ES2262206T3 - Procedimiento y medios de diagnostico para la deteccion de transtornos hemostaticos. - Google Patents
Procedimiento y medios de diagnostico para la deteccion de transtornos hemostaticos.Info
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Abstract
Procedimiento para la determinación de un trastorno de la hemostasis, en el que como consecuencia de una agregación de plaquetas sanguíneas, de una formación de coágulos y/o de una disolución de coágulos, se ponen en contacto entre sí ciertas sustancias en un intervalo de tiempo que permite o reprime una interacción, en particular una transferencia de energía, entre las sustancias, y se mide la magnitud de la interacción, caracterizado porque una o varias de estas sustancias están fijadas covalentemente, a través de una interacción específica y/o por adsorción, a partículas suspendibles, y/o están incorporadas en éstas o constituyen por sí mismas partículas suspendibles o son una parte de las mismas.
Description
Procedimiento y medios de diagnóstico para la
detección de trastornos hemostáticos.
El invento se refiere a procedimientos así como
a agentes de diagnóstico para la detección de trastornos de la
hemostasis, caracterizado porque como consecuencia de una agregación
de plaquetas sanguíneas, de una formación de coágulos y/o de una
disolución de coágulos, se ponen en contacto entre sí ciertas
sustancias en un intervalo de tiempo que permite o reprime una
interacción, en particular una transferencia de energía, entre las
sustancias, y se mide la magnitud de la interacción.
El torrente sanguíneo abastece, a través del
sistema vascular, a los órganos con sustancias nutritivas, y procura
la evacuación de productos del metabolismo. La conservación de un
sistema vascular abierto, y a pesar de todo aislado con respecto al
medio ambiente, tiene por lo tanto una importancia vital. Mediante
la cooperación de los sistemas opuestos de la coagulación sanguínea
y de la fibrinólisis - que están en un equilibrio recíproco
designado como hemostasis - esto se hace posible. Un trastorno de
estos sistemas se manifiesta a escala clínica en un caso extremo o
bien en unas trombosis, es decir oclusiones indeseadas del sistema
vascular, o en una diatesis hemorrágica, es decir una sangría.
Ambas cosas pueden conducir, pasando por fallos de órganos, hasta la
muerte. Éstas son una de las causas principales de muertes en el
mundo occidental. A la detección de un trastorno adquirido o
heredado de la hemostasis le corresponde por lo tanto un importante
cometido en el diagnóstico clínico.
Los procesos de la hemostasis se basan en la
cooperación de vasos sanguíneos (contracción, dilatación), de
células (el endotelio situado en los vasos o bien trombocitos que
flotan en el vaso sanguíneo) y de factores humorales. De modo
correspondiente a la sucesión fisiológica de los procesos, se
establece diferencia entre una coagulación primaria y una
coagulación secundaria. En el caso de la coagulación primaria,
dominan los componentes celulares, y ésta encuentra su terminación
en la formación de agregados de trombocitos (coágulo primario). En
el caso de la coagulación secundaria, que es iniciada en un caso
normal por los componentes celulares, dominan los factores
humorales. En los casos de estos factores humorales se trata de
proteínas, que son diferenciadas según su función, esencialmente en
enzimas, cofactores y proteínas de soporte. En el caso de la
activación de la coagulación, a través de un sistema similar a una
cascada, las proenzimas se convierten, mediante enzimas activas o
activadas, por vía proteolítica, en su forma activa. Esta actividad
puede ser aumentada mediante cofactores asimismo activados
proteolíticamente en la mayor parte de los casos. Como última etapa
se efectúa la conversión de la proteína de soporte fibrinógeno, que
es soluble en su forma preliminar, mediante la enzima de
coagulación trombina, en su producto de reacción insoluble fibrina.
Mediante agregación y reticulación enzimática de la fibrina,
resulta el coágulo de fibrina (coágulo secundario). Las
coagulaciones primaria y secundaria sirven para la curación de las
heridas. Sin embargo, en un caso patológico se llega a un
taponamiento indeseado de la vía sanguínea, designado clínicamente
como una trombosis. La disolución de los coágulos se efectúa a
través del sistema de fibrinólisis, que, a través de una sucesión
consecutiva similar de enzimas activadoras, conduce a la activación
de la proteasa plasmina. En el caso patológico de una
hiperfibrinólisis, la plasmina destruye de una manera inespecífica
al fibrinógeno que todavía no se ha coagulado y de esta manera
perturba a la integridad del sistema capilar, y se llega a sangrías
y hemorragias.
Con el fin de reconocer eventuales
perturbaciones de la hemostasis, los procesos antes descritos se
investigan con ayuda de procedimientos de diagnóstico, a los cuales
se diferencia en los denominados
- -
- procedimientos clásicos
- -
- procedimientos clínicos - químicos, así como
- -
- procedimientos inmunoquímicos.
Los procedimientos de diagnóstico, designados
como procedimientos clásicos, se basan en la detección de la
formación de un coágulo. Son predominantes los procedimientos que
activan a las cascadas de activación de la coagulación y/o de la
fibrinólisis en un sitio, y que miden el tiempo que transcurre hasta
la formación o respectivamente la disolución de un coágulo.
Las modificaciones de estos tiempos de
coagulación y respectivamente de fibrinólisis en comparación con una
muestra normal, permiten sacar conclusiones acerca de alteraciones
patológicas de la zona parcial activada, es decir la zona de las
cascadas de reacción hasta la formación y respectivamente la
disolución de un agregado de fibrina. Usualmente, la detección del
coágulo en el caso de los procedimientos clásicos se lleva a cabo
mediante procedimientos mecánicos u ópticos de detección.
En el caso de una detección mecánica, se
aprovecha la viscosidad elevada de la muestra en fase de coagulación
o la formación de hilos de fibrina. Así, por ejemplo, una bola o una
barra agitadora se introduce en el fondo de un recipiente de
reacción y se provoca la coagulación en la muestra de sangre que se
ha añadido a éste. La bola, y respectivamente la barra agitadora o
el recipiente, giran, y se mide la fuerza necesaria para este
movimiento. Si, a causa de la agregación de plaquetas o de la
formación de coágulos, se aumenta la viscosidad de la solución, esto
se mide como una resistencia aumentada y a partir de un determinado
valor se valora como iniciación de la coagulación. En el caso de
otro procedimiento (de acuerdo con Schnitger & Gross) un
electrodo en forma de gancho se sumerge en la muestra y se saca de
ella a intervalos rítmicos. En este caso se conecta y desconecta de
un modo correspondiente la aportación de corriente eléctrica a un
electrodo situado dentro de la muestra. Si se forma un hilo de
fibrina, entonces se enreda el electrodo móvil y se conserva el
flujo de corriente eléctrica. Esto se interpreta como una iniciación
de la coagulación. Al realizar el diagnóstico de una fibrinólisis,
se detecta, a la inversa de un modo correspondiente, la disolución
del coágulo mediante una disminución de la viscosidad y
respectivamente mediante la disolución de la fibrina.
La detección mecánica en los procedimientos
clásicos tiene la ventaja de que capta la propiedad, importante
fisiológicamente, de la formación de coágulos, a saber la oclusión
mecánicamente estable de una herida. Por el contrario, esta técnica
exige aparatos especiales, que son apropiados solamente para estos
ensayos especiales de hemostasis.
Como detección óptica se entiende la
determinación turbidimétrica de la modificación de la turbiedad de
la solución al haberse formado un coágulo. La señal de
enturbiamiento en el caso de un coágulo de fibrina se puede
reforzar mediante procedimientos conocidos para un experto en la
especialidad, tal como, por ejemplo, mediante elevación de la
densidad óptica de la muestra, por ejemplo mediante adición de
partículas o bien mediante un refuerzo de la desnaturalización de
la fibrina mediante adición de sales y respectivamente de iones,
por ejemplo de iones de metales, tales como iones de manganeso,
hierro o calcio. Como detección óptica en el caso de los
procedimientos clásicos no se entiende la conversión, asimismo
medible por vía fotoóptica, de substratos cromógenos, puesto que de
esta manera se determina una actividad enzimática, pero no la
agregación de trombocitos ni la conversión de la proteína de
soporte natural fibrinógeno.
En el documento de patente europea EP 0.039.885
se describe el hecho de que se pueden utilizar partículas hidrófobas
de un látex para la detección de monómeros de fibrina, es decir de
la fibrina todavía no polimerizada. Tales partículas sencillas de
un látex no son apropiadas, sin embargo, para la detección de un
coágulo, puesto que la aglutinación de partículas de látex causa una
dispersión aumentada de la luz, que no se puede diferenciar de la
dispersión de la luz, que un propio coágulo de fibrina genera.
En el documento de patente de los EE.UU. US
5.567.596 se describe un procedimiento para la detección de una
formación y respectivamente una degradación de polímeros
proteínicos, el cual está caracterizado porque el substrato
proteínico usado para el proceso de polimerización es marcado
mediante una marca de fluorescencia y porque este substrato
constituye un molde (del inglés template) de la proteína, que es
incorporado en el polímero proteínico. La detección se efectúa a
través de una extinción o sofocamiento (en inglés quenching) de la
emisión de luz por la
marca.
marca.
En el procedimiento de acuerdo con Steiner y
colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 805 (1984), páginas 53
- 58. se fijan específicamente, mediante anticuerpos o lectinas,
unas marcas fluorescentes a proteínas en membranas de plaquetas
sanguíneas. Este procedimiento sirve para la investigación de la
distribución de proteínas dentro de la membrana después de una
activación de plaquetas sanguíneas.
Una ventaja de la detección óptica es la
posibilidad de llevar a cabo las mediciones en convencionales
aparatos automáticos de análisis clínicos - químicos. Puesto que la
detección óptica, sin embargo, se basa en la medición de un
enturbiamiento, al contrario que la detección mecánica, unos
enturbiamientos de las muestras, p.ej. en el caso de muestras
hiperlipémicas, pueden perturbar a la determinación. En un caso
extremado, tal como por ejemplo en una sangre entera, a causa de la
densidad óptica no es posible incluso ninguna detección óptica.
Ésta es una desventaja esencial de estos métodos ópticos.
Junto a los procedimientos clásicos y habituales
de diagnóstico, que antes se han descrito, en el diagnóstico de la
hemostasis son habituales también los procedimientos clínicos -
químicos. En este contexto, a través de la conversión de substratos
cromógenos específicos a solas o en combinaciones con enzimas y/o
productos intermedios (ensayo acoplado enzimáticamente), se mide la
actividad de enzimas individuales. Estas determinaciones son
independientes de la formación de un agregado de trombocitos o de un
coágulo de fibrina. En este caso, sin embargo, es desventajoso el
hecho de que no se captan las reacciones relevantes
fisiológicamente, a saber trastornos en el caso de la formación de
un agregado de trombocitos o de un coágulo de fibrina y
respectivamente de su disolución, p.ej. una disfibrinogenemia o una
reactividad restringida de las enzimas de coagulación con
superficies de fosfolípidos a causa de una deficiencia de vitamina K
y respectivamente de una terapia con cumarina.
Los procedimientos inmunoquímicos son más bien
inusuales en el diagnóstico de la hemostasis, puesto que en este
caso se encuentra en predominancia el diagnóstico de trastornos
funcionales y menos la determinación de la cantidad de un analito
que se ha de detectar. No obstante, la detección inmunoquímica de
productos de disociación procedentes del efecto proteolítico de las
reacciones en cascada, o la detección de complejos de proteasas e
inhibidores, permite sacar conclusiones acerca de la actividad real
actual de los respectivos sistemas. Éstas pueden ser de mucha ayuda
para el diagnóstico diferencial. Actualmente, la aplicación de los
métodos inmunoquímicos en el diagnóstico de la hemostasis se
restringe predominantemente a trabajos de investigación.
El invento se basó en la misión de encontrar un
nuevo método de detección, que haga posible llevar a cabo también
los procedimientos mecánicos clásicos en convencionales aparatos
automáticos de análisis, y que se manifieste como robusto frente a
los trastornos causados por enturbiamientos de las muestras, que son
usuales en los procedimientos ópticos, por lo que también se hace
posible una medición en una sangre entera.
El problema planteado por esta misión se
resuelve conforme al invento mediante un procedimiento y
respectivamente mediante la utilización de un agente de diagnóstico
de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones
1-5, en particular mediante un procedimiento para
la detección de un trastorno de la hemostasis, en el que, como
consecuencia de una agregación de plaquetas sanguíneas, de una
formación de coágulos y/o de una disolución de coágulos, se ponen
en contacto entre sí ciertas sustancias en un intervalo de tiempo
que permite o reprime una interacción, en particular una
transferencia de energía, entre las sustancias, y se mide la
magnitud de la interacción, el cual está caracterizado porque una o
varias de estas sustancias están fijadas covalentemente, a través
de una interacción específica y/o por adsorción, a partículas
suspendibles, y/o están incorporadas en éstas o constituyen por sí
mismas partículas suspendibles o son una parte de las mismas.
Por el concepto de un trastorno de la hemostasis
se piensa en todos los trastornos heredados o adquiridos de los
sistemas de coagulación, de fibrinólisis y también del complemento,
en particular defectos o deficiencias de los factores y reguladores
que participan en ellos, así como de receptores para éstos, siempre
y cuando que éstos pasen a emplearse en la tanda de ensayo mediante
la presencia de tejidos, partes de tejidos y/o células.
Mediante la determinación de la magnitud de
interacción entre las sustancias - p.ej. mediante la medición
directa o indirecta de la cantidad transmitida de energía - se
pueden sacar conclusiones acerca del proceso de la agregación de
plaquetas sanguíneas, de la formación de coágulos y/o de la
disolución de coágulos. Con este procedimiento se pueden reunir,
por lo tanto, las ventajas de los clásicos procedimientos mecánicos
de diagnóstico de la hemostasis (por medición directa del proceso
fisiológico de la formación y respectivamente disolución de
coágulos) y de los clásicos procedimientos ópticos de diagnóstico de
la hemostasis (medición en usuales aparatos automáticos de
análisis), sin tomar a su cargo en este caso sus desventajas (p.ej.
la sensibilidad a perturbaciones frente a muestras turbias). Así,
con el procedimiento conforme al invento se pueden medir, por
consiguiente, todas las muestras usuales en el diagnóstico de la
hemostasis, tales como p.ej. un plasma pobre en plaquetas
sanguíneas, un plasma rico en plaquetas sanguíneas o una sangre
entera.
Una sangre entera constituye el máximo de una
perturbación de los procedimientos ópticos. A causa de los
eritrocitos presentes, la densidad óptica es tan alta, que no se
puede medir en convencionales aparatos que miden ópticamente. La
evolución de la reacción de la coagulación de muestras de sangre
entera, determinada con el procedimiento conforme al invento, está
prácticamente no influenciada. Esto hace posible la aplicación del
procedimiento conforme al invento a la determinación de muestras de
sangre entera en el diagnóstico cercano al paciente (en inglés point
of care) o en el diagnóstico doméstico. Puesto que en el caso de la
coagulación de sangre entera cooperan las coagulaciones primaria y
secundaria, el proceso global se puede determinar con el
procedimiento conforme al invento. El procedimiento conforme al
invento se ha de utilizar, por consiguiente, tanto para la
determinación de los factores humorales como también para la
determinación de las actividades de coagulación y respectivamente
de lisis de los componentes celulares.
El procedimiento conforme al invento permite la
realización de la totalidad del diagnóstico de la hemostasis en un
único aparato, puesto que también se pueden adaptar al procedimiento
conforme al invento los correspondientes procedimientos de
diagnóstico de la hemostasis de tipo clínico - químico o
inmunoquímico: En vez de los usuales substratos cromógenos, se
pueden emplear por ejemplo sustancias capacitadas para una efectiva
transferencia de energía, las cuales están ligadas p.ej. a través de
una cadena peptídica disociable enzimáticamente (véase p.ej. el
documento de solicitud de patente internacional WO 97/28261). En
este caso, una o varias de las sustancias pueden estar ligadas con
la cadena peptídica directa o indirectamente, p.ej. a través de
sistemas de ligadura, tales como los de antígenos y anticuerpos o
los de avidina y biotina, de manera tal que la reacción enzimática
puede tener lugar antes o después de la ligadura de la(s)
sustancia(s) a la cadena peptídica, o también al mismo tiempo
que la
ligadura.
ligadura.
Por el concepto de "sustancias" se han de
entender, en el marco del invento global, miembros de clases de
sustancias biológicas y/o químicas, que en el caso de estar en una
proximidad en el espacio pueden entrar en interacción unas con
otras, p.ej. en forma de donantes de energía y receptores de energía
tales como agentes fotosensibilizadores y compuestos
quimioluminiscentes (documento EP 0.515.914; las citas de Ullman y
colaboradores (1996) Clinical Chemistry 42: 1518 - 1526),
agentes fotosensibilizadores y fluoróforos (documento WO 95/06877;
Bystrak y colaboradores (1995) Anal. Biochem. 225: 127 -
134), o yodo^{125} radiactivo y agentes fluoróforos (S.
Udenfriend y colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:
8672 - 8676), o agentes fluoróforos y fluoróforos (Mathis, G. (1993)
Clin. Chem. 39: 1953 - 1959) o agentes fluoróforos y
extintores de fluorescencia (documento US 3.996.345).
Por una interacción entre las sustancias se ha
de entender en particular una transferencia de energía - es decir,
la transmisión directa de energía entre las sustancias, p.ej. por
medio de radiación luminosa o electrónica así como a través de
moléculas químicas reactivas -. La transferencia de energía puede
efectuarse desde una sustancia a otra sustancia, pero es posible
también que se desarrolle una cascada de diferentes sustancias a
través de la de transferencia de energía.
Además, por el concepto de "interacción entre
las sustancias" están abarcados también unos procesos, en los
que la actividad de una sustancia es inhibida o aumentada por una o
varias otras sustancias distintas, por ejemplo la inhibición o el
aumento de la actividad enzimática o la inhibición, el aumento o la
modificación (p.ej. un desplazamiento de longitudes de onda, una
polarización) de la luz emitida por la sustancia no
influenciada.
Por lo demás, dentro del concepto de una
interacción entre las sustancias, han de entenderse también cascadas
de enzimas (véase el documento US 4.663.278). En este caso, las
sustancias son enzimas, de las cuales por lo menos una suministra
el substrato para otra enzima, caracterizadas porque como
consecuencia de una agregación de plaquetas sanguíneas, de una
formación de un coágulo y/o de una disolución de un coágulo las
enzimas se llevan a una distancia unas de otras, de manera tal que
resulta una velocidad máxima o mínima de reacción de la conversión
acoplada del substrato. Así, por ejemplo, se pueden realizar las
siguientes variantes:
- (a)
- La enzima E1 (= sustancia A) genera el substrato "a" para la enzima E2 (= sustancia B), que es convertido por la enzima E2 en un producto final o intermedio medible "b". Si las enzimas están en forma de una solución, entonces el camino de difusión para al substrato "a" hasta la enzima E2 es relativamente largo y por consiguiente la cinética de conversión en "b" es lenta. Si las enzimas E1 y E2, p.ej. como consecuencia de la formación de un coágulo o de una agregación de plaquetas sanguíneas, no se presentan contiguas en el espacio, entonces resulta una cinética más rápida de conversión en "b".
- (b)
- Las enzimas E1 (= sustancia A) y E3 (= sustancia C) se presentan desde el comienzo en una proximidad en el espacio; p.ej. ambas están fijadas a las mismas partículas. La enzima E1 forma el substrato para la enzima E2 (sustancia B), generando la enzima E2 el substrato para la enzima E3. El procedimiento se efectúa de un modo análogo al (a), realizándose que, como consecuencia de una formación de un coágulo o de una agregación de plaquetas sanguíneas, las tres sustancias se llevan a proximidad en el espacio, o que, como consecuencia de la disolución de un coágulo se suprime una disposición presente en proximidad en el espacio.
Una interacción efectiva entre las sustancias
tiene lugar cuando éstas se presentan contiguas en el espacio, es
decir p.ej. mediante un intervalo de distancias de unos pocos \mum
(micrómetros), en particular dentro de un intervalo de distancias
de por debajo de 600 nm (nanómetros), de manera preferida por debajo
de 400 nm, de manera muy especialmente preferida por debajo de 200
nm.
En una forma preferida de realización del
procedimiento conforme al invento, la interacción entre las
sustancias se efectúa como transferencia de energía, p.ej.
mediante
- \bullet
- moléculas de vida corta, p.ej. oxígeno singulete (véanse el documento EP 0.515.194; y las citas de Ullman y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5426 - 5430: de Ullman y colaboradores (1996) Clinical Chemistry 42: 1518 - 1526), el documento WO 95/06877 y la cita de Bystrak y colaboradores (1995) Anal. Biochem. 225: 127 - 134),
- \bullet
- Radiación de pequeño alcance, p.ej. radiación \beta radiactiva (véanse las citas de Hart & Greenwald (1979) Molecular Immunology 16: 265 - 267 y de Udenfriend y colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672 - 8676),
- \bullet
- y/o una transferencia de energía de acuerdo con Förster (véanse la cita de Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953 - 1959; y el documento US 5.527.684).
Otra forma preferida de realización del
procedimiento conforme al invento está caracterizada porque la
actividad de ciertas sustancias es reforzada o inhibida mediante
otras sustancias, y esto conduce a una modificación medible de la
señal, tal como por ejemplo la modificación de la intensidad o la
polarización de la luz emitida, la inhibición o el aumento de
actividades enzimáticas y/o la modificación del comportamiento de
fluorescencia.
Están abarcadas por el procedimiento conforme al
invento también formas de realización en las que por lo menos una de
las sustancias se puede fijar de manera inespecífica, p.ej. por
interacción hidrófoba o electrostática, a componentes de un coágulo
de sangre que se forma o se disuelve. Esta fijación puede efectuarse
directamente, a través de una interacción de una sustancia y de los
componentes del coágulo que se forma o disuelve, o indirectamente,
al fijarse la sustancia a coágulos de sangre que se forman o
disuelven, a través de componentes que median en la fijación
- tales como por ejemplo polímeros presentes en la naturaleza o preparados por síntesis, que se presentan unidos con la sustancia, proteínas, en particular fragmentos del fibrinógeno, azúcares, lípidos o péptidos, en particular los que tienen la secuencia de aminoácidos RGD, o de manera especialmente preferida partículas -.
- tales como por ejemplo polímeros presentes en la naturaleza o preparados por síntesis, que se presentan unidos con la sustancia, proteínas, en particular fragmentos del fibrinógeno, azúcares, lípidos o péptidos, en particular los que tienen la secuencia de aminoácidos RGD, o de manera especialmente preferida partículas -.
El invento está caracterizado porque una o
varias sustancias están fijadas covalentemente, a través de una
interacción específica y/o por adsorción, a partículas suspendibles,
y/o están incorporadas en éstas o constituyen por sí mismas
partículas suspendibles o son una parte de las mismas. Por el
concepto de partículas suspendibles han de entenderse partículas,
tales como p.ej. cristales de colorantes, soles metálicos,
partículas de sílice, partículas magnéticas, gotas de aceites,
partículas de lípidos, dextrano, agregados de proteínas o, de manera
especialmente preferida, partículas de un látex. Se prefieren las
partículas con un diámetro de 0,01 - 10 \mum, de manera
especialmente preferida con un diámetro de 0,05 - 3 \mum y de
manera muy especialmente preferida con un diámetro de 0,05 - 1
\mum.
En el caso de una fijación covalente, las
sustancias están unidas a través de una fijación química con las
partículas o con eventuales valvas o capas, que envuelven a las
partículas. Las sustancias pueden estar unidas también a través de
interacciones específicas con las partículas o las envolturas de
partículas - p.ej. de manera mediada a través de anticuerpos,
lectinas, receptores, pares de biotina y avidina, y cadenas
complementarias de nucleótidos -. La fijación por adsorción ha de
atribuirse por regla general a interacciones hidrófobas, hidrófilas
o electrostáticas entre las partículas o envolturas de partículas y
las sustancias. Es efectiva también una incorporación de las
sustancias en uno o varios espacios huecos de partículas, que pueden
estar formados también por envolturas de partículas.
Están incluidas por el procedimiento conforme al
invento también unas formas de realización, en las cuales la
superficie de las partículas es modificada adicionalmente después de
su producción y/o las partículas son envueltas por una o varias
capas o valvas fijadas covalentemente o por adsorción - p.ej. a base
de proteínas, hidratos de carbono, sustancias lipófilas,
biopolímeros, polímeros orgánicos o mezclas de ellos -, con el fin
de conseguir mejoramientos en lo referente a la estabilidad de
suspensiones, la estabilidad en almacenamiento, la estabilidad
conformadora o la resistencia frente a luz UV (ultravioleta),
microbios o demás agentes que actúen destructoramente. Asimismo,
las modificaciones y envolturas pueden servir para reducir o
reprimir la fijación inespecífica a superficies de recipientes de
reacción, así como a las de componentes de muestras tales como en
particular proteínas (albúmina o anticuerpos) o componentes
celulares (p.ej. fosfolípidos o ácidos nucleicos). Además, las
modificaciones y envolturas pueden servir para aumentar o disminuir
la hidrofobia de la superficie de las partículas o la carga
eléctrica de la superficie de las partículas.
Mediante tales modificaciones de la superficie
de las partículas, se puede conseguir una fijación más selectiva y
mejorada de las partículas a componentes de un coágulo sanguíneo. La
capacidad de fijación específica de las sustancias a componentes de
un coágulo sanguíneo que se forma o que se encuentra en fase de
disolución, es una importante premisa para el funcionamiento del
procedimiento conforme al invento. El hecho de si las sustancias
que se han de emplear presentan por sí mismas esta propiedad, o de
si se necesitan componentes mediadores en una fijación, se puede
comprobar mediante ensayos de fijación - tal como se representa en
lo sucesivo en el ejemplo de sustancias fijadas a partículas -.
La elección de partículas apropiadas como
componentes mediadores en una fijación puede efectuarse mediante
comprobación de la fijación de las partículas a una superficie
inmovilizada de fibrina. Tal superficie de fibrina se puede
producir por ejemplo de acuerdo con Masson &
Angles-Cano (Biochem. J. (1988) 256: 237 -
244) de la siguiente manera, expresada brevemente: Unos recipientes
a base de un poli(cloruro de vinilo) se activan previamente
durante 2 horas a la temperatura ambiente con una solución al 2,5%
(v/v = volumen/volumen) de glutaraldehído en un tampón de
bicarbonato de sodio 0,1 M (de pH 9,5), y luego se aplica una
solución que contiene fibrinógeno (0,3 \mumol/l en un tampón de
fosfato de sodio 0,1 M (de pH 7,4) que contiene 1 mmol/l de cloruro
de calcio). En el caso de utilizarse unos tubitos de poliestireno
usuales en el comercio o unas placas de microtitulación, que por
ejemplo se han activado previamente mediante una radiación gamma
para el revestimiento proteínico, los recipientes de ensayo
utilizados se pueden poner en contacto directamente con una solución
que contiene fibrinógeno. Después de una incubación durante varias
horas, usualmente durante una noche (aproximadamente 18 horas), el
fibrinógeno no fijado se elimina por lavado con un tampón de lavado
que contiene un detergente (p.ej. procedente de la línea Enzygnost
de la entidad Dade Behring Marburg GmbH). El fibrinógeno fijado es
transformado en fibrina mediante una adición de trombina (1 unidad
NIH/ml en 50 ml de Tris-HCl; CaCl_{2} 1 M; de pH
7,4; por ejemplo un reactivo de trombina para ensayo
Test-Trombin Reagenz; de Dade Behring Marburg GmbH)
se transformó en fibrina y a continuación se eliminó la trombina por
lavado, p.ej. con una solución que contenía NaCl 0,5 M; CaCl_{2} 8
mM y 0,05% de Tween 20. Después de una etapa de lavado adicional con
un usual tampón de lavado que contiene un detergente, se saturan los
sitios de fijación libres en la fase sólida de fibrina mediante
lavado en una sola vez con una solución al 0,2% (p/v =
peso/volumen) de albúmina de suero bovino. La comprobación de la
fijación de las partículas que se han de investigar - p.ej.
partículas de un látex con agentes fotosensibilizadores (partículas
de sensibilizadores) en combinación con partículas de un látex que
contienen compuestos quimioluminiscentes (partículas de
quimioluminiscentes) (véase la cita de Clin. Chem. (1996) 42:
1518 - 1526) - a la superficie de fibrina se efectúa mediante una
adición de las partículas situadas dentro de los recipientes de
ensayo revestidos a un tampón neutro (por ejemplo: Tris/HCl 50 mM;
0,9% de NaCl, 0,05% de Tween 20; de pH 7,4). Después de una
incubación durante 10 min (según sea el material sometido a
investigación son recomendables también unos tiempos de incubación
más cortos o más largos) el recipiente de ensayo revestido con
fibrina se lava una vez o múltiples veces con el mismo tampón y a
continuación se mide la transferencia de energía de las partículas
de un sensibilizador y de un quimioluminiscente, que están
adheridas en el tubito de ensayo lavado, dentro de un apropiado
recipiente de medición, tal como p.ej. se describe con mayor detalle
en el Ejemplo 1. Para la exclusión de partículas que tienen la
propiedad indeseada de fijarse también a fibrinógeno, la incubación
de las partículas se puede efectuar en presencia de concentraciones
crecientes de fibrinógeno. En el caso de partículas que se fijan a
fibrinógeno, mediante el fibrinógeno añadido hasta llegar a una
concentración de 5 g/l, se reduce manifiestamente la fijación a la
superficie revestida con fibrina y de esta manera se disminuye a fin
de cuentas la señal de medición. Por analogía a este procedimiento,
se pueden descubrir también otros componentes mediadores en una
fijación, que sean apropiados para el procedimiento conforme al
invento.
Una forma especialmente preferida de realización
del procedimiento conforme al invento está caracterizada porque como
sustancias se emplean agentes fotosensibilizadores, por ejemplo
acetona, benzofenona, 9-tioxantona, eosina,
9,10-dibromo-antraceno, clorofila,
fullerenos de Buckminster, azul de metileno, rosa de Bengala,
porfirinas, ftalocianinas y/o sus derivados, y compuestos
quimioluminiscentes, por ejemplo olefinas,
9-alquiliden-xantanos,
9-alquiliden-N-alquil-acridanos,
enoléteres, enaminas, aril-vinil-éteres, dioxenos,
aril-imidazoles y/o lucigenina, y el oxígeno
singulete generado por el agente fotosensibilizador puede activar a
los compuestos quimioluminiscentes para la emisión de luz. Se
prefiere en el procedimiento conforme al invento también la
utilización de sustancias, tales como p.ej. luminol y ésteres
oxalatos, que reaccionan con oxígeno singulete para dar compuestos
intermedios, que pueden reaccionar con reactivos conocidos para un
experto en la especialidad, mediando emisión de luz.
Los compuestos quimioluminiscentes emiten por
regla general luz en las regiones de longitudes de onda situadas por
encima de 300 nm. La fluorescencia de un plasma disminuye
rápidamente en el intervalo de 500 nm y se puede despreciar por
encima de 550 nm. Si se exigen unas longitudes de onda más altas,
los compuestos quimioluminiscentes se pueden poner en contacto,
conforme al invento, también con agentes fluoróforos, que pueden ser
excitados por los compuestos quimioluminiscentes activados y que
emiten a longitudes de onda más altas. Son agentes fluoróforos
apropiados p.ej. rodaminas, bromuro de etidio,
5-dimetilamino-naftaleno-1-sulfonilo,
quelatos de europio con el agente
3-(2-tienoíl)-1,1,1-trifluoro-acetona
[Eu(TTA)_{3} (TTA =
3-(2-tienoíl)-1,1,1-trifluoro-acetona)]
o quelatos de rutenio con el agente 2,2'-dipiridilo
[Ru(bpy)_{3}++ (bpy =
2,2'-dipiridilo)].
Una forma preferida adicional de realización del
procedimiento conforme al invento está caracterizada porque como
sustancias se emplean agentes fotosensibilizadores y compuestos
fluorescentes, y porque el oxígeno singulete generado por el
sensibilizador puede activar al compuesto fluorescente para la
emisión de luz y respectivamente en un proceso de extinción puede
reprimir la emisión de luz. En particular se prefieren
procedimientos conformes al invento, que están caracterizados por
el empleo de compuestos fluorescentes, que por reacción con oxígeno
singulete experimentan una fotooxidación - en inglés
"photobleaching" = un fotoblanqueo -, tales como por ejemplo
1,3-di-fenil-isobenzofurano,
o reaccionan con oxígeno singulete como compuestos precursores
fotoactivos para dar agentes fluoróforos, tales como por ejemplo
oxeno-umbeliferil-éter o seleniuros de
umbeliferilo.
En lo que se refiere a otros ejemplos
adicionales para partículas, agentes fotosensibilizadores, y
compuestos quimioluminiscentes o fluorescentes, que se adecuan para
el procedimiento conforme al invento, se remite en particular al
documento EP 0.515.194, y a las citas de Ullman y colaboradores
(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 5426-5430, 1994) y
de Ullman y colaboradores (Clinical Chemistry 42:
1518-1526, 1996, documento WO 95/06877).
El procedimiento conforme al invento se puede
emplear para la detección, por ejemplo
- \bullet
- de una deficiencia debida a causas genéticas y/o adquirida de factores del sistema de coagulación de la sangre, tales como por ejemplo el factor de von Willebrand, factores (factor = F) del sistema extrínseco tales como FVII, FX, FII, FV, o la proteína Z, factores del sistema intrínseco tales como FXII, precalicreína, cininógeno de alto peso molecular, FXI, FIX ó FVIII, o factores de los sistemas de control tales como antitrombina III, el inhibidor de la ruta de factor tisular (del inglés tissue factor pathway inhibitor), la proteína C o la proteína S, y el inhibidor de C1,
- \bullet
- de una deficiencia debida a causas genéticas y/o adquirida de factores del sistema de fibrinólisis, tales como por ejemplo del activador tisular o del activador de plasminógeno urinario, del plasminógeno, de la \alpha-2-antiplasmina, de los inhibidores 1, 2 y 3 del activador de plasminógeno, o del inhibidor de fibrinólisis activable por trombina (TAFI, de Thrombin Aktivierbaren Fibrinolyse Inhibitor),
- \bullet
- de defectos genéticos de los trombocitos, tales como por ejemplo del síndrome de Bernard-Soulier, de la tromboastenia de Glanzmann, de la deficiencia de cuerpos densos (del inglés dense body defficiency), de la deficiencia de gránulos \alpha, o de defectos de la síntesis de tromboxano,
- \bullet
- trastornos adquiridos de la hemostasis, p.ej. como consecuencia de enfermedades o estados morbosos tales como uremia, enfermedades mieloproliferativas, tumores sólidos, la enfermedad de agrupación de almacenamiento (del inglés storage-pool disease) o inflamaciones, en particular las inflamaciones que conducen a proteínas modificadas por proteolisis o por oxidación, tales como por ejemplo las del sistema de la proteína C, de la antitrombina III y/o del inhibidor 1 del activador de plasminógeno,
- \bullet
- trastornos de hemostasis adquiridos como consecuencia de agentes terapéuticos administrados, que influ- yen sobre la actividad de componentes individuales del sistema de hemostasis o de varios de ellos, p.ej. heparina, derivados de cumarina, hirudina, inhibidores de fases de contacto, tales como p.ej. el inhibidor de tripsina o el inhibidor de esterasa C1, aspirina, o anticuerpos contra receptores de plaque-tas,
- \bullet
- o de defectos genéticos y/o adquiridos del sistema del complemento.
Con el procedimiento conforme al invento se
puede determinar también el tiempo que transcurre hasta la formación
de un coágulo de fibrina. En una forma de realización del
procedimiento conforme al invento, se provoca la formación de un
coágulo en un plasma o en un medio que contiene por lo menos
fibrinógeno y/o plaquetas sanguíneas, mediante la adición de
sustancias que provocan la coagulación,
- \bullet
- tales como enzimas, p.ej. procedentes de venenos de serpiente o trombina, u otras proteasas activas,
- \bullet
- o mediante sustancias activas superficialmente, tales como silicatos o derivados de fenol,
- \bullet
- o mediante plaquetas sanguíneas activadas o sustancias que activan a las plaquetas sanguíneas, tales como p.ej. trombina, colágeno, adrenalina, adenosina difosfato,
\newpage
- \bullet
- o mediante adición opcional de sustancias que apoyan a la coagulación, tales como sustancias tamponadoras, cloruro de calcio y/o fosfolípidos,
- \bullet
- o una o varias de estas sustancias.
El procedimiento conforme al invento se puede
usar con el fin de determinar el tiempo de tromboplastina parcial
activado (APTT), el tiempo de tromboplastina (PT), el tiempo de
activación de la proteína C (PCAT), el tiempo de veneno de víbora
de Russell (RVVT, de Russell's Viper Venom Time) o el tiempo de
trombina.
El tiempo de tromboplastina parcial activado
(APTT) capta trastornos de la vía intrínseca del sistema de
coagulación humoral. El tiempo de tromboplastina capta
perturbaciones de la ruta extrínseca del sistema de coagulación
humoral (véanse las citas de Colman RW y colaboradores Overview on
Hemostasis [Recopilación sobre hemostasis]. En: Colman RW, Hirsh J,
Marder VJ, Salzman EW, coordinadores de edición, Hemostasis and
Thrombosis [Hemostasis y trombosis], J.B. Lippincott Company, 3ª
edición, 1994; páginas 3-18). Los ensayos para su
determinación son ensayos de búsqueda, que necesitan en cada caso
todos los componentes del respectivo ramal del sistema de
coagulación humoral hasta la formación de la trombina, que convierte
al fibrinógeno en coágulos de fibrina.
En una forma preferida de realización del
procedimiento conforme al invento, para la captación de los factores
del sistema de fibrinólisis, la muestra que se ha de medir se
sustituye con los factores que son necesarios para la formación de
coágulos, tal como por ejemplo por mezcladura con un plasma
deficitario o la adición de factores purificados, tales como p.ej.
el activador de plasminógeno urinario (uPA), el activador de
plasminógeno tisular (tPA),
\alpha_{2}-antiplasmina, plasminógeno, el
inhibidor 1 del activador de plasminógeno, y/o el factor XII, en
particular la adición de fibrinógeno. En el caso de determinadas
formas de realización del procedimiento conforme al invento, se
puede provocar una lisis espontánea o una lisis después de haber
añadido activadores, tales como por ejemplo el factor XIIa, tPA,
uPA o estreptocinasa, o directamente después de haber añadido
plasmina.
En una forma de realización conforme al invento,
especialmente preferida, el momento del comienzo de la lisis de un
coágulo de fibrina se determina mediante un aumento de la señal: Un
plasma es llevado a la coagulación. Mediante adición, p.ej., de
estreptocinasa, que es una enzima que activa a plasmina, procedente
de Streptococcus, es lisado el coágulo. Esto se pone de
manifiesto en procedimientos habituales por una continua disminución
de la señal de medición. El comienzo de la disolución del coágulo
es, sin embargo, difícil de comprobar, puesto que en aparatos que
miden ópticamente la disminución de la señal se efectúa de una
manera muy lenta. Sorprendentemente, con el comienzo de la lisis en
el procedimiento conforme al invento, la señal aumenta de una manera
repentina y muy fuerte. Esto no se ha de atribuir a trastornos de
los componentes de ensayo, causados por la estreptocinasa añadida,
puesto que ésta está presente desde el comienzo del tiempo de
medición.
Este sorprendente efecto encontrado ofrece la
nueva posibilidad de determinar con mucha exactitud el comienzo de
una lisis. Esto amplia la posibilidad del diagnóstico del sistema
fibrinolítico, por ejemplo para la determinación de factores
individuales así como también de la fibrinólisis total o de la
fibrinólisis mediada por el factor XIIa, uPA o tPA (Bachmann F., The
plasminogen-Plasmin Enzyme System, [El sistema de
enzimas plasminógeno-plasmina]. En: Colman RW,
Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW, coordinadores de edición, Hemostasis
and Thrombosis. J.B. Lippincott Company, 3ª edición, 1994, páginas
1592-1622). Esto fracasaba hasta ahora sobre todo en
el hecho de que no era posible una medición exacta del tiempo de
lisis de un modo comparable con el tiempo de coagulación.
Se abarcan por el procedimiento conforme al
invento también unas formas de realización para la determinación de
la actividad de plaquetas sanguíneas a través de su capacidad de
agregación, en particular también formas de realización en las
cuales la agregación de plaquetas sanguíneas puede ser provocada por
sustancias tales como adenosina difosfato, colágeno, trombina,
serotonina o epinefrina, ionóforos, el complemento o
estreptolisina.
Otras formas de realización del procedimiento
conforme al invento se pueden utilizar para la determinación de la
concentración - en particular en la sangre o el plasma - o la
actividad de medicamentos tales como por ejemplo
- \bullet
- heparina, tPA, ácido acetilsalicílico, derivados de cumarina, hirudina, estreptasa,
- \bullet
- concentrados de factores plasmáticos, tales como p.ej. complejos de protrombina, un concentrado del factor VIII o concentrados de factores que contienen el vWF,
- \bullet
- anticuerpos contra receptores plaquetarios, tales como por ejemplo un complejo de GP IIb/IIIa, un complejo de GP Ib/V/X, un receptor de serotonina, un receptor de adenosina difosfato o un receptor de trombina,
- \bullet
- inhibidores de fases de contacto, tales como p.ej. un inhibidor de tripsina bovina o un inhibidor de esterasa C1,
- \bullet
- inhibidores del sistema de coagulación, tales como p.ej. el factor VIIa desactivado, anticuerpos contra tromboplastina tisular, el inhibidor de la ruta de factor tisular, antitrombina III, trombomodulina o la proteína C activada,
- \bullet
- así como inhibidores de la agregación de fibrina.
Éstas se pueden emplear también para la
vigilancia terapéutica de niveles de medicamentos, por ejemplo de
heparina, tPA, ácido acetilsalicílico, derivados de cumarina,
hirudina, inhibidores de fases de contacto tales como p.ej. el
inhibidor de tripsina bovina o un inhibidor de esterasa C1, o
anticuerpos contra receptores de plaquetas o proteínas asociadas a
plaquetas, tales como p.ej. un complejo de heparina y el factor
plaquetario 4.
El invento comprende también la utilización de
agentes de diagnóstico que contienen una o varias sustancias las
cuales, como consecuencia de una agregación de plaquetas sanguíneas,
de una formación de coágulos y/o de una disolución de coágulos, se
ponen en contacto entre sí las sustancias en un intervalo de tiempo
que permite o reprime una interacción, en particular una
transferencia de energía, entre las sustancias, realizándose que
por lo menos una de las sustancias se puede fijar directa o
indirectamente, de una manera inespecífica, p.ej. mediante una
interacción hidrófoba o electrostática, a componentes de un coágulo
de fibrina que se forma o disuelve, y porque una o varias de las
sustancias están fijadas covalentemente, a través de una interacción
específica y/o por adsorción, a partículas suspendibles, y/o están
incorporadas en éstas o constituyen por sí mismas partículas
suspendibles o son una parte de las mismas, para la realización del
procedimiento conforme al invento. Este agente de diagnóstico se
puede emplear para la detección de un trastorno adquirido o heredado
de la hemostasis.
A continuación se explica el invento con mayor
detalle con ayuda de Ejemplos y con referencia a las Figuras
adjuntas.
En las Figuras se utilizan, entre otras, las
siguientes abreviaturas: "t" = tiempo de medición en segundos
("s"); señales de medición: "A 405 nm" = unidades de
absorción en "mE" a una longitud de onda de 405 nm; "c" =
cómputos (en inglés counts) como señal de medición.
La Figura 1 muestra la evolución de la reacción
en un APTT de un plasma normal (NP) y de un plasma patológico (PP)
en un procedimiento turbidimétrico habitual (Figura 1a) así como en
el procedimiento conforme al invento (Figura 1b). La averiguación
del tiempo de coagulación mediante la determinación del punto de
intersección entre la respectiva línea de base y la línea de
formación de un coágulo, se representa esquemáticamente.
La Figura 2 muestra la determinación del APTT de
una muestra de sangre entera según el procedimiento conforme al
invento (A). Como control (testigo), se llevó a cabo el ensayo sin
la adición de cloruro de calcio (B).
La Figura 3 muestra la evolución de la reacción
en un APTT de un plasma normal en un procedimiento turbidimétrico
habitual (Figura 3a) así como en el procedimiento conforme al
invento (Figura 3b) mediando adición de estreptocinasa para la
lisis del coágulo de fibrina (A). Como comparación, se indica
conjuntamente la evolución de la reacción sin estreptocinasa (B). El
momento de la formación de un coágulo es caracterizado en cada caso
con una flecha.
Los siguientes Ejemplos sirven para la
explicación ejemplar del procedimiento conforme al invento: En el
ejemplo de sustancias fijadas a partículas, de acuerdo con el
procedimiento de Ullman y colaboradores (Clinical Chemistry (1996)
42: 1518-1526), se llevaron a cabo
ilustrativamente los ensayos fundamentales más importantes del
diagnóstico de la hemostasis. Estos procedimientos se aplican en
diferentes variantes como ensayos de búsqueda, pero también como un
ensayo de factores individuales, pero a fin de cuentas se basan
siempre en el mismo principio fundamental, a saber la determinación
del tiempo que transcurre hasta que se haya formado un coágulo
medible y respectivamente hasta que éste se haya disuelto de
nuevo.
Siempre y cuando no se indique otra cosa
distinta, se utilizaron para los ensayos de hemostasis ciertos
reactivos de la entidad Dade Behring Marburg GmbH, Marburg,
Alemania.
La producción de partículas de sensibilizadores
y de quimioluminiscentes se describe con detalle en el documento EP
0.515.194, y en las citas de Clin. Chem. (1996) 42:
1518-1526 y de Proc. Natl. Acad. Sci. (1994)
91: 5426-5430. Las partículas pueden llevar
p.ej. unas envolturas de dextrano y pueden tener estreptavidina
fijada adicionalmente (véase la cita de Proc. Natl. Acad. Sci.
(1994) 91: 5426-5430). A título ilustrativo
se describe a continuación la producción de una variante de
partículas de sensibilizadores y de quimioluminiscentes (véase el
documento EP 0.515.194, Ejemplo 8, para más detalles):
Una solución de clorofila "a" en alcohol
bencílico (1,0 ml; 0,6 mM) se añade a 8,0 ml de alcohol bencílico,
que ha sido calentado a 105ºC. Una suspensión de perlas de látex
(175 nm, un látex modificado con carboxilo, de Bangs Laboratories.
Carmel, IN) en agua (al 10%; 1,0 ml) se añade a la solución de
alcohol bencílico. La mezcla se agita a 105ºC durante 5 minutos y
luego se enfría a la temperatura ambiente. Se añaden a esto 10 ml
de etanol y la mezcla se centrifuga. El sedimento se vuelve a
suspender en una mezcla de agua y etanol 1:1 (10 ml) y a
continuación se centrifuga de nuevo. El mismo procedimiento se
repite con agua, y a continuación el sedimento se recoge en una
solución fisiológica de cloruro de sodio.
20 ml de la suspensión de partículas de un látex
modificadas con carboxilo (suspensión al 10% en agua) se mezclan con
20 ml de 2-etoxi-etanol. La mezcla
se calienta a 90ºC. Se añaden a la suspensión de partículas 20 ml
de una solución de 10 mM de dioxeno, de 20 mM de un quelato de
europio con el agente
3-(2-tienoíl)-1,1,1-trifluoro-acetona
(Kodak, CAS Nº 14054-87-6) (EuTTA)
y de 60 mM de óxido de trioctil-fosfina (TOPO) en
2-etoxi-etanol. La mezcla se
calienta adicionalmente a 97ºC durante 7 minutos. Después del
enfriamiento a la temperatura ambiente, se añaden 40 ml de etanol y
la mezcla se centrifuga. El sedimento se vuelve a suspender luego en
etanol al 80% y se centrifuga. Este proceso de lavado se repite con
etanol al 10%. Como final, las partículas se recogen en una solución
fisiológica de cloruro de sodio.
Procedimiento habitual: Una agrupación de
plasma normal (Control Plasma N; producto Nº ORKE) así como un
plasma patológico (Pathoplasma II; producto Nº OTXK) se mezclaron
paralelamente en un habitual aparato automático de coagulación, que
mide ópticamente (Behring Coagulation Timer; BCT) con Pathromtin SL
(producto Nº OQGS). Para esto se mezclaron 50 \mul de una muestra
con 50 \mul de Pathromtin SL y después de una incubación durante
2 minutos a +37ºC se comenzó la coagulación mediante adición de 50
\mul de una solución 25 mM de cloruro de calcio (producto Nº
ORHO).
La determinación del tiempo de tromboplastina
parcial activado según el procedimiento conforme al invento
se efectuó con una solución de uso de Pathromtin, preparada a partir
de un activador con caolín (producto Nº OTXC) y de un fosfolípido
(producto Nº OTXB) de acuerdo con los datos del fabricante, así como
una solución de cloruro de calcio 25 mmol/l (producto Nº ORHO). La
determinación se efectuó en un luminómetro. La unidad de medición
está equipada con un láser de diodos de 670 nm (fuente luminosa de
30 mW) y con una unidad contadora de fotones (tubo
fotomultiplicador de Hamamatsu R 4632). Delante del
fotomultiplicador se dispuso una combinación de filtros a base de un
filtro de paso corto y de un filtro de paso largo, que permite una
medición de luz entre 550 nm y 650 nm. El sistema global fue
protegido con respecto de la luz del medio ambiente. Un típico
proceso de medición implica un tiempo de iluminación con ayuda de la
fuente luminosa y una subsiguiente segunda fase, en la que se
recuentan los fotones emitidos por el material sometido a medición.
Este proceso de medición se puede repetir con cualquier frecuencia,
dependiendo del tiempo deseado, en el que se debe observar el
material sometido a medición. El tiempo de iluminación es
típicamente de 0,1 - 3 s. El tiempo de medición puede estar situado
en el mismo intervalo. Entre dos procesos de medición puede estar
situada una fase sin iluminación y respectivamente sin medición,
que se puede escoger dependiendo del número de los necesarios puntos
de medición. Adicionalmente se utilizaron conforme al invento
sustancias fijadas a partículas:
\bullet partículas de un quimioluminiscente =
partículas de un aceptor: 2,5 mg/ml en una solución fisiológica de
cloruro de sodio;
\bullet partículas de un sensibilizador: 2,5
mg/ml en una solución fisiológica de cloruro de sodio.
Se midieron las siguientes muestras:
1 agrupación (pool) de plasma normal (Control
Plasma P, producto Nº OUPZ), 2 plasmas patológicos, que se preparan
por absorción de las enzimas de coagulación dependientes de la
vitamina K (Pathoplasma I, producto Nº ORXK; Pathoplasma II,
producto Nº OTXL), 1 plasma patológico, que se había preparado por
dilución de todos los factores de coagulación (Control Plasma P;
producto Nº OUPZ) así como un suero de un donante de sangre
sano.
Los reactivos se calentaron previamente a +37ºC
antes del uso. Para la realización del ensayo, los componentes se
mezclaron de la siguiente manera:
- 200 \mul de una muestra
- 100 \mul de partículas de un aceptor
- 25 \mul de partículas de un sensibilizador
- 200 \mul de una solución de uso de Pathromtin.
A continuación se incubó a +37ºC durante 2 min y
se comenzó la coagulación por medio de la adición de
- 200 \mul de una solución de cloruro de calcio 25 mM.
Las señales se registraron a lo largo de la
evolución del tiempo.
A partir de las evoluciones de las curvas
obtenidas en el procedimiento conforme al invento se determinaron
los tiempos de coagulación, llevándose a cabo una regresión lineal
en cada caso para la línea de base y para los primeros 10 segundos
de la curva de reacción. El punto de intersección de ambas líneas se
valoró como tiempo de coagulación (véase la Figura 1b).
Resultado: La Tabla 1 muestra que los
tiempos de coagulación de los plasmas, determinados según el
procedimiento conforme al invento, están situados en el intervalo
de valores nominales determinado por el fabricante con
procedimientos clásicos (mecánicos y ópticos). Con un suero no se
obtuvo ninguna señal. En un suero son activas ciertamente las
enzimas de coagulación del respectivo ramal de la coagulación, pero
el coágulo de fibrina ha sido eliminado. Esto muestra que en el
procedimiento conforme al invento la formación del coágulo, pero no
un efecto de cualquier tipo de una enzima de coagulación sobre los
reactivos añadidos, es causante la formación de la
señal.
señal.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | CECA | Intervalo indicado de valores nominales |
| Control Plasma N | 39,2 | 30,1 - 40,7 |
| Control Plasma P | 81,9 | 57,6 - 86,4 |
| Pathoplasma I | 67,1 | 51,2 - 76,8 |
| Pathoplasma II | 99,0 | 67 - 101 |
| Suero | ninguna coagulación |
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación del PT se efectuó mediando
utilización de Thromborel S (Producto Nº OUHP) de acuerdo con los
datos del fabricante, con las muestras mencionadas en el Ejemplo 2,
en un aparato de coagulación que mide ópticamente según un
procedimiento óptico clásico, y en un luminómetro según el
procedimiento conforme al
invento.
invento.
En el BCT (medición turbidimétrica) se añadieron
con pipeta cada vez 50 \mum de Pathoplasma I y respectivamente de
Pathoplasma II a una cámara de medición y se comenzó la coagulación
mediante adición de 100 \mul de Thromborel S.
En el luminómetro, para la realización del
ensayo, los componentes se mezclaron de la siguiente manera:
- 200 \mul de una muestra
- 100 \mul de partículas de un aceptor
- 25 \mul de partículas de un sensibilizador.
Con la adición de
- 400 \mul de Thromborel S
se comenzó la coagulación. Las señales se
registraron a lo largo de la evolución del tiempo. Se mostraron unas
evoluciones prácticamente idénticas de la cinética de reacción,
midiéndose en un procedimiento habitual un aumento del
enturbiamiento, y en el procedimiento conforme al invento un aumento
de la emisión de quimioluminiscencia. Como se describe en el Ejemplo
2, se analizaron las evoluciones de las reacciones, que se habían
obtenido según el procedimiento conforme al invento. Los resultados,
en comparación con los tiempos de coagulación que son de esperar en
procedimientos habituales de acuerdo con los datos del fabricante,
se exponen en la Tabla 2. Se manifiesta, al igual que en el Ejemplo
2, una buena coincidencia. Con un suero como muestra no se obtuvo,
por la razón mencionada en el Ejemplo 2, ninguna modificación de la
señal de medición.
| Muestra | CECA | Intervalo indicado de valores nominales |
| Control Plasma N | 14,7 | 9,5 - 14,3 |
| Control Plasma P | 30,7 | 18,8 - 28,2 |
| Pathoplasma I | 37,0 | 24,6 - 36,8 |
| Pathoplasma II | 56,0 | 40,7 - 61,1 |
| Suero | ninguna coagulación |
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de un tiempo de coagulación en
una sangre entera no es posible en habituales aparatos que miden
ópticamente, puesto que es demasiado alta la densidad óptica de la
muestra. Según el procedimiento conforme al invento, la curva de
reacción de una muestra de sangre entera en un APTT se registró de
la siguiente
manera:
manera:
Los reactivos se calentaron previamente a +37ºC
antes del uso. Para la realización de ensayo, los componentes se
mezclaron de la siguiente manera:
- 100 \mul de una muestra (sangre con citrato)
- 50 \mul de partículas de un aceptor
- 12,5 \mul de partículas de un sensibilizador
- 100 \mul de una solución de uso de Pathromtin.
A continuación se incubó a +37ºC durante 2 min y
se comenzó la coagulación por adición de
- 100 \mul de una solución de cloruro de calcio 25 \muM o de una solución fisiológica de cloruro de sodio.
Las señales se registraron a lo largo de la
evolución del tiempo.
El resultado se muestra en la Figura 2. Como
comparación se registró la curva de reacción (B), que se obtiene
cuando no se añade nada de cloruro de calcio y por consiguiente no
se provoca ninguna acción de coagulación. El ejemplo pone de
manifiesto que también con sangre entera como muestra se obtiene una
curva de reacción que es típica de una coagulación, la cual resulta
mediante la formación de un coágulo y no es provocada por ejemplo
por reacciones colaterales inespecíficas.
Además, mediante la aplicabilidad del
procedimiento conforme al invento a partir de muestras de sangre
entera, se pone de manifiesto que éste es más robusto en
comparación con procedimientos habituales en lo que se refiere a
trastornos de las muestras debidos a enturbiamientos.
La menor susceptibilidad a perturbaciones del
procedimiento conforme al invento frente a enturbiamientos
inespecíficos de la muestra o de reactivos se desprende ya del
Ejemplo 2. Allí, en un luminómetro se llevó a cabo un APTT, en el
que como activador de la fase de contacto del sistema intrínseco de
coagulación se utilizó un caolín (Pathromtin). El caolín es un
mineral estratificado arcilloso en forma de partículas argentinas.
Éstas generan una dispersión de luz tan grande que este reactivo no
se puede emplear en aparatos que miden ópticamente. Por lo tanto,
en un aparato que mide ópticamente, con Pathromtin SL, se empleó
otro activador distinto de fases de contacto, desarrollado
especialmente para aparatos que miden ópticamente. Se trata de
partículas finamente molidas de dióxido de silicio, cuya dispersión
inespecífica de la luz es todavía tolerable.
Para la determinación de la actividad de
fibrinólisis se llevaron a coagulación un plasma normal (Control
Plasma N, producto Nº ORKE) así como una muestra de sangre entera en
el APTT, tal como se describe en los Ejemplos 2 y 4 según el
procedimiento conforme al invento. Al mismo tiempo que la
provocación de la coagulación, mediante adición de una solución que
contenía estreptocinasa (100 UI (unidades internacionales)/ml de una
solución fisiológica de cloruro de sodio; de la entidad Hoechst
Marion Roussel) se provocó también la lisis del coágulo resultante.
La estreptocinasa es una enzima procedente de estreptococos, que
pasa a formar un complejo activo con el plasminógeno. Este complejo
activa a la enzima plasminógeno de la muestra para dar plasmina, la
cual disuelve proteolíticamente al fibrinógeno y precisamente a
coágulos de fibrina. En procedimientos ópticos habituales, esto
conduce a una extinción continua de la señal de medición (véase la
Figura 3a).
Los reactivos se calentaron previamente a +37ºC
antes del uso. Para la realización de ensayo, los componentes se
mezclaron de la siguiente manera:
- 100 \mul de una muestra (Control Plasma N, ORKE)
- 50 \mul de partículas de un aceptor
- 12,5 \mul de partículas de un sensibilizador
- 100 \mul de una solución de uso de Pathromtin.
A continuación se incubó a +37ºC durante 2 min y
se comenzó la coagulación por adición de
- 7,2 \mul de una solución de estreptocinasa (100 UI/ml de una solución fisiológica de cloruro de sodio
- 100 \mul de una solución de cloruro de calcio.
Las señales se registraron a lo largo de la
evolución del tiempo (véase la Figura 3b).
Como consecuencia de la formación incipiente de
un coágulo se llega primeramente, como en los Ejemplos 2 a 4, a un
aumento de la señal de medición. La correspondiente curva de
comparación sin estreptocinasa se dibuja conjuntamente en la Figura
3b, caracterizada como "B". En presencia de estreptocinasa, con
la iniciación de la lisis del coágulo se llega sin embargo a una
elevación repentina de la señal de medición, que es más fuertemente
pronunciada en un plasma que en una muestra de sangre entera
asimismo medida. Esta señal se extingue lentamente luego en la
evolución del tiempo. Éste es un efecto hasta ahora no descrito.
Puesto que la estreptocinasa está presente desde el comienzo y no se
puede consignar ninguna modificación de la evolución de la reacción
hasta la iniciación de la formación del coágulo, este aumento
repentino de la señal no puede haber sido causado por reacciones
colaterales de la solución de estreptocinasa.
Este Ejemplo demuestra una aplicación
enteramente nueva para el diagnóstico del procedimiento conforme al
invento. El aumento de la señal, muy fuerte y rápido, debido a la
disolución de un coágulo - también en sangre entera -
hace posible determinar de una manera muy sensible y nueva el momento de la lisis. En los procedimientos actuales (véase la Figura 3a) se observó solamente la disminución de la señal que también aparece aquí, la cual sin embargo se efectúa tan lentamente según los procedimientos habituales, que la iniciación de la lisis no se podía medir con exactitud hasta ahora.
hace posible determinar de una manera muy sensible y nueva el momento de la lisis. En los procedimientos actuales (véase la Figura 3a) se observó solamente la disminución de la señal que también aparece aquí, la cual sin embargo se efectúa tan lentamente según los procedimientos habituales, que la iniciación de la lisis no se podía medir con exactitud hasta ahora.
Claims (25)
1. Procedimiento para la determinación de un
trastorno de la hemostasis, en el que como consecuencia de una
agregación de plaquetas sanguíneas, de una formación de coágulos y/o
de una disolución de coágulos, se ponen en contacto entre sí
ciertas sustancias en un intervalo de tiempo que permite o reprime
una interacción, en particular una transferencia de energía, entre
las sustancias, y se mide la magnitud de la interacción,
caracterizado porque una o varias de estas sustancias están
fijadas covalentemente, a través de una interacción específica y/o
por adsorción, a partículas suspendibles, y/o están incorporadas en
éstas o constituyen por sí mismas partículas suspendibles o son una
parte de las mismas.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la transferencia de
energía se efectúa mediante moléculas de corta vida, p.ej. oxígeno
singulete, radiación de pequeño alcance, p.ej. una radiación
\beta radiactiva y/o mediante transferencia de energía de acuerdo
con Förster.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la actividad de
sustancias se refuerza o inhibe mediante otras sustancias y esto
conduce a una modificación medible de la señal, tal como por
ejemplo la modificación de la intensidad o de la polarización de la
luz emitida, la inhibición o el aumento de actividades de enzimas
y/o la modificación del comportamiento de fluorescencia.
4. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-3, caracterizado
porque por lo menos una de las sustancias se puede fijar directa o
indirectamente de una manera inespecífica, p.ej. por una interacción
hidrófoba o electrostática, a componentes de un coágulo de sangre
que se forma o disuelve.
5. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-4, caracterizado
porque en el caso de las partículas suspendibles se trata p.ej. de
que cristales de colorantes, soles metálicos, partículas de sílice,
partículas magnéticas, gotas de aceites, partículas de lípidos,
dextrano, agregados de proteínas o de manera preferida partículas de
un látex.
6. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-5, caracterizado
porque la superficie de las partículas, después de su producción, es
modificada adicionalmente y/o las partículas son envueltas por una
o varias capas o valvas fijadas covalentemente o por adsorción -
p.ej. a base de proteínas, hidratos de carbono, sustancias
lipófilas, biopolímeros, polímeros orgánicos o mezclas de éstos
-.
7. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-6, caracterizado
porque como sustancias se emplean agentes fotosensibilizadores y
compuestos quimioluminiscentes y el oxígeno singulete generado por
un fotosensibilizador puede activar a los compuestos
quimioluminiscentes para la emisión de luz.
8. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-6, caracterizado
porque como sustancias se emplean agentes fotosensibilizadores y
compuestos fluorescentes y el oxígeno singulete generado por el
agente fotosensibilizador puede activar al compuesto fluorescente
para la emisión de luz y respectivamente puede reprimir la emisión
de luz en un proceso de extinción.
9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-8, caracterizado
porque como agentes fotosensibilizadores se emplean acetona,
benzofenona, 9-tioxantonas, eosina,
9,10-dibromo-antraceno, clorofila,
fullerenos de Buckminster, azul de metileno, rosa de Bengala,
porfirinas, ftalocianinas y/o sus derivados.
10. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-9, caracterizado
porque como compuestos quimioluminiscentes se emplean olefinas,
9-alquiliden-xantanos,
9-alquiliden-N-alquil-acridanos,
enoléteres, enaminas, aril-vinil-éteres, dioxenos,
aril-imidazoles y/o lucigenina.
11. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-10, caracterizado
porque se ponen en contacto compuestos quimioluminiscentes con
agentes fluoróforos, los cuales pueden ser excitados por los
compuestos quimioluminiscentes activados y emiten luz de una
longitud de onda más alta.
12. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-11, caracterizado
porque se emplean compuestos fluorescentes, los cuales por reacción
con oxígeno singulete experimentan una fotooxidación (= un
fotoblanqueo), tales como por ejemplo
1,3-di-fenil-isobenzofurano,
o reaccionan con oxígeno singulete como compuestos precursores
fotoactivos para dar agentes fluoróforos, tales como por ejemplo
oxeno-umbeliferil-éter o seleniuros de
umbeliferilo.
13. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-12, que se puede emplear para
la detección de una deficiencia, debida a causas genéticas y/o
adquirida, de factores de los sistemas de coagulación de la sangre
y de fibrinólisis, de defectos genéticos de los trombocitos, de
trastornos de la hemostasis debidos a enfermedades, o como
consecuencia de agentes terapéuticos administrados y/o de defectos
genéticos y/o adquiridos del sistema del complemento.
\newpage
14. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-13, caracterizado
porque se determina el tiempo que transcurre hasta la formación de
un coágulo de fibrina.
15. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-14, caracterizado
porque la formación de un coágulo en un plasma o por lo menos en un
fibrinógeno y/o en un medio que contiene plaquetas sanguíneas, se
provoca mediante la adición de una o varias sustancias que provocan
la coagulación.
16. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-15, caracterizado
porque se determina el tiempo de tromboplastina parcial activado
(APTT), el tiempo de tromboplastina (PT), el tiempo de activación
de la proteína C (PCAT), el tiempo del veneno de víbora de Russell
(RVVT) o el tiempo de trombina.
17. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-16, caracterizado
porque para la captación de los factores del sistema de
fibrinólisis, la muestra que se ha medir se puede sustituir con los
factores necesarios para la formación de un coágulo, tal como por
ejemplo por mezclamiento con un plasma deficitario o por la adición
de factores purificados, tales como p.ej. uPA, tPA,
\alpha_{2}-antiplasmina, plasminógeno, el
inhibidor 1 del activador de plasminógeno y/o el factor XII, en
particular la adición de fibrinógeno.
18. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-17, caracterizado
porque se provoca una lisis espontánea o una lisis después de haber
añadido activadores, tales como por ejemplo el factor XIIa, tPA,
uPA, estreptocinasa o directamente después de una adición de
plasmina.
19. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-18, caracterizado
porque mediante un aumento de la señal se determina el momento del
comienzo de la lisis de un coágulo de fibrina.
20. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-19, caracterizado
porque la actividad de las plaquetas sanguíneas se determina a
través de su capacidad para la agregación.
21. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-20, caracterizado
porque la agregación de plaquetas sanguíneas se puede provocar
mediante sustancias tales como adenosina difosfato, colágeno,
trombina, serotonina o epinefrina, ionóforos, el complemento o
estreptolisina.
22. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones 1-21, caracterizado
porque se determina la concentración o la actividad de
medicamentos.
23. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, caracterizado porque se emplea para la
vigilancia terapéutica de niveles de medicamentos.
24. Utilización de un agente de diagnóstico, que
contiene una o varias sustancias, las cuales como consecuencia de
una agregación de plaquetas sanguíneas, de una formación de coágulos
y/o de una disolución de coágulos, se ponen en contacto entre sí en
un intervalo de tiempo, que permite o reprime una interacción, en
particular una transferencia de energía, entre las sustancias,
realizándose que por lo menos una de las sustancias puede fijarse
directa o indirectamente de una manera inespecífica, p.ej. por
interacción hidrófoba o electrostática, a componentes de un coágulo
de sangre que se forma o se disuelve, y una o varias de las
sustancias están fijadas covalentemente, a través de una
interacción específica y/o por adsorción, a partículas suspendibles,
y/o están incorporadas en éstas o constituyen por sí mismas
partículas suspendibles o son una parte de las mismas, para la
realización del procedimiento de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-23.
25. Utilización de un agente de diagnóstico de
acuerdo con la reivindicación 24 para la detección de una
perturbación adquirida o heredada de la hemostasis.
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