JPH11242035A - 止血診断の新規な方法および診断剤 - Google Patents
止血診断の新規な方法および診断剤Info
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- JPH11242035A JPH11242035A JP10360662A JP36066298A JPH11242035A JP H11242035 A JPH11242035 A JP H11242035A JP 10360662 A JP10360662 A JP 10360662A JP 36066298 A JP36066298 A JP 36066298A JP H11242035 A JPH11242035 A JP H11242035A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 止血診断の新規な方法および診断剤の提供。
【解決手段】 血小板凝集、凝塊形成および／または凝
塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間の相互
作用、特にエネルギー転移を可能にし、または妨げるた
め、その相互作用の程度を測定することにより止血障害
の検出を可能とする。
塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間の相互
作用、特にエネルギー転移を可能にし、または妨げるた
め、その相互作用の程度を測定することにより止血障害
の検出を可能とする。
Description
【０００１】本発明は血小板凝集、凝塊形成および／ま
たは凝塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間
の相互作用、特にエネルギー伝達を可能にし、または妨
げるため、その相互作用の程度を測定することからなる
止血障害の検出方法、およびそのための診断剤に関す
る。
たは凝塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間
の相互作用、特にエネルギー伝達を可能にし、または妨
げるため、その相互作用の程度を測定することからなる
止血障害の検出方法、およびそのための診断剤に関す
る。
【０００２】血流は臓器に栄養分を供給し、血管系を通
って代謝産物を排泄する。したがって、それにも関わら
ず環境に対して密閉された開放血管系の維持はきわめて
重要である。これは対立する系の血液凝固およびフィブ
リン溶解（平衡時は「止血」と呼ばれる）の相互作用に
より可能になる。極端な場合これらの系の障害は血栓
症、すなわち故意でない血管系の閉塞、または出血性素
質、すなわち出血において臨床的に証明される。これら
の現象は臓器不全により死をもたらしうる。西洋では、
これらは主要な死亡原因の１つである。したがって、重
要な役割は後天性または遺伝性止血障害を検出する臨床
診断と結びついている。
って代謝産物を排泄する。したがって、それにも関わら
ず環境に対して密閉された開放血管系の維持はきわめて
重要である。これは対立する系の血液凝固およびフィブ
リン溶解（平衡時は「止血」と呼ばれる）の相互作用に
より可能になる。極端な場合これらの系の障害は血栓
症、すなわち故意でない血管系の閉塞、または出血性素
質、すなわち出血において臨床的に証明される。これら
の現象は臓器不全により死をもたらしうる。西洋では、
これらは主要な死亡原因の１つである。したがって、重
要な役割は後天性または遺伝性止血障害を検出する臨床
診断と結びついている。
【０００３】止血過程は血管（収縮および拡張）、細胞
（血管の内張りをなす内皮および／または血管内で浮遊
している血小板）および体液性因子の相互作用に基づい
ている。一次および二次凝固の区別は本過程の生理学的
連鎖に従ってなされる。一次凝固では細胞成分が支配
し、この凝固は血小板凝集物（一次凝塊）の形成をもた
らす。二次凝固では体液性因子が支配し、通常細胞成分
により開始する。これらの体液性因子はそれらの機能に
従って本質的に酵素、補因子および支持タンパク質に区
別されるタンパク質である。凝固が活性化されると、活
性または活性化した酵素はカスケード様反応系によりタ
ンパク質分解的にプロ酵素をそれらの活性形態に変換す
る。この活性はそれら自体が大抵タンパク質分解的に活
性化される補因子により高めることができる。最後の工
程として、その前駆体形態では可溶性である支持タンパ
ク質フィブリノーゲンは凝固酵素トロンビンによりその
不溶性産物、すなわちフィブリンに変換される。フィブ
リン凝塊（二次凝塊）はフィブリンの凝集および酵素的
架橋により形成される。一次および二次凝固は創傷の癒
合を促進する。しかしながら、病的状態では血流は故意
でなくブロックされ、これは臨床的に血栓症と呼ばれ
る。凝塊は同様の活性化酵素によりプロテアーゼプラス
ミンの活性化をもたらすフィブリン溶解系により溶解す
る。病的状態の過剰フィブリン溶解では、プラスミンは
まだ凝塊となっていないフィブリノーゲンを非特異的に
破壊し、完全な形の毛細血管系を壊して出血をもたら
す。
（血管の内張りをなす内皮および／または血管内で浮遊
している血小板）および体液性因子の相互作用に基づい
ている。一次および二次凝固の区別は本過程の生理学的
連鎖に従ってなされる。一次凝固では細胞成分が支配
し、この凝固は血小板凝集物（一次凝塊）の形成をもた
らす。二次凝固では体液性因子が支配し、通常細胞成分
により開始する。これらの体液性因子はそれらの機能に
従って本質的に酵素、補因子および支持タンパク質に区
別されるタンパク質である。凝固が活性化されると、活
性または活性化した酵素はカスケード様反応系によりタ
ンパク質分解的にプロ酵素をそれらの活性形態に変換す
る。この活性はそれら自体が大抵タンパク質分解的に活
性化される補因子により高めることができる。最後の工
程として、その前駆体形態では可溶性である支持タンパ
ク質フィブリノーゲンは凝固酵素トロンビンによりその
不溶性産物、すなわちフィブリンに変換される。フィブ
リン凝塊（二次凝塊）はフィブリンの凝集および酵素的
架橋により形成される。一次および二次凝固は創傷の癒
合を促進する。しかしながら、病的状態では血流は故意
でなくブロックされ、これは臨床的に血栓症と呼ばれ
る。凝塊は同様の活性化酵素によりプロテアーゼプラス
ミンの活性化をもたらすフィブリン溶解系により溶解す
る。病的状態の過剰フィブリン溶解では、プラスミンは
まだ凝塊となっていないフィブリノーゲンを非特異的に
破壊し、完全な形の毛細血管系を壊して出血をもたら
す。
【０００４】いわゆる古典的な方法、臨床化学的方法お
よび免疫化学的方法に分類される診断法は止血障害を検
出するための上記過程を調べるために使用される。古典
的な方法と呼ばれる診断法は凝塊形成の検出に基づいて
いる。凝固および／またはフィブリン溶解の活性化カス
ケードをある時点で活性化し、凝塊が形成または溶解す
るまでの時間を測定する方法が支配的である。正常な試
料と比較したこれらの凝固またはフィブリン溶解時間の
変化は活性化された構成部分、すなわちフィブリン凝集
物の形成または溶解までの反応カスケード部分において
生じた病理学的変化と関連した結論を引き出すことがで
きる。古典的な方法において、凝塊は通常機械的または
光学的検出法により検出される。
よび免疫化学的方法に分類される診断法は止血障害を検
出するための上記過程を調べるために使用される。古典
的な方法と呼ばれる診断法は凝塊形成の検出に基づいて
いる。凝固および／またはフィブリン溶解の活性化カス
ケードをある時点で活性化し、凝塊が形成または溶解す
るまでの時間を測定する方法が支配的である。正常な試
料と比較したこれらの凝固またはフィブリン溶解時間の
変化は活性化された構成部分、すなわちフィブリン凝集
物の形成または溶解までの反応カスケード部分において
生じた病理学的変化と関連した結論を引き出すことがで
きる。古典的な方法において、凝塊は通常機械的または
光学的検出法により検出される。
【０００５】機械的検出法は凝固する試料の上昇した粘
度またはフィブリン系の形成を利用する。例えば、球ま
たは動き回るノミを反応容器の底に入れ、容器に加えた
血液試料中で凝固をひき起こす。球または動き回るノミ
または容器を回転させ、この運動に必要な力を測定す
る。溶液の粘度が血小板凝集または凝塊形成により上昇
する場合、これは増加した抵抗として測定され、特定の
値以降は凝固開始とみなされる。他の方法（Schnitger
およびGrossの方法）では、フック形の電極を試料中に
浸漬し、一定の間隔でそれから取り出す。これに伴っ
て、試料中の電極への電流の供給はスイッチをつけた
り、切ったりして行なわれる。フィブリン系が形成され
る場合、可動電極はからみ合って電流の流れが維持され
る。これは凝固開始とみなされる。逆に、フィブリン溶
解が診断される場合、凝塊の溶解は相当する方法でフィ
ブリンの粘度または溶解の減少により検出される。古典
的な方法において、機械的検出方法は凝塊形成の生理学
的に重要な特性、すなわち創傷の機械的に安定な閉合を
示すという利点を有する。他方、この方法はこれらの特
殊な止血試験にだけ適した特殊な装置を要する。
度またはフィブリン系の形成を利用する。例えば、球ま
たは動き回るノミを反応容器の底に入れ、容器に加えた
血液試料中で凝固をひき起こす。球または動き回るノミ
または容器を回転させ、この運動に必要な力を測定す
る。溶液の粘度が血小板凝集または凝塊形成により上昇
する場合、これは増加した抵抗として測定され、特定の
値以降は凝固開始とみなされる。他の方法（Schnitger
およびGrossの方法）では、フック形の電極を試料中に
浸漬し、一定の間隔でそれから取り出す。これに伴っ
て、試料中の電極への電流の供給はスイッチをつけた
り、切ったりして行なわれる。フィブリン系が形成され
る場合、可動電極はからみ合って電流の流れが維持され
る。これは凝固開始とみなされる。逆に、フィブリン溶
解が診断される場合、凝塊の溶解は相当する方法でフィ
ブリンの粘度または溶解の減少により検出される。古典
的な方法において、機械的検出方法は凝塊形成の生理学
的に重要な特性、すなわち創傷の機械的に安定な閉合を
示すという利点を有する。他方、この方法はこれらの特
殊な止血試験にだけ適した特殊な装置を要する。
【０００６】光学的検出法は凝塊が形成した溶液の濁り
度の変化を測定する濁り試験を意味すると解される。フ
ィブリン凝塊に関する濁り信号は当業者に知られている
方法により、例えば粒子を加えて試料の光学濃度を増加
することにより、あるいは／またはイオン、例えばマン
ガン、鉄またはカルシウムイオンのような金属イオンを
加えてフィブリンの変性を強化することにより増幅する
ことができる。古典的な方法において、光学的検出法は
同様に光学的に測定することができる色素産生基質の変
換を意味するとは解されない。これは酵素活性を検出す
るが、血小板の凝集または、天然の支持タンパク質フィ
ブリノーゲンの変換を検出しないからである。
度の変化を測定する濁り試験を意味すると解される。フ
ィブリン凝塊に関する濁り信号は当業者に知られている
方法により、例えば粒子を加えて試料の光学濃度を増加
することにより、あるいは／またはイオン、例えばマン
ガン、鉄またはカルシウムイオンのような金属イオンを
加えてフィブリンの変性を強化することにより増幅する
ことができる。古典的な方法において、光学的検出法は
同様に光学的に測定することができる色素産生基質の変
換を意味するとは解されない。これは酵素活性を検出す
るが、血小板の凝集または、天然の支持タンパク質フィ
ブリノーゲンの変換を検出しないからである。
【０００７】ＥＰ ０ ０３９ ８８５は疎水性ラテック
ス粒子がフィブリンモノマー、すなわちまだ重合してい
ないフィブリンを検出するのに使用されることを報告し
ている。しかしながら、このような単純なラテックス粒
子は、ラテックス粒子の凝集がフィブリン凝塊そのもの
がもたらす光散乱と区別できない光散乱の増加をひき起
こすため凝塊を検出するのに適していない。光学的検出
法の利点は臨床化学分野で現在一般に使用されている自
動分析装置で測定することができるという点である。し
かしながら、光学的検出法は濁り度の測定に基づいてい
るため、機械的検出法と対照して、例えば高脂血症試料
の場合、試料の濁りは測定を妨害しうる。極端な場合、
例えば全血の場合、光学濃度による光学的検出はまった
く不可能である。これはこれらの光学的方法の重要な欠
点である。
ス粒子がフィブリンモノマー、すなわちまだ重合してい
ないフィブリンを検出するのに使用されることを報告し
ている。しかしながら、このような単純なラテックス粒
子は、ラテックス粒子の凝集がフィブリン凝塊そのもの
がもたらす光散乱と区別できない光散乱の増加をひき起
こすため凝塊を検出するのに適していない。光学的検出
法の利点は臨床化学分野で現在一般に使用されている自
動分析装置で測定することができるという点である。し
かしながら、光学的検出法は濁り度の測定に基づいてい
るため、機械的検出法と対照して、例えば高脂血症試料
の場合、試料の濁りは測定を妨害しうる。極端な場合、
例えば全血の場合、光学濃度による光学的検出はまった
く不可能である。これはこれらの光学的方法の重要な欠
点である。
【０００８】上記の慣用の古典的診断法の他に、臨床化
学的方法もまた止血診断において慣用的に使用される。
これらの方法は独立の、あるいは酵素および／または中
間体と組み合わせた（酵素的に結合した試験）特定の色
素産生基質の変換を利用して個々の酵素の活性を測定す
る。これらの測定法は血小板凝集物またはフィブリン凝
塊の形成とは無関係である。しかしながら、これらの方
法の欠点は生理学的に関連した反応、すなわち血小板凝
集物またはフィブリン凝塊の形成または溶解の障害、例
えば異常フィブリノーゲン血症、あるいはビタミンＫ欠
乏またはクマリンを用いた治療によるリン脂質表面を有
する凝固酵素の制限された反応性が検出されないという
ことである。
学的方法もまた止血診断において慣用的に使用される。
これらの方法は独立の、あるいは酵素および／または中
間体と組み合わせた（酵素的に結合した試験）特定の色
素産生基質の変換を利用して個々の酵素の活性を測定す
る。これらの測定法は血小板凝集物またはフィブリン凝
塊の形成とは無関係である。しかしながら、これらの方
法の欠点は生理学的に関連した反応、すなわち血小板凝
集物またはフィブリン凝塊の形成または溶解の障害、例
えば異常フィブリノーゲン血症、あるいはビタミンＫ欠
乏またはクマリンを用いた治療によるリン脂質表面を有
する凝固酵素の制限された反応性が検出されないという
ことである。
【０００９】免疫化学的方法は止血診断ではあまり一般
的ではない。この場合、この方法は機能障害の診断であ
り、また多くはないが重要な検出対象の分析物の量の測
定であるためである。にも関わらず、タンパク質分解作
用によるカスケード反応の分解生成物の免疫化学的検
出、またはプロテアーゼ／阻害剤複合体の検出は関連し
た系の現存する活性に関して結論を下すことができる。
これらの結論は鑑別診断において有用である。現在、止
血診断における免疫化学的方法の使用は主として調査研
究に限られている。
的ではない。この場合、この方法は機能障害の診断であ
り、また多くはないが重要な検出対象の分析物の量の測
定であるためである。にも関わらず、タンパク質分解作
用によるカスケード反応の分解生成物の免疫化学的検
出、またはプロテアーゼ／阻害剤複合体の検出は関連し
た系の現存する活性に関して結論を下すことができる。
これらの結論は鑑別診断において有用である。現在、止
血診断における免疫化学的方法の使用は主として調査研
究に限られている。
【００１０】本発明は現在の自動分析装置を使用して古
典的な機能的方法を行なうことができ、また試料の濁り
により生じる。光学的方法ではよくある干渉に関して抵
抗性があるため全血中での測定も行なうことができる新
規な検出方法を見い出すことを目的とする。本発明によ
れば、本目的は請求項１〜２７の何れかの項に記載の方
法または診断剤；特に血小板凝集、凝塊形成および／ま
たは凝塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間
の相互作用、特にエネルギー転移を可能にし、または妨
げるため、その相互作用の程度を測定することからなる
止血障害の検出方法により達成される。
典的な機能的方法を行なうことができ、また試料の濁り
により生じる。光学的方法ではよくある干渉に関して抵
抗性があるため全血中での測定も行なうことができる新
規な検出方法を見い出すことを目的とする。本発明によ
れば、本目的は請求項１〜２７の何れかの項に記載の方
法または診断剤；特に血小板凝集、凝塊形成および／ま
たは凝塊溶解の結果として各物質は互いに離れて物質間
の相互作用、特にエネルギー転移を可能にし、または妨
げるため、その相互作用の程度を測定することからなる
止血障害の検出方法により達成される。
【００１１】「止血障害」なる用語は凝固系、フィブリ
ン溶解系および補体系のすべての遺伝性または後天性障
害、特にこれらの系に関与する因子および調節遺伝子、
さらにこれらの因子および調節遺伝子の受容体の欠失ま
たは欠損を意味する。但し、これらの受容体が組織、組
織部分および／または細胞の存在により試験で使用され
るようになる限りにおいてである。血小板凝集、凝塊形
成および／または凝塊溶解の過程に関する結論は各物質
の相互作用の程度を測定することにより、例えば転移し
たエネルギーの量を直接または間接的に測定することに
より引き出すことができる。したがって、この方法が使
用される場合、古典的な機械的方法（凝塊形成または溶
解の生理学的過程の直接測定）および古典的な光学的止
血診断法（慣用の自動分析装置を使用する測定）の利点
を同時に考えられるそれらの欠点（例えば濁った試料の
干渉に対する感度）なしで組み合わせることができる。
したがって新規方法を使用してすべての試料、例えば止
血診断で慣用的に使われる血小板の少ない血漿、血小板
を多く含んだ血漿、または全血を測定することができ
る。
ン溶解系および補体系のすべての遺伝性または後天性障
害、特にこれらの系に関与する因子および調節遺伝子、
さらにこれらの因子および調節遺伝子の受容体の欠失ま
たは欠損を意味する。但し、これらの受容体が組織、組
織部分および／または細胞の存在により試験で使用され
るようになる限りにおいてである。血小板凝集、凝塊形
成および／または凝塊溶解の過程に関する結論は各物質
の相互作用の程度を測定することにより、例えば転移し
たエネルギーの量を直接または間接的に測定することに
より引き出すことができる。したがって、この方法が使
用される場合、古典的な機械的方法（凝塊形成または溶
解の生理学的過程の直接測定）および古典的な光学的止
血診断法（慣用の自動分析装置を使用する測定）の利点
を同時に考えられるそれらの欠点（例えば濁った試料の
干渉に対する感度）なしで組み合わせることができる。
したがって新規方法を使用してすべての試料、例えば止
血診断で慣用的に使われる血小板の少ない血漿、血小板
を多く含んだ血漿、または全血を測定することができ
る。
【００１２】全血は光学的方法において最大の干渉を示
す。存在する赤血球のため、光学濃度が非常に高いので
光学的に測定する現在入手できる装置での測定を行なう
ことができない。新規方法により測定されるような全血
試料中の凝固反応の進行は実際に影響を受けない。この
ため、治療時にまたは家庭での診断で全血試料を測定す
るのに新規方法を使用することができる。全血の凝固に
おいて一次および二次凝固は相互作用するため、新規方
法を使用して全過程を測定することができる。したがっ
て、新規方法は体液性因子の測定および細胞成分の凝固
または溶解活性の測定の両方において使用することがで
きる。
す。存在する赤血球のため、光学濃度が非常に高いので
光学的に測定する現在入手できる装置での測定を行なう
ことができない。新規方法により測定されるような全血
試料中の凝固反応の進行は実際に影響を受けない。この
ため、治療時にまたは家庭での診断で全血試料を測定す
るのに新規方法を使用することができる。全血の凝固に
おいて一次および二次凝固は相互作用するため、新規方
法を使用して全過程を測定することができる。したがっ
て、新規方法は体液性因子の測定および細胞成分の凝固
または溶解活性の測定の両方において使用することがで
きる。
【００１３】相当する臨床化学的および免疫化学的止血
診断法もまた新規方法に適合させることができるため、
新規方法によりただ１つの装置で止血診断全体を行なう
ことができる；例えば慣用の色素産生基質の代わりに、
有効にエネルギーを転移することができ、例えば適当な
酵素的に分解可能なペプチド鎖により結合した物質を使
用することができる（例えばWO 97／28261を参照）。こ
の場合、１種以上の物質を直接にまたは間接的に、例え
ば抗原／抗体またはアビジン／ビオチンのような結合系
によりペプチド鎖と結合させ、酵素反応を各物質とペプ
チド鎖との結合の前後に、またはこの結合と同時に行う
ことができる。
診断法もまた新規方法に適合させることができるため、
新規方法によりただ１つの装置で止血診断全体を行なう
ことができる；例えば慣用の色素産生基質の代わりに、
有効にエネルギーを転移することができ、例えば適当な
酵素的に分解可能なペプチド鎖により結合した物質を使
用することができる（例えばWO 97／28261を参照）。こ
の場合、１種以上の物質を直接にまたは間接的に、例え
ば抗原／抗体またはアビジン／ビオチンのような結合系
によりペプチド鎖と結合させ、酵素反応を各物質とペプ
チド鎖との結合の前後に、またはこの結合と同時に行う
ことができる。
【００１４】本明細書全体を通して、「物質」なる用語
は空間的に近接している時例えば光増感剤および化学発
光化合物（EP 0 515 194；Ullmanらの「臨床化学」，4
2,1518〜1526（1996年)）、光増感剤および発蛍光団（W
O 95／06877；BystrakらのAnal. Biochem. 225, 127〜1
34（1995年)）、放射性沃素125および発蛍光団（S．Ude
nfriendらのProc. Natl. Acad. Sci. 82, 8672〜8676
（1985年）)、発蛍光団および発蛍光団（Mathis, G.の
「臨床化学」，39，1953〜1959（1993年)）、または発
蛍光団およびケイ光消光剤（US 3,996,345）のようなエ
ネルギー供与体およびエネルギー受容体の形態で物質間
の相互作用に参加することができる生物学的物質および
／または化学物質の一員を意味すると解される。
は空間的に近接している時例えば光増感剤および化学発
光化合物（EP 0 515 194；Ullmanらの「臨床化学」，4
2,1518〜1526（1996年)）、光増感剤および発蛍光団（W
O 95／06877；BystrakらのAnal. Biochem. 225, 127〜1
34（1995年)）、放射性沃素125および発蛍光団（S．Ude
nfriendらのProc. Natl. Acad. Sci. 82, 8672〜8676
（1985年）)、発蛍光団および発蛍光団（Mathis, G.の
「臨床化学」，39，1953〜1959（1993年)）、または発
蛍光団およびケイ光消光剤（US 3,996,345）のようなエ
ネルギー供与体およびエネルギー受容体の形態で物質間
の相互作用に参加することができる生物学的物質および
／または化学物質の一員を意味すると解される。
【００１５】物質間の相互作用は特にエネルギー転移、
すなわち例えば光線または電子線による、あるいは反応
性化学分子による物質間の直接的なエネルギー転移を意
味すると解される。エネルギー転移は一方の物質から他
方の物質へ行われるが、異なる物質のカスケードにより
エネルギー転移を行うこともできる。さらに、「物質間
の相互作用」なる表現はまた、物質の活性が１種以上の
異なる物質により阻害または増加される過程、例えば酵
素活性の阻害または増加、あるいは影響を受けた物質が
発する光の阻害、増加または変化（例えば波長移動、偏
光）を包含する。
すなわち例えば光線または電子線による、あるいは反応
性化学分子による物質間の直接的なエネルギー転移を意
味すると解される。エネルギー転移は一方の物質から他
方の物質へ行われるが、異なる物質のカスケードにより
エネルギー転移を行うこともできる。さらに、「物質間
の相互作用」なる表現はまた、物質の活性が１種以上の
異なる物質により阻害または増加される過程、例えば酵
素活性の阻害または増加、あるいは影響を受けた物質が
発する光の阻害、増加または変化（例えば波長移動、偏
光）を包含する。
【００１６】「物質間の相互作用」なる表現はまた、酵
素カスケードを意味すると解される（US 4,663,278を参
照）。この場合、各物質は酵素であり、それらのうち少
なくとも１つは他の酵素に基質を供給し、血小板凝集、
凝塊形成および／または凝塊溶解の結果として、各酵素
は結合した基質の変換反応速度が最大または最小になる
ように互いに離れる。このように、例えば次の変法を行
うことができる； （ａ） 酵素Ｅ１（＝物質Ａ）は酵素Ｅ２（＝物質Ｂ）
に基質“ａ"を供給し、その基質は酵素Ｅ２により測定
可能な最終生成物または中間体“ｂ"に変換される。酵
素が溶液中に存在する場合、酵素Ｅ２に達する基質
“ａ"の拡散路は比較的長く、結果として“ｂ"への変換
反応の速度は遅い。酵素Ｅ１およびＥ２が例えば凝塊形
成または血小板凝集の結果として空間的に隣接している
場合、“ｂ"への変換反応の速度はより速くなる。
素カスケードを意味すると解される（US 4,663,278を参
照）。この場合、各物質は酵素であり、それらのうち少
なくとも１つは他の酵素に基質を供給し、血小板凝集、
凝塊形成および／または凝塊溶解の結果として、各酵素
は結合した基質の変換反応速度が最大または最小になる
ように互いに離れる。このように、例えば次の変法を行
うことができる； （ａ） 酵素Ｅ１（＝物質Ａ）は酵素Ｅ２（＝物質Ｂ）
に基質“ａ"を供給し、その基質は酵素Ｅ２により測定
可能な最終生成物または中間体“ｂ"に変換される。酵
素が溶液中に存在する場合、酵素Ｅ２に達する基質
“ａ"の拡散路は比較的長く、結果として“ｂ"への変換
反応の速度は遅い。酵素Ｅ１およびＥ２が例えば凝塊形
成または血小板凝集の結果として空間的に隣接している
場合、“ｂ"への変換反応の速度はより速くなる。
【００１７】（ｂ） 酵素Ｅ１（＝物質Ａ）およびＥ３
（＝物質Ｃ）は最初から空間的に近接している；例えば
これらは共に同じ粒子に結合している。酵素Ｅ１は酵素
Ｅ２（＝物質Ｂ）に基質を供給し、また酵素Ｅ２は酵素
Ｅ３に基質を供給する。本法は（ａ）と同様に進行し、
凝塊形成または血小板凝集の結果として３種の物質はす
べて空間的に近接する、あるいは凝塊溶解の結果として
空間的に近接していた配置が崩壊する。物質間の有効な
相互作用はこれらの物質が空間的に隣接している、すな
わち例えば数μmの距離範囲内、特に６００nm未満、好
ましくは４００nm未満、とりわけ好ましくは２００nm未
満の距離範囲内である場合に起こる。
（＝物質Ｃ）は最初から空間的に近接している；例えば
これらは共に同じ粒子に結合している。酵素Ｅ１は酵素
Ｅ２（＝物質Ｂ）に基質を供給し、また酵素Ｅ２は酵素
Ｅ３に基質を供給する。本法は（ａ）と同様に進行し、
凝塊形成または血小板凝集の結果として３種の物質はす
べて空間的に近接する、あるいは凝塊溶解の結果として
空間的に近接していた配置が崩壊する。物質間の有効な
相互作用はこれらの物質が空間的に隣接している、すな
わち例えば数μmの距離範囲内、特に６００nm未満、好
ましくは４００nm未満、とりわけ好ましくは２００nm未
満の距離範囲内である場合に起こる。
【００１８】新規方法の好ましい態様において、物質間
の相互作用は例えば ・短命分子、例えば一重項酸素（EP 0 515 194；Ullman
らのProc. Natl. Acad. Sci. 91, 5426〜5430（1994
年)；Ullmanらの「臨床化学」，42, 1518〜1526（1996
年), WO 95/06877およびBystrakらのAnal. Biochem. 22
5, 127〜134（1995年）を参照）、 ・短領域の放射線、例えば放射性β線（HartおよびGree
nwaldの「分子免疫学」，16, 265〜267（1979年）並び
にUdenfriendらのProc. Natl. Acad. Sci. 82,8672〜86
76（1985年）を参照）、および／または ・フェルスターのエネルギー転移（Mathis, G.の「臨床
化学」，39, 1953〜1959（1993年）; US 5,527,684） によりエネルギー転移として行われる。新規方法の他の
好ましい態様において、物質の活性は他の物質により増
加または阻害され、それにより測定可能な信号変化、例
えば放射光の強度または偏光の変化、酵素活性の阻害ま
たは増加、および／またはケイ光性の変化が生じる。
の相互作用は例えば ・短命分子、例えば一重項酸素（EP 0 515 194；Ullman
らのProc. Natl. Acad. Sci. 91, 5426〜5430（1994
年)；Ullmanらの「臨床化学」，42, 1518〜1526（1996
年), WO 95/06877およびBystrakらのAnal. Biochem. 22
5, 127〜134（1995年）を参照）、 ・短領域の放射線、例えば放射性β線（HartおよびGree
nwaldの「分子免疫学」，16, 265〜267（1979年）並び
にUdenfriendらのProc. Natl. Acad. Sci. 82,8672〜86
76（1985年）を参照）、および／または ・フェルスターのエネルギー転移（Mathis, G.の「臨床
化学」，39, 1953〜1959（1993年）; US 5,527,684） によりエネルギー転移として行われる。新規方法の他の
好ましい態様において、物質の活性は他の物質により増
加または阻害され、それにより測定可能な信号変化、例
えば放射光の強度または偏光の変化、酵素活性の阻害ま
たは増加、および／またはケイ光性の変化が生じる。
【００１９】新規方法はまた、少なくとも１種の物質が
非特異的に疎水性または静電的作用により、形成または
溶解する凝血塊の成分と結合することができる態様を包
含する。この結合は物質と形成または溶解する凝血塊の
成分との相互作用により直接的に、あるいは物質に結合
しており、天然に存在するまたは合成されるポリマー、
タンパク質、特にフィブリノーゲンのフラグメント、
糖、脂質またはペプチド、特にアミノ酸配列ＲＧＤを有
するペプチド、特に好ましくは粒子のような結合媒介成
分により形成または溶解する凝血塊と結合する物質を使
用して間接的に行うことができる。
非特異的に疎水性または静電的作用により、形成または
溶解する凝血塊の成分と結合することができる態様を包
含する。この結合は物質と形成または溶解する凝血塊の
成分との相互作用により直接的に、あるいは物質に結合
しており、天然に存在するまたは合成されるポリマー、
タンパク質、特にフィブリノーゲンのフラグメント、
糖、脂質またはペプチド、特にアミノ酸配列ＲＧＤを有
するペプチド、特に好ましくは粒子のような結合媒介成
分により形成または溶解する凝血塊と結合する物質を使
用して間接的に行うことができる。
【００２０】新規方法の特に有利な態様は１種以上の物
質が特定の相互作用により共有結合的におよび／または
吸着的に懸濁性粒子と結合し、そして／またはこれらの
粒子中に取り込まれ、またはそれら自体が懸濁性粒子も
しくはその一部を構成することを特徴とする。「懸濁性
粒子」なる用語は染料結晶、金属ゾル、シリカ粒子、磁
気粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン、タンパク質凝
集物、特に好ましくはラテックス粒子のような粒子を意
味すると解される。好ましくは、０.０１〜１０μmの直
径、特に好ましくは０.０５〜３μmの直径、とりわけ好
ましくは０.０５〜１μmの直径を有する粒子である。
質が特定の相互作用により共有結合的におよび／または
吸着的に懸濁性粒子と結合し、そして／またはこれらの
粒子中に取り込まれ、またはそれら自体が懸濁性粒子も
しくはその一部を構成することを特徴とする。「懸濁性
粒子」なる用語は染料結晶、金属ゾル、シリカ粒子、磁
気粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン、タンパク質凝
集物、特に好ましくはラテックス粒子のような粒子を意
味すると解される。好ましくは、０.０１〜１０μmの直
径、特に好ましくは０.０５〜３μmの直径、とりわけ好
ましくは０.０５〜１μmの直径を有する粒子である。
【００２１】共有結合の場合、物質は化学結合により粒
子、あるいは粒子を被覆するシェルまたは層に結合して
いる。物質はまた、例えば抗体、レクチン、受容体、ビ
オチン／アビジンまたは相補的ヌクレオチド鎖が媒介す
る特定の相互作用により粒子または粒子被膜と結合する
ことができる。一般に、吸着的結合は粒子または粒子被
膜と物質との疎水性、親水性または静電的相互作用によ
るものである。粒子被膜によっても形成されうる１個以
上の粒子のくぼみへの物質の取り込みもまた有効であ
る。
子、あるいは粒子を被覆するシェルまたは層に結合して
いる。物質はまた、例えば抗体、レクチン、受容体、ビ
オチン／アビジンまたは相補的ヌクレオチド鎖が媒介す
る特定の相互作用により粒子または粒子被膜と結合する
ことができる。一般に、吸着的結合は粒子または粒子被
膜と物質との疎水性、親水性または静電的相互作用によ
るものである。粒子被膜によっても形成されうる１個以
上の粒子のくぼみへの物質の取り込みもまた有効であ
る。
【００２２】新規方法はまた、粒子の製造後に粒子表面
が変性され、そして／または粒子が例えばタンパク質、
炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマ
ー、またはその混合物からなる１種以上の共有結合的に
または吸着的に結合した層またはシェルにより被覆さ
れ、それにより例えば懸濁液安定性、貯蔵安定性、形成
安定性、あるいは紫外線、微生物または破壊的作用を有
する他の薬剤に対する耐性に関する改善が達成される態
様を包含する。変性および被覆はまた、反応容器の表面
および試料成分、特にタンパク質（例えばアルブミンま
たは抗体）または細胞成分（例えばリン脂質または核
酸）の表面との非特異的結合を減少または妨止するのに
役立つことができる。さらに、変性および被覆は粒子表
面の疎水性または粒子の表面変化を増加または減少する
のに役立つことができる。
が変性され、そして／または粒子が例えばタンパク質、
炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマ
ー、またはその混合物からなる１種以上の共有結合的に
または吸着的に結合した層またはシェルにより被覆さ
れ、それにより例えば懸濁液安定性、貯蔵安定性、形成
安定性、あるいは紫外線、微生物または破壊的作用を有
する他の薬剤に対する耐性に関する改善が達成される態
様を包含する。変性および被覆はまた、反応容器の表面
および試料成分、特にタンパク質（例えばアルブミンま
たは抗体）または細胞成分（例えばリン脂質または核
酸）の表面との非特異的結合を減少または妨止するのに
役立つことができる。さらに、変性および被覆は粒子表
面の疎水性または粒子の表面変化を増加または減少する
のに役立つことができる。
【００２３】粒子表面をこのように変化させることによ
り、粒子と凝血塊成分の結合を改善し、この結合をより
選択的にすることができる。物質が形成または溶解する
過程の凝血塊の成分と特異的に結合することができると
いうことが新規方法の機能を果たすための重要な前提条
件である。使用される物質そのものがこの特性を有する
か、または結合媒介成分が必要かどうかは粒子に結合し
た物質の例を使用して下記のように説明される結合試験
により証明することができる：結合媒介成分として使用
するのに適した粒子は粒子と固定化フィブリン表面の結
合を調べることにより選択することができる。このよう
なフィブリン表面は例えばMassonおよびAngles-CanoのB
iochem. J. 256, 237〜244（1988年）に記載の方法によ
り製造することができ、簡単には次の通りである；塩化
ポリビニルレセプタクルを室温で２時間、０.１Ｍ重炭
酸ナトリウム緩衝液（pH９.５）中におけるグルタルア
ルデヒドの２.５％（v/v）溶液により予備活性化し、次
にフィブリノーゲン含有溶液（０.３μモル／Ｌ；１ミ
リモル／Ｌの塩化カルシウムを含有する０.１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７.４）中）を加える。例えば、
γ線照射により予備活性化された商業的に入手できる小
さなポリスチレン管または微小滴定プレートをタンパク
質被膜に使用する場合、使用する試験レセプタクルを直
接、フィブリノーゲン含有溶液と接触させることができ
る。数時間、通常は一晩（約１８時間）のインキュベー
ション後、非結合フィブリノーゲンは洗剤を含有する洗
浄緩衝液（例えばDade Behring Marburg GmbH Enzygnos
t Lineより入手）で洗浄することにより除去される。結
合したフィブリノーゲンはトロンビン（５０mMトリス−
ＨＣｌ中の１ ＮＩＨ単位／ml；１mM ＣａＣｌ2；pH７.
４；例えば試験トロンビン試薬；Dade Behring Marburg
GmbH製）を加えることによりフィブリンに変換され、
その後トロンビンは例えば０.５Ｍ ＮａＣｌ、８mM Ｃ
ａＣｌ2および０.０５％ツイーン２０を含有する溶液を
使用して洗浄することにより除去される。さらに、慣用
の洗剤を含有する洗浄緩衝液を使用する洗浄工程後、フ
ィブリン固相の遊離結合部位はウシ血清アルブミンの
０.２％（w/v）溶液で１回洗浄することにより飽和す
る。調査対象の粒子、例えば化学発光化合物を含有する
ラテックス粒子（化学発光剤粒子）と組み合わせた光増
感剤を含有するラテックス粒子（増感剤粒子）（「臨床
化学」，42，1518〜1526（1996年）を参照）のフィブリ
ン表面との結合は粒子を中性緩衝液（例えば５０mMトリ
ス−ＨＣｌ；０.９％ ＮａＣｌ；０.０５％ツイーン２
０；pH７.４）中の被覆された試験レセプタクルに加え
ることにより試験される。１０分間のインキュベーショ
ン後（調査する物質に応じてこれよりも短いまたは長い
インキュベーション時間もまた可能である）、フィブリ
ンで被覆された試験レセプタクルを同じ緩衝液で１回以
上洗浄し、そして洗浄した試験管に付着している増感剤
粒子と化学発光剤粒子との間のエネルギー転移を例えば
実施例１でより詳細に説明したように適当な測定装置で
測定する。フィブリノーゲンとも結合するという望まし
くない特性を有する粒子を除くため、高濃度のフィブリ
ノーゲンの存在下でインキュベートすることができる。
フィブリノーゲンと結合する粒子とフィブリンで被覆さ
れた表面の結合は５ｇ／Ｌの濃度まで加えられるフィブ
リノーゲンにより著しく減少し、そのため測定される信
号は極端に低下する。新規方法に適した他の結合媒介成
分もまた、この方法と同様にして見い出すことができ
る。
り、粒子と凝血塊成分の結合を改善し、この結合をより
選択的にすることができる。物質が形成または溶解する
過程の凝血塊の成分と特異的に結合することができると
いうことが新規方法の機能を果たすための重要な前提条
件である。使用される物質そのものがこの特性を有する
か、または結合媒介成分が必要かどうかは粒子に結合し
た物質の例を使用して下記のように説明される結合試験
により証明することができる：結合媒介成分として使用
するのに適した粒子は粒子と固定化フィブリン表面の結
合を調べることにより選択することができる。このよう
なフィブリン表面は例えばMassonおよびAngles-CanoのB
iochem. J. 256, 237〜244（1988年）に記載の方法によ
り製造することができ、簡単には次の通りである；塩化
ポリビニルレセプタクルを室温で２時間、０.１Ｍ重炭
酸ナトリウム緩衝液（pH９.５）中におけるグルタルア
ルデヒドの２.５％（v/v）溶液により予備活性化し、次
にフィブリノーゲン含有溶液（０.３μモル／Ｌ；１ミ
リモル／Ｌの塩化カルシウムを含有する０.１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７.４）中）を加える。例えば、
γ線照射により予備活性化された商業的に入手できる小
さなポリスチレン管または微小滴定プレートをタンパク
質被膜に使用する場合、使用する試験レセプタクルを直
接、フィブリノーゲン含有溶液と接触させることができ
る。数時間、通常は一晩（約１８時間）のインキュベー
ション後、非結合フィブリノーゲンは洗剤を含有する洗
浄緩衝液（例えばDade Behring Marburg GmbH Enzygnos
t Lineより入手）で洗浄することにより除去される。結
合したフィブリノーゲンはトロンビン（５０mMトリス−
ＨＣｌ中の１ ＮＩＨ単位／ml；１mM ＣａＣｌ2；pH７.
４；例えば試験トロンビン試薬；Dade Behring Marburg
GmbH製）を加えることによりフィブリンに変換され、
その後トロンビンは例えば０.５Ｍ ＮａＣｌ、８mM Ｃ
ａＣｌ2および０.０５％ツイーン２０を含有する溶液を
使用して洗浄することにより除去される。さらに、慣用
の洗剤を含有する洗浄緩衝液を使用する洗浄工程後、フ
ィブリン固相の遊離結合部位はウシ血清アルブミンの
０.２％（w/v）溶液で１回洗浄することにより飽和す
る。調査対象の粒子、例えば化学発光化合物を含有する
ラテックス粒子（化学発光剤粒子）と組み合わせた光増
感剤を含有するラテックス粒子（増感剤粒子）（「臨床
化学」，42，1518〜1526（1996年）を参照）のフィブリ
ン表面との結合は粒子を中性緩衝液（例えば５０mMトリ
ス−ＨＣｌ；０.９％ ＮａＣｌ；０.０５％ツイーン２
０；pH７.４）中の被覆された試験レセプタクルに加え
ることにより試験される。１０分間のインキュベーショ
ン後（調査する物質に応じてこれよりも短いまたは長い
インキュベーション時間もまた可能である）、フィブリ
ンで被覆された試験レセプタクルを同じ緩衝液で１回以
上洗浄し、そして洗浄した試験管に付着している増感剤
粒子と化学発光剤粒子との間のエネルギー転移を例えば
実施例１でより詳細に説明したように適当な測定装置で
測定する。フィブリノーゲンとも結合するという望まし
くない特性を有する粒子を除くため、高濃度のフィブリ
ノーゲンの存在下でインキュベートすることができる。
フィブリノーゲンと結合する粒子とフィブリンで被覆さ
れた表面の結合は５ｇ／Ｌの濃度まで加えられるフィブ
リノーゲンにより著しく減少し、そのため測定される信
号は極端に低下する。新規方法に適した他の結合媒介成
分もまた、この方法と同様にして見い出すことができ
る。
【００２４】新規方法の特に好ましい態様は光増感剤、
例えばアセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサント
ン、エオシン、９,１０−ジブロモアントラセン、クロ
ロフィル、バックミンスターフラーレン、メチレンブル
ー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタロシアニンお
よび／またはそれらの誘導体、並びに化学発光化合物、
例えばオレフィン、９−アルキリデンキサンタン、９−
アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、エノールエー
テル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセ
ン、アリールイミダゾールおよび／またはルシゲニンが
物質として使用され、そして光増感剤により発生する一
重項酸素は化学発光化合物を活性化して発光させること
ができる方法である。新規方法において、一重項酸素と
反応して、発光を伴って当業者に知られている試薬と反
応することができる中間体を生成するルミノールおよび
オキサレートエステルのような物質を使用することが好
ましい。
例えばアセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサント
ン、エオシン、９,１０−ジブロモアントラセン、クロ
ロフィル、バックミンスターフラーレン、メチレンブル
ー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタロシアニンお
よび／またはそれらの誘導体、並びに化学発光化合物、
例えばオレフィン、９−アルキリデンキサンタン、９−
アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、エノールエー
テル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセ
ン、アリールイミダゾールおよび／またはルシゲニンが
物質として使用され、そして光増感剤により発生する一
重項酸素は化学発光化合物を活性化して発光させること
ができる方法である。新規方法において、一重項酸素と
反応して、発光を伴って当業者に知られている試薬と反
応することができる中間体を生成するルミノールおよび
オキサレートエステルのような物質を使用することが好
ましい。
【００２５】一般に、化学発光化合物は３００nm以上の
波長領域で発光する。血漿のケイ光は５００nm領域で急
速に低下し、５５０nm以上の領域を無視することができ
る。本発明によれば、より長い波長の場合、化学発光化
合物を活性化した化学発光化合物により刺激され、より
長い波長で発光することができる発蛍光団（fluorophor
e）と接触させることもできる。適当な発蛍光団の例は
ローダミン、臭化エチジウム、５−ジメチルアミノ−１
−ナフタレンスルホニル、３−（２−チエノイル）−
１,１,１−トリフルオロアセトンとのユーロピウムキレ
ート化合物〔Ｅｕ(ＴＴＡ)3（ＴＴＡ＝３−（２−チエ
ノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン）〕、また
は２,２′−ジピリジルとのルテニウムキレート化合物
〔Ｒｕ(ｂｐｙ)3 ++（ｂｐｙ＝２,２′−ジピリジル）〕
である。
波長領域で発光する。血漿のケイ光は５００nm領域で急
速に低下し、５５０nm以上の領域を無視することができ
る。本発明によれば、より長い波長の場合、化学発光化
合物を活性化した化学発光化合物により刺激され、より
長い波長で発光することができる発蛍光団（fluorophor
e）と接触させることもできる。適当な発蛍光団の例は
ローダミン、臭化エチジウム、５−ジメチルアミノ−１
−ナフタレンスルホニル、３−（２−チエノイル）−
１,１,１−トリフルオロアセトンとのユーロピウムキレ
ート化合物〔Ｅｕ(ＴＴＡ)3（ＴＴＡ＝３−（２−チエ
ノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン）〕、また
は２,２′−ジピリジルとのルテニウムキレート化合物
〔Ｒｕ(ｂｐｙ)3 ++（ｂｐｙ＝２,２′−ジピリジル）〕
である。
【００２６】新規方法の他の好ましい態様は光増感剤お
よびケイ光化合物が物質として使用され、そして光増感
剤により発生する一重項酸素はケイ光化合物を活性化し
て発光させるか、または消光工程で発光を抑制すること
ができる方法である。好ましくは、特に一重項酸素との
反応の結果として光酸化、すなわち“光漂白”に付され
るケイ光化合物、例えば１,３−ジフェニルイソベンゾ
フラン、または光活性前駆体として一重項酸素と反応し
て発蛍光団を生成するケイ光化合物、例えばオキセンウ
ンベリフェリルエーテルまたはウンベリフェリルセレニ
ドが使用される新規方法である。さらに、新規方法に適
した粒子、光増感剤および化学発光またはケイ光化合物
の例については、特にEP 0 515 194，UllmanらのProc.
Natl. Acad. Sci. 91, 5426〜5430（1994年) およびUll
manらの「臨床化学」，42, 1518〜1526(1996年),WO 95/
06877を参照。
よびケイ光化合物が物質として使用され、そして光増感
剤により発生する一重項酸素はケイ光化合物を活性化し
て発光させるか、または消光工程で発光を抑制すること
ができる方法である。好ましくは、特に一重項酸素との
反応の結果として光酸化、すなわち“光漂白”に付され
るケイ光化合物、例えば１,３−ジフェニルイソベンゾ
フラン、または光活性前駆体として一重項酸素と反応し
て発蛍光団を生成するケイ光化合物、例えばオキセンウ
ンベリフェリルエーテルまたはウンベリフェリルセレニ
ドが使用される新規方法である。さらに、新規方法に適
した粒子、光増感剤および化学発光またはケイ光化合物
の例については、特にEP 0 515 194，UllmanらのProc.
Natl. Acad. Sci. 91, 5426〜5430（1994年) およびUll
manらの「臨床化学」，42, 1518〜1526(1996年),WO 95/
06877を参照。
【００２７】新規方法は例えば： ＊血漿凝固系因子、例えばフォン・ビルブラント因子、
外来系因子（因子＝Ｆ）、例えばＦVII、ＦＸ、ＦII、
ＦＶまたはプロテインＺ内在系因子、例えばＥXII、プ
レカリクレイン、高分子量キニノーゲン、ＦXI、ＦIXま
たはＦVIII、あるいは制御系因子、例えばアンチトロン
ビンIII、組織因子経路阻害物質、プロテインＣ、プロ
テインＳまたはＣ１阻害物質の遺伝子的に決定された、
そして／または後天性の欠失； ＊フィブリン溶解系因子、例えば組織プラスミノーゲン
活性化因子、尿プラスミノーゲン活性化因子、プラスミ
ノーゲン、α２−抗プラスミン、プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤１、２および３、またはトロンビン−活性
化可能なフィブリン溶解阻害物質の遺伝的に決定され
た、そして／または後天性の欠失； ＊血小板の遺伝的欠損、例えばベルナール・スリエール
（Bernard Soulier）症候群、グランツマン血小板無力
症、歯状体欠損（dense body deficiency）、α−顆粒
欠乏症またはトロンボキサン合成欠損； ＊後天性の止血障害、例えば尿毒症、骨髄増殖性疾患、
充実性腫瘍、貯蔵プール疾患または炎症、特に例えばプ
ロテインＣ系、アンチトロンビンIIIおよび／またはプ
ラスミノーゲン活性化因子、阻害剤１のタンパク質分解
的にまたは酸化的に変性されたタンパク質をもたらす炎
症のような疾患または疾患状態により起こるもの； ＊止血系の１種以上の成分の活性において影響を与える
治療剤、例えばヘパリン、クマリン誘導体、ヒルジン、
接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤またはＣ１
エステラーゼ阻害剤、血小板受容体に対するアスピリン
または抗体の投与により起こる後天性の止血障害；ある
いは ＊補体系の遺伝的および／または後天性欠損を検出する
のに使用することができる。
外来系因子（因子＝Ｆ）、例えばＦVII、ＦＸ、ＦII、
ＦＶまたはプロテインＺ内在系因子、例えばＥXII、プ
レカリクレイン、高分子量キニノーゲン、ＦXI、ＦIXま
たはＦVIII、あるいは制御系因子、例えばアンチトロン
ビンIII、組織因子経路阻害物質、プロテインＣ、プロ
テインＳまたはＣ１阻害物質の遺伝子的に決定された、
そして／または後天性の欠失； ＊フィブリン溶解系因子、例えば組織プラスミノーゲン
活性化因子、尿プラスミノーゲン活性化因子、プラスミ
ノーゲン、α２−抗プラスミン、プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤１、２および３、またはトロンビン−活性
化可能なフィブリン溶解阻害物質の遺伝的に決定され
た、そして／または後天性の欠失； ＊血小板の遺伝的欠損、例えばベルナール・スリエール
（Bernard Soulier）症候群、グランツマン血小板無力
症、歯状体欠損（dense body deficiency）、α−顆粒
欠乏症またはトロンボキサン合成欠損； ＊後天性の止血障害、例えば尿毒症、骨髄増殖性疾患、
充実性腫瘍、貯蔵プール疾患または炎症、特に例えばプ
ロテインＣ系、アンチトロンビンIIIおよび／またはプ
ラスミノーゲン活性化因子、阻害剤１のタンパク質分解
的にまたは酸化的に変性されたタンパク質をもたらす炎
症のような疾患または疾患状態により起こるもの； ＊止血系の１種以上の成分の活性において影響を与える
治療剤、例えばヘパリン、クマリン誘導体、ヒルジン、
接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤またはＣ１
エステラーゼ阻害剤、血小板受容体に対するアスピリン
または抗体の投与により起こる後天性の止血障害；ある
いは ＊補体系の遺伝的および／または後天性欠損を検出する
のに使用することができる。
【００２８】新規方法はまた、フィブリン凝塊の形成に
要する時間を測定するのに使用することができる。新規
方法の１態様において凝塊形成は血漿中でまたは少なく
ともフィブリノーゲンおよび／または血小板を含有する
培地で凝固を誘発する物質、 ＊例えばヘビ毒由来の酵素、トロンビンまたは他の活性
プロテアーゼのような酵素を加えることにより； ＊界面活性物質、例えばシリケートまたはフェノール誘
導体により； ＊活性化血小板または血小板を活性化する物質、例えば
トロンビン、コラーゲン、アドレナリンまたはアデノシ
ン二リン酸により； ＊凝固を促進する物質、例えば緩衝物質、塩化カルシウ
ムおよび／またはリン脂質を任意に添加することによ
り；あるいは ＊これらの物質を１種以上加えることにより誘発され
る。
要する時間を測定するのに使用することができる。新規
方法の１態様において凝塊形成は血漿中でまたは少なく
ともフィブリノーゲンおよび／または血小板を含有する
培地で凝固を誘発する物質、 ＊例えばヘビ毒由来の酵素、トロンビンまたは他の活性
プロテアーゼのような酵素を加えることにより； ＊界面活性物質、例えばシリケートまたはフェノール誘
導体により； ＊活性化血小板または血小板を活性化する物質、例えば
トロンビン、コラーゲン、アドレナリンまたはアデノシ
ン二リン酸により； ＊凝固を促進する物質、例えば緩衝物質、塩化カルシウ
ムおよび／またはリン脂質を任意に添加することによ
り；あるいは ＊これらの物質を１種以上加えることにより誘発され
る。
【００２９】新規方法は活性化部分トロンボプラスチン
時間（ＡＰＴＴ）、トロンボプラスチン時間（ＰＴ）、
プロテインＣ活性化時間（ＰＣＡＴ）、ラッセルマムシ
毒液時間（ＲＶＶＴ）またはトロンビン時間を測定する
ために使用することができる。活性化部分トロンボプラ
スチン時間（ＡＰＴＴ）は体液性凝固系の内因性経路障
害を示す。トロンボプラスチン時間は体液性凝固系の外
因性経路障害を示す（Colman RWらの「止血の概説」；C
olman RW, Hirsh J, Marder V.J, Salzman EW編の「止
血および血栓症」，J.B. Lippincott社，第３版，第３
〜18頁（1994年）を参照）。 これらの障害を測定する
ための試験はフィブリノーゲンをフィブリン凝塊に変換
するトロンビンの生成までの体液性凝固系の関連した分
枝のすべての成分を必要とするスクリーニング試験であ
る。
時間（ＡＰＴＴ）、トロンボプラスチン時間（ＰＴ）、
プロテインＣ活性化時間（ＰＣＡＴ）、ラッセルマムシ
毒液時間（ＲＶＶＴ）またはトロンビン時間を測定する
ために使用することができる。活性化部分トロンボプラ
スチン時間（ＡＰＴＴ）は体液性凝固系の内因性経路障
害を示す。トロンボプラスチン時間は体液性凝固系の外
因性経路障害を示す（Colman RWらの「止血の概説」；C
olman RW, Hirsh J, Marder V.J, Salzman EW編の「止
血および血栓症」，J.B. Lippincott社，第３版，第３
〜18頁（1994年）を参照）。 これらの障害を測定する
ための試験はフィブリノーゲンをフィブリン凝塊に変換
するトロンビンの生成までの体液性凝固系の関連した分
枝のすべての成分を必要とするスクリーニング試験であ
る。
【００３０】新規方法の好ましい態様では、フィブリン
溶解系因子を測定するために、測定対象の試料は例えば
欠失がある血漿と混合することにより、または尿プラス
ミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔＰＡ）、α 2−抗プラスミン、プラス
ミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１およ
び／またはXII因子、特にフィブリノーゲンのような精
製因子を加えることにより凝塊形成に必要な因子で置換
される。特に好ましい態様の新規方法では、自然溶解が
誘発されるか、あるいはXIIａ因子、ｔＰＡ、ｕＰＡま
たはストレプトキナーゼのような活性化剤を加えた後、
またはプラスミンを加えた直後に溶解が誘発される。
溶解系因子を測定するために、測定対象の試料は例えば
欠失がある血漿と混合することにより、または尿プラス
ミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｔＰＡ）、α 2−抗プラスミン、プラス
ミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１およ
び／またはXII因子、特にフィブリノーゲンのような精
製因子を加えることにより凝塊形成に必要な因子で置換
される。特に好ましい態様の新規方法では、自然溶解が
誘発されるか、あるいはXIIａ因子、ｔＰＡ、ｕＰＡま
たはストレプトキナーゼのような活性化剤を加えた後、
またはプラスミンを加えた直後に溶解が誘発される。
【００３１】本発明の特に好ましい態様において、フィ
ブリン凝塊の溶解が始まる時間は信号の増加により測定
される：血漿を凝固させる。凝塊は例えばプラスミンを
活性化する連鎖球菌由来の酵素であるストレプトキナー
ゼを加えることにより溶解させる。慣用の方法におい
て、この溶解は測定した信号の連続的な減少として見ら
れる。しかしながら、凝塊の溶解開始時間は光学的に測
定する装置が使用される場合、信号の減少が徐々に起こ
るため確定するのが困難である。驚くべきことに新規方
法では、溶解が始まると信号は急に、かつ非常に明らか
に増加する。これは加えたストレプトキナーゼが試験成
分を妨害するために起こるものではなく、ストレプトキ
ナーゼが、測定期間の開始時からずっと存在するからで
ある。この驚くべき効果は溶解の開始時間を非常に正確
に決定する新しい可能性をもたらす。これはフィブリン
溶解系の診断、例えば個々の因子および全体の系を測定
する、あるいはXIIａ因子、ｕＰＡまたはｔＰＡが媒介
するフィブリン溶解を測定する可能性にまで及ぶ（Bach
mann F.の「プラスミノーゲン−プラスミン酵素系」；Co
lman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW編の「止血
および血栓症」，J.B. Lippincott社， 第３版，第1592
〜1622頁（1994年))。以前は、特に凝固時間を測定する
ように溶解時間を正確に測定できなかったため、これは
達成されなかった。
ブリン凝塊の溶解が始まる時間は信号の増加により測定
される：血漿を凝固させる。凝塊は例えばプラスミンを
活性化する連鎖球菌由来の酵素であるストレプトキナー
ゼを加えることにより溶解させる。慣用の方法におい
て、この溶解は測定した信号の連続的な減少として見ら
れる。しかしながら、凝塊の溶解開始時間は光学的に測
定する装置が使用される場合、信号の減少が徐々に起こ
るため確定するのが困難である。驚くべきことに新規方
法では、溶解が始まると信号は急に、かつ非常に明らか
に増加する。これは加えたストレプトキナーゼが試験成
分を妨害するために起こるものではなく、ストレプトキ
ナーゼが、測定期間の開始時からずっと存在するからで
ある。この驚くべき効果は溶解の開始時間を非常に正確
に決定する新しい可能性をもたらす。これはフィブリン
溶解系の診断、例えば個々の因子および全体の系を測定
する、あるいはXIIａ因子、ｕＰＡまたはｔＰＡが媒介
するフィブリン溶解を測定する可能性にまで及ぶ（Bach
mann F.の「プラスミノーゲン−プラスミン酵素系」；Co
lman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW編の「止血
および血栓症」，J.B. Lippincott社， 第３版，第1592
〜1622頁（1994年))。以前は、特に凝固時間を測定する
ように溶解時間を正確に測定できなかったため、これは
達成されなかった。
【００３２】血小板の活性をそれらの凝集力により測定
する方法、特に血小板の凝集がアデノシン二リン酸、コ
ラーゲン、トロンビン、セロトニンまたはエピネフリン
のような物質、イオノホア、補体、あるいはストレプト
リシンにより誘発されうる方法もまた新規方法に包含さ
れる。他の態様の新規方法を使用して特に血液または血
漿の濃度、あるいは ＊ヘパリン、ｔＰＡ、アセチルサリチル酸、クマリン誘
導体、ヒルジンおよびストレプターゼ、 ＊血漿因子濃縮物、例えばプロトロンビン複合体、VIII
因子濃縮物またはｖＷＦ−含有因子濃縮物、 ＊血小板受容体に対する抗体、例えばＧＰ IIｂ／IIIａ
複合体、ＧＰ Ｉｂ／Ｖ／Ｘ複合体、セロトニン受容
体、アデノシン二リン酸受容体またはトロンビン受容
体、 ＊接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤またはＣ
１エステラーゼ阻害剤、 ＊凝固系の阻害剤、例えば不活性化VIIａ因子、組織ト
ロンボプラスチンに対する抗体、組織因子経路阻害物
質、アンチトロンビンIII、トロンボモジュリンまたは
活性化プロテインＣ、および ＊フィブリン凝集阻害物質のような薬剤の効能を測定す
ることができる。
する方法、特に血小板の凝集がアデノシン二リン酸、コ
ラーゲン、トロンビン、セロトニンまたはエピネフリン
のような物質、イオノホア、補体、あるいはストレプト
リシンにより誘発されうる方法もまた新規方法に包含さ
れる。他の態様の新規方法を使用して特に血液または血
漿の濃度、あるいは ＊ヘパリン、ｔＰＡ、アセチルサリチル酸、クマリン誘
導体、ヒルジンおよびストレプターゼ、 ＊血漿因子濃縮物、例えばプロトロンビン複合体、VIII
因子濃縮物またはｖＷＦ−含有因子濃縮物、 ＊血小板受容体に対する抗体、例えばＧＰ IIｂ／IIIａ
複合体、ＧＰ Ｉｂ／Ｖ／Ｘ複合体、セロトニン受容
体、アデノシン二リン酸受容体またはトロンビン受容
体、 ＊接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤またはＣ
１エステラーゼ阻害剤、 ＊凝固系の阻害剤、例えば不活性化VIIａ因子、組織ト
ロンボプラスチンに対する抗体、組織因子経路阻害物
質、アンチトロンビンIII、トロンボモジュリンまたは
活性化プロテインＣ、および ＊フィブリン凝集阻害物質のような薬剤の効能を測定す
ることができる。
【００３３】これらの方法はまた、例えばヘパリン、ｔ
ＰＡ、アセチルサリチル酸、クマリン誘導体、ヒルジ
ン、接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤または
Ｃ１エステラーゼ阻害剤、あるいは血小板受容体に対す
る抗体または血小板に関与するタンパク質、例えばヘパ
リン／血小板因子４複合体を治療的薬剤レベルでモニタ
ーするのに使用することができる。本発明はまた、血小
板凝集、凝塊形成および／または凝塊溶解の結果として
互いに離れて物質間の相互作用、特にエネルギー転移を
可能にし、または妨げ、その相互作用の程度を測定する
ことができる１種以上の物質を含有する診断剤を包含す
る。この診断剤は後天性または遺伝性止血障害を検出す
るのに使用することができる。さらに、本発明は様々な
態様の新規方法を実施するための診断剤を包含する。
ＰＡ、アセチルサリチル酸、クマリン誘導体、ヒルジ
ン、接触相阻害剤、例えばウシトリプシン阻害剤または
Ｃ１エステラーゼ阻害剤、あるいは血小板受容体に対す
る抗体または血小板に関与するタンパク質、例えばヘパ
リン／血小板因子４複合体を治療的薬剤レベルでモニタ
ーするのに使用することができる。本発明はまた、血小
板凝集、凝塊形成および／または凝塊溶解の結果として
互いに離れて物質間の相互作用、特にエネルギー転移を
可能にし、または妨げ、その相互作用の程度を測定する
ことができる１種以上の物質を含有する診断剤を包含す
る。この診断剤は後天性または遺伝性止血障害を検出す
るのに使用することができる。さらに、本発明は様々な
態様の新規方法を実施するための診断剤を包含する。
【００３４】添付図面を参照して次の実施例により本発
明を詳細に説明する。図１は慣用の濁り測定法（１−
ａ）および新規方法（１−ｂ）における正常血漿（Ｎ
Ｐ）および異常血漿（ＰＰ）のＡＰＴＴ反応の経過を示
す。それぞれのベースラインおよび凝塊形成ラインの交
点を測定することによる凝固時間の確認を図示する。図
２は新規方法による全血試料のＡＰＴＴの測定（Ａ）を
示す。比較のために、塩化カルシウムを加えない試験
（Ｂ）を行った。図３はフィブリン凝塊を溶解するため
にストレプトキナーゼを加えた時（Ａ）の慣用の濁り測
定法（３−ａ）および新規方法（３−ｂ）における正常
血漿のＡＰＴＴ反応の経過を示す。比較のために、スト
レプトキナーゼを加えない反応（Ｂ）の経過もまた示
す。凝塊形成時間はそれぞれ矢印で示す。
明を詳細に説明する。図１は慣用の濁り測定法（１−
ａ）および新規方法（１−ｂ）における正常血漿（Ｎ
Ｐ）および異常血漿（ＰＰ）のＡＰＴＴ反応の経過を示
す。それぞれのベースラインおよび凝塊形成ラインの交
点を測定することによる凝固時間の確認を図示する。図
２は新規方法による全血試料のＡＰＴＴの測定（Ａ）を
示す。比較のために、塩化カルシウムを加えない試験
（Ｂ）を行った。図３はフィブリン凝塊を溶解するため
にストレプトキナーゼを加えた時（Ａ）の慣用の濁り測
定法（３−ａ）および新規方法（３−ｂ）における正常
血漿のＡＰＴＴ反応の経過を示す。比較のために、スト
レプトキナーゼを加えない反応（Ｂ）の経過もまた示
す。凝塊形成時間はそれぞれ矢印で示す。
【００３５】次の実施例により新規方法を詳細に説明す
る：Ullmanらの「臨床化学」，42, 1518〜1526（1996
年）に記載の方法に従って粒子−結合物質を使用して最
も重要で基本的な止血診断試験を行った。これらの方法
はスクリーニング試験、さらに単一因子試験として様々
な形で使用されるが、結局いつも同じ基本原則、すなわ
ち測定可能な凝塊が形成するまで、またはこの凝塊が再
び溶解するまで経過する時間を測定するということに基
づいている。 特に断りがなければ、Dade Behring Marburg GmbHから
入手した試薬を止血試験で使用した。
る：Ullmanらの「臨床化学」，42, 1518〜1526（1996
年）に記載の方法に従って粒子−結合物質を使用して最
も重要で基本的な止血診断試験を行った。これらの方法
はスクリーニング試験、さらに単一因子試験として様々
な形で使用されるが、結局いつも同じ基本原則、すなわ
ち測定可能な凝塊が形成するまで、またはこの凝塊が再
び溶解するまで経過する時間を測定するということに基
づいている。 特に断りがなければ、Dade Behring Marburg GmbHから
入手した試薬を止血試験で使用した。
【００３６】
【実施例】実施例１ 増感剤および化学発光剤粒子の製
造 増感剤および化学発光剤粒子の製造はEP 0 515 194,
「臨床化学」，42, 1518-1526（1996年）およびProc. Nat
l. Acad. Sci. 91, 5426-5430（1994年）において詳細
に記載されている。粒子はデキストラン被膜を有し、例
えば、結合ストレプトアビジンであってよい（Proc. Na
tl. Acad. Sci. 91, 5426-5430（1994年）を参照）。あ
る増感剤および化学発光剤粒子の製造を下記の実施例に
より説明する（さらに詳しくはEP 0 515 194、 実施例８
を参照）： 増感剤粒子の製造：ベンジルアルコール中におけるクロ
ロフィルの溶液（１.０ml；０.６mM）を１０５℃に加熱
した８.０mlのベンジルアルコールに加えた。水中にお
けるラテックスビーズ（１７５nm、カルボキシル−修飾
ラテックス、Bange Laboratories,Carmel, IN）の懸濁
液（１０％、１.０ml）をベンジルアルコール溶液に加
えた。混合物を１０５℃で５分間撹拌し、室温まで冷却
した。１０mlのエタノールを加え、混合物を遠心分離し
た。ペレットを１：１の水／エタノール混合物（１０m
l）中で再懸濁し、もう１回遠心分離した。同じ工程を
水で繰り返して、ペレットを生理的食塩水に取った。
造 増感剤および化学発光剤粒子の製造はEP 0 515 194,
「臨床化学」，42, 1518-1526（1996年）およびProc. Nat
l. Acad. Sci. 91, 5426-5430（1994年）において詳細
に記載されている。粒子はデキストラン被膜を有し、例
えば、結合ストレプトアビジンであってよい（Proc. Na
tl. Acad. Sci. 91, 5426-5430（1994年）を参照）。あ
る増感剤および化学発光剤粒子の製造を下記の実施例に
より説明する（さらに詳しくはEP 0 515 194、 実施例８
を参照）： 増感剤粒子の製造：ベンジルアルコール中におけるクロ
ロフィルの溶液（１.０ml；０.６mM）を１０５℃に加熱
した８.０mlのベンジルアルコールに加えた。水中にお
けるラテックスビーズ（１７５nm、カルボキシル−修飾
ラテックス、Bange Laboratories,Carmel, IN）の懸濁
液（１０％、１.０ml）をベンジルアルコール溶液に加
えた。混合物を１０５℃で５分間撹拌し、室温まで冷却
した。１０mlのエタノールを加え、混合物を遠心分離し
た。ペレットを１：１の水／エタノール混合物（１０m
l）中で再懸濁し、もう１回遠心分離した。同じ工程を
水で繰り返して、ペレットを生理的食塩水に取った。
【００３７】化学発光剤粒子（＝受容体粒子）の製造：
２０mlのカルボキシル−修飾ラテックス粒子懸濁液（水
中の１０％懸濁液）を２０mlの２−エトキシエタノール
と混合した。混合物を９０℃に加熱した。２−エトキシ
エタノール中における１０mMジオキセン、３−（２−チ
エノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン剤との２
０mMユーロピウムキレート（Kodak, CAS＃14054-87-6）
（ＥｕＴＴＡ）および６０mMトリオクチルホスフィンオ
キシド（ＴＯＰＯ）の溶液２０mlを粒子懸濁液に加え
た。混合物をさらに７分間、９７℃に加熱した。それを
室温まで冷却した後、４０mlのエタノールを加え、混合
物を遠心分離した。次に、ペレットを８０％エタノール
中で再懸濁し、遠心分離した。この洗浄工程を１０％エ
タノールで繰り返した。最後に、粒子を生理的食塩水に
取った。
２０mlのカルボキシル−修飾ラテックス粒子懸濁液（水
中の１０％懸濁液）を２０mlの２−エトキシエタノール
と混合した。混合物を９０℃に加熱した。２−エトキシ
エタノール中における１０mMジオキセン、３−（２−チ
エノイル）−１,１,１−トリフルオロアセトン剤との２
０mMユーロピウムキレート（Kodak, CAS＃14054-87-6）
（ＥｕＴＴＡ）および６０mMトリオクチルホスフィンオ
キシド（ＴＯＰＯ）の溶液２０mlを粒子懸濁液に加え
た。混合物をさらに７分間、９７℃に加熱した。それを
室温まで冷却した後、４０mlのエタノールを加え、混合
物を遠心分離した。次に、ペレットを８０％エタノール
中で再懸濁し、遠心分離した。この洗浄工程を１０％エ
タノールで繰り返した。最後に、粒子を生理的食塩水に
取った。
【００３８】実施例２ 慣用の方法（濁り測定）および
新規方法における活性化部分トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）の測定 慣用の方法：正常血漿（対照血漿Ｎ：製造番号ＯＲＫ
Ｅ）および異常血漿（Pathoplasms II; 製造番号ＯＴＸ
Ｋ）のゾールをパスロムチンＳＬ（製造番号ＯＱＧＳ）
を使用して慣用の光学的に測定する自動凝固装置（Behr
ing CoagulafionTimer; ＢＣＴ）で同時に測定した。こ
のために、５０μｌの試料を５０μｌのパスロムチンＳ
Ｌと混合し、３７℃で２分間インキュベートした後、５
０μｌの２５mM塩化カルシウム（製造番号ＯＲＨＯ）溶
液を加えることにより凝固を開始した。
新規方法における活性化部分トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）の測定 慣用の方法：正常血漿（対照血漿Ｎ：製造番号ＯＲＫ
Ｅ）および異常血漿（Pathoplasms II; 製造番号ＯＴＸ
Ｋ）のゾールをパスロムチンＳＬ（製造番号ＯＱＧＳ）
を使用して慣用の光学的に測定する自動凝固装置（Behr
ing CoagulafionTimer; ＢＣＴ）で同時に測定した。こ
のために、５０μｌの試料を５０μｌのパスロムチンＳ
Ｌと混合し、３７℃で２分間インキュベートした後、５
０μｌの２５mM塩化カルシウム（製造番号ＯＲＨＯ）溶
液を加えることにより凝固を開始した。
【００３９】活性化部分トロンボプラスチン時間は製造
業者の取扱説明書に従ってカオリン活性剤（製造番号Ｏ
ＴＸＣおよびリン脂質（製造番号ＯＴＸＢ）から製造し
たパスロムチン作用液、並びに２５ミリモル／Ｌの塩化
カルシウム（製造番号ＯＲＨＯ）溶液を使用して新規方
法で測定した。測定は光度計を使用して行った。測定単
位を６７０nmダイオードレーザー（３０mWの光源）およ
び光子計数ユニット（Hamamatsu R4632光電子増倍管）
に合わせた。５５０nm〜６５０nmの光をさらに測定でき
る短波長通過フィルターおよび長波長通過フィルターか
らなる組み合わせフィルターを光電子増倍管の前に置い
た。全体のシステムを周囲の光から保護した。典型的な
測定手順は光源を使用して照明する期間および測定物質
が放出する光子がカウントされる第２段階からなる。こ
の測定手順はその間に測定物質が観察される所望の時間
に応じて必要な回数繰り返すことができる。照明時間は
典型的に０.１〜３秒である。測定時間もまた同じ範囲
内である。照明または測定のない段階は２つの測定手順
の間に入れることができ、その段階は必要な測定点の数
に応じて選択することができる。さらに粒子に結合した
物質、すなわち: ・化学発光剤粒子＝受容体粒子：２.５mg／ml、生理的
食塩水中； ・増感剤粒子：２.５mg／ml、生理的食塩水中を本発明
に従って使用した。
業者の取扱説明書に従ってカオリン活性剤（製造番号Ｏ
ＴＸＣおよびリン脂質（製造番号ＯＴＸＢ）から製造し
たパスロムチン作用液、並びに２５ミリモル／Ｌの塩化
カルシウム（製造番号ＯＲＨＯ）溶液を使用して新規方
法で測定した。測定は光度計を使用して行った。測定単
位を６７０nmダイオードレーザー（３０mWの光源）およ
び光子計数ユニット（Hamamatsu R4632光電子増倍管）
に合わせた。５５０nm〜６５０nmの光をさらに測定でき
る短波長通過フィルターおよび長波長通過フィルターか
らなる組み合わせフィルターを光電子増倍管の前に置い
た。全体のシステムを周囲の光から保護した。典型的な
測定手順は光源を使用して照明する期間および測定物質
が放出する光子がカウントされる第２段階からなる。こ
の測定手順はその間に測定物質が観察される所望の時間
に応じて必要な回数繰り返すことができる。照明時間は
典型的に０.１〜３秒である。測定時間もまた同じ範囲
内である。照明または測定のない段階は２つの測定手順
の間に入れることができ、その段階は必要な測定点の数
に応じて選択することができる。さらに粒子に結合した
物質、すなわち: ・化学発光剤粒子＝受容体粒子：２.５mg／ml、生理的
食塩水中； ・増感剤粒子：２.５mg／ml、生理的食塩水中を本発明
に従って使用した。
【００４０】次の試料を測定した：１プールの正常血漿
（対照血漿Ｐ、製造番号ＯＵＰＺ）、ビタミンＫ−依存
性凝固酵素を吸収することにより調製される２−プール
の異常血漿（pathoplasma1, 製造番号ＯＲＸＫ；pathop
lasma II, 製造番号ＯＴＸＬ）、すべての凝固因子を希
釈することにより調製された１プールの異常血漿（対照
血漿Ｐ；製造番号ＯＵＰＺ）、さらに健康な献血者から
採取した血清。試薬を使用前に＋３７℃に加温した。試
験を行うために、次の成分を混合した： ２００μｌの試料 １００μｌの受容体粒子 ２５μｌの増感剤粒子 ２００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、２
００μｌの２５mM塩化カルシウム溶液を加えることによ
り凝固を開始した。信号を所定の時間記録した。
（対照血漿Ｐ、製造番号ＯＵＰＺ）、ビタミンＫ−依存
性凝固酵素を吸収することにより調製される２−プール
の異常血漿（pathoplasma1, 製造番号ＯＲＸＫ；pathop
lasma II, 製造番号ＯＴＸＬ）、すべての凝固因子を希
釈することにより調製された１プールの異常血漿（対照
血漿Ｐ；製造番号ＯＵＰＺ）、さらに健康な献血者から
採取した血清。試薬を使用前に＋３７℃に加温した。試
験を行うために、次の成分を混合した： ２００μｌの試料 １００μｌの受容体粒子 ２５μｌの増感剤粒子 ２００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、２
００μｌの２５mM塩化カルシウム溶液を加えることによ
り凝固を開始した。信号を所定の時間記録した。
【００４１】凝固時間はそれぞれ反応曲線のベースライ
ンおよび最初の１０秒について一次回帰を行うことによ
り新規方法で得られた曲線から確認した。これらの２つ
の線が交差する点を凝固時間とした（１−ｂを参照）。 結果：表１から、新規方法で測定された血漿凝固時間は
古典的（機械的および光学的）方法を使用して製造業者
により確認された所望値範囲内であることがわかる。血
清に関して信号は得られなかった。凝固系の各部分の凝
固酵素は血清中で活性であるが、フィブリン凝塊は除去
されていた。このことは、新規方法ではそれは凝塊形成
であり、信号の発生に寄与する添加試薬における凝固酵
素のある特定の効果ではないことを示している。
ンおよび最初の１０秒について一次回帰を行うことによ
り新規方法で得られた曲線から確認した。これらの２つ
の線が交差する点を凝固時間とした（１−ｂを参照）。 結果：表１から、新規方法で測定された血漿凝固時間は
古典的（機械的および光学的）方法を使用して製造業者
により確認された所望値範囲内であることがわかる。血
清に関して信号は得られなかった。凝固系の各部分の凝
固酵素は血清中で活性であるが、フィブリン凝塊は除去
されていた。このことは、新規方法ではそれは凝塊形成
であり、信号の発生に寄与する添加試薬における凝固酵
素のある特定の効果ではないことを示している。
【００４２】表１ 商業的に入手できる様々な血漿についての古典的（機械
的および光学的）方法を使用して製造業者により確認さ
れた所望値と比べた新規方法（ＣＥＣＡ）で得られたＡ
ＰＴＴ凝固時間。値は秒である。
的および光学的）方法を使用して製造業者により確認さ
れた所望値と比べた新規方法（ＣＥＣＡ）で得られたＡ
ＰＴＴ凝固時間。値は秒である。
【表１】
【００４３】実施例３ 慣用の方法（濁り測定）および
新規方法におけるトロンボプラスチン時間（ＰＴ）の測
定 ＰＴは製造業者の取扱説明書に従ってトロンボレルＳ
（製造番号ＯＵＨＰ）および実施例２で挙げた試料を使
用し、古典的な光学的方法の場合は光学的に測定する凝
固装置、そして新規方法の場合は光度計により測定し
た。ＢＣＴ（濁り測定）において、５０μｌの異常血漿
Ｉまたは異常血漿IIをそれぞれ測定室にピペットで移
し、１００μｌのトロンボレルＳを加えることにより凝
固を開始した。光度計において、試験を行うために、次
の成分を混合した： ２００μｌの試料 １００μｌの受容体粒子 ２５μｌの増感剤粒子 ４００μｌのトロンボレルＳを加えることにより凝固を
開始した。信号を所定の時間記録した。濁りの増加は慣
用の方法で測定し、化学発光の増加は新規方法で測定し
たが、反応の経過は実質的に同一であることがわかっ
た。新規方法による反応の経過を実施例２に記載のよう
にして分析した。慣用の方法で予想される、製造業者の
情報による凝固時間と比べた結果を表２に示す。実施例
２と同様に、よく一致した。実施例２で挙げた理由によ
り、試料として血清を使うと測定信号の変化はなかっ
た。
新規方法におけるトロンボプラスチン時間（ＰＴ）の測
定 ＰＴは製造業者の取扱説明書に従ってトロンボレルＳ
（製造番号ＯＵＨＰ）および実施例２で挙げた試料を使
用し、古典的な光学的方法の場合は光学的に測定する凝
固装置、そして新規方法の場合は光度計により測定し
た。ＢＣＴ（濁り測定）において、５０μｌの異常血漿
Ｉまたは異常血漿IIをそれぞれ測定室にピペットで移
し、１００μｌのトロンボレルＳを加えることにより凝
固を開始した。光度計において、試験を行うために、次
の成分を混合した： ２００μｌの試料 １００μｌの受容体粒子 ２５μｌの増感剤粒子 ４００μｌのトロンボレルＳを加えることにより凝固を
開始した。信号を所定の時間記録した。濁りの増加は慣
用の方法で測定し、化学発光の増加は新規方法で測定し
たが、反応の経過は実質的に同一であることがわかっ
た。新規方法による反応の経過を実施例２に記載のよう
にして分析した。慣用の方法で予想される、製造業者の
情報による凝固時間と比べた結果を表２に示す。実施例
２と同様に、よく一致した。実施例２で挙げた理由によ
り、試料として血清を使うと測定信号の変化はなかっ
た。
【００４４】表２ 商業的に入手できる様々な血漿についての古典的（機械
的および光学的）方法を使用して製造業者により確認さ
れた所望値と比べた新規方法（ＣＥＣＡ）で得られたＰ
Ｔ凝固時間。値は秒である。
的および光学的）方法を使用して製造業者により確認さ
れた所望値と比べた新規方法（ＣＥＣＡ）で得られたＰ
Ｔ凝固時間。値は秒である。
【表２】
【００４５】実施例４ 全血中凝固の測定 試料の光学濃度が高すぎるため、慣用の光学測定器では
全血の凝固時間を測定することができない。新規方法に
おいて、全血試料についてのＡＰＴＴの反応曲線を次の
ようにして記録した：試薬を使用前に＋３７℃に加温し
た。試験を行うために、次の成分を混合した： １００μｌの試料（クエン酸塩添加血液） ５０μｌの受容体粒子 １２.５μｌの増感剤粒子 １００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、１
００μｌの２５mM塩化カルシウム溶液または生理的食塩
水を加えることにより凝固を開始した。これらの信号を
所定の時間記録した。結果を図２に示す。塩化カルシウ
ムを加えない（その結果凝固反応が起こらない）で得ら
れた反応曲線（Ｂ）を比較のために示す。この実施例に
より凝塊の形成により起こるが、例えば非特異的な副反
応により誘発されない凝固に関する典型的な反応曲線は
全血が試料として使用される時もまた得られることがわ
かる。さらに、全血試料に適用可能なため、新規方法は
濁りによる試料干渉に関して慣用の方法より抵抗性があ
ることがわかる。
全血の凝固時間を測定することができない。新規方法に
おいて、全血試料についてのＡＰＴＴの反応曲線を次の
ようにして記録した：試薬を使用前に＋３７℃に加温し
た。試験を行うために、次の成分を混合した： １００μｌの試料（クエン酸塩添加血液） ５０μｌの受容体粒子 １２.５μｌの増感剤粒子 １００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、１
００μｌの２５mM塩化カルシウム溶液または生理的食塩
水を加えることにより凝固を開始した。これらの信号を
所定の時間記録した。結果を図２に示す。塩化カルシウ
ムを加えない（その結果凝固反応が起こらない）で得ら
れた反応曲線（Ｂ）を比較のために示す。この実施例に
より凝塊の形成により起こるが、例えば非特異的な副反
応により誘発されない凝固に関する典型的な反応曲線は
全血が試料として使用される時もまた得られることがわ
かる。さらに、全血試料に適用可能なため、新規方法は
濁りによる試料干渉に関して慣用の方法より抵抗性があ
ることがわかる。
【００４６】新規方法が試料または試薬に存在する非特
異的な濁りによる干渉に対して感受性が低いという事実
はすでに実施例２からわかっている。この実施例におい
て、内因性凝固系の接触相活性剤としてカオリン（パス
ロムチン）が使用されるＡＰＴＴの測定は光度計で行っ
た。カオリンは銀薄片状のクレー層鉱物である。これら
の薄片は高度の光散乱をひき起こすため、光学測定器で
この試薬を使うことはできない。このため、光学測定器
用として特別に開発された別の接触相活性剤であるパス
ロムチンＳＬを光学測定器で使用した。パスロムチンＳ
Ｌは非特異的光散乱がまだ許容される二酸化ケイ素の微
細粒子からなる。
異的な濁りによる干渉に対して感受性が低いという事実
はすでに実施例２からわかっている。この実施例におい
て、内因性凝固系の接触相活性剤としてカオリン（パス
ロムチン）が使用されるＡＰＴＴの測定は光度計で行っ
た。カオリンは銀薄片状のクレー層鉱物である。これら
の薄片は高度の光散乱をひき起こすため、光学測定器で
この試薬を使うことはできない。このため、光学測定器
用として特別に開発された別の接触相活性剤であるパス
ロムチンＳＬを光学測定器で使用した。パスロムチンＳ
Ｌは非特異的光散乱がまだ許容される二酸化ケイ素の微
細粒子からなる。
【００４７】実施例５ 新規方法におけるフィブリン溶
解活性の測定 フィブリン溶解活性を測定するために、正常血漿（対照
血漿Ｎ、製造番号ＯＲＫＥ）および全血試料を新規方法
により、実施例２および４に記載のようにしてＡＰＴＴ
において凝固した。凝固が起こると同時に、形成した凝
塊の溶解もまたストレプトキナーゼ含有溶液（１００IU
／mlの生理的食塩水；Hoechst. MarionRousselから入
手）を加えることにより誘発した。ストレプトキナーゼ
はプラスミノーゲンと一緒に活性複合体に加わる連鎖球
菌酵素である。この複合体は試料のプラスミノーゲン酵
素を活性化してプラスミンを生成し、それはフィブリノ
ーゲンおよびフィブリン凝塊をタンパク質分解的に溶解
する。慣用の光学的方法において、これは測定信号の低
下を継続的にもたらす(３−ａ)を参照)。試薬を使用前
に＋３７℃に加温した。試験を行うために、次の成分を
混合した： １００μｌの試料（対照血漿Ｎ、ＯＲＫＥ） ５０μｌの受容体粒子 １２.５μｌの増感剤粒子 １００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、
７.２μｌのストレプトキナーゼ溶液（１００IU／mlの
生理的食塩水）、１００μｌの２５mM塩化カルシウム溶
液を加えることにより凝固を開始した。信号を所定の時
間記録した（３−ｂを参照）。
解活性の測定 フィブリン溶解活性を測定するために、正常血漿（対照
血漿Ｎ、製造番号ＯＲＫＥ）および全血試料を新規方法
により、実施例２および４に記載のようにしてＡＰＴＴ
において凝固した。凝固が起こると同時に、形成した凝
塊の溶解もまたストレプトキナーゼ含有溶液（１００IU
／mlの生理的食塩水；Hoechst. MarionRousselから入
手）を加えることにより誘発した。ストレプトキナーゼ
はプラスミノーゲンと一緒に活性複合体に加わる連鎖球
菌酵素である。この複合体は試料のプラスミノーゲン酵
素を活性化してプラスミンを生成し、それはフィブリノ
ーゲンおよびフィブリン凝塊をタンパク質分解的に溶解
する。慣用の光学的方法において、これは測定信号の低
下を継続的にもたらす(３−ａ)を参照)。試薬を使用前
に＋３７℃に加温した。試験を行うために、次の成分を
混合した： １００μｌの試料（対照血漿Ｎ、ＯＲＫＥ） ５０μｌの受容体粒子 １２.５μｌの増感剤粒子 １００μｌのパスロムチン作用液。 次に、混合物を＋３７℃で２分間インキュベートし、
７.２μｌのストレプトキナーゼ溶液（１００IU／mlの
生理的食塩水）、１００μｌの２５mM塩化カルシウム溶
液を加えることにより凝固を開始した。信号を所定の時
間記録した（３−ｂを参照）。
【００４８】初期の凝塊形成の結果として、測定された
信号は実施例２〜４に記載のように初めは増加する。比
較のために、ストレプトキナーゼを加えない相当する曲
線を３−ｂに示し、“Ｂ”と表した。しかしながら、ス
トレプトキナーゼが存在すると、測定信号は突然増加
し、その増加は凝塊の溶解が始まると、全血試料中より
も血漿中の方がより顕著である。この信号は時間が経つ
につれてゆっくり低下した。これは以前に明らかにされ
ていない効果である。ストレプトキナーゼは最初から存
在し、凝塊形成が始まるまで反応の経過に変化がないの
で、この突然の信号増加はストレプトキナーゼ溶液中の
副反応によりひき起こされたものではない。
信号は実施例２〜４に記載のように初めは増加する。比
較のために、ストレプトキナーゼを加えない相当する曲
線を３−ｂに示し、“Ｂ”と表した。しかしながら、ス
トレプトキナーゼが存在すると、測定信号は突然増加
し、その増加は凝塊の溶解が始まると、全血試料中より
も血漿中の方がより顕著である。この信号は時間が経つ
につれてゆっくり低下した。これは以前に明らかにされ
ていない効果である。ストレプトキナーゼは最初から存
在し、凝塊形成が始まるまで反応の経過に変化がないの
で、この突然の信号増加はストレプトキナーゼ溶液中の
副反応によりひき起こされたものではない。
【００４９】この実施例は新規方法を全く新しく診断に
適用できることを示している。全血中でも生じる凝塊の
溶解による信号の非常に強力で急速な増加のため、新規
方法により非常に感度よく溶解の時間を測定することが
できる。従来の方法（３−ａを参照）において、それは
信号の減少だけであり、それはまた本発明の場合にも起
こるし、観察された；しかしながら、慣用の方法ではこ
の信号減少はゆっくり起こるので、以前は溶解の開始時
間を正確に測定することができなかった。
適用できることを示している。全血中でも生じる凝塊の
溶解による信号の非常に強力で急速な増加のため、新規
方法により非常に感度よく溶解の時間を測定することが
できる。従来の方法（３−ａを参照）において、それは
信号の減少だけであり、それはまた本発明の場合にも起
こるし、観察された；しかしながら、慣用の方法ではこ
の信号減少はゆっくり起こるので、以前は溶解の開始時
間を正確に測定することができなかった。
【図１】（Ａ）は慣用の濁り測定法（１−ａ）および新
規方法（１−ｂ）における正常血漿（ＮＰ）および異常
血漿（ＰＰ）のＡＰＴＴ反応の経過を示す。それぞれの
ベースラインおよび凝塊形成ラインの交点を測定するこ
とによる凝固時間の確認を図示する。
規方法（１−ｂ）における正常血漿（ＮＰ）および異常
血漿（ＰＰ）のＡＰＴＴ反応の経過を示す。それぞれの
ベースラインおよび凝塊形成ラインの交点を測定するこ
とによる凝固時間の確認を図示する。
【図２】新規方法による全血試料のＡＰＴＴの測定
（Ａ）を示す。比較のために、塩化カルシウムを加えな
い試験（Ｂ）を行った。
（Ａ）を示す。比較のために、塩化カルシウムを加えな
い試験（Ｂ）を行った。
【図３】フィブリン凝塊を溶解するためにストレプトキ
ナーゼを加えた時（Ａ）の慣用の濁り測定法（３−ａ）
および新規方法（３−ｂ）における正常血漿のＡＰＴＴ
反応の経過を示す。比較のために、ストレプトキナーゼ
を加えない反応（Ｂ）の経過もまた示す。凝塊形成時間
はそれぞれ矢印で示す。
ナーゼを加えた時（Ａ）の慣用の濁り測定法（３−ａ）
および新規方法（３−ｂ）における正常血漿のＡＰＴＴ
反応の経過を示す。比較のために、ストレプトキナーゼ
を加えない反応（Ｂ）の経過もまた示す。凝塊形成時間
はそれぞれ矢印で示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレーアス・ヴイーガント ドイツ連邦共和国34613シユヴアルムシユ タツト．トライゼーアシユトラーセ15
Claims (27)
- 【請求項１】 血小板凝集、凝塊形成および／または凝
塊溶解の結果として、各物質は互いに離れて物質間の相
互作用、特にエネルギー転移を可能にし、または妨げる
ため、その相互作用の程度を測定することからなる、止
血障害の検出方法。 - 【請求項２】 エネルギー転移は短命分子、例えば一重
項酸素、短領域の放射線、例えば放射性β線、および／
またはフェルスターのエネルギー転移により起こる請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 物質の活性は他の物質により増加または
阻害され、それにより測定可能な信号変化、例えば放射
光の強度または偏光の変化、酵素活性の阻害または増
加、および／またはケイ光性の変化が生じる請求項１ま
たは２記載の方法。 - 【請求項４】 少なくとも１種の物質が非特異的に例え
ば疎水性または静電的相互作用により、直接的または間
接的に形成または溶解する凝血塊の成分と結合すること
ができる請求項１〜３の何れかの項記載の方法。 - 【請求項５】 １種以上の物質が特定の相互作用により
共有結合的に、および／または吸着的に懸濁性粒子と結
合し、そして／またはこれらの粒子中に取り込まれ、ま
たはそれら自体が懸濁性粒子もしくはその一部を構成す
る請求項１〜４の何れかの項記載の方法。 - 【請求項６】 懸濁性粒子は例えば染料結晶、金属ゾ
ル、シリカ粒子、磁気粒子、油滴、脂質粒子、デキスト
ラン、タンパク質凝集体、好ましくはラテックス粒子で
ある請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 粒子の製造後に粒子表面が変性され、そ
して／または粒子が例えばタンパク質、炭水化物、親油
性物質、バイオポリマー、有機ポリマーまたはその混合
物からなる１種以上の共有結合的にまたは吸着的に結合
した層またはシェルにより被覆される請求項５または６
記載の方法。 - 【請求項８】 光増感剤および化学発光化合物が物質と
して使用され、そして光増感剤により発生する一重項酸
素は化学発光化合物を活性化して発光させることができ
る請求項１〜７の何れかの項記載の方法。 - 【請求項９】 光増感剤およびケイ光化合物が物質とし
て使用され、そして光増感剤により発生する一重項酸素
はケイ光化合物を活性化して発光させる、または消光工
程で発光を抑制することができる請求項１〜７の何れか
の項記載の方法。 - 【請求項１０】 アセトン、ベンゾフェノン、９−チオ
キサントン、エオシン、９,１０−ジブロモアントラセ
ン、クロロフィル、バックミンスターフラーレン、メチ
レンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、フタロシ
アニンおよび／またはそれらの誘導体が光増感剤として
使用される請求項１〜９の何れかの項記載の方法。 - 【請求項１１】 オレフィン、９−アルキリデンキサン
タン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、エ
ノール、エーテル、エナミン、アリールビニルエーテ
ル、ジオキセン、アリールイミダゾールおよび／または
ルシゲニンが化学発光化合物として使用される請求項１
〜１０の何れかの項記載の方法。 - 【請求項１２】 化学発光化合物は活性化した化学発光
化合物により刺激され、より長い波長の光を発すること
ができる発蛍光団と接触させる請求項１〜１１の何れか
の項記載の方法。 - 【請求項１３】 一重項酸素との反応の結果として光酸
化（光漂白）に付されるケイ光化合物、例えば１,３−
ジフェニルイソベンゾフラン、または光活性前駆体とし
て一重項酸素と反応して発蛍光団を与えるケイ光化合
物、例えばオキセンウンベリフェリルエーテルまたはウ
ンベリフェリルセレニドが使用される請求項１〜１２の
何れかの項記載の方法。 - 【請求項１４】 血液凝固系およびフィブリン溶解系因
子の遺伝的に決定された、そして／または後天性の欠
失；血小板の遺伝的欠損；病気による、または投与され
た治療剤による止血障害；並びに／あるいは補体系の遺
伝的および／または後天性欠損を検出するために使用さ
れる請求項１〜１３の何れかの項記載の方法。 - 【請求項１５】 フィブリン凝塊を形成するのに必要な
時間が測定される請求項１〜１４の何れかの項記載の方
法。 - 【請求項１６】 凝塊形成は血漿中で、または少なくと
もフィブリノーゲンおよび／または血小板を含有する培
地で凝固を誘発する１種以上の物質を加えることにより
誘発される請求項１〜１５の何れかの項記載の方法。 - 【請求項１７】 活性化部分トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）、トロンボプラスチン時間（ＰＴ）、プロ
テインＣ活性化時間（ＰＣＡＴ）、ラッセルマムシ毒液
時間（ＲＶＶＴ）またはトロンビン時間が測定される請
求項１〜１６の何れかの項記載の方法。 - 【請求項１８】 フィブリン溶解系因子を測定するため
に、測定対象の試料は例えば欠失がある血漿と混合する
ことにより、またはｕＰＡ、ｔＰＡ、α2−抗プラスミ
ン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻
害剤Ｉおよび／またはXII因子、特にフィブリノーゲン
のような精製因子を加えることにより凝塊形成に必要な
因子で置換されうる請求項１〜１７の何れかの項記載の
方法。 - 【請求項１９】 自然溶解が誘発される、あるいはXII
ａ因子、ｔＰＡ、ｕＰＡまたはストレプトキナーゼのよ
うな活性化剤を加えた後、またはプラスミンを加えた直
後に溶解が誘発される請求項１〜１８の何れかの項記載
の方法。 - 【請求項２０】 フィブリン凝塊の溶解が始まる時間は
信号の増加により測定される請求項１〜１９の何れかの
項記載の方法。 - 【請求項２１】 血小板の活性はそれらの凝集力により
測定される請求項１〜２０の何れかの項記載の方法。 - 【請求項２２】 血小板の凝集はアデノシン二リン酸、
コラーゲン、トロンビン、セロトニンまたはエピネフリ
ンのような物質、イオノホア、補体、あるいはストレプ
トリシンにより誘発されうる請求項１〜２１の何れかの
項記載の方法。 - 【請求項２３】 薬剤の濃度または活性が測定される請
求項１〜２２の何れかの項記載の方法。 - 【請求項２４】 治療的薬剤レベルで監視するのに使用
される請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 血小板凝集、凝塊形成および／または
凝塊溶解の結果として互いに離れて物質間の測定可能な
相互作用、特にエネルギー転移を可能にする、または妨
げる１種以上の物質を含有する診断剤。 - 【請求項２６】 後天性または遺伝性止血障害を検出す
るための請求項２５記載の診断剤。 - 【請求項２７】 請求項１〜２４の何れかの項記載の方
法を実施するための診断剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19756773:8 | 1997-12-19 | ||
| DE19756773A DE19756773A1 (de) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11242035A true JPH11242035A (ja) | 1999-09-07 |
| JP4422227B2 JP4422227B2 (ja) | 2010-02-24 |
Family
ID=7852682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36066298A Expired - Fee Related JP4422227B2 (ja) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | 止血障害の検出方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6187594B1 (ja) |
| EP (1) | EP0924523B1 (ja) |
| JP (1) | JP4422227B2 (ja) |
| AT (1) | ATE329269T1 (ja) |
| AU (1) | AU9718298A (ja) |
| CA (1) | CA2256089C (ja) |
| DE (2) | DE19756773A1 (ja) |
| ES (1) | ES2262206T3 (ja) |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2010085411A (ja) * | 2008-10-02 | 2010-04-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | 血液凝固アッセイ |
| JP2019039912A (ja) * | 2017-08-02 | 2019-03-14 | シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング | ヘパリン誘発性血小板減少症の診断用結合アッセイ |
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| DE19756773A1 (de) * | 1997-12-19 | 1999-06-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik |
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| DE10116586B4 (de) | 2001-04-03 | 2005-07-21 | Stief, Thomas, Dr.med. | Testsystem zur Bestimmung der Hämostaseaktivierung von biologischen Flüssigkeiten |
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| CA2547351A1 (en) | 2003-12-01 | 2005-07-07 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogeneous detection method |
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