciones neoplásicas o cáncer se refiere a todas las formas de crecimiento celular neoplásico, incluyendo tanto tumores quísticos como macizos, tumores óseos y de tejidos blandos, incluyendo tanto tumores benignos como malignos, incluyendo tumores en el tejido anal, conducto biliar, vejiga, células sanguíneas, hueso, hueso (secundario), intestino (colon y recto), cerebro, cerebro (secundario), mama, mama (secundario), carcinoide, cuello uterino, cánceres infantiles, ojo, esófago, cabeza y cuello, sarcoma de Kaposi, riñón, laringe, leucemia (linfoblástica aguda), leucemia (mieloide aguda), leucemia (linfocítica crónica), leucemia (mieloide crónica), leucemia (otra), hígado, hígado (secundario), pulmón, pulmón (secundario), nódulos linfáticos (secundario), linfoma (de hodgkin), linfoma (no hodgkin), melanoma, mesotelioma, mieloma, ovario, páncreas, pene, próstata, piel, sarcomas de tejidos blandos, estómago, testículos, tiroides, tumor primario desconocido, vagina, vulva, útero. Los tumores de tejidos blandos incluyen monosomía de schwannoma benigno, tumor desmoide, lipoblastoma, lipoma, liomioma uterino, sarcoma de células claras, dermatofibrosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, liposarcoma mixoide, liposarcoma, bien diferenciado, rabdomiosarcoma alveolar y sarcoma sinovial. Algunos tumores óseos específicos incluyen fibroma no osificante, quiste óseo unicameral, encondrioma, quiste óseo aneurismático, osteoblastoma, condroblastoma, condromixofibroma, fibroma osificante y adamantinoma, tumor de células gigantes, displasia fibrosa, sarcoma de Ewing, granuloma eosinófilo, osteosarcoma, condrioma, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y carcinoma metastásico. Las leucemias se refieren a cánceres de los glóbulos blancos que son producidos por la médula ósea. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los cuatro tipos principales de leucemia; linfoblástica aguda (ALL), mieloblástica aguda (AML), linfocítica crónica (CLL) y mieloide crónica (CML). [0007] Antes de una discusión sobre las formas de realización detalladas de la invención, se proporciona una definición de los términos específicos relacionados con los aspectos principales de la invención. [0008] En el contexto de la presente invención, la IL-21 se define como la secuencia desvelada en el documento WO00/53761 como la ID. SEC. Nº: 2, o la misma secuencia sin la secuencia N-terminal. La presente solicitud también describe variantes y derivados de la IL-21. En el contexto de la presente invención, el término "IL-21" significa por tanto la IL-21 según se describe en el documento WO00/53761, opcionalmente sin la secuencia N-terminal. La presente invención contiene proteínas equivalentes y de otras especies ("ortólogas"). Son de particular interés los polipéptidos de IL-21 de otras especies de mamíferos, incluyendo roedores, porcinos, bovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y otros primates. [0009] "Derivados de la IL-21" comprende la derivatización o la unión de otra molécula funcional. La unión puede ser un acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o similares, a otras entidades moleculares tales como anticuerpos, toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, o moléculas poliméricas o grupos lipófilos. Algunos ejemplos no limitantes incluyen grupos poliméricos tales como, por ejemplo, dendrímeros según se desvela en el documento PCT/DK2004/000531, óxido de polialquileno (PAO), polialquilenglicol (PAG), polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, anhídrido de polietileno-co-ácido maleico, anhídrido de poliestireno-co-ácido maleico, dextrano, carboximetil-dextrano; ligandos de unión a proteínas séricas, tales como compuestos que se unen a la albúmina, como ácidos grasos, ácidos grasos C5-C24, diácidos alifáticos (por ejemplo, C5-C24). Los ligantes de la albúmina se describen en las solicitudes de patente danesa PCT/DK04/000625. Los ligantes de la albúmina también son compuestos con la
5 siguiente fórmula:
imagen1
Otros ejemplos de grupos de prolongación incluyen pequeñas moléculas orgánicas que contienen fracciones que, en condiciones fisiológicas, alteran sus propiedades de carga, tales como ácidos carboxílicos o aminas, o sustituyentes neutros que impiden el
10 reconocimiento específico del glucano, tales como sustituyentes de alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C5). [0010] Las variantes o análogos de los péptidos de IL-21 se caracterizan por tener una o más sustituciones, delecciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son típicamente de una naturaleza menor, esto es, sustituciones de aminoácidos
15 conservativas y otras sustituciones que no afectan significativamente a la unión al receptor, la afinidad al receptor, plegamiento o la actividad biológica del péptido. Sin embargo, según se describe a continuación, incluso pequeñas modificaciones en aminoácidos esenciales cambian el efecto del péptido de IL-21. Pequeñas delecciones, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones
20 amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad), tal como una sección de polihistidina, proteína A, Nilsson y col., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198: 3 (1991), glutatión S transferasa, Smith y Johnson, Gene 67:
25 31 (1988), u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991). Los ADN que codifican para etiquetas de afinidad están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). [0011] Algunas variantes de péptidos de la IL-21 también pueden comprender residuos de aminoácidos no naturales. Algunos aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4hidroxiprolina, Nmetilglicina, addo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deshidroprolina, 3 y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, tercleucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4fluorofenilalanina. En la materia se conocen diversos procedimientos para incorporar residuos de aminoácidos no naturales en proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que las mutaciones sin sentido se eliminan usando ARNt supresores aminoacilados químicamente. Los procedimientos para sintetizar aminoácidos y ARNt aminoacilados son conocidos en la materia. Los aminoácidos esenciales de los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse según los procedimientos conocidos en la materia, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)]; Bass y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 4498-4502 (1991). En la última técnica se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula, y se ensaya la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes (por ejemplo, unión al ligando y señal de transducción) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción ligando-proteína también pueden determinarse mediante un análisis de la estructura cristalina, según se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcaje de fotoafinidad. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden inferirse a partir del análisis de homologías con proteínas relacionadas. [0012] En una realización, una variante es idéntica en un 70% o más a la secuencia de la ID. SEC. Nº: 2 del documento WO0053761 (es decir, la Figura 1 proporcionada en este documento). En una realización, una variante es idéntica en un 80% o más a la secuencia de la ID. SEC. Nº: 2 del documento WO0053761 (es decir, la Figura 1 proporcionada en este documento). En otra realización, una variante es idéntica en un 90 % o más a la secuencia de la ID. SEC. Nº: 2 del documento WO0053761 (es decir, la Figura 1 proporcionada en este documento). En una realización adicional, una variante es idéntica en un 95 % o más a la secuencia de la ID. SEC. Nº: 2 del documento WO0053761. [0013] El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante una alineación de Needelman-Wunsch, útil para alineaciones tanto de proteínas como de ADN. Para alineaciones de proteínas, la matriz de baremo usada por defecto es BLOSUM50, y la penalización para el primer residuo en un hueco es -12, mientras que la penalización para residuos adicionales en un hueco es -2. La alineación puede realizarse con el programa informático Align del paquete FASTA versión v20u6 (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448; y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183: 63-98). [0014] Algunos ejemplos no limitantes de variantes de la IL-21 con una actividad biológica sustancialmente modificada con respecto a la IL-21 natural se describen en el documento WO03/40313, en el que las sustituciones de aminoácidos individuales en la secuencia de la IL-21 antagonizan el efecto de la IL-21. [0015] Los compuestos antagonistas de la IL-21 inhiben la actividad observada normalmente en la IL-21. Dichos compuestos pueden ser igualmente moléculas pequeñas, péptidos o receptores solubles que interactúan con la IL-21. [0016] Los antagonistas también son proteínas de fusión que incluyen el dominio extracelular de la IL-21 R fusionado con una región Fc de una inmunoglobulina. [0017] Algunos ejemplos de proteínas de fusión antagónicas se muestran en las ID. SEC. Nº: 23, ID. SEC. Nº: 25, ID. SEC. Nº: 27, ID. SEC. Nº: 29, ID. SEC. Nº: 31, ID. SEC. Nº: 33, ID. SEC. Nº: 35, ID. SEC. Nº: 37 o ID. SEC. Nº: 39, del documento WO03/28630. [0018] Otros antagonistas de la IL-21 que pueden usarse según la invención son las secuencias 4 y 6 del documento WO03/40313. Los péptidos de la IL-21 con variaciones en una o ambas de las posiciones 114 y 119, según se menciona en el documento WO03/87320. [0019] Los receptores solubles de la IL-21 con efecto antagonista sobre la IL-21 se desvelan en el documento WO04/07682. [0020] Algunos ejemplos de proteínas de fusión antagonistas que pueden usarse en los procedimientos de la invención se muestran en las ID. SEC. Nº: 23, ID. SEC. Nº: 25, ID. SEC. Nº: 27, ID. SEC. Nº: 29, ID. SEC. Nº: 31, ID. SEC. Nº: 33, ID. SEC. Nº: 35, ID. SEC. Nº: 37 e ID. SEC. Nº: 39, del documento WO03/28630. [0021] Otros antagonistas de la IL-21 que pueden usarse en los procedimientos inventivos proporcionados aquí son las ID. SEC. Nº 4 y 6 del documento WO03/40313, y los péptidos de la IL-21 con variaciones en una o ambas de las posiciones 114 y 119 de la IL-21 humana, según se menciona en el documento WO03/87320. El documento WO04/07682 describe receptores solubles con actividad antagonista frente a la IL-21. [0022] En un aspecto de la invención se usan anticuerpos de IL-21 como antagonistas de la IL-21. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la materia, y algunos ejemplos de dichos anticuerpos se describen en el documento WO00/53761. Los anticuerpos antagonistas de la IL-21 se caracterizan por inhibir una o más actividades biológicas de la IL-21. La inhibición de la actividad biológica puede medirse, por ejemplo, mediante el ensayo Ba F3, en el que células Ba F3 transfectadas de forma estable con IL-21 R humana (IL21 R-Ba F3) experimentan proliferación cuando se añade IL-21 al cultivo. La adición de antagonistas de la IL-21 a las células IL-21 R-Ba F3 inhibe deseablemente parcial o completamente la proliferación dependiente de la IL-21 de las células IL-21 R-Ba F3. [0023] El término "molécula polimérica", o "grupo polimérico", o "fracción polimérica", o "molécula de polímero", engloba moléculas formadas por uniones covalentes de dos o más monómeros en las que ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácido. Algunos polímeros preferidos son moléculas de polímero elegidas del grupo formado por dendrímeros según se desvela en el documento PCT/DK2004/000531, óxido de polialquileno (PAO), incluyendo polialquilenglicol (PAG), tal como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, anhídrido de polietileno-co-ácido maleico, anhídrido de poliestireno-co-ácido maleico y dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano, siendo particularmente preferido el PEG. El término "IL-21 PEGilada" se refiere a la IL-21 con una o más moléculas de PEG conjugadas con un polipéptido de IL-21 humana. Debe entenderse que la molécula de PEG puede estar unida a cualquier parte del polipéptido de IL-21, incluyendo cualquier residuo de aminoácido o fracción de carbohidrato del polipéptido de IL-21. El término "IL-21 cisteína-PEGilada" se refiere a la IL-21 con una molécula de PEG conjugada con un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en la IL-21. El término "polietilenglicol" o "PEG" se refiere a un compuesto de polietilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, fracciones de acoplamiento o de activación (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano o preferiblemente con una fracción de maleimida). Compuestos tales como maleimido monometoxi PEG son ejemplos de compuestos de PEG activados de la invención. El término "PEG" pretende indicar polietilenglicol de un peso molecular entre 500 y 150.000 Da, incluyendo análogos del mismo, en el que, por ejemplo, el grupo terminal OH ha sido sustituido por un grupo metoxi (denominado mPEG). [0024] En el presente contexto, las palabras "péptido" y "polipéptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable y pretenden indicar lo mismo. [0025] En el contexto de la presente invención, "tratamiento" o "tratar" se refiere a evitar, aliviar, tratar, curar o reducir la enfermedad, por ejemplo, un síntoma de la enfermedad, una dolencia subyacente de la enfermedad o ambos. [0026] El término "semivida funcional in vivo" se usa con su significado normal, es decir, el tiempo en el que el 50% de la actividad biológica del polipéptido o conjugado todavía está presente en el cuerpo/órgano objetivo, o el tiempo en el cual la actividad del polipéptido o el conjugado es el 50% de su valor inicial. Como una alternativa para determinar la semivida funcional in vivo, puede determinarse la "semivida sérica", es decir, el tiempo en el que el 50% de las moléculas de polipéptido
o conjugado circulan en el plasma o el torrente sanguíneo antes de ser eliminadas. La determinación de la semivida sérica es a menudo más simple que la determinación de la semivida funcional, y la magnitud de la semivida sérica es habitualmente una buena indicación de la magnitud de la semivida funcional in vivo. Algunos términos alternativos a la semivida sérica incluyen semivida plasmática, semivida circulante, semivida circulatoria, aclaramiento sérico, aclaramiento plasmático y semivida de aclaramiento. La funcionalidad a conservar se elige normalmente de entre procoagulante, proteolítica, unión a cofactor, actividad de unión a receptor u otro tipo de actividad biológica asociada con la proteína en particular. El término "aumentado" en relación con la semivida funcional in vivo o la semivida plasmática se usa para indicar que la semivida relevante del polipéptido o conjugado está estadísticamente significativamente aumentada con respecto a la de la molécula de referencia, tal como una glucoproteína no conjugada, determinada en condiciones comparables. Por ejemplo, la semivida relevante puede aumentarse en al menos aproximadamente un 25%, tal como en al menos aproximadamente un 50%, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 100%, 150%, 200%, 250% o un 500%. [0027] En una realización, la presente invención se refiere a un uso de un derivado de la IL-21 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades responsables de la estimulación de la proliferación de los linfocitos T y NK.
[0028] La presente invención proporciona adicionalmente una variedad de otras fusiones polipeptídicas y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, puede prepararse un polipéptido de IL-21 como una fusión con una proteína dimerizante según se desvela en las patentes de EE.UU. Nos 5.155.027 y 5.567.584 y derivatizarse según la invención. Algunas proteínas dimerizantes preferidas a este respecto incluyen los dominios de la región constante de inmunoglobulinas. Las fusiones polipeptídicas inmunoglobulina-IL-21 pueden expresarse en células modificadas genéticamente. Pueden fusionarse dominios auxiliares a los polipéptidos de IL-21 para dirigirlos a células, tejidos o macromoléculas específicas (por ejemplo, colágeno). [0029] Los péptidos de la presente invención, incluyendo péptidos completos, fragmentos de péptidos (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando), y polipéptidos de fusión, pueden producirse en células hospedadoras modificadas genéticamente según técnicas convencionales. Las células hospedadoras adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y cultivados, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucariotas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células hospedadoras se desvelan en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y Ausubel y col., ibid. [0030] Debe reconocerse que, según la presente invención, cuando se reivindica un ADNc según se ha descrito anteriormente, debe entenderse que lo que se reivindica es tanto la hebra de sentido directo como la hebra de sentido contrario, siendo el ADN bicatenario y estando ambas hebras de sentido directo y de sentido contrario emparejadas entre sí mediante sus respectivos enlaces de hidrógeno. También se reivindica el ARN mensajero (ARNm) que codifica para los polipéptidos de la presente invención, ARNm que está codificado por el anteriormente descrito ADNc. Un ARN mensajero (ARNm) codificará un polipéptido usando los mismos codones a los definidos anteriormente, con la excepción de que cada nucleótido de timina (T) está sustituido por un nucleótido de uracilo (U). Para dirigir un polipéptido de IL-21 hacía la vía secretora de una célula hospedadora, se proporciona una secuencia de señalización secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia) en el vector de expresión. La secuencia de señalización secretora puede ser la de la proteína o puede derivar de otra proteína secretada (por ejemplo,) o sintetizarse de novo. La secuencia de señalización secretora está unida a la secuencia de ADN de la IL-21 en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señalización secretoras están habitualmente posicionadas en 5' en la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de interés, aunque algunas secuencias de señalización pueden posicionarse en cualquier otro sitio de la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch y col., patente de EE.UU. No 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. No 5.143.830). [0031] La IL-21 y las variantes de la misma pueden expresarse en E. coli según se describe en el documento WO04/55168. Opcionalmente, las variantes de la IL-21 pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante en otros organismos. Con este fin pueden aislarse secuencias de ADN que codifican para polipéptidos relacionados con la IL-21 humana o variantes de la IL-21 preparando una genoteca genómica o de ADNc y cribando las secuencias de ADN que codifican para toda o parte de la proteína mediante hibridación usando sondas oligonucleotídicas sintéticas según técnicas estándar (cotéjese Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Para el propósito actual, la secuencia de ADN que codifica para la proteína es preferiblemente de origen humano, es decir, derivada de una genoteca genómica o de ADNc humanas. [0032] Las secuencias de ADN que codifican las variantes de la IL-21 también pueden prepararse sintéticamente mediante procedimientos estándar establecidos, por ejemplo, el método de la fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el procedimiento descrito por Matthes y col., EMBO Journal 3 (1984), 801-05. Según el método de la fosfoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se aparean, se ligan y se clonan en vectores adecuados. [0033] La invención también comprende modificaciones químicas del polipéptido de IL-21, variantes del mismo o proteínas de fusión que comprenden la IL-21 o variantes de la misma. Las modificaciones químicas comprenden modificaciones covalentes con un agente orgánico capaz de reaccionar con una cadena lateral o un residuo terminal elegido. [0034] Algunos ejemplos de dichas modificaciones son aquellas en las que se fija un sustituyente lipófilo a uno o más residuos de aminoácidos en una posición relativa a la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 1 ó 2, según se describió anteriormente. Debe entenderse que un residuo de aminoácido en la posición relativa a la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 2 puede ser cualquier residuo de aminoácido, y no sólo el residuo de aminoácido presente de forma natural en esa posición. En una realización, el sustituyente se une a una lisina. Una o más de las lisinas de la IL-21 podrían ser derivados según se describe en la solicitud. En otras formas de realización preferidas se sustituyen lisinas adicionales, se insertan en la secuencia o se añaden en el N-terminal o C-terminal, y después opcionalmente se derivatizan. Otros aspectos de la invención incluyen la adición de asp, glu, cys, gin, ser, thr o tyr, que porta grupos funcionales en la cadena lateral para derivatizar. Las regiones de inserción preferidas están donde no se vea afectada negativamente la actividad global de la proteína. Los truncamientos N-terminales y C-terminales pueden aparecer simultáneamente, así como las adiciones en las zonas terminales de las secuencias apropiadas. [0035] En aspectos de la invención, se eligen cualquiera de las siguientes posiciones para una sustitución, opcionalmente en combinación: Lys22, Lys53, Lys57, Lys76, Lys78, Lys89, Lys102, Lys103, Lys106, Lys113 o Lys118. [0036] En un aspecto de la invención pueden derivatizarse los siguientes sustituyentes, opcionalmente en combinación y opcionalmente después de preparar variantes con lisina en las correspondientes posiciones; Arg66, Arg86, Arg87, Arg91, Arg111 o Arg127. Todas las posiciones anteriores están calculadas a partir de posiciones del péptido de IL-21 según se describe en el documento WO00/53761 sin la secuencia N-terminal inicial de 28 aminoácidos. [0037] El término "sustituyente lipófilo" se caracteriza por comprender 4-40 átomos de carbono y por tener una solubilidad en agua a 20°C en el intervalo de desde aproximadamente 0,1 mg/100 ml de agua hasta aproximadamente 250 mg/100 ml de agua, tal como en el intervalo de desde aproximadamente 0,3 mg/100 ml de agua hasta aproximadamente 75 mg/100 ml de agua. Por ejemplo, el ácido octanoico (C8) tiene una solubilidad en agua a 20°C de 68 mg/100 ml, el ácido decanoico (C10) tiene una solubilidad en agua a 20°C de 15 mg/100 ml, y el ácido octadecanoico (C18) tiene una solubilidad en agua a 20°C de 0,3 mg/100 ml. Para obtener un perfil de acción prolongado satisfactorio del derivado de la IL-21, el sustituyente lipófilo unido a la fracción de IL-21, comprende, por ejemplo, 4-40 átomos de carbono, tal como 8-25 átomos de carbono. El sustituyente lipófilo puede estar unido a un grupo amino de la fracción de IL-21 mediante un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo, que forma un enlace amida con un grupo amino del aminoácido al cual está unido. Como alternativa, el sustituyente lipófilo puede estar unido a dicho aminoácido de una forma tal que el grupo amino del sustituyente lipófilo forme un enlace amida con un grupo carboxilo del aminoácido. Como opción adicional, el sustituyente lipófilo puede estar conectado con la fracción de IL-21 a través de un enlace éster. Formalmente, el éster puede formarse bien mediante reacción entre un grupo carboxilo de la fracción de IL-21 y un grupo hidroxilo del futuro sustituyente, o mediante reacción entre un grupo hidroxilo de la fracción de IL-21 y un grupo carboxilo del futuro sustituyente. Como alternativa adicional, el sustituyente lipófilo puede ser un grupo alquilo que es introducido en un grupo amino primario de la fracción de IL-21. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 sólo tiene un sustituyente lipófilo unido al péptido de IL-21. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende desde 4 hasta 40 átomos de carbono. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende desde 8 hasta 25 átomos de carbono. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende desde 12 hasta 20 átomos de carbono. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está unido a un residuo de aminoácido de una forma tal que un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo forma un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido. En otras formas de realización preferidas se sustituyen lisinas adicionales, se insertan en la secuencia o se añaden en el N-terminal o C-terminal, y después opcionalmente se derivatizan. Las regiones de inserción preferidas están donde no se vea afectada negativamente la actividad global de la proteína. Las regiones preferidas son las posiciones enumeradas anteriormente. [0038] En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está unido a un residuo de aminoácido de una forma tal que un grupo amino del sustituyente lipófilo forma un enlace amida con un grupo carboxilo del residuo de aminoácido. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está unido al péptido de IL21 mediante un separador. En una realización de la invención, el separador es un alcano no o ramificado un grupo ácido α,ω-dicarboxílico con desde 1 hasta 7 grupos metileno, tal como dos grupos metileno cuyo separador forma un puente entre un grupo amino de los péptidos de IL21 y un grupo amino del sustituyente lipófilo.
En una realización de la invención, el separador es un residuo de aminoácido excepto un residuo de Cys, o un dipéptido. Algunos ejemplos de separadores adecuados incluyen β-alanina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), ácido γ-glutámico, ácido succínico, Lys, Glu o Asp, o un dipéptido tal como Gly-Lys. Cuando el separador es ácido succínico, un grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el otro grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo. Cuando el separador es Lys, Glu o Asp, el grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el grupo amino del mismo puede formar un enlace amida con un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo. Cuando se usa Lys como separador, en algunos casos puede insertarse un separador adicional entre el grupo ε-amino de la Lys y el sustituyente lipófilo. En una realización, dicho separador adicional es ácido succínico que forma un enlace amida con el grupo εamino de la Lys y con un grupo amino presente en el sustituyente lipófilo. En otra realización, dicho separador adicional es Glu o Asp, que forma un enlace amida con el grupo ε-amino de la Lys y otro enlace amida con un grupo carboxilo presente en el sustituyente lipófilo, esto es, el sustituyente lipófilo es un residuo de lisina Nε-acilada. En una realización de la invención, el separador se elige de la lista consistente en βalanina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), ácido γ-glutámico, Lys, Asp, Glu, un dipéptido que contiene Asp, un dipéptido que contiene Glu, o un dipéptido que contiene Lys. En una realización de la invención el separador es β-alanina. En una realización de la invención, el separador es ácido gamma-aminobutírico (GABA). En una realización de la invención, el separador es ácido γ-glutámico. En una realización de la invención, un grupo carboxilo del péptido parental de IL-21 forma un enlace amida con un grupo amino de un separador, y el grupo carboxilo del aminoácido o dipéptido separador forma un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo. En una realización de la invención, un grupo amino del péptido parental de IL-21 forma un enlace amida con un grupo carboxílico de un separador, y un grupo amino del separador forma un enlace amida con un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende un esqueleto de ciclopentanofenatreno parcial o completamente hidrogenado. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es el grupo acilo de un ácido graso de cadena lineal o ramificada.
En una realización de la invención, el grupo acilo de un sustituyente lipófilo se elige del grupo que comprende CH3(CH2)nCO-, en el que n es desde 4 hasta 38, tal como CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-, CH3(CH2)20CO-y CH3(CH2)22CO-. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo acilo de un ácido α,ω-dicarboxílico de un alcano de cadena lineal o ramificada. En una realización de la invención, el grupo acilo del sustituyente lipófilo se elige del grupo que comprende HOOC(CH2)mCO-, en el que m es desde 4 hasta 38, tal como HOOC(CH2)14CO-, HOOC(CH2)16CO-, HOOC(CH2)18CO-, HOOC (CH2)20CO-y HOOC(CH2)22CO-. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-, en la que p y q son números enteros y p+q es un número entero de desde 8 hasta 40, tal como desde 12 hasta 35. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, en la que r es un número entero de desde 10 hasta 24. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, en la que s es un número entero de desde 8 hasta 24. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula COOH(CH2)tCO-en la que t es un número entero de desde 8 hasta 24. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3, en la que u es un número entero de desde 8 hasta 18. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3, en la que w es un número entero de desde 10 hasta 16. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(OOOH)NH-CO(CH2)xCH3, en la que x es un número entero de desde 10 hasta 16. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3, en la que y es cero o un número entero de desde 1 hasta 22. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es N-litocolilo. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es N-colilo.
En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene un sustituyente lipófilo. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene dos sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene tres sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene cuatro sustituyentes lipófilos. [0039] Los procedimientos de la presente invención también contemplan el uso de composiciones de IL-21 modificada químicamente, en las que se une un polipéptido de IL-21 con una molécula polimérica. Los polipéptidos ilustrativos de IL-21 son polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembranal funcional, tal como un polipéptido de IL-21 maduro. Típicamente, el polímero es soluble en agua, de forma que el conjugado de IL-21 no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es aquel que ha sido modificado para tener un único grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación,
o un aldehído para alquilación. De esta forma puede controlarse el grado de polimerización. Un ejemplo de un adherido reactivo es polietilenglicol propionaldehído, o alcoxi mono-(C1-C10), o derivados ariloxi del mismo (véase, por ejemplo, Harris, y col., patente de EE.UU. Nº 5.252.714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Por otra parte, puede usarse una mezcla de polímeros para producir conjugados de IL-21. Los conjugados de IL-21 usados en terapia pueden comprender fracciones de polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Algunos polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-(C1-C10)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(Nvinilpirrolidona)PEG, tresilmonometoxi PEG, PEG propionaldehído, bissuccinimidilcarbonato de PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos. Los diferentes tamaños del PEG se han descrito anteriormente. En un aspecto de la invención, el péptido es derivatizado con un grupo PEG N-terminal mediante la oxidación de una serina con peryodato sódico, seguido por la reacción del derivado de PEG, al que está unido hidroxilamina, rindiendo una oxima. En principio, la serina también podría haber sido un residuo de serina interno o un residuo de serina añadido, según se describió anteriormente. Otros procedimientos para unir grupos de PEG se describen en G. Pasut, A. Guiotto, F.
M.
Veronese Expert Opin. Ther. Patents 2004, 14, 859-894. Las variantes de la IL-21 adecuadas para su unión a grupos poliméricos pueden obtenerse según se describió
anteriormente. En un aspecto de la invención, la IL-21 está unida por el C-terminal del péptido. Esto puede conseguirse usando IL-21 o una variante de la IL-21 adecuada como sustrato de la CPY (carboxipeptidasa Y) de la cual se describe parte de la reacción en el
5 documento EP243929. Este intermedio puede entonces ser adicionalmente sustituido por un compuesto que contenga uno o más grupos reactivos, X, adecuado para una sustitución adicional con moléculas que contienen el grupo reactivo Y. El grupo reactivo puede elegirse de entre los grupos mencionados a continuación. [0040] En una realización, los grupos funcionales X e Y se eligen de entre los
10 grupos carbonilo, tales como grupos ceto y aldehído, y derivados amino, tales como
derivados de hidrazina
-NH-NH2,
derivados de carboxilato de hidrazina
-O-C(O)-NH-NH2
derivados de semicarbazida
-NH-C(O)-NH-NH2
derivados de tiosemicarbazida
-NH-C(S)-NH-NH2
derivados de dihidrazida de ácido carbónico
-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2
derivados de carbazida
-NH-NH-C(O)-NH-NH2
derivados de tiocarbazida
-NH-NH-C(S)-NH-NH2
derivados de aril hidrazina
-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2, y
derivados de hidrazida
-C(O)-NH-NH2;
derivados de oxilamina, tales como -O-NH2, -C(O)-O-NH2, -NH-C(O)-O-NH2 y -NHC(S)-O-NH2. [0041] Debe entenderse que si el grupo funcional comprendido en X es un grupo carbonilo, entonces el grupo funcional comprendido en Y es un derivado amínico, y
15 viceversa. Debido a la presencia de grupos -NH2 en la mayoría de los péptidos, se cree que se puede obtener una mejor selectividad si X comprende una funcionalidad ceto o aldehído. [0042] Algunos ejemplos de derivados de PEG adecuados en la reacción descrita anteriormente son en la que n es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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5 en la que m es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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10 en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y m es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que n es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que mPEG tiene un peso molecular de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa.
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en la que Y es -O-NH2, NH-NH2,
5 n, m y s son cualquier número entre 0 y 20; R' y R” representan independientemente, por ejemplo, metilo, fenilo, bifenilo, fenoxifenilo, fenilcarboxifenilo. [0043] ]Puede insertarse un grupo de fórmula -SO2-, -C(O)NH-, -C(O)NHSO2-, SO2-fenilo-, C(O)NHSO2-fenilo-en cualquier posición adecuada en las cadenas
10 alquílicas de cualquiera de las fórmulas anteriores. Opcionalmente, el grupo C(O)NH de la fórmula anterior puede sustituirse por
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[0044] En una realización de la invención, la introducción del derivado se introduce en una etapa. Entonces el R-X contiene los derivados que se van a introducir
15 en la IL-21. El nucleófilo representa por ejemplo aminoácidos, que ha sido modificado para portar el derivado. En principio puede usarse cualquier secuencia de aminoácidos. En un aspecto de la invención se usan nucleófilos tales como G(1-5)-PEG, G(1-5)-lípido, G(1-4)-NH-CH2-CHO, G(1-4) -NH-CH2-C-O-NH2 etc. [0045] El PEG es una molécula polimérica adecuada, dado que sólo tiene unos
20 pocos grupos reactivos capaces de reticular en comparación con polisacáridos tales como dextrano. En particular, es de interés el PEG monofuncional, por ejemplo, metoxipolietilenglicol (mPEG), dado que su química de acoplamiento es relativamente simple (sólo hay disponible un grupo reactivo para conjugar con grupos de unión en el polipéptido). Consecuentemente, se elimina el riesgo de reticulación, los conjugados polipeptídicos resultantes son más homogéneos y la reacción de las moléculas poliméricas con el polipéptido es más fácil de controlar. [0046] Para efectuar la unión covalente de la(s) molécula(s) de polímero al polipéptido, los grupos hidroxilo terminales de la molécula de polímero se proporcionan en su forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. Las moléculas poliméricas activadas adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Shearwater Corp., Huntsville, Ala., EE.UU., o en PolyMASC Pharmaceuticals plc, Reino Unido. Alternativamente pueden activarse las moléculas de polímero mediante procedimientos convencionales conocidos en la materia, por ejemplo, según se desvela en el documento WO90/13540. Algunos ejemplos específicos de moléculas poliméricas lineales o ramificadas activadas para su uso en la presente invención se describen en los catálogos de Shearwater Corp. 1997 y 2000 (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives). Algunos ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG (por ejemplo, SPAPEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, y SCM-PEG), y NOR-PEG), BTC-PEG, EPDX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG y MAL-PEG, y PEG ramificados tales como PEG2-NHS y los desvelados en los documentos Pat. de EE.UU. Nº 5.932.462 y Pat. de EE.UU. Nº 5.643.575. Adicionalmente, las publicaciones siguientes desvela moléculas poliméricas útiles y/o químicas de PEGilación: Pat. de EE.UU. Nº 5.824.778, Pat. de EE.UU. Nº 5.476.653, documento WO97/32607, documento EP229.108, documento EP402.378, Pat. de EE.UU. Nº 4.902.502, Pat. de EE.UU. Nº 5.281.698, Pat. de EE.UU. Nº 5.122.614, Pat. de EE.UU. Nº 5.219.564, documento WO92/16555, documento WO94/04193, documento WO94/14758, documento WO94/17039, documento WO94/18247, documento WO94/28024, documento WO95/00162, documento WO95/11924, documento WO95/13090, documento WO95/33490, documento WO96/00080, documento WO97/18832, documento WO98/41562, documento WO98/48837, documento WO99/32134, documento WO99/32139, documento WO99/32140, documento WO96/40791, documento WO98/32466, documento WO95/06058, documento EP439508, documento WO97/03106, documento WO96/21469, documento WO95/13312, documento EP921131, Pat. de EE.UU. Nº 5.736.625, documento WO98/05363, documento EP809996, Pat. de EE.UU. Nº 5.629.384, documento WO96/41813, documento WO96/07670, Pat. de EE.UU. Nº 5.473.034, Pat. de EE.UU. Nº 5.516.673, documento EP605963, Pat. de EE.UU. Nº 5.382.657, documento EP510356, documento EP400472, EP183503 y documento EP154316. La conjugación del polipéptido y las moléculas poliméricas activadas es conducida mediante el uso de cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, según se describe en las siguientes referencias (que también describen procedimientos adecuados para la activación de moléculas poliméricas): R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y col., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). El experto en la materia será consciente de que el procedimiento de activación y/o la química de conjugación que se vaya a usar dependerá del (los) grupo(s) de unión del polipéptido (algunos ejemplos de los cuales se proporcionan adicionalmente a continuación), así como de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, siendo amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfidrilo, succinimidilo, maleimida, vinisulfona o haloacetato). La PEGilación puede dirigirse hacia una conjugación de todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, aquellos grupos de unión que están expuestos en la superficie del polipéptido), o puede dirigirse hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal (Pat. de EE.UU. Nº 5.985.265). Adicionalmente, la conjugación puede conseguirse en una etapa o de una forma por etapas (por ejemplo, según se describe en el documento WO99/55377). Se entenderá que la PEGilación está diseñada de forma que se produzca la molécula óptima con respecto al número de moléculas de PEG unidas, el tamaño y la forma de dichas moléculas (por ejemplo, si son lineales o ramificadas) y dónde se unen dichas moléculas en el polipéptido. El peso molecular del polipéptido que se va a usar se elegirá teniendo en consideración el efecto deseado que se quiere conseguir. Por ejemplo, si el propósito primario de la conjugación es conseguir un conjugado con un alto peso molecular y un tamaño mayor (por ejemplo, para reducir el aclaramiento renal), se puede elegir conjugar una o unas pocas moléculas de polímero de alto peso molecular o varias moléculas de polímero con un peso molecular menor para obtener el efecto deseado. Sin embargo, preferiblemente se usarán varias moléculas de polímero con un peso molecular menor. Este también es el caso si se desea un alto grado de protección del epítopo. En tales casos pueden usarse, por ejemplo, 2-8 polímeros con un peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 5.000 Da, tal como 3-6 de dichos polímeros. Como ilustran los ejemplos, a continuación, puede ser ventajoso tener un mayor número de moléculas de polímero con un menor peso molecular (por ejemplo, 4-6 con un PM de 12.000-20.000) en términos de mejora de la semivida funcional in vivo del conjugado polipeptídico, incluso cuando el peso molecular total de las moléculas de polímero unidas en los dos casos sea el mismo o similar. Se cree que la presencia de un mayor número de moléculas de polímero más pequeñas proporciona al polipéptido un diámetro o un tamaño aparente mayor que, por ejemplo, una molécula de polímero individual aún mayor, al menos cuando las moléculas de polímero están distribuidas relativamente uniformemente en la superficie del polipéptido. Adicionalmente se ha averiguado que se obtienen resultados ventajosos cuando el tamaño aparente (también denominado "masa molecular aparente" o "masa aparente") de al menos una porción importante del conjugado de la invención es de al menos aproximadamente 55 kDa, tal como al menos de aproximadamente 60 kDa, por ejemplo, de al menos aproximadamente 66 kDa. Se cree que esto es debido al hecho de que el aclaramiento renal está sustancialmente eliminado para los conjugados con un tamaño aparente lo suficientemente grande. En el presente contexto, el "tamaño aparente" de un conjugado de IL-21 o un polipéptido de IL-21 se determina mediante el método de SDS-PAGE. [0047] En una realización de la invención, el PEG conjugado con un péptido según la presente invención puede ser de cualquier peso molecular. En particular, el peso molecular puede estar entre 500 y 100.000 Da, tal como entre 500 y 60.000 Da, tal como entre 1.000 y 40.000 Da, tal como entre 5.000 y 40.000 Da. En particular, en la presente invención pueden usarse PEG con pesos moleculares de 10.000 Da, 20.000 Da o 40.000 KDa. En todos los casos, los PEG pueden ser lineales o ramificados. En una realización de la invención, los grupos de PEG son de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa o 60 kDa. En una realización de la invención, se añaden una o más moléculas poliméricas al péptido. [0048] La presente invención proporciona compuestos que son adecuados para la unión de un grupo polimérico. En una realización de la invención, el derivado proporciona así un péptido que tiene una semivida in vivo mejorada. Esto puede conseguirse protegiendo el compuesto frente a la degradación química, la degradación proteolítica o el reconocimiento por anticuerpos –o cualquier otro mecanismo. En una realización, los compuestos proporcionados son menos tóxicos.
En una realización, los compuestos proporcionados son más solubles en agua. En una realización, los compuestos proporcionados tienen una biodistribución modificada. Los anteriores son con respecto a los análogos no derivatizados o a la hIL-21.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS [0049] La invención proporciona, en una realización particular, lo siguiente: [0050] Otro objeto de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende IL-21, análogos o derivados de la misma, u opcionalmente junto con cualquier otro compuesto mencionado en la presente solicitud, que está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml, y en la que dicha formulación tiene un pH desde 2,0 hasta 10,0. La formulación puede comprender adicionalmente un sistema tamponante, conservante (s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. En una realización de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Dicha formulación es típicamente una disolución o una suspensión. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica es una disolución acuosa. El término "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos un 50% p/p de agua. Asimismo, el término "disolución acuosa" se define como una disolución que comprende al menos un 50% p/p de agua, y el término "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos un 50% p/p de agua. [0051] En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes de su uso. [0052] En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por pulverización), lista para su uso sin ninguna disolución previa. [0053] En un aspecto adicional, la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una disolución acuosa de IL-21 o cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente y un tampón, o en la que dicho compuesto está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml o, según se mencionó anteriormente, preferiblemente desde 0,5 mg/ml -50 mg/ml, y en la que dicha formulación tiene un pH desde aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 10,0. El pH preferido es desde 3,0 hasta aproximadamente 8,0. El intervalo en particular preferido es desde 4,0-6,0, tal como, por ejemplo, los intervalos 4,0-4,5, 4,5
5,0, 5,0-5,5 y 5,5-6,0. [0054] En otra realización de la invención, el pH de la formulación se elige de la lista consistente en 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0. [0055] En una realización adicional de la invención, el tampón se elige del grupo consistente en acetato sódico, carbonato sódico, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato sódico, hidrogenofosfato disódico, fosfato sódico y tris(hidroximetil)aminometano, bicoina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención. [0056] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un conservante antimicrobiano farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional de la invención, el conservante se elige del grupo consistente en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato sódico, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropan-1,2-diol) o mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención, el conservante está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 20 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 5 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante está presente en una concentración de desde 5 mg/ml hasta 10 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el conservante está presente en una concentración de desde 10 mg/ml hasta 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. [0057] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un agente isotónico. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico se elige del grupo consistente en una sal (por ejemplo, cloruro sódico), un azúcar o un alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, Lhistidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400), o mezclas de los mismos. Puede usarse cualquier azúcar, tal como mono, di o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo, por ejemplo fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetil celulosa-Na. En una realización, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo C4-C8 con al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. No hay un límite fijo en la cantidad usada, siempre que el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y no afecte negativamente a los efectos estabilizantes conseguidos usando los procedimientos de la invención. En una realización, la concentración del azúcar o alcohol de azúcar está entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente en una concentración de desde 1 mg/ml hasta 50 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente en una concentración de desde 1 mg/ml hasta 7 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente en una concentración de desde 8 mg/ml hasta 24 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico está presente en una concentración de desde 25 mg/ml hasta 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes isotónicos específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas es conocido por el experto en la materia. Por comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. [0058] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un agente quelante. En una realización adicional de la invención, el agente quelante se elige de entre sales del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico, y mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 5 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 2 mg/ml. En una realización adicional de la invención, el agente quelante está presente en una concentración de desde 2 mg/ml hasta 5 mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas es conocido por el experto en la materia. Por comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. [0059] [0059] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un estabilizante. El uso de un estabilizante en composiciones farmacéuticas es conocido por el experto en la materia. Por comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. [0060] Más particularmente, las composiciones de la invención son composiciones farmacéuticas líquidas estabilizadas cuyos componentes terapéuticamente activos incluyen un polipéptido que posiblemente muestre formación de agregados durante el almacenamiento en formulaciones farmacéuticas líquidas. Por "formación de agregados" se entiende una interacción física entre las moléculas de polipéptido que da como resultado la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan en la disolución. Por "durante el almacenamiento" se entiende una composición o formulación farmacéutica líquida que, una vez preparada, no se administra inmediatamente a un sujeto. Más bien, tras la preparación se envasa para su almacenamiento, bien en forma líquida, en estado congelado, o en forma seca para su posterior reconstitución en una forma líquida u otra forma adecuada para su administración a un sujeto. Por "forma seca" se entiende la composición o formulación farmacéutica líquida se seca mediante liofilización (véase, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secado por pulverización (véase Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (5ª ed; Longman Scientific and Technical, Essez, Reino Unido), págs. 491-676; Broad-head y col. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; y Mumenthaler y col. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), o secado al aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar negativamente a la actividad biológica de ese polipéptido, dando como resultado una pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Adicionalmente, la formación de agregados puede causar otros problemas tales como un bloqueo de los tubos, membranas o bombas cuando se administra la composición farmacéutica que contiene el polipéptido usando un sistema de infusión.
[0061] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender adicionalmente una cantidad de un aminoácido base suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. Por "aminoácido base" se entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, en los que cualquier aminoácido dado está presente bien en su forma de base libre o bien en su forma salina. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas salinas, o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre mientras que otros están presentes en sus formas salinas. En una realización, los aminoácidos que se van a usar para preparar las composiciones de la invención son aquellos que portan una cadena lateral cargada, tales como arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En las composiciones farmacéuticas de la invención puede estar presente cualquier estereoisómero (es decir, isómero L, D o DL) de un aminoácido en particular (por ejemplo, glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina y mezclas de los mismos), o combinaciones de estos estereoisómeros, siempre que el aminoácido particular esté presente bien en su forma de base libre o bien en su forma salina. En una realización se usa el estereoisómero L. Las composiciones de la invención también pueden formularse con análogos de estos aminoácidos. Por "aminoácido análogo" se entiende un derivado del aminoácido natural que provoca el efecto deseado de disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención. Algunos análogos de arginina adecuados incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil Larginina, algunos análogos de metionina adecuados incluyen etionina y butionina, y algunos análogos de cisteína adecuados incluyen S-metil-L-cisteína. Como con los otros aminoácidos, los análogos de aminoácidos se incorporan en las composiciones bien en forma de su base libre o bien en su forma salina. En una realización adicional de la invención, los aminoácidos o análogos de aminoácidos se usan en una concentración que es suficiente para evitar o retardar la agregación de la proteína. [0062] En una realización adicional de la invención, puede añadirse metionina (u otros aminoácidos o análogos de aminoácidos sulfúricos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a sulfóxido de metionina cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible de dicha oxidación. Por "inhibe" se entiende una acumulación mínima con el tiempo de especies de metionina oxidadas. La inhibición de la oxidación de la metionina da como resultado una mayor retención del polipéptido en su forma molecular adecuada. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (isómero L, D, o DL) o combinaciones de los mismos. La cantidad que se va añadir debería ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los residuos de metionina, de forma que la cantidad de sulfóxido de metionina sea aceptable por las autoridades sanitarias. Típicamente, esto significa que la composición no contiene más de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 30% de sulfóxido de metionina. Generalmente, esto puede conseguirse añadiendo metionina de una forma tal que la proporción entre la metionina añadida y los residuos de metionina varía desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1.000:1, tal como 10:1 hasta aproximadamente 100:1. [0063] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un estabilizante elegido del grupo de polímeros de alto peso molecular
o compuestos moleculares bajos. En una realización adicional de la invención, el estabilizante se elige de entre polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi/hidroxi celulosa o derivados de los mismos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol, y diferentes sales (por ejemplo, cloruro sódico). Cada uno de estos estabilizantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. [0064] Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes estabilizantes adicionales, que mejoran adicionalmente la estabilidad de un polipéptido terapéuticamente activo en las mismas. Algunos agentes estabilizantes de particular interés para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, metionina y EDTA, que protegen el polipéptido frente a la oxidación de la metionina, y un tensioactivo no iónico, que protege el polipéptido frente a la agregación asociada con la congelación-descongelación o la cizalladura mecánica. [0065] En una realización adicional de la invención, la formulación comprende adicionalmente un tensioactivo. En una realización adicional de la invención, el tensioactivo se elige de entre un detergente, aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres de ácidos grasos de sorbitano, polímeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo, poloxámeros tales como Pluronido F68, poloxámero 188 y 407, Triton X-100), ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitano, polioxietileno y derivados de polietileno tales como derivados alquilados y alcoxilados (tweens, por ejemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 y Brij-35), monoglicéridos o derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados de polioxietileno de los mismos, alcoholes, glicerol, lectinas y fosfolípidos (por ejemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por ejemplo, ácido dipalmitoilfosfatídico) y lisofosfolípidos (por ejemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina y ésteres de 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina o treonina) y derivados de alquilo, alcoxilo (éster de alquilo), alcoxi (éter de alquilo) de lisofosfatidil y fosfatidilcolinas, por ejemplo, derivados lauroil y miristoil de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, y modificaciones del grupo polar de cabeza, esto es, colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, y los DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina cargados positivamente, y glicerofosfolípidos (por ejemplo, cefalinas), gliceroglucolípidos (por ejemplo, galactopiransoide), esfingoglucolípidos (por ejemplo, ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados del ácido fusídico (por ejemplo, tauro-dihidrofusidato sódico, etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales C6-C12 de los mismos (por ejemplo, ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivatidos, derivados Nα-acilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados en la cadena lateral de lisina o arginina, derivados Nα-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina y un aminoácido neutro o ácido, derivados Nα-acilados de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato sódico, registro CAS nº [577-11-7]), docusato cálcico, registro CAS nº [128-49-4]), docusato potásico, registro CAS nº [7491-09-0]), SDS (dodecilsulfato sódico o laurilsulfato sódico), caprilato sódico, ácido cólico o derivados del mismo, sales biliares y sales de los mismos y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato sódico, desoxicolato sódico, taurocolato sódico, glicocolato sódico, sulfonato de N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano, tensioactivos aniónicos monovalentes (sulfonatos de alquilarilo), tensioactivos bipolares (por ejemplo, sulfonatos de N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propano, 3sulfonato de colamido-1-propildimetilamonio-1-propano, tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternario) (por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Dodecil β-Dglucopiranósido), poloxaminas (por ejemplo, Tetronic's), que son copolímeros en bloque tetrafuncionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilenodiamina, o el tensioactivo puede elegirse del grupo de derivados de imidazolina, o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tensioactivos específicos constituye una realización alternativa de la invención. [0066] El uso de un tensioactivos en composiciones farmacéuticas es conocido por el experto en la materia. Por comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995. [0067] Es posible que haya presentes otros ingredientes en la formulación farmacéutica peptídica de la presente invención. Dichos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de relleno, modificantes de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas) y un ión bipolar (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Por supuesto, dichos ingredientes adicionales no deberían afectar negativamente a la estabilidad global de la formulación farmacéutica de la presente invención. [0068] Las composiciones farmacéuticas que contienen IL-21 o cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente según la presente invención, pueden ser administradas a un paciente en necesidad de dicho tratamiento en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, piel y sitios de mucosa, en sitios que evitan la absorción, por ejemplo, administración en una arteria, en una vena, en el corazón, y en sitios que implican absorción, por ejemplo, administración en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen. [0069] La administración de composiciones farmacéuticas según la invención puede ser a través de diversas vías de administración, por ejemplo, lingual, sublingual, yugal, en la boca, oral, en el estómago e intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a través de los bronquiolos y los alveolos o una combinación de los mismos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo, a través de la conjuntiva, uretal y parenteral, a pacientes en necesidad de dicho tratamiento. [0070] Las composiciones de la actual invención pueden administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo, como disoluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsión múltiple, espumas, bálsamos, pastas, emplastos, ungüentos, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, pulverizadores, polvo, aerosoles, inhaladores, gotas oftálmicas, ungüentos oftálmicos, lavados oftálmicos, óvulos vaginales, lavados vaginales, ungüentos vaginales, disolución para inyección, disoluciones que se transforman in situ, por ejemplo, gelificación in situ, endurecimiento in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, disolución para infusión e implantes. [0071] Las composiciones de la invención pueden combinarse adicionalmente, o unirse, por ejemplo, mediante interacciones covalentes, hidrófobas, electrostáticas, a un fármaco portador, un sistema de administración de fármacos y un sistema de administración de fármacos avanzado, con objeto de incrementar adicionalmente la estabilidad de la IL-21 o cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente, aumentar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, conseguir una cronoterapia, conocida por los expertos en la materia, y aumentar el cumplimiento por parte del paciente o cualquier combinación de los mismos. Algunos ejemplos de portadores, sistemas de administración de fármacos y sistemas de administración de fármacos avanzados incluyen, pero no se limitan a, polímeros, por ejemplo, celulosa y derivados, polisacáridos, por ejemplo, dextrano y derivados, almidón y derivados, alcohol polivinílico, polímeros de acrilato y metacrilato, ácido poliláctico y poliglicólico y copolímeros en bloque de los mismos, polietilenglicoles, proteínas portadoras, por ejemplo, albúmina, geles, por ejemplo, sistemas termogelificantes, por ejemplo, sistemas de copolímeros en bloque conocidos por los expertos en la materia, micelas, liposomas, microesferas, nanoparticulados, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de los mismos, conocidos por los expertos en la materia de comportamiento de fase en sistemas lípidoagua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, autoemulsionantes, microautoemulsionantes, ciclodextrinas y derivados de las mismas, y dendrímeros. [0072] Las composiciones de la actual invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvos y disoluciones para la administración por vía pulmonar de la IL-21 o de cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente usando, por ejemplo, un inhalador dosímetro, un inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos los dispositivos conocidos por los expertos en la materia. [0073] Las composiciones de la actual invención son específicamente útiles en la formulación de sistemas de administración de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta. Más específicamente, pero no limitándose a, las composiciones son útiles en la formulación de sistemas de liberación controlada y de liberación sostenida (dando lugar ambos sistemas a una reducción de muchas veces en el número de administraciones), conocidos por los expertos en la materia. Incluso más preferiblemente, son sistemas de liberación controlada y de liberación sostenida administrados por vía subcutánea. Sin limitar el ámbito de la invención, algunos ejemplos de sistemas y composiciones de liberación controlada útiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas. [0074] Algunos procedimientos para producir sistemas de liberación controlada útiles para las composiciones de la actual invención incluyen, pero no se limitan a, cristalización, condensación, cocristalización, precipitación, coprecipitación, emulsificación, dispersión, homogeneización a alta presión, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación del disolvente para producir microesferas, extrusión y procesos de fluidos supercríticos. Se hace referencia general a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000). [0075] La administración parenteral puede realizarse por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa mediante una jeringa, opcionalmente una jeringa en pluma. Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse mediante una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser una disolución o suspensión para la administración de la IL-21 o de cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente, en forma de un pulverizador nasal o pulmonar. Como otra opción adicional más, las composiciones farmacéuticas que contienen IL-21 o cualquier otro compuesto según se mencionó anteriormente, también pueden adaptarse para su administración transdérmica, por ejemplo, mediante una inyección sin aguja o desde un parche, opcionalmente una administración en parche iontoforético, ortransmucosal, por ejemplo, yugal. [0076] El término "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con una estabilidad física incrementada, una estabilidad química incrementada o una estabilidad física y química incrementadas. [0077] El término "estabilidad física" de la formulación proteica según se usa en este documento se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a estreses termomecánicos y/o interacción con interfases y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies de interfases hidrófobas. La estabilidad física de las formulaciones proteicas acuosas se evalúa mediante una inspección visual y/o medidas de turbidez tras exponer la formulación contenida en recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o viales) a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos periodos de tiempo. La inspección visual de las formulaciones se realiza con una luz brillante enfocada bajo un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza mediante una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 (una formulación que no muestra turbidez se corresponde con una puntuación visual de 0, y una formulación que muestra una turbidez visual a la luz del día se corresponde con una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica como físicamente inestable con respecto a la agregación proteica cuando muestra una turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la formulación puede evaluarse mediante simples medidas de turbidez conocidas por el experto en la materia. La estabilidad física de las formulaciones proteicas acuosas también puede evaluarse usando un agente o sonda espectroscópicos del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferiblemente una molécula pequeña que preferiblemente se une a la conformación no nativa de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de estructura proteica es la Tioflavina T. La Tioflavina T es un pigmento fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas, y quizás otras configuraciones proteicas también, la Tioflavina T provoca un nuevo máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y un incremento en la emisión a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma proteica de fibrilla. La Tioflavina T es esencialmente no fluorescente a las longitudes de onda. [0078] Pueden usarse otras moléculas pequeñas como sondas de los cambios en la estructura protectora desde estados nativos a no nativos. Por ejemplo, las sondas de "parche hidrófobo" que se unen preferentemente a parches hidrófobos expuestos de una proteína. Los parches hidrófobos están generalmente enterrados en la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo, pero quedan expuestos cuando una proteína comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Algunos ejemplos de estas pequeñas sondas moleculares espectroscópicas son pigmentos aromáticos hidrófobos tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas espectroscópicas son complejos de metal-aminoácido, tales como complejos de cobalto de aminoácidos hidrófobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina, o similares. [0079] El término "estabilidad química" de la formulación proteica según se usa en este documento se refiere a cambios químicos covalentes en la estructura proteica que dan lugar a la formación de productos de degradación química con una potencial menor potencia biológica y/o un aumento en las propiedades inmunógenas en comparación con la estructura protectora nativa. Pueden formarse varios productos de degradación química dependiendo del tipo y la naturaleza de la proteína nativa y el entorno al que está expuesto la proteína. La eliminación de la degradación química puede muy probablemente no ser completamente evitada, y a menudo se observan cantidades crecientes de productos de degradación química durante el almacenamiento y el uso de la formulación proteica, como bien sabe el experto en la materia. La mayoría de las proteínas tienden a la desamidación, un proceso en el cual el grupo amida de la cadena lateral de los residuos de glutaminilo o asparraginilo es hidrolizado para formar un ácido carboxílico libre. Otras vías de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular, en los que dos o más moléculas proteicas se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o puentes de disulfuro, dando lugar a la formación de productos de degradación dímeros, oligómeros y polímeros unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, Nueva York 1992). Puede mencionarse la oxidación (de, por ejemplo, residuos de metionina) como otra variante de degradación química. La estabilidad química de la formulación proteica puede evaluarse midiendo la cantidad de los productos de degradación química en diversos momentos temporales tras la exposición a diferentes condiciones medioambientales (la formación de los productos de degradación a menudo puede acelerarse, por ejemplo, con un aumento en la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual se determina a menudo mediante la separación de los productos de degradación dependiendo del tamaño y/o la carga de la molécula, usando diversas técnicas cromatográficas (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC). [0080] Por lo tanto, según se esquematiza anteriormente, una "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con una estabilidad física incrementada, una estabilidad química incrementada o unas estabilidades física y química incrementadas. En general, una formulación debe ser estable durante su uso y almacenamiento (de conformidad con las condiciones de uso y almacenamiento recomendadas) hasta que se alcanza la fecha de caducidad.
EJEMPLOS [0081] Se expresó la interleucina 21 (IL21) recombinante como cuerpos de inclusión en E. coli según se describe en el documento WO04/55168 con una extensión N-terminal (Met-Ser-hIL21). El residuo de Met N-terminal se elimina mediante sistemas de proteasa presentes en E. coli, dejando la Ser-hIL21. La secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Glu puede estar presente o ausente. [0082] La proteína se replegó y se purificó hasta un 90-95% de pureza usando
procedimientos cromatográficos convencionales. [0083] Subsiguientemente, la proteína pura fue pegilada N-terminalmente mediante la oxidación de la serina N-terminal mediante reacción con peryodato sódico, seguido por la reacción del derivado de PEG, al cual se unió una hidroxilamina,
5 rindiendo una oxima. [0084] La subsiguiente purificación se realizó usando una filtración en gel o una cromatografía de exclusión por tamaños (size exclusion chromatography, SEC). [0085] En un ensayo de proliferación, como por ejemplo el ensayo BAF3 descrito a continuación, la IL21 pegilada era equipotente con el estándar no pegilado, lo que
10 indica que la pegilación no interfiere en la unión al receptor, y que el procedimiento de reacción no es perjudicial para la proteína.
Ejemplos preparatorios [0086] Un procedimiento para la unión de una fracción de PEG al C-terminal de un derivado de IL-21 puede realizarse de forma análoga a la unión de fracciones
15 químicas a otros péptidos o proteínas descrita anteriormente: [0087] Puede unirse una fracción de PEG al C-terminal de la IL-21 o un derivado de la IL-21 tal como, por ejemplo, la hIL-21, mediante un procedimiento en dos etapas. [0088] En la primera etapa se somete un análogo adecuado de la IL-21 tal como,
20 por ejemplo, (hIL-21il)alanina, a una reacción de transpeptidación catalizada por la carboxipeptidasa Y (CPY) en presencia de un nucleófilo adecuado, por ejemplo, ácido (S)-2-amino-3-(4-(propargiloxi)fenil)propanoico, en un tampón adecuado tal como tampón de HEPES/TMEDA, a un pH adecuado como por ejemplo pH 7,5 o pH 8, a una temperatura adecuada tal como, por ejemplo, una temperatura ambiente de 30°C o
25 35°C.
imagen1
[0089] En la segunda etapa, puede hacerse reaccionar un reactivo de PEG derivatizado adecuado con (S)-2-((hIL-21il)amino)-3-(4(propariloxi)fenil)propanamida. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar un exceso de 4
(mPEG20000il)-N-(3-(hidroxiimino)bencil)butanamida en condiciones oxidativas, tales como, por ejemplo, una disolución de hipoclorito sódico con 4-(mPEG20000il)N-(3-(oxiciano)bencilbutanamida. Puede añadirse una disolución de 4(mPEG20000il)-N-(3-(oxiciano)bencilbutanamida a una disolución de (S)-2-((hIL
5 21il)amino)-3-(4-(propariloxi)fenil)propanamida para rendir (S)-2-((hIL-21il)amino)3-(4-((3-(3-((4-(m PEG20000il)butanoilamino)metil)fenil)isoxazol-5il)metoxi)fenil)propanamida.
imagen1
[0090] Puede prepararse 4-(mPEG20000il)-N-(3-(hidroxiimino)bencil)butanamida 10 a partir del comercialmente disponible ácido 3-((tercbutoxicarbonilamino)metil)benzoico, que puede reducirse con un reactivo o
combinación de reactivos adecuados, por ejemplo, en un procedimiento en dos etapas conocido por la persona entrenada en la materia, que comprende en una primera etapa la adición de cloroformiato de etilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, trietilamina, la eliminación del cloruro de trimetilamonio formado mediante filtración y la adición de borohidruro de litio para rendir N-(3-(hidroxilmetil)bencil)carbamato de terc-butilo. El N-(3-(hidroxilmetil)bencil)carbamato de terc-butilo puede oxidarse con un reactivo o combinación de reactivos adecuados, por ejemplo, usando una oxidación de Swem, conocida por la persona entrenada en la materia, que comprende la adición de una disolución del alcohol en, por ejemplo, diclorometano, a -78°C, a una mezcla de cloruro de oxalilo y dimetilsulfóxido en diclorometano, que se ha formado a -78°C, seguido por la adición de una base amínica adecuada, tal como, por ejemplo, trietilamina, y el subsiguiente calentamiento hasta la temperatura ambiente. El N-(3formilbencil)carbamato de terc-butilo formado puede hacerse reaccionar para rendir terc-butil N-(3-((hidroxilimino)metil)bencilo) mediante reacción con la base libre o una sal adecuada de hidroxilamina en una disolución de, por ejemplo, hidróxido sódico en agua. El grupo de protección BOC puede eliminarse del terc-butil N-(3((hidroxilimino)metil)bencilo) mediante procedimientos descritos en la bibliografía (por ejemplo, T. W. Green, P. G. M Wuts Protective groups in organic sinthesis 2ª ed. Wiley, Nueva York, 1991), por ejemplo, mediante tratamiento con una disolución al 50% de ácido trifluoroacético en diclorometano para dar 3-(aminometil)benzaldehído oxima. Finalmente, puede prepararse 4-(mPEG20000il)-N-(3(hidroxiimino)bencil)butanamida mediante una reacción de formación de amida, que comprende una reacción de la base libre o una sal adecuada de 3(aminometil)benzaldehído oxima en presencia de un exceso de una base adecuada, tal como, por ejemplo, etildiisopropilamina con el comercialmente disponible éster 2,5-dioxipirrolidinil 4-(mPEG20000il)butanoico (Nektar, 2M450P01).
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[0091] En una segunda etapa alternativa puede prepararse una mezcla de una cantidad apropiada de sulfato de cobre pentahidratado, por ejemplo, el 5% o el 10% o 1 equivalente o 10 equivalentes con respecto a (S)-2-((hIL-21il)amino)-3-(45 (propariloxi)fenil)propanamida y una cantidad apropiada de ácido L-ascórbico, tal como, por ejemplo, 50 eq con respecto a (S)-2-((hIL-21il)amino)-3-(4(propariloxi)fenil)propanamida, en agua, que se tampona con 2,6-lutidina. Después de un periodo de tiempo apropiado, tal como, por ejemplo, 5 min, esta disolución puede aportarse a una disolución de (S)-2-((hIL-21 il)amino)-3-(410 (propariloxi)fenil)propanamida y N-(2-(mPEG20000il)etil) 11-azidoundecanamida, que se tampona con 2,6-lutidina. La mezcla de reacción puede conservarse a una temperatura apropiada, tal como, por ejemplo, la temperatura ambiente, hasta que pueda formarse una mezcla de un único compuesto elegido de entre (S)-((hIL21)amino)-3-(4-((1-(10-(N-(2-(m PEG20000il)etil)carbamoil)decanil)-1,2,3-triazol-415 il)metoxi)fenilo) y (S)-((hIL-21)amino)-3-(4-((1-(10-(N-(2
(mPEG20000il)etil)carbamoil)decanil)-1,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenilo).
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[0092] La síntesis de N-(2-(mPEG20000il)etil) 11-azidoundecanamida puede realizarse mediante reacción del comercialmente disponible éster metil-115 bromoundecanoico con azida sódica en un disolvente apropiado tal como, por ejemplo, N,N-dimetilformamida, a una temperatura apropiada, como por ejemplo 60°C. El éster
metil 11-azidoundecanoico puede saponificarse mediante un procedimiento conocido por el experto en la materia y descrito en la bibliografía (por ejemplo, T. W. Green, P.
G. M Wuts Protective groups in organic synthesis 2ª ed. Wiley, Nueva York, 1991) tal como, por ejemplo, hidróxido potásico en metanol o trietilsilanolato potásico en 5 tetrahidrofurano. El ácido resultante puede activarse mediante un procedimiento conocido por el experto en la materia, por ejemplo, mediante reacción con tetrafluoroborato de 2-succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio (TSTU) en un disolvente apropiado tal como, por ejemplo, N,N-dimetilformamida, a una temperatura apropiada tal como, por ejemplo, la temperatura ambiente, para dar 11-azido-N-2,510 dioxopirrolidin-1-ilundecanamida. La 11-azido-N-2,5-dioxopirrolidin-1ilundecanamida puede hacerse reaccionar con la comercialmente disponible (2(mPEG20000il)etil)amina (Nektar 2M2U0P01) en un disolvente apropiado tal como, por ejemplo, diclorometano, y en presencia de una base apropiada tal como, por ejemplo, trietilamina o etildiisopropilamina, para dar N-(2-(mPEG20000il)etil) 11
15 azidoundecanamida.
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Ejemplo
1-(((((4-((4-(mPEG-20000il)butanoil)amino)butoximinoacetil)serinil)glutamil) alaninil)glutamil)hIL-21
Etapa 1: 2-(4-(terc-Butoxicarbonilaminoxi)butil)isoindol-1,3-diona
[0093]
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5 [0094] A una mezcla de la N-(4-bromobutil)ftalimida (2,82g, 10 mmol) comercialmente disponible y N-Boc-hidroxilamina (2,08 g, 15,6 mmol) se añadió acetonitrilo (2 ml) y sucesivamente 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (2,25 ml, 15 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y después a 50°C durante 2 días. Se diluyó con una mezcla de agua (30 ml) y ácido
10 clorhídrico 1 N (20 ml). Se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (50 ml) y se secó sobre sulfato magnésico. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en sílice (60 g), usando un gradiente de heptano/acetato de etilo desde 1:0 hasta 0:1 como eluyente para dar 2,08 g de 2-(4(tercbutoxicarbonilaminoxi)butil)isoindol-1,3-diona.
15 Etapa 2: Terc-butil éster del ácido N-(4-aminobutoxi)carbámico [0095]
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[0096] Se añadió una disolución de hidrato de hidrazina (1,0 ml, 20 mmol) a una
20 disolución de 2-(4-(tercbutoxicarbonilaminoxi)butil)isoindol-1,3-diona (2,08 g, 6,22 mmol) en etanol (8,0 ml). La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 65 h. El disolvente se eliminó a vacío. El residuo se disolvió en tolueno (10 ml) y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico 1 N (10 ml). La precipitación se eliminó por filtración y se lavó con agua (2 ml). El filtrado y los
25 líquidos de lavado se combinaron y se basificaron con carbonato potásico. La disolución se extrajo con diclorometano (4 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico. El disolvente se eliminó a vacío para dar 0,39 g de terc-butil éster del ácido N-(4-aminobutoxi)carbámico. Se añadió carbonato potásico (3 g) a la fase acuosa, que se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). Estas capas orgánicas
5 combinadas se secaron sobre sulfato magnésico. El disolvente se eliminó a vacío para dar otros 0,39 g de terc-butil éster del ácido N-(4-aminobutoxi)carbámico. Etapa 3: Terc-butil éster del ácido N-(4-(4-(mPEG20000il)butanoliamino)butoxi)carbámico [0097]
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[0098] Se disolvió el comercialmente disponible N-hidroxisuccinimida éster del ácido mPEG2000ilbutanoico (Nektar "mPEG-SBA", nº 2M450P01, 3 g, 0,15 mmol) en diclorometano (25 ml). Se añadió terc-butil éster del ácido N-(4aminobutoxi)carbámico (0,12 g, 0,59 mmol). La mezcla de reacción se agitó a
15 temperatura ambiente. Se añadió éter dietílico hasta que se obtuvo una precipitación. La precipitación se aisló mediante filtración. El material se secó a vacío para rendir 2,39 g de terc-butil éster del ácido N-(4-(4(mPEG20000il)butanoliamino)butoxi)carbámico. Etapa 4:
20 N-(4-Aminoxibutil)-4-(mPEG20000il)butanoliamida
[0099]
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[0100] Se añadió ácido trifluoroacético (20 ml) a una disolución de terc-butil éster del ácido N-(4-(4-(mPEG20000il)butanoliamino)butoxi)carbámico (2,39 g, 0,12 25 mmol) en diclorometano (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. Se añadió éter dietílico (100 ml). La precipitación formada se aisló mediante filtración. Se lavó con éter dietílico (2 x 100 ml) y se secó a vacío para dar 1,96 g de N-(4
aminoxibutil)-4-(mPEG20000il)butanoliamida. Etapa 5: [0101] Se disolvió 1-((((serinil)glutamil)alninil)glutamil)hIL-21 (4 mg, liofilizada en un tampón de fosfato, 252 nmol) en 0,400 ml de un tampón consistente en trietanolamina (0,008 ml) en agua (4 ml). Sucesivamente se añadieron una disolución de metionina (3,15 mg, 21420 nmol) en agua (0,12 ml) y una disolución de peryodato sódico (0,38 mg, 1890 nmol). La mezcla de reacción se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadió una disolución de N-(4-aminoxibutil)-4(mPEG20000il)butanoliamida (77 mg, 3.780 nmol) en agua (0,240 ml). El pH se ajustó a pH 4-5 con ácido acético glacial (0,004 ml). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla de reacción se diluyó con una disolución de trietanolamina (12 mg) en agua (3,2 ml) y se mantuvo a -18°C hasta su purificación. Química proteica [0102] La interleucina 21 recombinante (IL21) se expresó como cuerpos de inclusión en E. coli con una extensión N-terminal (Met-Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21). El residuo de Met N-terminal es eliminado por los sistemas de proteasa presentes en E. coli, dejando Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21. La secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Glu puede estar presente o ausente (nosotros iniciamos experimentos con Met-Ser-hIL21). [0103] La proteína se replegó y se purificó hasta un 90-95% de pureza usando procedimientos cromatográficos convencionales. [0104] La proteína pura fue subsiguientemente pegilada N-terminalmente mediante la reacción descrita en las etapas 1-5. [0105] La subsiguiente purificación se realizó usando una filtración en gel o una cromatografía de exclusión por tamaños (SEC). [0106] En un ensayo de proliferación, la IL21 pegilada mostró una potencia similar al estándar no pegilado, lo que indica que la pegilación no interfiere en la unión al receptor, y que los procedimientos de reacción no son perjudiciales para la proteína.
PROCEDIMIENTOS FARMACOLÓGICOS [0107] Ensayo de proliferación usando células Baf-3(IL21R). [0108] Se hacen crecer células Baf-3 dependientes de IL3 transfectadas con la IL21 R murina o humana, en un medio de cultivo que contiene IL-3 hasta el establecimiento de un ensayo de proliferación (preferiblemente 3 días). [0109] Las células usadas para el ensayo se lavan con medio sin IL3 y se colocan en placas de 96 pocillos con 50.000 c/p en medio de ensayo (sin IL-3). La IL21 se
añade en diluciones sucesivas desde 10-7 M-10-13 M y las células se incuban a 37°C, 5% de CO2. Se añade alamarBlue (Biosource) a los pocillos después de 66 horas de cultivo, y las células se incuban adicionalmente durante 6 horas. Si las células están creciendo, el alamarBlue se reduce y el color del medio cambia del azul al rojo. Entonces las placas se leen en un Fluostar (bmg) a 550 nm (excitación) y 590 nm (emisión) y se analizan mediante Prism (programa informático GrafPad). [0110] Una ref sobre las células Baf-3: Palacios, R. & Steinmetz, M. (1985) Cell 41 págs. 727-734.
Descripción de un estudio sobre PEG-hIL-21 PK en ratones [0111] El presente experimento es para administrar una única dosis de PEG20KhIL-21, PEG40K-hIL-21 y hIL-21 por vía intravenosa y subcutánea a ratones, con objeto de obtener la biodisponibilidad y las características farmacocinéticas de la PEGhIL-21.
Materiales y procedimientos [0112] En el experimento se incluyen cuarenta y ocho hembras C57BL/6Jbom que pesan aproximadamente 25 g, de Bomhoitgbrd, Ry, Dinamarca. [0113] Durante el estudio los animales se mantendrán y manipularán según el procedimiento normal de la unidad animal (Procedimiento Operativo Estándar nº 010364), y tendrán acceso libre a comida y agua.
Formulaciones de prueba [0114] hIL-21, PEG20k-hIL-21 y PEG40k-hIL-21 a una concentración de 200 μg/ml. Las sustancias de prueba se disolverán en PBS, pH 7,4.
Dosificación [0115] La sustancia de prueba se dosificarán según lo siguiente: 20 μg/25 g de ratón, correspondientes a 0,8 μg/g de peso de ratón. Las inyecciones i.v. se administrarán en la vena de la cola en un volumen de 0,1 ml.
Las inyecciones s.c. se administrarán en la parte posterior del cuello en un volumen de 0,1 ml.
Muestras sanguíneas [0116] Se recogerán muestras sanguíneas según el siguiente esquema: Después de la inyección intravenosa: Predosis, 5, 10, 20, 30, 45 (minutos), 1, 1,5, 2, 4 y 6 horas después de la dosificación. Después de la inyección subcutánea: Predosis, 10, 30 (minutos), 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación.
[0117] Las muestras sanguíneas se tomarán en el plexo venoso orbital. Se recogerán aproximadamente 0,1-0,2 ml de sangre en cada momento de muestreo. Se tomarán tres muestras sanguíneas de cada animal. En cada momento temporal se recogerán muestras sanguíneas de dos ratones.
5 [0118] Las muestras sanguíneas se recogerán en tubos de prueba Micronic y se mantendrán en hielo durante un máximo de 20 min antes de la centrifugación (1.200 m x g, 4°C, 10 min). Se transferirán 25 μl de muestra de plasma a tubos Micronic inmediatamente después de la centrifugación y se almacenarán a -20°C hasta su análisis.
10 Ensayo [0119] Se analizará el contenido en hIL-21 en las muestras de plasma mediante un inmunoensayo específico mediante Inmunoquímica, Novo Nordisk NS. [0120] Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se analizarán mediante procedimientos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales.
15
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un derivado de la IL-21 humana, que comprende:
    (i)
    un polipéptido de la IL-21 humana con al menos una identidad del 70% en la secuencia de aminoácidos con la secuencia mostrada en la Figura 1.
    (ii)
    una adición N-terminal a dicho polipéptido de IL-21 humana de 1 a 10 residuos de aminoácidos, que comprende al menos un residuo de Ser, Tyr, Lys o Cys; y
    (iii) uno o más grupos PEG unidos al N-terminal de dicho polipéptido de la IL-21 humana a través de dicho residuo de Ser, Tyr, Lys o Cys.
  2. 2.
    Un derivado de la IL-21 humana según la Reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de la IL-21 humana tiene al menos una identidad del 90% en la secuencia de aminoácidos con la secuencia mostrada en la Figura 1.
  3. 3.
    Un derivado según la Reivindicación 1 ó 2, en el que el uno o más grupos PEG tiene un peso de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa o 60 kDa, y es lineal o ramificado.
  4. 4.
    Un derivado según la Reivindicación 1 ó 2, en el que dicha adición N-terminal es un residuo de Ser.
  5. 5.
    Uso de un derivado de la IL-21 humana según cualquiera de las reivindicaciones previas para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer o de infecciones.
  6. 6.
    Un derivado de la IL-21 humana según cualquiera de las reivindicaciones previas para su uso en el tratamiento del cáncer o de infecciones.
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