MX2010009530A

MX2010009530A - Conjugados de rgd-(bacterio) clorofila para terapia fotodinámica y formación de imágenes de tumores necróticos.

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Publication number: MX2010009530A
Application number: MX2010009530A
Authority: MX
Inventors: Avigdor Scherz; Yoram Salomon; Liat Goldshaid
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2009-03-01
Publication date: 2010-11-30
Also published as: CA2717060A1; US20110064658A1; US8815213B2; ES2764781T3; ZA201006789B; EP2257309A1; CN102036684A; RU2010139461A; KR20100127798A; KR101595138B1; RU2518296C2; WO2009107139A1; CN102036684B; BRPI0907791A2; JP5620279B2; CA2717060C; AU2009219682A1; EP2712627A3; AU2009219682B2; JP2011513298A

Abstract

Se proveen conjugados de RGD-clorofila y RGD-bacterioclorofila que se inician y acumulan en dominios de tumores necróticos durante más tiempo que en dominios no necróticos de tumores, para su uso en la formación de imágenes mínimamente invasiva dirigida a tumores, terapia fotodinámica dirigida a tumores y/o pronóstico en línea de tumores necróticos.

Description

CONJUGADOS DE RGD-(BACTERIO)CLOROFILA PARA TERAPIA FOTODINÁ ICA Y LA FORMACIÓN DE IMÁGENES DE TUMORES NECRÓTICOS CAMPO TÉCNICO La presente invención está en el campo de oncología, y se refiere a la detección de dominios necróticos de tumores por la formación de imágenes fotodinámica dirigida hacia tumores, y el tratamiento de dichos tumores por terapia fotodinámica dirigida hacia tumores usando fotosensibllizadores, en particular conjugados de derivados de clorofila y bacterioclorofila con péptidos que contienen el motivo de RGD o peptidomiméticos de RGD.

Definiciones y abreviaturas Bchl a: bacterioclorofila a: 7,8,17,18-tetrahidroporfirina pentacíclica con un quinto anillo isocíclico, un átomo de Mg central, un grupo fitilo o geranilgeranilo en la posición 173, un grupo COOCH3 en la posición 132, un átomo de H en la posición 132, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 1,2, 18¡ un grupo acetilo en la posición 3 y un grupo etilo en la posición 8, en la presente compuesto V, Bphe: bacteriofeofitina a (Bchl en la cual el Mg central es reemplazado por dos átomos de H)¡ Bpheid: bacteriofeoforbida a (el ácido carboxílico libre de C-172 derivado de Bphe sin el átomo de metal central); Chl: clorofila; rodobacterioclorina: 7,8,17,18-tetrahidroporfirina tetracíclica que tiene un grupo -CH2CH2COOH en la posición 17, un -COOH en la posición 13, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 8 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8; Pd-Bpheid: Pd-bacteriofeoforbida a; EC: células endoteliales; ECM: matriz extracelular; NIR: infrarrojo cercano; PDT: terapia fotodinámica; RGD- C: el nonapéptido cíclico CDCRGDCFC-NH2; ROS: especies de oxigeno reactivas. Se usa la numeración de la IUPAC de los derivados de bacterioclorofila en toda la especificación. Mediante el uso de esta nomenclatura, las bacterioclorofilas naturales poseen dos ésteres de ácido carboxílico en las posiciones 132 y 172; sin embargo, son esterificadas en las posiciones 133 y 173.

TÉCNICA ANTECEDENTE La necrosis y la hipoxia de los tumores primarios y metastásicos se han correlacionado fuertemente con la agresividad de los tumores y el mal, pronóstico en los pacientes con cáncer. Los tumores sólidos que alcanzan un cierto tamaño, extienden su suministro de oxígeno y llegan a ser hipóxicos y finalmente necróticos. En áreas del tumor posicionadas más de 70 pm del vaso sanguíneo nutritivo, la presión de oxígeno intersticial disminuye, y más allá de una distancia de 150-180 pm, las células llegan a ser casi anóxicas (Vaupel et al., 2001). Se cree que la necrosis es el resultado de la isquemia crónica que es causada por el colapso vascular y el rápido crecimiento de las células tumorales que es mayor que la velocidad de la angiogénesis (Léek et al., 1999). Las áreas necróticas en los tumores sólidos sufren modificaciones morfológicas. Al inicio la estructura original es básicamente preservada, y las células necróticas conservan su forma general, pero llegan a ser altamente eosinofílicas. Después de cierto tiempo, este patrón es reemplazado por necrosis por licuefacción, en la cual las estructuras celulares son degradadas (Leek et al., 1999). La necrosis y la hipoxia están bien establecidas como indicadores de mal pronóstico. En el carcinoma de células de transición del tracto urinario superior, mesotelioma maligno y carcinoma de células renales (RCC), se sugirió a la necrosis como un mecanismo de predicción independiente del resultado de cáncer, y como una herramienta muy poderosa para propósitos de pronóstico (Edwards et al., 2003; Sengupta et al., 2005; Lee et al., 2007). En el carcinoma invasivo de la mama, se correlacionó a la necrosis con alta densidad vascular y angiogénesis, altos niveles de infiltración de macrófagos focales y supervivencia disminuida de los pacientes (Kato et al., 1997; Lee et al., 1997; Leek et al., 1999; Tomes et al., 2003). La necrosis central, la cual es una característica común del cáncer de mama invasivo, estuvo asociada con mal resultado y agresión del tumor. Se mostró que los macrófagos son atraídos hacia los tumores necróticos por factores quimiotácticos, liberados por células tumorales hipóxicas o moribundas (Leek et al., 1999). Grandes áreas necróticas en el lumen ductal se observaron en el comedocarcinoma ductal in situ (DCIS) (invasivo), opuestamente al no comedocarcinoma ductal in situ (no invasivo) (Cutuli et al., 2002). La necrosis y la hipoxia en el centro de las lesiones del DCIS con un diámetro de hasta 360 pm, mostraron una diferencia biológica notable en la naturaleza y el comportamiento de las células neoplásicas. De esta manera, se encontró que la presencia o ausencia de necrosis en los conductos, es un criterio factible para la clasificación del DCIS (Bussolati et al., 2000). Se mostró que la necrosis en la mayoría de este tipo de tumores se asocia con hipoxia (Tomes et al., 2003). La hipoxia y la anoxia someten a las células tumorales a tensión oxidativa. Se mostró que las condiciones hipóxicas prolongadas incrementan la frecuencia de las mutaciones, aceleran la progresión del tumor, incrementan la angiogénesis y el potencial metastásico, y activan a las vías de señalización que promueven el crecimiento. La adaptación a la tensión oxidativa hace con frecuencia que las células tumorales sean resistentes a ciertas modalidades terapéuticas (Brown er a/., 2001). La correlación entre la necrosis y la hipoxia está muy bien establecida; sin embargo, podría haber condiciones hipóxicas que no hayan llegado a la necrosis, o necrosis que no necesariamente refleje hipoxia aguda o severa (Dewhirst 1998). Existen varios genes marcadores para hipoxia, entre ellos: el factor 1 inducido por hipoxia (HIF1), el transportador 1 de glucosa y la anhidrasa carbónica IX. Sólo la detección de los tres marcadores garantiza la clasificación de la necrosis (Tomes ef al., 2003), haciendo que la identificación de un área como necrótica por expresión génica sea bastante complicada. Las condiciones necróticas e hipóxicas son conocidas por crear un problema principal en la terapia del cáncer. Los dominios hipóxicos de los tumores son relativamente resistentes al tratamiento con radiaciones, puesto que existe una mala promoción del ataque de la radiación, y puesto que las células madre que finalmente pueden estar presentes en el volumen del tumor no responden bien al tratamiento, resultando en reanudación del crecimiento del tumor (Brown et al., 1998; Dean et al., 2005). Puesto que la mayoría de los reactivos quimioterapéuticos imponen muerte de las células debido a las interacciones con el funcionamiento cíclico de las células, la detención de las células debido a la hipoxia resulta en resistencia a la quimioterapia convencional, dejando células de proliferación lenta o no proliferantes no dañadas (Tannock, 1978). Además, las condiciones hipóxicas crean usualmente un ambiente ácido que podría cambiar la naturaleza del fármaco, haciéndolo menos activo (Tannock et al., 1989). Uno de los aspectos más problemáticos de la quimioterapia de los tumores sólidos implica el tráfico de los agentes terapéuticos en los tumores, y especialmente hacia los dominios hipóxicos y necróticos. Los tumores contienen usualmente microvasos irregulares y permeables con flujo sanguíneo heterogéneo y grandes distancias entre los vasos. Estas características, además de la ausencia de un drenaje linfático adecuado y altas presiones intersticiales, hacen de la difusión el mecanismo más importante del transporte extravascular de nutrientes y fármacos en los tumores. Sin embargo, debido a la vascularización no regular, muchas de las células tumorales están a mayores distancias de los capilares que las células en los tejidos normales, reflejado en que tienen concentraciones insuficientes de agentes antitumorales en los sitios de las células. Además, la presión aumentada del fluido intersticial debido a la falta de drenaje linfático, reduce la captación por convección e inhibe además la distribución de los fármacos en las células tumorales, en particular aquellos de macromoléculas (Minchinton et al., 2006). De esta manera, la capacidad para detectar áreas hipóxjcas y necróticas dentro de los tumores in vivo, es de suma importancia. El conocimiento de los dominios hipóxicos de los tumores podría ayudar a elegir el tratamiento adecuado - ya sea mejorando la oxigenación del tumor antes o durante el tratamiento, o usando estrategias que exploten la hipoxia (Weinmann et al., 2004). Mediante el uso de este procedimiento, la aplicación de citotoxinas activadas por hipoxia tales como 2-ciclopropil-indoloquinonás, AQ4N, Tirapazamine (TPZ) y PR-104, puede ayudar a mejorar el resultado del tratamiento (Brown et al., 2004; Lee et al., 2007; Patterson er a/., 2007). La histopatología y la inmunohistoquímica se usan comúnmente para la identificación de la necrosis y la hipoxia; sin embargo, son invasivas y no permiten la detección in situ. Los métodos in situ incluyen formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) (Kamel et al., 2003; Metz et al-, 2003), MRI dependiente del nivel de oxigenación de la sangre (Kennan et al., 1997), tomografía de emisión de positrones (PET) (Lehtio et al., 2004) y MRI ponderada por difusión (Lang et al., 1998). Los agentes de contraste ávidos de necrosis (NACAs) para MRI, pueden clasificarse en agentes basados en porfirina y no basados en porfirina. Uno de los NACAs basados en porfirina más conocidos es la gadofrina^2, que muestra acumulación específica de necrosis principalmente en los márgenes del área necrótica. Se sugirió que el mecanismo de acumulación se basa en el tráfico de albúmina de suero (SA), pero estudios recientes pusieron en duda este procedimiento (Hofmann et al., 1999; Ni et al., 2005) La mayoría de las células malignas no pueden crecer hasta una masa tumoral clínicamente detectable en ausencia de vasos sanguíneos. Este es el por qué los tumores que alcanzan un cierto tamaño (aproximadamente 2-3 mm3) tienen que cambiar a un fenotipo angiogénico para sustentar su crecimiento. El cambio a un fenotipo angiogénico puede representar una expresión desequilibrada de factores angiogénicos e inhibidores de angiogénesis. La sobreexpresión de los factores angiogénicos y la subregulación de los inhibidores de angiogénesis son necesarias y suficientes para inducir el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, y estos dos procesos usualmente ocurren simultáneamente para activar la angiogénesis del tumor (Cao, 2005). Las características bioquímicas que significan vasos sanguíneos en tumores pueden incluir moléculas relacionadas con la angiogénesis, tales como ciertas integrinas. La familia de las integrinas de receptores de adhesión celular comprende 24 heterodímeros aß distintos que reconocen ligandos de glucoproteína en la matriz extracelular o sobre la superficie de las células. Muchos miembros de la familia de las integrinas, que incluyen a5ß1 , a8ß1 , allbp3, a\ ß3, a?ß5, a?ß6 y a\/ß8, reconocen un motivo de Arg-Gly-Asp (RGD) dentro de sus ligandos. Estos ligandos incluyen fibronectina, fibrinógeno, vitronectina, factor de von Willebrand y muchas otras grandes glucoproteínas (Takagi, 2004). Por lo tanto, se ha sugerido que las moléculas que contienen al motivo de RGD proveen nuevas oportunidades para la captación selectiva y subsiguientemente la formación de imágenes y la detección de lesiones, áreas necróticas y terapias dirigidas hacia tumores primarios. Este campo de investigación está logrando atención incrementada. Existen muchos reportes del uso de componentes marcados con RGD para la formación de imágenes (Temming et al., 2005). El principal inconveniente reportado en la literatura es la concentración insuficiente del elemento de reporte en el sitio de tumores abajo de 4-5 mm. Este es el por qué el uso de la formación de imágenes dirigida hacia RGD fue restringido principalmente a PET-scan, que es un método más sensible. El entendimiento del crecimiento del tumor, la formación de metástasis, la interacción tumor-hospedero y la angiogénesis, requiere modelos de tumores que permitan el fácil rastreo de las células tumprales incluso a su nivel individual. Los métodos previos usados para la medición directa de los parámetros biológicos más significativos de los tumore$ sólo han sido alcanzables por medio de procedimientos de punto de extremo invasivos (Lyons, 2005). La mayoría de dichos métodos implica examen histopatológico o inmunohistoquímica, los cuales son procedimientos lentos, invasivos y no siempre sensibles (Yang et al., 2000). Por lo tanto, fue necesario introducir nuevos métodos que permitieran la visualización directa de tejidos tumorales, fuesen no invasivos y permitieran la medición de los parámetros relevantes del tumor al nivel celular y molecular. En años recientes, se han desarrollado varios métodós no invasivos: MRI y espectroscopia, PET, tomografía computada de emisión de fotones individuales y tomografía computada (Lyons, 2005). Existen varios métodos de formación de imágenes que se basan en transgenes. Estos métodos permiten la medición no invasiva de una amplia gama de parámetros biológicos con especificidad excelente por el tumor, la formación de imágenes de cuerpo entero en animales modelo vivos, y la detección de metástasis. Dos de estos métodos son: formación de imágenes de bioluminiscencia y formación de imágenes de fluorescencia. La bioluminiscencia óptica se basa en tres componentes: la enzima luciferasa, el substrato luciferina y adenosín trifosfato (ATP). En este método, no se requiere excitación por la luz para generar la emisión de luz. Sin embargo, si uno de estos componentes está ausente, ninguna detección es posible. El método permite el monitoreo de la viabilidad de las células o la función de las células a un alto rendimiento, debido al buen valor de señal/ruido (Lyons, 2005). Las principales desventajas del método de la luciferasa/luciferina, son las bajas resoluciones anatómicas y de la imagen, requiriendo de esta manera una cantidad sustancial de tiempo para colectar suficientes fotones para formar una imagen de un animal anestesiado. Además, la profundidad incrementada del tejido y la necesidad del suministro exógeno del substrato, atenúan la emisión de luz in vivo (Yang et al., 2000; Lyons, 2005). Además, los experimentos ex vivo son difíciles de realizar, puesto que se requiere ATP para la actividad enzimática. De modo importante, el método implica parameterización subjetiva que reduce su valor cuantitativo. Otra forma de monitorear la progresión de los tumores por la formación de imágenes de fluorescencia óptica, se basa en la transfección de las células tumorales con una proteína fluorescente estable tal como la proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína fluorescente roja (RFP). En este método, existe la necesidad de excitación externa antes de que pueda detectarse emisión. Las principales desventajas de este método son que (1) las luces de excitación y emisión están propensas a atenuación con la profundidad incrementada del tejido, y (2) la autofluorescencia de las células no marcadas incrementa el ruido (Lyons, 2005). Las principales ventajas incluyen: longitudes de onda de reporteros múltiples que permiten la formación de imágenes multiplex; alta compatibilidad con una gama de procedimientos ex vivo para métodos analíticos tales como el análisis dé tejido fresco; no hay necesidad de procedimientos preparativos para la formación de imágenes, lo cual lo hace únicamente adecuado para visualizar tejido in vivo; el método es externo y no invasivo; el método provee una formación de imágenes óptica de fluorescencia en tiempo real de tumores que crecen internamente y metástasis en animales trasplantados que pueden dar una imagen de cuerpo entero, pero también la imagen de células individuales extraídas de la lesión primaria y metástasis (Yang et al., 2000; Lyons, 2005). La formación de imágenes de cuerpo entero es una de las herramientas más requeridas para entender el desarrollo de los tumores. De esta manera, mediante la marcación genética de las células tumorales con GFP o RFP, puede lograrse la formación de imágenes de cuerpo entero externa de tumores primarios y metastásicos (Yang et al., 2000). La marcación por fluorescencia es adecuada para la detección in vivo, de tejido fresco e in vitro. El uso de células tumorales que expresan proteínas fluorescentes, permite la formación de imágenes de animales vivos y el seguimiento de la progresión del tumor en diferentes puntos de tiempo. La RFP tiene una emisión de longitud de onda más larga que la GFP, permitiendo de esta manera mayor sensibilidad y resolución del crecimiento de tumores microscópicos (longitud de onda de excitación de la GFP; - 489 nm, longitud de onda de emisión - 508 nm, longitud de onda de excitación de la RFP - 558 nm, longitud de onda de emisión - 583 nm). El carcinoma ductal in situ (DCIS) comprende una proliferación clonal de células que parecen ser malignas y se acumulan dentro del lumen de los conductos de la mama sin evidencia de invasión en el estroma adyacente de la mama y más allá de la membrana basal epitelial. Existe una oportunidad significativa de transformación de las lesiones del DCIS no invasivo en una enfermedad invasiva que pone en riesgo la vida si no se trata en una etapa temprana. Después del uso extenso de la mamografía, ha habido un incremento dramático en el número de pacientes diagnosticados con DCIS en la etapa temprana, y la modalidad de tratamiento recomendada ha cambiado en consecuencia de mastectomía (con índice de curación cercano a 100%) a cirugía de conservación de la mama (BC) (BCS), por ejemplo, lumpectomía o cirugía de mama mínimamente invasiva (Kepple et al., 2004), opcionalmente acompañada de RT y terapias endocrinas adyuvantes. Sin embargo, recientemente se encontró que los índices de recurrencia después de BCS, tanto ipsilateralmente (misma mama) como contralateralmente (otra mama), incluso cuando van acompañados de RT, son significativamente mayores que después de mastectomía, en particular para pacientes a la edad de =40 años (índice de regresión de 25-35%; Bijkér N er al., 2006; Cutuli et al., 2002). Además, las lesiones multifocales plantean una dificultad para la disección parcial, y lo mismo es aplicable para los márgenes persistentemente involucrados que se encontró son críticos para concluir la regresión del tumor (Cellini et al., 2005). Además, la carga física y psicológica y los resultados cosméticos posibles de la lumpectomía seguida de RT, son significativos. Estos inconvenientes hacen que el tratamiento y el manejo del DCIS hoy en día sean problemas controversiales en la terapia del cáncer de mama, y han estimulado la búsqueda de modalidades nuevas y/o complementarias de tratamiento y pronóstico.

El DCIS es una forma biológicamente heterogénea de malignidad con una presentación clínica, histología, características celulares y potencial biológico diversos. Se ha clasificado en comedocarcinoma ductal in situ (DCIS) (invasivo) y no comedocarcinoma ductal in situ (no invasivo), en donde el comedocarcinoma tiene un mayor grado, con un subtipo potencialmente más invasivo, conteniendo característicamente una gran área necrótica en el lumen ductal y células con atipia citológica notable. Se espera que aproximadamente dos terceras partes de los pacientes con DCIS de grado bajo a intermedio tengan una enfermedad ipsilateral multifocal, con espacios intermedios que puedan alcanzar 1 cm entre diferentes focos (Cutuli et al., 2002). Las lesiones de alto grado tienden a ser continuas, con espacios intermedios menores de 5 mm (Cellini et al., 2005). El desarrollo natural del DCIS no invasivo en un tumor de mama invasivo puede tardar 15-20 años, e implicar 14 a 60 por ciento de las mujeres diagnosticadas (Burstein eí al., 2004). De hecho, el DCIS parece representar una etapa de desarrollo del cáncer de mama en el cual muchos de los eventos moleculares que definen el cáncer de mamá invasivo, ya están presentes (Cutuli et al., 2002; Holland et al., 1990). Específicamente, aproximadamente 30% de las lesiones de bajo grado se desarrollarán en carcinoma invasivo, si se dejan sin tratar (Sanders et al., 2005). Las lesiones con un diámetro mayor de 2.5 cm van acompañadas con frecuencia de tumores microinvasivos ocultos que pueden no exceder 0.1 mm. El envolvimiento de los márgenes del tumor provee un marcador de pronóstico importante. Cerca de la excisión (menos de 1 mm) o márgenes positivos, las áreas de alto grado y/o comed onecróticas están asociadas con un mayor riesgo de recurrencia. Al igual que en muchos otros cánceres, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) en el cáncer de mama desempeña una función central en la progresión local del tumor y el desarrollo de metástasis distante (Boehm-Viswanathan, 2000; Kieran et al., 2003). Significativamente, se encontró mayor densidad de microvasos (MVD) en el tejido del DCIS en comparación con el tejido normal circundante (Guidi et al., 1994; Guidi et al., 1997; Guinebretiére et al., 1994). Lesiones fibroquísticas con la más alta densidad vascular están asociadas con un mayor riesgo de cáncer de mama (Guidi ef al., 1994; Guidi et al., 1997; Guinebretiére et al., 1994). Los exámenes histopatológicos de las lesiones agresivas del DCIS estuvieron asociados con MVD y expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) incrementados (Guidi et al., 1997; Schneider er al., 2005). Las correlaciones clinicopatológicas confirman también la función cardinal de la angiogénesis en la progresión del cáncer de mama, haciéndolas un objetivó atractivo para la terapia y el pronóstico del DCIS (Folkman, 1997; Krippl et al., 2003; Relf et al., 1997). La coopción de los vasos, el crecimiento por intususcepción (Patán et al., 1996), el mimetismo vascular y la vasculogénesis, son procesos de ocurrencia natural que pueden disminuir la dependencia que exhibe el tumor por la angiogénesis clásica. De importancia particular es el hallazgo de que el cáncer de mama inflamatorio depende casi enteramente de la vasculogénesis, debido aparentemente a la incapacidad de las células cancerosas para unirse a las células endoteliales. La dependencia crítica que exhibe el DCIS por un lecho vascular altamente denso, ha hecho que las terapias antiangiogénica (inhibición de la formación de nuevos vasos sanguíneos) y antivascular (oclusión/destrucción de vasos sanguíneos existentes) (Shimizu et al., 2005; Thorpe, 2004), sean opciones atractivas para la terapia localizada del BC (Schneider et al., 2005; Folkman, 1996). Por supuesto, fármacos antiangiogénicos tales como el bevacizumab (un anticuerpo de receptor anti-VEGF-A) y SU011248 (un inhibidor de tirosina del receptor del VEGF) están en pruebas clínicas dé fase II. De modo interesante, se encontró también que el tamoxifeno posee actividad antiangiogénica. Sin embargo, un cuerpo creciente de evidencia indica deficiencias en el procedimiento antiangiogénico. Estas incluyen la necesidad de un tratamiento crónico, la falla parcial de la "teoría de resistencia por resistencia" (Schneider ef al., 2005; Streubel et al., 2004) y resistencia farmacocinética. Después de estos obstáculos, el procedimiento antivascular parece ser actualmente más prometedor, que se espera resulte en la erradicación del tumor entero sin la necesidad de tratamiento crónico (Folkman, 2004). Una vía prometedora recientemente emergente para el tratamiento dirigido hacia el sistema vascular, es la terapia fotodinámica (VTP). Asimismo, la determinación del blanco de metales paramagnéticos con relaxividad adecuada, entidades químicas que emiten positrones (por ejemplo 64Cu), o sondas de fluorescencia para el lecho vascular denso del DCIS, deben abrir nuevas vías para la detección de las lesiones relacionadas, la definición de márgenes y el pronóstico, como se explica a continuación. Se mostró que la detección por fluorescencia de lesiones de cáncer de mama, es útil para una profundidad de hasta 10 mm (Britton, 2006). La MRI dinámica con Gd como un agente de contraste se^ basa en la falta de estanqueidad aumentada de la vasculatura del tumor, y se usa actualmente para la localización de tumores en la mama (Rankin, 200Q). Sin embargo, el uso actual de la MIR es limitado por el tiempo de integración breve disponible de los agentes de contraste que residen brevemente, pero no son absorbidos selectivamente por el tejido tumoral. La terapia fotodinámica (PDT) genera un estallido de especies de oxígeno reactivas (ROS) citotóxicas en un sitio de tratamiento seleccionado. Debido a su duración de vida breve, la toxicidad de las ROS es confinada al sitio iluminado. La PDT consiste típicamente de cinco pasos: 1. Administración intravenosa (IV) de un fotosensibilizador; 2. Un período que permite que una concentración deseable de fotosensibilizadores llegue al tejido objetivo; 3. Iluminación del sitio objetivo transcutáneamehte o intersticialmente con luz láser de alta intensidad (hasta 1W para iluminación continua) por medio de fibras ópticas delgadas (0.4 mm de diámetro o menos) para iluminación profunda del tejido con la generación local consecuente de ROS citotóxicas; 4. Desarrollo de necrosis del tumor y erradicación del tumor; 5. Reconstrucción y curación del tejido.

La PDT dirigida hacia la vasculatura (VTP) apunta hacia la generación de ROS dentro de los vasos sanguíneos del tejido tratado que puede lograrse por iluminación del tejido inmediatamente después de la administración del sensibilizador, o usando sensibilizadores que no se extravasen de la circulación. Varias generaciones de sensibilizadores de bacterioclorofila denominados en la presente como "derivados de BchI" o "BchID", se han desarrollado en el laboratorio de los presentes inventores. Los compuestos sintetizados (Rosenbach-Belkin et al., 1996; documento US 5,650,292) poseen una absorción muy fuerte en el NIR (750-765 nm) que permite la penetración profunda de la luz en los tejidos del sujeto, garantizando un diámetro de tratamiento de hasta 4 cm alrededor de una fibra cilindrica a altas velocidades de fluencia (20mW-1W). Tras la iluminación, una alta concentración local de ROS (radicales OH y O2") es generada en el tumor y la vecindad por la BchID circulante, resultando en coagulación sanguínea y perforación de los vasos del tumor seguida de una detención completa de la vasculatura del tumor dentro de minutos de iluminación. Con algunos; derivados de BchI, se observó intoxicación directa de las células endoteliales (Gross et al., 2003; Mazor et al., 2005). Por razones que están actualmente bajo investigación, la respuesta vascular del tumor es notablemente más rápida y más severa en comparación con la de los vasos en el tejido normal circundante. La eficacia del tratamiento resulta en altos índices de curación (60-90% de supervivencia de los animales) ( azor et al., 2005). De modo importante, los sensibilizadores inyectados IV se depuran rápidamente de la circulación de los animales tratados (Ti/2 está en el orden de minutos a horas) (Mazor et al., 2005), evitando la toxicidad prolongada de la piel y permitiendo la repetición del tratamiento si fuese necesario. En pruebas clínicas de fase II en cáncer de próstata localizado en los pacientes, en donde la radioterapia falló (Weersink et al., 2005), la VTP basada en BchID ha resultado generalmente en una erradicación exitosa de las lesiones del tumor en 50-60% de los pacientes tratados, y reconstrucción del tejido. Un segundo tratamiento en modelos animales y humanos (pruebas clínicas de fase ll/lll), parece resultar en índices de curación similares o mayores por sesión (dependiendo del fármaco y la dosis de luz), incrementando el índice de éxito general esperado hasta aproximadamente 90% después de 2 a 3 sesiones. De modo importante, se encontraron índices de curación notablemente mayores por sesión en estudios en animales con mayores dosis del sensibilizador aplicado. La terapia fotodinámica (PDT) en tumores implica la combinación del fotosensibilizador administrado y el suministro de luz local, ambos agentes inocuos por sí mismos, pero en presencia de oxígeno molecular, son capaces de producir especies de oxígeno reactivas (ROS) citotóxicas que pueden eliminar a las células. Siendo una modalidad de tratamiento binaria, la PDT permite mayor especificidad, y tiene el potencial de que es más selectiva y sin embargo no menos destructiva cuando se compara con la quimioterapia o la radioterapia usadas comúnmente (Dougherty et al., 1998).

La aplicación de derivados de bacterioclorofila (Bchl) novedosos como sensibilizadores en PDT, ha sido reportada por los presentes inventores en años recientes (Zilberstein et al., 2001 ; Schreiber et al., 2002; Gross et al., 1997; Zilberstein et al., 1997; Rosenbach-Belkin et al., 1996; Gross et al., 2003a; Koudinova et al., 2003; Preise et ai, 2003; Gross et al., 2003b) y en las publicaciones de patente US 5,726,169 US 5,650,292, US 5,955,585, US 6,147,195, US 6,740,637, US 6,333,319, US 6,569,846, US 7,045,117, DE 41 21 876, EP 1 246 826, WO 2004/045492 y WO 2005/120573. Los espectros, fotofísica y fotoquímica de los derivados de Bchl, las han hecho moléculas cosechadoras de luz óptimas con claras ventajas sobre otros sensibilizadores usados actualmente en PDT. Estos derivados de Bchl son principalmente polares y permanecen en la circulación por un tiempo muy corto con prácticamente ninguna extravasación en otros tejidos (Brandis, 2003; Mazor et al., 2005). Por lo tanto, estos compuestos son buenos candidatos para la PDT dirigida hacia la vasculatura (VTP) que depende del encuentro intravascular temporal breve (5-10 minutos) con la luz y mayor susceptibilidad de los vasos del tumor a las ROS citotóxicas generadas por la PDT. Estudios recientes realizados por el grupo de los presentes inventores, mostraron que la fotosensibilización primaria es intravascular con desarrollo rápido de oclusiones isquémicas y estasis dentro del período de iluminación. Este proceso promueve también la peroxidación de lípidos (LPO) inducida fotoquímicamente y la muerte temprana de células endoteliales que es confinada principalmente a la vasculatura del tumor (Koudinova et al., 2003). Debido a la progresión independiente de la luz, de reacciones en cadena de radicales libres junto con el desarrollo de hipoxia, la LPO y la muerte de células se extienden más allá del compartimiento vascular para abarcar el intersticio entero del tumor hasta que la necrosis completa del tumor se logra alrededor de 24 horas post-PDT. Por lo tanto, la ¡acción primaria de la PDT bloquea el riego sanguíneo e induce hipoxia que inicia, en una segunda manera, una serie de eventos moleculares y fisiopatológicos que culminan con la erradicación del tumor. De modo importante, este proceso depende de las diferencias entre la respuesta de los vasos sanguíneos normales y del tumor a las ROS generadas. La solicitud internacional No. WO 2008/023378 de los mismos solicitantes, incorporada en su totalidad en la presente como referencia como se describe enteramente en la presente, describe conjugados novedosos de derivados de porfirina, clorofila y bacterioclorofila (BchI) con péptidos que contienen el motivo de RGD o con peptidomiméticos de RGD, y su uso en métodos de terapia fotodinámica in vivo y el diagnóstico de tumores, y diferentes enfermedades vasculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad. En particular, el derivado de BchI c(RGDfK)-Pd-MLT (compuesto 24) mostró acumulación de hasta 4-8 µ? en xenoinjertos de tumores primarios, y permanece en el sitio del tumor por tiempo prolongado, permitiendo la acumulación de la señal y una buena relación de señal a ruido. La determinación del blanco de la fluorescencia es adecuada para la detección in vivo, de tejido fresco e in vitro. c(RGDfK)-Pd-MLT tiene fluorescencia intrínseca en el infrarrojo cercano (NIR) que puede ser detectada. c(RGDfK)-2H-MLT tiene una capacidad luminiscente tres órdenes de magnitud mayor y, por lo tanto, podría ser un candidato incluso mejor para la formación de imágenes dirigida. En este estudio, los presentes inventores mostraron que estas moléculas abren la posibilidad de detectar con precisión los márgenes y la necrosis del tumor en el modelo de adenocarcinoma de mama humano. La detección de los márgenes y la necrosis del tumor, presenta hasta la fecha dos de los problemas más desafiantes en el tratamiento de los tumores. Además, ambas son mecanismos de predicción fieles de la reanudación del crecimiento del tumor después del tratamiento. De esta manera, en el futuro, cuando se apliquen clínicamente, se espera que los derivados de RGD mencionados anteriormente sean adecuados para la detección de necrosis y tumores en la mesa de operaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora de conformidad con la presente invención, que los conjugados de RGD-(bacterio)clorofila descritos en el documento WO 2008/023378 mencionado anteriormente, se alojan y se acumulan en los dominios necróticos del tumor por mucho más tiempo que en los dominios no necróticos del tumor. La presente invención se refiere de esta manera al uso de dichos conjugados de RGD-bacterioclorofila y RGD-clorofila, en la formación de imágenes dirigida hacia tumores mínimamente invasiva, la terapia fotodinámica dirigida hacia tumores y/o el pronóstico en línea de tumores necróticos, y a métodos para los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1C muestran los plásmidos usados para la transfección de líneas de células tumorales con proteína fluorescente roja (RFP). Figura 1A: plásmido pDsRed2-N1 (Clontech, Palo Alto, CA), Figura 1B: pDsRed-Monomer-Hyg-C1 (Clontech, Palo Alto, CA), Figura 1C: pDsRed-Monomer-Hyg-C1 modificado. Las figuras 2A-2B muestran clones fluorescentes de las células transfectadas de las figuras 1A-1C como se detectan con microscopio de fluorescencia (Nikon, aumento de 10X) después de exposición por 3 segundos. Figura 2A: clon 1 de MDA-MB-231 RFP (resistente a G418). Figura 2B: clon 3 de MDA-MB-231 RFP (resistente a higromicina). Las figuras 3A-3B muestran imágenes de tumores extirpados y el análisis histológico (tinción con hematoxilina y eosina) de secciones transversales de tumores MDA-MB-231 -RFP. Figura 3A: gran tumor (~1 cm3). Figura 3B: pequeño tumor (~0.5 cm3) (ND - dominio necrótico, VD - dominio viable). Las figuras 4A-4B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MDA-MB-231 -RFP (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de 15 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 4A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 4B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 5A-5B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de los días 1 a 7 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 5A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 5B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 6A-6B muestran la acumulación del compuesto 3 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de 20 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 6A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 6B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 7A-7B muestran la acumulación del compuesto 3 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de los días 1 a 3 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 7A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 7B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR.

La figura 8 es una gráfica que muestra la medición de la señal de fluorescencia del compuesto 13 en el tumor contra el lado colateral. Se midió la señal de fluorescencia en fotones/segundo/cm2 en 9 animales para el tumor y el lado colateral. Se recabaron resultados de 15 minutos a 216 horas posteriores a la inyección del compuesto 13. Se da el resultado promedió para todos los animales en cada punto de tiempo, así como la relación de la fluorescencia entre el tumor y el lado colateral. Las figuras 9A-9B muestran la acumulación del compuesto 24 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 24. Se tomaron imágenes de 1 hora a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 9A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 9B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 10A-10B muestran la acumulación del compuesto 24 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 24, y se tomaron imágenes de los días 1 a 7 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 10A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 10B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 11A-1 1B muestran la acumulación del compuesto 24 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 24, y se tomaron imágenes de 20 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 11A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 11 B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 12A-12B muestran la acumulación del compuesto 24 en el tumor ortotópico MDA- B-231-RFP (tamaño del tumor -0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 24, y se tomaron imágenes de los días 1 a 2 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 12A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 12B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 13A-13B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MLS-mBanana (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de 1 hora a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 13A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 13B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 14A-14B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MLS-mBanana (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de los días 1 a 4 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 14A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 14B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 15A-15B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MLS-mBanana (tamaño del tumor --0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de 10 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 15A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 15B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 16A-16B muestran la acumulación del compuesto 13 en el tumor ortotópico MLS-mBanana (tamaño del tumor ~0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 13. Se tomaron imágenes de los días 1 a 4 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 16A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 16B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 17A-17B demuestran la comparación de la acumulación del compuesto 13 en tumores necróticos y no necróticos primarios MLS-mBanana de ovario humano. Se tomaron imágenes 2 días posteriores a la inyección del compuesto 13. Se tomaron imágenes de la fluorescencia del NIR de cuerpo entero in vivo del compuesto 13. Figura 17A: tumores no necróticos (-0.5 cm3). Figura 17B: tumores necróticos (~1 cm3). Las figuras 18A-18B muestran la acumulación del compuesto 25 en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 25, y se tomaron imágenes de 5 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 18A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 18B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 19A-19B muestran la acumulación del compuesto 25, en el tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor ~1 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 25, y se tomaron imágenes de los días 1 a 3 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 19A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 19B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 20A-20B muestran la acumulación del compuesto 25 en el tumor no necrótico ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor ~0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 25, y se tomaron imágenes de 10 minutos a 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Figura 20A: formación de imágenes de fluorescencia roja. Figura 20B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 21A-21B muestran la acumulación del compuesto 25 en el tumor no necrótico ortotópico MDA-MB-231-RFP (tamaño del tumor -0.5 cm3). Se inyectó a ratones con el compuesto 25, y se tomaron imágenes de los días 1 a 3 posteriores a la inyección del fármaco. Figura 21A: formación; de imágenes de fluorescencia roja. Figura 21 B: formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Las figuras 22A-22D muestran la prueba de competencia de la acumulación del compuesto 13 en el tumor primario MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico (tamaño del tumor -0.5 cm3) cuando se administró 1 hora después de la administración de c(RGDfK) libre. Se tomaron imágenes 24 horas posteriores a la administración del compuesto 13. Figuras 22A, 22B - formación de imágenes de fluorescencia roja; Figuras 22C, 22D - formación de imágenes de fluorescencia del NIR. Figuras 22A, 22C: se administro el compuesto 13 1 hora después de la administración de c(RGDfK) libre (competencia). Figuras 22B, 22D: control, sólo se administró el compuesto 13. Las figuras 23A-23F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 10 minutos posteriores a la inyección del fármaco. Figuras 23A. 23B y 23C, son una fotografía de cuerpo entero in vivo, imagen de fluorescencia roja e imagen de fluorescencia del NIR, respectivamente, del animal intacto; Figuras 23D, 23E y 23F, son una fotografía, imagen de fluorescencia ¡ roja e imagen de fluorescencia del NIR, respectivamente, del tumor extirpado (el tumor fue cortado a la mitad) (ND - dominio necrótico, VD - dominio viable). Las figuras 24A-24F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 1 hora posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 24A, 24B, 24C y 24D, 24E, 24F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 25A-25F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP; medida 4 horas posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 25A, 25B, 25C y 25D, 25E, 25F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 26A-26F muestran la acumulación del compuesto 3 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 26A, 26B, 26C y 26D, 26E, 26F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 27A-27F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 3 días posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 27A, 27B, 27C y 27D, 27E, 27F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 28A-28F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico DA-MB-231-RFP medida 5 días posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 28A, 28B, 28C y 28D, 28E, 28F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 29A-29F muestran la acumulación del compuesto 13 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 7 días posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 29A, 29B, 29C y 29D, 29E, 29F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 30A-30F muestran la acumulación del compuesto 24 en las áreas viables contra necróticas del tumor ortotópico MDA-MB-231-RFP medida 9 días posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 30A, 3QB, 30C y 30D, 30E, 30F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente.

Las figuras 31A-31F muestran la acumulación del compuesto 13 en la necrosis central del tumor MLS-mBanana, medida 7 días después de la inyección. Las figuras 31A, 32B, 33C y 34D, 35E, 36F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 32A-32F muestran la acumulación del compuesto 13 en la necrosis no central del tumor MLS-mBanana, medida 7 días posteriores a la inyección del fármaco. Las figuras 30A, 30B, 30C y 30D, 30E, 30F son como se describieron anteriormente para las figuras 23A, 23B, 23C y 23D, 23E, 23F, respectivamente. Las figuras 33A-33D muestran la imagen del tumor extirpado y el análisis histológico (tinción con hematoxilina y eosina) de la sección transversal del tumor MDA-MB-231-RFP. Figura 33A: fotografía de: la superficie en sección transversal del tumor (apariencia macroscópica). Figura 33B: presentación histológica de la superficie en sección transversal (apariencia microscópica). Figura 33C: vista a potencia media del área encerrada en la Figura 33B. Figura 33D: vista a alta potencia de una región en la interfaz entre el tejido viable y necrótico. Las figuras 34A-34B muestran un ejemplo representativo de la respuesta local del tumor MDA-MB-231-RFP humano a la PDT. Un ratón con xenoinjerto de MDA-MB-231-RFP (-0.5 cm3) en el dorso, fue inyectado i.v. con 7.5 mg/kg del compuesto 13 e iluminado 8 horas después a través de la piel. Figura 34A: fotografías tomadas del día 0 (antes del tratamiento) y después del tratamiento a 1 , 4, 7, 12 y 90 días. Figura 34B: formación de imágenes de fluorescencia roja de cuerpo entero in vivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es un objetivo principal de la presente invención proveer conjugados de fotosensibilizadores que dirijan especialmente el sensibilizador hacia los dominios necróticos de tumores necróticos. Existen algunas ventajas para la terapia fotodinámica (PDT) dirigida hacia tumores sobre la determinación de tumores como blanco con la quimioterapia convencional. Primero, durante la acumulación de un fármaco convencional dirigido, es con frecuencia activo, a menos que sea un profármaco, mientras que el fotosensibilizador dirigido no es activo hasta que sea iluminado localmente. Segundo, un fármaco convencional dirigido se unirá y actuará también en objetivos no deseables presentando la dirección guiada, mientras que el fotosensibilizador dirigido será activado sólo en el sitio iluminado relevante. De esta manera, en un amplio aspecto, la presente invención se refiere al uso de un conjugado de un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD y un fotosensibilizador de clorofila o bacterioclorofila, para formación de imágenes dirigida hacia tumores mínimamente invasiva, PDT dirigida hacia tumores y/o pronóstico en línea de tumores necróticos. Los términos "péptido que contiene RGD" o "péptido de RGD" se usan recíprocamente en la presente, y significan un péptido que contiene la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD), referida también como motivo de RGD. El término "peptidomimético de RGD", como se usa en la presente, se refiere a compuestos, particularmente compuestos no peptídicos, que imitan a péptidos y tienen el motivo de RGD. Los péptidos de RGD son conocidos por interactuar con los receptores de integrina de las células, y tienen el potencial de iniciar procesos de señalización celular e influir sobre muchas enfermedades. Por estas razones, el sitio de unión de RGD a la integrina se ha considerado como un objetivo farmacéutico atractivo. El péptido que contiene RGD puede ser un péptido lineal o cíclico compuesto de 4-100, de preferencia 5-50, 5-30, 5-20 ó, más preferiblemente, 5-10, residuos de aminoácido. En modalidades preferidas, él péptido de RGD está compuesto de 4, 5, 6, 7, 9 o 25, más preferiblemente 5 residuos de aminoácido. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" incluye los 20 aminoácidos de ocurrencia natural, así como aminoácidos no naturales. Ejemplos de aminoácidos naturales adecuados para la invención incluyen, pero no están limitados a, Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, His, Gln, Glu, Gly, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val. Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no están limitados a, ácido 4-aminobutírico (Abu), ácido 2-aminoadípico, áddó diaminopropiónico (Dap), hidroxilisina, homoserina, homovalina, homoleucina, norleucina (Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), TIC, naftilalanina (Nal), derivados metilados de anillo de Phe, y derivados halogenados de Phe u o- metil-Tyr.

El término "aminoácido" incluye también en la presente aminoácidos modificados tales como modificaciones que ocurren post- traducción in vivo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreoniha; D- modificación; acilación o alquilación, de preferencia metilación, del ¡grupo amino terminal o del grupo amino libre de Lys; esterificación o amidación del grupo carboxi terminal o de un grupo carboxi libre de Asp o Glu; y esterificación o eterificación del grupo hidroxilo de Ser o Tyr.

El término "aminoácido" incluye D- y L-aminoácidos. De esta manera, los péptidos usados en los conjugados de la invención pueden ser todos D-aminoácidos (salvo por la glicina), todos L-aminoácidos o todos L,D- aminoácidos. Las D-modificaciones de los aminoácidos y la N-alquilacion del enlace peptídico son más benéficas para prevenir la digestión del péptido por las enzimas en el organismo. En la presente invención, un D-aminoácido es indicado por una letra pequeña como para el residuo de D-fenilalanina "f en el péptido cicloRGDfK de SEQ ID NO: 1 usado en la presente.

La presente invención incluye también péptidos cíclicos. Los péptidos pueden ser ciclizados por una variedad de métodos tales como la formación de disulfuros, sulfuras y, especialmente, la formación de lactama entre las funciones carboxilo y amino de los extremos N- y C-terminal de las cadenas laterales de aminoácidos. La ciclización puede lograrse por cualquier i método conocido en la técnica, por ejemplo, a través de la formación de enlaces de amida, por ejemplo, incorporando Glu, Asp, Lys, Orn, ácido diaminobutírico (Dab) o ácido di-aminopropiónico (Dap) en varias posipiones en la cadena (enlaces -CO-NH o -NH-CO). Puede lograrse también la ciclización de estructura de base a estructura de base a través de la incorporación de aminoácidos modificados de las fórmulas H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH o H-N((CH2)n-NH2)-C(R)H-COOH, en donde n = 1-4, y en donde además R es cualquier cadena lateral natural o no natural de un aminoácido. Puede lograrse también la ciclización por medio de la formación de enlaces S-S a través de la incorporación de dos residuos de Cys. Puede lograrse la ciclización adicional de cadena lateral a cadena lateral por medio de la formación de un enlace de interacción de la fórmula -(CH2)n-S-CH2-CO-, en donde n = 1 ó 2, lo cual es posible, por ejemplo, a través de la incorporación de Cys u homoCys y reacción de su grupo SH libre con, por ejemplo, Lys Orn, Dab o Dap bromoacetilados. En algunas modalidades, los péptidos de RGD pueden ser aquellos descritos en los documentos US 6,576,239, EP 0927045 y WO 2008/023378, incorporados en su totalidad en la presente como referencia como se describe enteramente en la presente. En una modalidad preferida, el péptido usado de conformidad con la invención es el pentapéptido cíclico RGDfK de SEQ ID NO: 1 , en donde 'f indica un residuo de D-Phe.

En otra modalidad preferida, el péptido es el pentapéptido cíclico RADfK de SEQ ID NO: 2, y se usa en la presente para facilitar la significancia del motivo de RGD en la unión a los receptores de integrina. Otro ciclopéptido útil de conformidad con la invención es el nonapéptido CDCRGDCGC de SÉQ ID NO: 9, designado en la presente como 'RGD-4C, que contiene cuatro residuos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro en la molécula. El residuo de ácido aspártico del motivo de RGD es altamente susceptible a la degradación química, que lleva a la pérdida de actividad biológica, y esta degradación podría prevenirse por ciclización por medio del enlace disulfuro. Junto con la mejora de la estabilidad, los péptidos cíclicos muestran mayor potencia en comparación con los péptidos lineales para inhibir la unión de la vitronectina a las células. El número y la naturaleza de los residuos que flanquean la secuencia de RGD en los péptidos sintéticos, tienen una influencia significativa sobre cómo esa secuencia es reconocida por los receptores de integrina individuales. Un residuo aromático puede ser particularmente significativo para hacer contactos favorables en el sitio de unión de la integrina. Los péptidos de RGD cíclicos dirigidos para a?ß3 se incorporan por una vía de endocitosis de fase fluida independiente de la integrina, que no altera el número de receptores de integrina funcionales sobre la superficie de la célula. Además, los péptidos de RGD cíclicos permanecen o se degradan en el lisosoma, en un proceso que alcanza la saturación después de 15 minutos, y sólo una pequeña porción puede salir del lisosoma y llegar al citoplasma de la célula.

En otras modalidades preferidas, el péptido de RGD se selecciona de los péptidos cíclicos: (i) tetrapéptido cicloRGDK (SEQ ID NO: 3), pentapéptido cicloRGDf-n(Me)K (SEQ ID NO: 4), en donde f indica D-Phe, y el enlace peptídico entre f y K está metilado; y pentapéptido cicloRGDyK (SEQ ID NO: 5), en donde y indica D-Tyr. En otra modalidad, el péptido que contiene RGD es lineal, y puede seleccionarse del hexapéptido GRGDSP (SEQ ID NO: 6), el heptapéptido GRGDSPK (SEQ ID NO: 7), y el miembro de 25 elementos (GRGDSP)4K (SEQ ID NO: 8). En una modalidad más preferida, el péptido lineal es GRGDSP. En una modalidad de la invención, el péptido de RGD es enlazado directamente al macrociclo fotosensibilizador de clorofila o bacterioclorofila por medio de un grupo funcional en su periferia, por ejemplo, COOH, formando un grupo amida CO-NH2 con el grupo amino terminal o un grupo amino libre del péptido de RGD. En otra modalidad, el péptido de RGD es enlazado al macrociclo fotosensibilizador por medio de un brazo espaciador/grupo de unión por puentes tal como, pero no limitado a, un hidrocarbileno de C1-C25, de preferencia un alquileno o fenileno de CrC10 sustituido por un grupo funcional de extremo tal como OH, COOH, SO3H, COSH o NH2, formando de esta manera un grupo éter, éster, amida, tioamida o sulfonamida. En algunas modalidades, el fotosensibilizador es conjugado con un peptidomimético de RGD.

En una modalidad preferida, el peptidomimético de RGD es un compuesto no peptídico que comprende una guanidina y un grupo carboxilo terminal espaciados por una cadena de 11 átomos, por lo menos 5 de dichos átomos siendo átomos de carbono, y dicha cadena comprende uno o más átomos de O, S o N y puede ser opcionalmente sustituida por oxo, tioxo, halógeno, amino, alquilo de C1-C6, hidroxilo o carboxi, o uno o más átomos de dicha cadena pueden formar un anillo heterocíclico o carbocíclico de 3 a 6 miembros. Compuestos de este tipo se describen en los documentos WO 93/09795 y WO 2008/023378 del mismo solicitante, incorporados en su totalidad en la presente como referencia como se describen enteramente en la presente. En modalidades preferidas, el peptidomimético de RGD anterior comprende en la cadena átomos de N y es sustituido por un grupo oxo. En una modalidad más preferida, el peptidomimético de RGD tiene la fórmula: H2N-C(=NH)NH-(CH2)5-CO-NH-CH(CH2)-(CH2)2-COOH o -NH-RGD-CO-NH- (CH2)2-piperazino-(CH2)2-NH-. El fotosensibilizador para su uso en la invención es un derivado de clorofila o bacterioclorofila que puede ser un derivado natural o un derivado no natural sintético de clorofila o bacterioclorofila, incluyendo compuestos en los cuales se han hecho modificaciones en el macrociclo, y/o en la periferia, y/o el átomo de Mg central puede estar ausente o es reemplazado por otro átomo de metal adecuado para el propósito de diagnóstico y/o para, el propósito de PDT.

En modalidades preferidas, la invención se refiere a un conjugado en donde el fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III: en donde: M representa 2H o un átomo seleccionado del grupo que consiste de Mg, Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, In, Eu, Fe, Au, Al, Gd, Dy, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, P, Re, TI y Te e isótopos y radioisótopos de los mismos; X es O ó N-R7; R-i, R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-Re, -NRgR'g o - o R1 y R6 en la fórmula II junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, forman un anillo que comprende un péptido de RGD o peptidomimético de RGD; Y es O ó S; R2 es H, OH o COOR9; R3 es H, OH, alquilo de C1-C12 o alcoxi de C C 2; R4 es -CH=CR9R'9, -CH=CR9Hal, -CH=CH-CH2-NR9R'9, - CH=CH-CH2- N+R9R'9R"9 A~ -CHO, -CH=NR9, -CH=N+R9R'9 A~ -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal, -CH2-R9) -CH2-NR9R'9, -CH2-N+R9R'9R"9 A_, -CH2-CH2R9, -CH2-CH2Hal, -CH2-CH2OR9, -CH2-CH2SR9, -CH2-CH2-NR9R'9, -CH2-CH2-N+ReR,eR,,9 A", -COCH3, C(CH3)=CR9R'9, -C(CH3)=CR9Hal, -C(CH3)=NR9, -CH(CH3)=N+R9R'9A~ -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-OR9, -CH(CH3)-SR9, -CH(CH3)-NR9R 9, -CH(CH3)-N+R9R'9 R'gA" o -C=CR9¡ R'4 es metilo o formilo; R5es =O, =S, =N-R9, =N+R9R'9A~, =CR9R'9 o =CR9-Hal; 7, Re, R9, R'9 y R 9 es cada uno independientemente: (a) H; (b) hidrocarbilo de Ci-C2s; (c) hidrocarbilo de Ci-C25, de preferencia alquilo, alquenilo o alquinilo de Ci-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10 o alquilo de C1-C6, , sustituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, -CONRR', ÍC0R, COOR, -OSO3R, -SO3R, -S02R, -NHSO2R, - S02NRR' -NRR', =N-OR, =N- NRR', -C(=NR)-NRR',-NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', 0<-NR-, >C=NR, - -0-(CH2)n-OR, -0-(CH2)n-0-(CH2)n-R, -PRR', -OP03RR', -P02HR y -P03RR', en donde R y R' es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, y R" es hidrocarbilo o heterociclilo; (d) hidrocarbilo de Ci-C25, de preferencia alquilo de Ci-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10 o alquilo de Ci-C6, sustituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de grupos cargados positivamente, grupos cargados negativamente, grupos básicos que son convertidos a grupos cargados positivamente bajo condiciones fisiológicas, y i grupos ácidos que son convertidos a grupos cargados negativamente bajo condiciones fisiológicas; (e) hidrocarbilo de C C25, de preferencia alquilo de Ci-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10 o alquilo de C-|-C6) conteniendo uno o más i heteroátomos y/o una o más porciones carbocíclicas o heterocíclicas; (f) hidrocarbilo de C C25, de preferencia alquilo de Ci-C25, más. preferiblemente alquilo de C-1-C10 o alquilo de C1-C6, conteniendo uno o más heteroátomos y/o una o más porciones carbocíclicas o heterocíclicas y sustituido por uno o más grupos funcionales como se define en los incisos (c) y (d) anteriores; (g) hidrocarbilo de C1-C25, de preferencia alquilo de C1-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10, o alquilo de C-i-C6 sustituido por un residuo de un aminoácido, un péptido, de preferencia un péptido de RGD, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, o un ligando polidentado y su complejo quelante con metales; o (h) un residuo de un aminoácido, un péptido, de preferencia un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, o un ligando polidentado y su complejo quelante con metales; R7 puede ser además -NRR', en donde R y R' es cada uno H o hidrocarbilo de C1-C25, de preferencia alquilo de C1-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10 o alquilo de C1-C6, opcionalmente sustituido por un grupo cargado negativamente, de preferencia S03 ; R8 puede ser además H+ o un catión R+10 cuando R-i , R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-Re; R+io es un metal, un grupo amonio o un catión orgánico; A es un anión fisiológicamente aceptable; m es 0 ó 1 ; la línea de puntos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace opcional; y sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos; de los mismos; y dicho derivado de clorofila o bacterioclorofila de fórmula I, II o III contiene por lo menos un residuo de péptido que contiene RGD. En una modalidad, la línea de puntos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace y el fotosensibilizador es una clorofila de la fórmula I, II o III. Los compuestos de fórmula I en donde M es Mg, Ri en la posición 173 es fitiloxi, R2 en la posición 132 es COOCH3, R3 en la posición 132 es un átomo de H, R5 es O, R4 en la posición 3 es vinilo, la línea de puntos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace, y R' es metilo en la posición 7 y R4 es etilo en la posición 8 o R' es formilo en la posición 7 y R4 es etilo en la posición 8, son clorofila a y b, respectivamente, y sus derivados tendrán diferente átomo de metal y/o diferentes sustituyentes R-i, R2, R3, R4, R'4 y/o R5. En otra modalidad, las posiciones 7-8 son hidrogenadas y el fotosensibilizador es una bacterioclorofila de la fórmula I, II o III. Los compuestos de fórmula I, en donde M es Mg, R1 en la posición 173 es fitiloxi o geranilgeraniloxi, R2 en la posición 132 es COOCH3, R3 en la posición 132 es un átomo de H, R5 es O, R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo, y la línea de puntos en las posiciones 7-8 está ausente, son bacterioclorofila a, y sus derivados tendrán diferente átomo de metal y/o diferentes sustituyentes R1 , R2, R3, R4 y/o R5. Como se usa en la presente, el término "hidrocarbilo" significa cualquier radical hidrocarbilo recto o ramificado, saturado o insaturado, acíclico o cíclico, incluyendo aromático, de 1 a 25 átomos de carbono, de preferencia de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 6, muy preferiblement de 2 a 3 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un radical alquilo, de preferencia de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, o alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo tal como fenilo o un grupo aralquilo tal como bencilo, o en la posición 17 de los compuestos de fórmula I, II o III, es un radical derivado de compuestos naturales de Chl y Bchl, por ejemplo, geranilgeranilo (2,6-dimetil-2,6-octadienilo) o titilo (2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-en-16-ilo). Como se usa en la presente, el término "porción carbocíclica" se refiere a un compuesto monocíclico o policíclico que contiene sólo átomos de carbono en el anillo o los anillos. La porción carbocíclica puede ser saturada, es decir, cicloalquilo, o insaturada, es decir, cicloalquenilo, o aromática, es decir, arilo. El término "alcoxi", como se usa en la presente, se refiere a un grupo alquilo de C1-C25-O-, en donde el alquilo de C1-C25 es como se definió anteriormente. Ejemplos de alcoxi son metoxi, etoxi, n-propox¡, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, ter-butoxi, pentoxi, hexoxi, -OC15H31 , -OCi6H33l -OCitHas, -OC18H37, y similares. El término "ariloxi", como se usa en la presente, se refiere a un grupo arilo de C6-C 8-O-, en donde el arilo de C6-Ci8 es como se definió anteriormente, por ejemplo, fenoxi y naftoxi. Los términos "heteroarilo" o "porción heterocíclica" o "heteroaromático" o "heterociclilo", como se usan en la presente, significan, un radical derivado de un anillo heteroaromático monocíclico o policíclico que contiene uno a tres heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de O, S y N. Ejemplos particulares son pirrolilo, furilo, tienilo, pirazolilo, imidazoülo, oxazolilo, tiazolilo, piridyl, quinolinilo, pirimidinilo, 1 ,3,4-triazinilo, 1 ,2,3-triazinilo, 1 ,3,5-triazinilo, benzofurilo, isobenzofurilo, indolilo, imidazo[1 ,2-a]piridilo, bencimidazolilo, benztiazolilo y benzoxazolilo. Cualquier "carbocíclico", "arilo" o "heteroarilo" puede ser sustituido por uno o más radicales tales como halógeno, arilo de C6-C14, alquilo de Ci-C25, nitro, OR, SR, -COR, -COOR, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R, -NRR', -(CH2)n-NR-COR' y -(CH2)n-CO-NRR'. Se entenderá que cuando un anillo heteroaromático policíclico es sustituido, las sustituciones pueden ser en cualquiera de los anillos carbocíclicos y/o heterocíclicos. El término "halógeno", como se usa en la presente, se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo. En una modalidad de la invención, el fotosensibilizador del conjugado es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III que contiene por lo menos un grupo cargado negativamente y/o por lo menos un grupo ácido que es convertido a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico. Como se define en la presente, "un grupo cargado negativamente" es un anión derivado de un ácido, e incluye carboxilato (COO 2-), tiocarboxilato (COS ), sulfonato (SO3 ) y fosfonato (PO3 ), y el "grupo ácido que es convertido a un grupo cargado negativamente bajo condiciones fisiológicas", incluye los grupos ácido carboxílico (-COOH), tiocarboxílicp (-COSH), sulfónico (-SO3H) y fosfónico (-PO3H2). Derivados de BChl con grupos cargados negativamente o grupos convertidos a los mismos bajo condiciones fisiológicas, se han descrito en el documento WO 2004/045492 del mismo solicitante, incorporado en su totalidad en la presente como referencia como se describe enteramente en la presente. En una modalidad más preferida, el fotosensibilizador en el conjugado de la invención es clorofila o bacterioclorofila de fórmula II, en donde f¾6 es -NR9R'9, R9 es H y R'9 es alquilo de C1-C10 sustituido por S03H o una sal alcalina del mismo. Más preferiblemente, el conjugado comprende un derivado de bacterioclorofila de fórmula II, en donde R6 es -NH-(CH2)2-S03K o -NH-(CH2)3-S03K. En otra modalidad de la invención, el fotosensibilizador del conjugado es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III que contiene por lo menos un grupo cargado positivamente y/o por lo menos un grupo básico que es convertido a un grupo cargado positivamente al pH fisiológico. Como se define en la presente, "un grupo cargado positivamente" denota un catión derivado de un grupo que contiene N o de un grupo onio que no contiene N. Puesto que el endotelio de los tumores se caracteriza por un número incrementado de sitios aniónicos, los grupos cargados positivamente o los grupos básicos que son convertidos a grupos cargados positivamente bajo condiciones fisiológicas, pueden aumentar la eficiencia de determinación del blanco de los conjugados de la presente invención.

Un "catión derivado de un grupo que contiene N", como se usa en la presente denota, por ejemplo, pero no está limitado a, un grupo amonio -N+(RR'R"), hidrazinio -(R)N-N+(R'R"), amoniooxi 0«-N+(RR')-, ¡minio >C=N+(RR'), amidinio -C(=RN)-N+R"R" o guanidinio -(R)N-C(=NR)-N+R'R", en donde R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo, de preferencia alquilo de C1-C6 como se define en la presente, fenilo o bencilo, o heterociclilo, o en el grupo amonio uno de R, R' y R" puede ser OH, o dos de R, R' y R" en el grupo amonio, o R y R' en los grupos hidrazinio, amoniooxi, ¡minio, amidinio o guanidinio, junto con el átomo de N al cual están unidos, forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros, opcionalmente conteniendo uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de O, S o N, y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional, o dicho catión se deriva de un compuesto que contiene uno o más átomos de N en un anillo heteroaromático. En una modalidad más preferida, el conjugado de la presente invención contiene un grupo amonio de la fórmula -N+(RR'R"), en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H o heterociclilo o hidrocarbilo opcionalmente sustituido, como se define en la presente, o uno de ellos puede ser OH. El grupo amonio -N+(RR'R") puede ser un amonio secundario, en donde cualquier par de los radicales R, R' o R" es H; un amonio terciario, en donde sólo uno de R, R' o R" es H; o un amonio cuaternario, en donde cada uno de R, R' o R" es un grupo heterociclilo o hidrocarbilo opcionalmente sustituido como se define en la presente. Cuando uno de R, R' o R" es OH, el grupo es un grupo hidroxilamonio. De preferencia, el grupo amonio es un grupo amonio cuaternario en donde R, R' y R" es cada uno alquilo de¡ C C6 tal como metilo, etilo, propilo, butilo o hexilo. El grupo amonio puede ser un grupo de extremo en la molécula, o puede encontrarse dentro de una cadena de alquilo en la molécula. En los grupos hidrazinio -(R)N-N+(R'R"), amidinio -C(=NR)-N+R'R" y guanidinio -(RJN-C^NRJ-N'R'R", R, R' y R" puede ser cada uno independientemente H o hidrocarbilo o heterociclilo, o R' y R" junto ¡con el átomo de N al cual están unidos forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros, como se define en la presente. Ejemplos de dichos grupos incluyen aquellos en donde R es H, y R' y R" es cada uno alquilo de C^-Ce, tal como metilo, etilo, propilo, butilo o hexilo. En los grupos amoniooxi 0<-N+(RR')- e ¡minio >C=N+(RR'), R y R' pueden ser cada uno independientemente H o hidrocarbilo, de preferencia alquilo de CrC&, o heterociclilo, o R y R' junto con el átomo de N al cual están unidos forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros, como se define en la presente. En otra modalidad preferida, el derivado de clorofila o bacterioclorofila contiene un grupo amonio cíclico de la fórmula -N+(RR'R"), en donde dos de R, R' y R" junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros definido a continuación. Como se define en la presente, "un anillo saturado de 3 a 7 miembros" formado por dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al cual están unidos, puede ser un anillo que contiene sólo N tal como aziridina, pirrolidina, piperidina, piperazina o azepina, o puede contener un heteroátomo adicional seleccionado de O y S, tal como morfolina o tiomorfolina. El otro átomo de N en el anillo de piperazina puede ser opcionalmente sustituido por alquilo, por ejemplo, alquilo de Ci-C6, que puede ser sustituido por halo, OH o amino. Los grupos onio derivados de dichos anillos saturados incluyen aziridinio, pirrolidinio, piperidinio, piperazinio morfolinio, tiomorfolinio y azepinio. Como se define en la presente, "un catión derivado de un radical heteroaromático que contiene N" denota un catión derivado de un compuesto N-heteroaromático que puede ser un compuesto monocíclico o policíclico que contiene opcionalmente O, S o átomos de N adicionales. El anillo del cual el catión se deriva debe contener por lo menos un átomo de N y ser aromático, pero los otros anillos, si lo hay, puede ser parcialmente saturado. Ejemplos de cationes N-heteroaromáticos incluyen pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, pirimidinio, quinolinio, isoquinolinio, 1 ,2,4-triazinio, 1 ,3,5-triazinio y: purinio. El grupo cargado positivamente puede ser también un grupo onio que no contiene nitrógeno tal como, pero no limitado a, grupo fosfonio [-P+(RR'R")], arsonio [-As+(RR'R")], oxonio [-0+(RR')], sulfonio [-S+(RR')j, selenonio [-Se+(RR')], teluronio [-Te+(RR')], estibonio [-Sb+(RR'R")] o bismutonio [-Bi+(RR'R")], en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, de preferencia alquilo de Ci-C6 tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, o arijo, de preferencia, fenilo. Ejemplos de grupos fosfonio de la fórmula -P+(RR'R") incluyen gropos en donde R, R' y R" es cada uno metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo, o R es metilo, etilo, propilo, butilo o hexilo y R' y R" son ambos fenilo. Ejemplos de grupos arsonio de la fórmula -As+(RR'R") incluyen grupos en donde R, R' y R" es cada uno metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo. Ejemplos de grupos sulfonio de la fórmula -S+(RR') incluyen grupos en donde R y R' es cada uno metilo, etilo, propilo, butilo, fenilo, bencilo, fenetilo, o un grupo hidrocarbilo sustituido. Como se define en la presente, "un grupo básico que es convertido a un grupo cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas" es, por lo menos teóricamente, cualquier grupo básico que generara bajo condiciones fisiológicas un grupo cargado positivamente como se define en la presente. Se observará que las condiciones fisiológicas, como se usa en la presente, no sólo se refieren al suero, sino a diferentes tejidos y compartimientos de las células en el cuerpo. Ejemplos de dichos grupos básicos que contienen N incluyen, sin que sean limitados a, cualquier grupo amino que genere un grupo amonio, cualquier grupo ¡mina que genere un grupo ¡minio, cualquier grupo hidrazina que genere un grupo hidrazinio, cualquier grupo aminoxi que genere un grupo amoniomoxi, cualquier grupo amidina que genere un grupo amidinio, o cualquier grupo guanidina que genere un grupo guanidinio, todos como se definen en la presente. Otros ejemplos incluyen grupos fosfino y mercapto. De esta manera, los conjugados de la presente invención pueden contener por lo menos un grupo básico que es convertido a un grupo cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas, tales como -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)N-C(=NR)-NR'R", O<-NR- o >C=NR, en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, de preferencia alquilo de C1-C25, más preferiblemente alquilo de C1-C10 o alquilo de C1-C6, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros, opcionaimente conteniendo un átomo de O, S o N, y opcionaimente sustituido además en el átomo de N adicional, o el grupo básico es un radical heteroaromático que contiene N. El anillo saturado de 3 a 7 miembros puede ser aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionaimente sustituido en el átomo de N adicional por alquilo de Ci-C6 opcionaimente sustituido por halo, hidroxilo o amino, y el radical heteroaromático que contiene N puede ser pirazolilo, imidazolilo, oxazolHo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilio, 1 ,2,4-triazinilo, 1 ,3,5-triazinilo o purinilo. Derivados de BChl con grupos cargados positivamente o grupos convertidos a los mismos bajo condiciones fisiológicas, se han descrito en el documento WO 2005/120573 del mismo solicitante, incorporado en su totalidad en la presente como referencia como se describe enteramente en la presente. En una modalidad, el fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II, y R6 es un grupo básico -NR9R 9, en dondé Rg es H y R'g es alquilo de C C6 sustituido por un grupo básico -NRR' o -NH-(CH2)2-6-NRR', en donde cada uno de R y R' es independientemente H, alquilo de CrC6 opcionaimente sustituido por NH2, o R y R' junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 5 a 6 miembros, opcionaimente conteniendo un átomo de O o N, y opcionaimente sustituido además en el átomo de N adicional por -(CH2)2-6-NH2. En otra modalidad, el fotosensibilizador es una bacterioclorofila de fórmula II, y R6 es -NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2, -NH-(CH2)2-1-morfolino o -NH-(CH2) 3-piperazlno-(CH2)3-NH2. En otra modalidad, R1 y R6 forman juntos un anillo cíclico que comprende un péptido de RGD o peptidomimético de RGD. En otra modalidad, el fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula III, X es -NR7, R es -NRR', R es H y R' es alquilo de C1-C6 sustituido por SO3- o una sal alcalina del mismo, de preferencia el fotosensibilizador es una bacterioclorofila y X es -NR7 y R7 es -NH-(CH2)3-SO3K. En otra modalidad, cada R , R8, R9 o R'9 es un alquilo de Ci-C6 sustituido por uno o más grupos -OH. Por ejemplo, el fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II, y R6 es -NRgR'g, R9 es H y R'9 es HOCH2-CH(OH)-CH2-. En otra modalidad, el fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de fórmula II, y R6 es -NRgR'g, Rg es H y R'9 es alquilo de Cr C6 sustituido por un ligando polidentado o sus complejos quelantes con metales. Ejemplos de ligandos polidentados incluyen, sin que sean limitados a, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) o el ligando macrocíclico DOTA. En una modalidad preferida, el ligando polidentado es DTPA, R6 es -NH-(CH2)3-NH-DTPA y el metal es Gd. El catión Re+ puede ser un catión monovalente o divalente derivado de un metal alcalino o metal alcalinotérreo tal como K+, Na+, Li+, NH4+ o Ca2+, más preferiblemente K+; o R8+ es un catión orgánico derivado de una amina o de un grupo que contiene N. Como se define en la presente, el hidrocarbilo de ^^25 definido por R7r R8, R9 y R'9 puede ser opcionalmente sustituido por uno o más grupos funcionales seleccionados de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, COOR, -OSO3R, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R> -S02NRR' -NRR', =N-OR, =N-NRR', -C(=NR)-NRR', -NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', O<-NR-, >C=NR, -(CH2)n-NR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -PO2HR o -PO3RR'; uno o más grupos cargados negativamente tales como COO , COS , -OSO3 , -SO3 , -OPO3R , -PO2H , -PO32' y -PO3R ¡ y/o uno o más grupos cargados positivamente tales como -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -O+(RR'), -S+(RR'), -Se+(RR'), -Te+(RR'), -Sb+(RR'R"), -Bi+(RR'R"), O<-N+(RR')-, >C=N+(RR'), -N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)N-C(=HN)-N+RR'R" o -C(=NH)-N+(RR'R"), o un catión N-heteroaromático tal como pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, pirimidinio, 1 ,2,4-triazinio, 1 ,3,5-triazinio y purinio; en donde n es un entero de 1 a 6, R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al cual están unidos forman7 un anillo saturado de 3 a 7 miembros, opcionalmente conteniendo uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de O, S o N y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional. El hidrocarbilo de C^C25 definido por R7, R8, Rg y R'g puede ser sustituido también por el residuo de un monosacárido, oligosacárido o polisacárido tal como glucosilo, o de un aminoácido, péptido o proteína, de preferencia un péptido de RGD. Además, R8, Rg y R 9 pueden ser cada üno independientemente un residuo de un monosacárido, oligosacárido o polisacárido tal como glucosilo, o de un aminoácido, péptido o proteína, o un ligando polidentado tal como DTPA, DOTA, EDTA, y similares, y sus complejos quelantes con metales. En los grupos OR y SR, cuando R es H, los grupos hidroxí y mercapto están representados, respectivamente, y cuando R es diferente de H, éteres y sulfuros están representados. En el grupo -PRR', el grupo fosfino está representado cuando R y R' son H. En el grupo -COR, cuando R es H, el grupo formilo -CHO de un aldehido está representado, mientras que cuando R es diferente de H, este es el residuo de una cetona tal como grupos alquilcarbonilo y arilcarbonilo. En el grupo COOR, cuando R no es H, este es un grupo éster de ácido carboxílico tal como los grupos alcoxicarbonilo y ariloxicarbonilo. Asimismo, ésteres están representados en los grupos -OSO3R, -S03R, -S02R, -OP03RR\ -P02HR y -P03RR', cuando R y R' son diferentes de H. En una modalidad preferida de la invención, el fotosensibilizador es no metalado, a saber, M es 2H. En otras modalidades preferidas, el fotosensibilizador es metalado como se definió anteriormente, más preferiblemente M es Pd, Cu o Mn, muy preferiblemente Pd o Cu. En algunas modalidades preferidas de la invención, el fotosensibilizador es una BchI de la fórmula I, II o III, más preferiblemente de la fórmula II, y M es 2H, Cu, Mn o Pd. En otras modalidades, el fotosensibilizador es una ChI de la fórmula I, II o III, más preferiblemente de la fórmula II, y M es 2H, Cu o Mn. En algunas modalidades preferidas, el conjugado comprende un fotosensibilizador de BchI de la fórmula II, en donde M es Pd, Mn, Cu o, 2H; ? es 0; R1 es NH-P, en donde P es el residuo de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD enlazado directamente al NH- o por medio de un espaciador; R'2 es metoxi; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)n-S03 ~ Me+, en donde n es 2 o 3 y Me+ es Na+ o K+.

En una modalidad muy preferida de la invención, el conjugado comprende Bchl de la fórmula II, en donde M es 2H y Ri es NH-P, en dónde P es el residuo del péptido que contiene RGD c(RGDfK) de SEQ ID NO: 1 , R'2 es metoxi, R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo, R'4 es metilo, y R6 es -NH-(CH2)2-SO3 K, designado en la presente como compuesto 13 o c(RGDfK)-2H-MLT. En otra modalidad más preferida, M es Pd, y R1 , R'2, R4, R'4 y Re son como se definieron anteriormente, y P es c(RGDfK) de SEQ ID NO: 1 , designado en la presente como compuesto 24 o c(RGDfK)-Pd-MLT. En una modalidad más preferida, M es Mn, R1 , R'2, R4, R'4 y Re son como se definieron anteriormente, y P es c(RGDfK), designado en la presente como compuesto 14 o c(RGDfK)-Mn-MLT, o M es Cu y el conjugado se designa en la presente como compuesto 15 o c(RGDfK)-Cu-MLT. En otra modalidad más preferida, M en la Bchl de fórmula II es 2H, R'2, R4, R'4 y R6 son como se definieron anteriormente, y R1 es NH-P, en donde P es c(RADfK) de SEQ ID NO: 2 designado en la presentei como compuesto 45 o c(RADfK)-2H-MLT, o P es c(RGDyK) de SEQ ID NO: 5. En otras modalidades más preferidas, M es 2H, R1 ( R'2| R4, R'4 y R6 son como se definieron anteriormente, y P es un péptido lineal seleccionado de GRGDSP de SEQ ID NO: 6, o GRGDSPK de SEQ ID NO: 7 o (GRGDSP)4 de SEQ ID NO: 8, más preferiblemente P es GRGDSP, y el conjugado se designa en la presente como compuesto 26 o GRGDSP-2H-MLT lineal.

En modalidades aún más preferidas, en la BchI de la fórmula II, M es Pd, m es 0 y Ri es NH-P, en donde P es c(RGDfK), R'2 es metoxi^ R en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo, R'4 es metilo, y R6 es -NH-(CH2)3-S03 K, o P es el ciclopéptido RGDf-n(Me)K de SEQ ID NO: 4 y R6 es -NH-(CH2)2-SO3 K. Otras modalidades más preferidas en donde el átomo de metal central de la BchI de fórmula II es Pd; m, R'2, R4 y R'4 son como se definieron anteriormente, Ri es HH-P y R6 es -NH-(CH2)2-SO3 K, se refieren a conjugados con los péptidos lineales GRGDSPK de SEQ ID NO: 7 o (GRGDSP)4 de SEQ ID NO: 8. En una modalidad aún más preferida, el conjugado comprende una BchI de la fórmula II, en donde M es Pd; m, R'2, R4 y R'4 son como se definieron anteriormente, R es NH-CH [(-(CH2)2-CO-NH-P]2, en donde P es el residuo del péptido que contiene RGD c(RGDyK) de SEQ ID NO: 5, y R6 es -NH-(CH2)2-SO3K, designado en la presente como compuesto 36 o c(RGDyK)2-2H-MLT. En otras dos modalidades más preferidas de la invención, en la BchI de la fórmula II M es Pd o 2H; m es 0; Ri es NH-P, en donde P es el residuo de c(RGDfK) (SEQ ID NO: 1), R'2 es metoxi; R en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo y R6 es -NH-CH2-CH(OH)-CH2OH. En otras modalidades aún más preferidas, los conjugados comprenden un péptido de RGD como se mencionó anteriormente, de preferencia c(RGDfK) conjugado con una Bchl de la fórmula II, en donde M es 2H; m, R-i , R'2, R y R son como se definieron anteriormente, y R6 es NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2, -NH-(CH2)2-morfolino o -NH-(CH2)3-piperazino-(CH2)3-NH2. Otras modalidades más preferidas se refieren a conjugados que comprenden una Bchl de la fórmula II, en donde M es 2H; m es 0; R1 es NH-c(RGDfK), R'2 es metoxi, R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo, R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)3-NH-CO-DTPA, o su complejo de quelato con Gd. La invención se refiere además a conjugados preferidos que comprenden un fotosensibilizador de Bchl de la fórmula II, en donde M es Pd o 2H; m es 0; R1 es NH-P, en donde P es el residuo de un peptidomimético de RGD enlazado directamente al NH- o por medio de un espaciador; R'2 es metoxi; R en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH o -NH-(CH2)2-S03K. En otra modalidad de la invención, el conjugado comprende una Bchl de la fórmula III, en donde M es Pd; R^ es NH-P, en donde P es el residuo de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD enlazado directamente al NH- o por medio de un espaciador; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; X es N-R7 y R7 es -NH-(CH2)3-SO3 " Me+, en donde Me+ es Na+ o K+. En otra modalidad, el conjugado comprende una Bchl de la fórmula I, en donde M es Mn; R1 es NH-P, en donde P es el residuo de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD enlazado directamente al NH- o por medio de un espaciador; R2 es OH; R3 es COOCH3; R4 en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R' es metilo; y R5 es O. En modalidades más preferidas, M es 2H o Mn, y P es el residuo del péptido que contiene RGD c(RGDfK) de SEQ ID NO: 1 o c(RGDK) de SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, el conjugado comprende una Chl de la fórmula II, en donde M se selecciona de Mn, Cu o 2H; RÍ es NH-P, en donde P es el residuo de un péptido que contiene RGD o peptidomimético de RGD enlazado directamente al NH- o por medio de un espaciador; R4 en la posición 3 es vinilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R6 es -NH-(CH2)2-SC>3~ Me+, en donde Me+ es Na+ o K+. En modalidades más preferidas en la Chl de fórmula II, M es 2H o Cu o Mn, y R4, R'4 y R6 son como se definieron anteriormente, y el fotosensibilizador es conjugado con el péptido pentacíclico que contiene RGD c(RGDfK) de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, R1 y R6 forman juntos un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-NH- o -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-piperazino-(CH2)2-NH-. En una modalidad, el conjugado comprende una Bchl de la fórmula II, en donde m es 0; R'2 es metoxi; R en la posición 3 es acetilo y en la posición 8 es etilo; R'4 es metilo; y R1 y R6 forman juntos un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-NH-, y M es Pd o M es 2H, o R1 y R6 forman juntos un anillo cíclico que comprende -NH-RGD-CO-NH-(CH2)2-piperazino-(CH2)2-NH-, y M es Pd.

Campo de aplicación industrial Para su uso en la presente invención, los conjugados se formulan en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la composición farmacéutica es para su uso I en terapia fotodinámica (PDT), más particularmente para PDT dirigida hacia tumores. En otra modalidad, la composición farmacéutica es para su uso para propósitos de diagnóstico, para la visualización de dominios necróticos de los tumores. Varias técnicas de diagnóstico pueden aplicarse de conformidad con la invención, adaptando el átomo de metal central a la técnica particular. Para el diagnóstico de dominios necróticos de los tumores por formación de imágenes de fluorescencia dinámica, M en el fotosensibilizador es 2H o un metal seleccionado de Pd y Zn. Para el diagnóstico de dominios necróticos de los tumores por la técnica de radiodiagnóstico, M en el fotosensibilizador es un radioisótopo seleccionado de 64Cu, 67Cu, 99mTc, 67Ga, 20 TI, 195Pt, 60Co, 111ln y 51Cr. En una modalidad, la técnica de radiodiagnóstico es tomografía de emisión de positrones (PET), y M es ^Cu o 67Cu. En otra modalidad, la técnica de radiodiagnóstico es tomografía de emisión de fotones individuales (SRET), y M es un radioisótopo seleccionado de 99mTc, 67Ga, 195Pt, 11 ln, 5 Cr y 60Co. Para el diagnóstico de dominios necróticos de los tumores por formación de imágenes de resonancia magnética molecular (MRI), Ml es un metal paramagnético seleccionado de n3+, Cu2+, Fe3+, Eu3+, Gd3+ y Dy3+, o el fotosensibilizador es sustituido por un complejo de quelato de metal de un ligando polidentado, y el metal es como se definió anteriormente. En una modalidad, la invención se refiere a un método para la formación de imágenes de dominios necróticos de los tumores por forrnacíón de imágenes de fluorescencia dinámica, que comprende: (a) administrar a un sujeto que se sospecha que tiene un tumor con dominios necróticos, un conjugado de conformidad con la invención, en donde M es 2H o un metal seleccionado de Pd y Zn; (b) iluminar al sujeto y medir la fluorescencia de las áreas presuntas durante por lo menos 24-48 horas después de la administración del conjugado a intervalos de tiempo de 1-8 horas, en donde las áreas que exhiben fluorescencia después de 24-48 horas o más tiempo indican la presencia de dominios necróticos del tumor. En modalidades preferidas, el conjugado para el método anterior es el compuesto 13 o el compuesto 24, el tumor es tumor de la mama o de ovario, y los dominios necróticos son visualizados 3 a 8 días, de preferencia 5-8 días, posteriores a la inyección del fármaco (conjugado). En otra modalidad, la invención provee un método para el diagnóstico de dominios necróticos del tumor por técnica de radiodiagnóstico, que comprende: (a) administrar a un sujeto que se sospecha que tiene un tumor un conjugado de conformidad con la invención, en donde M es un radioisótopo seleccionado del grupo que consiste de ^Cu, 67Cu, 99mTc, 67Ga, 201TI, 195Pt, 60Co, 111ln o 5 Cr¡ (b) explorar al sujeto en un explorador de formación de imágenes durante por lo menos 24-48 horas después de la administración del conjugado a intervalos de tiempo de 1-8 horas, y medir el nivel de radiación de las áreas supuestas, en donde las áreas que exhiben radiación después de 24-48 horas o más tiempo indican la presencia de dominios necróticos del tumor. La invención provee también un método de formación de imágenes de resonancia magnética molecular (MRI) para el diagnóstico de dominios necróticos del tumor, que comprende los pasos de: (a) administrar a un sujeto que se sospecha que tiene un tumor un conjugado como se define en la presente, en donde M es un metal paramagnético seleccionado de Mn3+, Cu2+, Fe3+, Eu3+, Gd3+ o Dy3+; y (b) someter al paciente a la formación de imágenes de resonancia magnética generando por lo menos una imagen de MR de la región objetivo de interés dentro del cuerpo del paciente antes de dicha administración (tiempo cero), y una o más imágenes de MR en un segundo punto de tiempo o más puntos de tiempo por lo menos 24-48 horas, de preferencia 96 horas, después de dicha administración; y (c) procesar y analizar los datos para diagnosticar la presencia o ausencia de dichos dominios necróticos del tumor. La invención provee además un método para el mapeo de los márgenes de un tumor antes de la cirugía, que comprende administrar a un sujeto que necesita un conjugado como se define en la presente, ¡luminar al sujeto y explorar por formación de imágenes el tumor, de preferencia tumor de mama, a las primeras 2-24 horas después de la administración del conjugado, mapeando de esta manera los márgenes del tumor en preparación para la cirugía. La invención provee además un tratamiento mínimamente invasivo, estrategia de detección y pronóstico para cáncer de mama localizado, en particular carcinoma ductal in situ (DCIS), que comprende (i) administrar a un sujeto un conjugado como se define en la presente, de preferencia un conjugado de RGD-Bchl, por el cual el conjugado de RGD-Bchl específicamente se aloja y se acumula en los dominios necróticos del tumor, (¡i) formar imágenes dirigidas hacia el tumor, del sujeto tratado con el derivado de RGD-BChl por cualquiera de los métodos descritos anteriormente para la detección del tumor y la definición de los márgenes del tumor a alta precisión, así como el pronóstico por procedimientos de MRI, fluorescencia y PET SCAN; y (iii) terapia fotodinámica (PDT) dirigida hacia el tumor, de las áreas necróticas localizadas, permitiendo la conservación y reconstrucción de la mama. Los conjugados de péptido de RGD-fotosensibilizador usados en la invención, son particularmente adecuados para PDT dirigida hacia el tumor de tumores necróticos, y son útiles para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

De esta manera, en una modalidad, los conjugados de la invención son útiles en el campo oncológico mediante el tratamiento por PDT de estados precancerosos y varios tipos de cáncer tales como, péro no limitados a, melanoma, cáncer de próstata, cerebro, colon, ovario, mama, colorrectal, cabeza y cuello, tumores de la pared del tórax que surgen de cáncer de mama, piel, pulmón, esófago y cánceres y tumores de la vejiga. Los compuestos son útiles para el tratamiento de tumores necróticos primarios, así como tumores necróticos metastásicos. En una modalidad preferida, el método se usa para el tratamiento de cáncer de mama localizado, en particular carcinoma ductal in situ. De conformidad con la invención, se provee un método para la terapia fotodinámica de tumores necróticos, que comprende: (a) administrar a un individuo que necesita un conjugado de péptido de RGD-fotosensibHizador de conformidad con la invención; y (b) irradiar el sitio del tumor y sus dominios necróticos después de que se determine la presencia de dominios necróticos por lo menos 24 horas, de preferencia 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días después de la inyección del conjugado, por cualquiera de los métodos descritos en la presente. En un aspecto, la presente invención se refiere a un nuevo método para la detección de necrosis tumoral que se basa en la captación selectiva y acumulación prolongada de conjugados de Chl/Bchl-RGD fluorescentes en los dominios necróticos del tumor. El sensibilizador de Chl/Bchl es conjugado con ligandos que se alojan en receptores específicos de las células endoteliales y tumorales. Entonces, se inicia la generación fotodinámica de ROS iluminando el volumen del tumor y cerca de la vecindad una vez que la Chl/Bchl se acumula a concentraciones suficientemente altas y es depurada del tejido circundante. El componente de BchI del compuesto 24 tiene fluorescencia intrínseca en el infrarrojo cercano (NIR) que puede ser detectada. Experimentos recientes, usando el compuesto 24, mostraron la acumulación de hasta 4-8 µ? en xenoinjertos de tumores primarios. El compuesto 24 permanece en el sitio del tumor por tiempo prolongado, permitiendo la acumulación de la señal y una buena relación de señal a ruido. Estas capacidades de la molécula dependen quizá de la interacción entre la BchI y la albúmina de suero, haciendo que esta molécula sea un buen candidato para la formación de imágenes dirigida y finalmente la terapia dirigida. Otro derivado de BchI, el compuesto 13, tiene capacidad luminiscente tres órdenes de magnitud mayor, y por lo tanto podría ser un candidato incluso mejor para la formación de imágenes dirigida. Estas moléculas abren la posibilidad de detectar con precisión los márgenes y la necrosis del tumor en el modelo de adenocarcinoma de mama humano. La detección de los márgenes y la necrosis del tumor, presenta hasta la fecha dos de los problemas más desafiantes en el tratamiento de los tumores. Además, ambas son mecanismos de predicción fieles de la reanudación del crecimiento del tumor después del tratamiento. De esta manera, en el futuro, cuando se apliquen clínicamente, se espera que los derivados de RGD mencionados anteriormente sean adecuados para la detección de necrosis y tumores en la mesa de operaciones. La presente invención ha introducido un nuevo procedimiento para lograr la acumulación prolongada de derivados de Chl/Bchl que se conjugan con péptidos de RGD en los dominios necróticos del tumor después de residencia temporal en el tejido viable del tumor. Los compuestos acumulados pueden usarse para la formación de imágenes in vivo de los dominios del tumor viable (a tiempos cortos después de la administración) o necrótico (a tiempos más largos), así como para la terapia del tumor por, PDT, quimioterapias o radioterapias con isótopos, cambiando el metal central de la Bchl, o por conjugación adicional con pequeños agentes terapéuticos. El nuevo procedimiento ha sido ejemplificado por los compuestos 13 y 24. El c(RGDfK) ha sido reconocido ya como un ligando altamente especificó para a?ß3 y a?ßd integrinas que son sobrerreguladas en la angiogénesis. La porción del compuesto 25 provee el conjugado con una fuerte autofluorescencia en el NIR, haciéndolo adecuado para la formación de imágenes de fluorescencia después de la captación por el tejido. Datos experimentales muestran que la porción RGD es esencial para la acumulación específica de los compuestos 13 y 24 en tumores pequeños (no necróticos) y grandes (necróticos), puesto que ninguna acumulación a corto o largo plazo se observó para el compuesto 25 no conjugado. Además, la depuración general del compuesto 25 del ratón tratado fue significativamente más rápida que la del compuesto conjugado. El mecanismo pendiente de la porción RGD es reforzado por el experimento de competencia descrito en la presente, en donde un exceso de c(RGDfK) libre, inyectado brevemente o concomitantemente con el compuesto 13, previno la captación posterior por el tejido del tumor. Se observó una diferencia dramática en la acumulación del compuesto 13 entre los tumores necróticos y no necróticos. De esta manera, los tumores MDA-MB-231-RFP pequeños (-0.5 cm3), que no hayan I desarrollado ya necrosis, mostraron una rápida acumulación del compuesto 13 en el tumor dentro de 1-6.5 horas posteriores a la inyección del fármaco seguida de rápida depuración (< 24 h). Sólo cantidades muy pequeñas del fármaco pudieron detectarse en el tumor en tiempos posteriores cuando la mayor parte del fármaco restante fue confinada a los órganos de depuración (principalmente los ríñones, pero también el hígado). Los tumores MDA-MB-231 -RFP grandes (> 1cm3) que han desarrollado necrosis, mostraron acumulación más lenta que alcanzó una relación de concentración pico del tumor, en comparación con otros órganos, a partir de 48 horas posteriores a la inyección del fármaco. La concentración promedio del fármaco en la masa del tumor sólo se redujo ligeramente a partir de 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Estos resultados son generales para las regiones necróticas del tumor, pero difieren con el tipo de tumor. Además, se observaron diferencias similares entre los patrones de acumulación en los tumores necróticos y no necróticos para el compuesto 24, salvo por los regímenes de depuración más lentos observados en el hígado, haciendo del compuesto 13 un mejor candidato para aplicaciones clínicas. Posiblemente, la diferencia observada en la presente entre los regímenes de acumulación del compuesto 13 en las regiones necróticas y no necróticas en un modelo de cáncer de mama y un modelo de tumores de cáncer de ovario, se relaciona con la naturaleza diferente del microambiente en los dos tipos de tumor. Se encontró una relación inversa entre el volumen del tumor y la densidad de microvasos en tumores de mama: conforme el volumen del tumor se incrementa, existe una disminución dramática en la densidad de microvasos por cm3. Por lo tanto, la concentración de integrinas llega a ser proporcíonalmente menor, y por lo tanto la velocidad de acumulación del fármaco dependiente de las integrinas debe ser proporcíonalmente menor. La característica más notable de los datos presentados, es el claro desplazamiento de la fluorescencia del fármaco del volumen del tumor viable en el volumen del tumor necrótico demostrado por la formación de imágenes de fluorescencia del tumor extirpado de los tumores MDA-MBr231-RFP necróticos en diferentes tiempos después de la administración del compuesto 13. Siguiendo la dependencia de la acumulación del fármaco por la porción RGD, puede ser posible una acumulación en pasos múltiples, en donde el primer paso implica la disociación de la porción (2H-MLT) del compuesto 25 de una molécula de albúmina de suero y una captación activa por a?ß3 integrinas en la microvasculatura, células tumorales viables y posiblemente, macrófagos o neutrófilos. Se sugiere que este paso va seguido de una transferencia pasiva o migración por transcitosis del compuesto 13 del acceso en el dominio necrótico, y la falta de drenaje desde ahí por tiempo prolongado. En tumores no necróticos, el fármaco se acumula rápidamente, a través del área viable, consistiendo del tumor entero, pero puesto que ninguna necrosis está presente, el fármaco es depurado rápidamente. Cuando se inyectó el compuesto 24, los resultados de la fluorescencia del tumor extirpado fueron similares a los obtenidos para el compuesto 13. Diferencias similares en la velocidad de acumulación en tumores necróticos y no necróticos se encontraron en otros modelos de tumores, es decir, MLS-mBanana, cáncer de ovario humano. Sin embargo, existe cierta variación en las velocidades y el patrón de acumulación, reflejando quizá los diferentes tipos de tumor. El compuesto 13 se acumula rápidamente en tumores MLS-mBanana no necróticos, y entonces es depurado lentamente. En tumores necróticos, el fármaco alcanza concentración máxima en los márgenes viables dentro de la primera hora, y se mueve entonces en la zona necrótica, en donde alcanza una concentración máxima a 24 horas posteriores a la administración. La rápida acumulación en MLS-mBanana a altas concentraciones, en comparación con MDA-MB-231-RFP, refleja quizá una mayor concentración de los receptores de integrina en las células de MLS-mBanana. La histología de los tumores grandes y pequeños de animales tratados con el compuesto 13 parece apoyar el patrón de acumulación sugerido, y provee algunas pistas hacia el mecanismo subyacente. Existe un traslape muy bueno entre el dominio viable del tumor y la fluorescencia del compuesto 13 en las primeras horas, y un traslape muy bueno entre la fluorescencia del compuesto 13 y los dominios necróticos a 24 horas y tiempos más largos posteriores a la administración. Existen muchos reportes sobre la acumulación de fármacos y agentes de contraste en tumores relacionados con el drenaje linfático deficiente y el retorno venoso lento. Este fenómeno, denominado efecto de permeabilidad y retención aumentado (EPR), se ha sugerido previamente como un medio para determinar como blanco el tejido del tumor en una manera no específica. Es posible que el EPR explique el patrón de acumulación del compuesto 13 o el compuesto 24 en el dominio necrótico y los tumores no necróticos. La permeación del complejo de albúmina de suero (SA)-fármaco a través de la vasculatura del tumor en el tejido intersticial del tumor, se propuso recientemente para explicar dicha acumulación (Tanaka, Shiramoto et al., 2004). Existen varios ejemplos en la literatura que han mostrado que la conjugación de moléculas con SA resultó en el suministro de la molécula hacia el tumor e incluso en el dominio necrótico. Por supuesto, los presentes inventores mostraron previamente que los derivados de Bchl solubles en agua cargados negativamente, tienen alta afinidad por la SA. De esta manera, el compuesto 13 o el compuesto 24 probablemente se asocian con la SA a través de la porción de Bchl después de la administración, , circulan en la sangre y se extravasan con la SA en el tejido del tumor por el efecto de EPR como se explicó anteriormente. En ese caso, se espera la acumulación del compuesto 25 como una entidad química autónoma en el área necrótica; sin embargo, puesto que la retención del compuesto 25 en los tumores estudiados es breve, puede excluirse la acumulación posible por el efecto de EPR. En forma alternativa, cuando el derivado de Bchl-RGD encuentra aVp3 o a\/ß5 integrinas, debe separarse de la SA vehículo y debe unirse a través de la parte de RGD, a la integrina a una mayor afinidad que a la molécula de SA. Después de esta unión primaria, el compuesto 13 o el compuesto 24 pueden difundirse por endocitosis en las células epiteliales, o por transcitosis a través de las células epiteliales. También es posible que el fármaco se mueva directamente hacia la matriz extracelular (ECM). En estos casos, el movimiento del fármaco de acuerdo con el gradiente de concentración se inclinará hacia la región necrótica, en donde el compuesto 13 o el compuesto 24 están inicialmente a su concentración más baja. Las interacciones c(RGDfK)-2H/Pd-MLT propuestas con la integrina, pueden implicar que la acumulación en el dominio necrótico del tumor es dependiente de los neutrófilos/macrófagos. Se sabe desde! hace tiempo que los neutrofilos y macrófagos activados expresan integrinas. Los resultados de histología muestran que los neutrofilos residen en el dominio necrótico (aunque principalmente en los márgenes). Se sabe de la literatura que existe alta infiltración de macrófagos en el carcinoma invasivo de la mama (Leek, Landers et al., 1999). Para NACAs (agentes de contraste ávidos de necrosis), se encontró que la depuración final de los focos necróticos ocurre unos cuantos días después de la administración, y corresponde al proceso de curación natural durante el cual los tejidos necróticos son cada vez más infiltrados y fagocitados por las células inflamatorias, principalmente neutrófilos, monocitos y/o macrófagos, y reemplazados por tejidos de granulación. Por lo tanto, se piensa que los NACAs retenidos en la necrosis son removidos junto con los materiales necróticos por la fagocitosis. Dé esta manera, la captación secundaria por los macrófagos después de la unión entre la necrosis y los NACAs, puede explicar también su enriquecimiento local. Por lo tanto, se sugiere que es posible que la atracción hacia el dominio necrótico y la retención en el mismo, dependen de la atracción hacia los neutrófilos y/o macrófagos que están poblando el dominio necrótico. La determinación del blanco posible y la retención prolongada de la fluorescencia de Chls/Bchls en el dominio necrótico, puede perrnitir su detección temprana y ayudar a predecir el pronóstico y los modos de tratamiento del tumor. Además, abre el camino para el suministro de fármacos dirigidos hacia la hipoxia. La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Materiales y métodos (i) Compuestos - Los derivados de Bchl, péptidos de RGD y conjugados de los mismos, se prepararon como se describe en el documento WO 2008/023378 de los mismos solicitantes. Estos conjugados y compuestos se presentan en la presente con los mismos números arábigos como en el documento WO 2008/023378 (salvo el compuesto 45). Compuesto 13 [c(RGDfK)-2H-MLT]: sal de potasio de 3 -oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida-173-c(RGDfK)amida. Compuesto 14 [c(RGDfK)-Mn-MLT]: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida-173- (cicloRGDfK)amida de manganeso (III). Compuesto 15 [c(RG Df K)-C u-M LT] : sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida-173-(cicloRGDfK)amida de cobre (II). Compuesto 24 [c(RG Df K)-Pd-M LT] : sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonil-metil-rodobacterioclorin 13 -(2-sulfoetil)amida-l73-c(RGDfK)amida de paladio. Compuesto 25 [2H-MLT]: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida.

Compuesto 26 [GRGDSP-2H-MLT lineal]: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)am¡da-173-(GRGDSP)amida. Compuesto 36 [c(RGDyK)2-2H-MLT]: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 13 -(2-sulfoetil)amida-173-bis(cicloRGDfK)amida. Compuesto 45 [c( RADf K)-2 H-M LT] : sal de potasio de 31-oxo- 5-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida-173- (cicloRADfK)amida. (i¡) Líneas de células - Se obtuvieron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Células de cáncer de ovario humano transfectadas MLS-pRSETB-mBanana resistentes a puromicina, fueron provistas amablemente por el Prof. Michal Neeman (Department of Biological Regulation, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). (¡ii) Transfección de MDA-MB-231 con proteína fluorescente roja (RFP) - Se usaron dos plásmidos para la transfección: pDsRed2-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) (figura 1A) que posee el gen de resistencia para neomicina, y un pDsRed-Monomer-Hyg-C1 modificado (Clontech, Palo Alto, CA) que posee el gen de resistencia para higromicina, en el cual el gen de DsRed-Monomer del plásmido mostrado en la figura B fue reemplazado con pDsRed2 (del plásmido pDsRed2-N1 , figura 1C). Para la transfección, se usó Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™) de acuerdo con el protocolo del fabricante. (iv) Cultivo de tejidos - Se mantuvieron células MDA-MB-231-RFP en medio del RPMI 1640 complementado con 1 mmol/L de piruvato de sodio, suero de ternera fetal (FCS) a 10%, 250 Mg/ml de higromicina, 0.06 mg/ml de penicilina y 0.1 mg/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron como monocapas a 37°C en una atmósfera humidificada (CO2 a 5%, aire a 95%). Se mantuvieron células MLS-mBanana en medio MEM-a complementado con un 1 mmol/L de piruvato de sodio, suero de ternera fetal (FCS) a 10%, 10 pg/ml de puromicina, 0.06 mg/ml de penicilina y 0.1 mg/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron como monocapas a 37°C en una atmósfera humidificada (CO2 a 5%, aire a 95%). (v) Animales - Ratones desnudos CD1 hembras (7 a 8 semanas, aproximadamente 25 g) fueron alojados y manipulados con libre acceso a alimento y agua en la instalación para animales, de acuerdo con las normas generales (1996) del Institutional Animal Care and Use Committee of the Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel). (vi) Modelo de tumores en ratones - Células de cáncer de mama humano fluorescentes MDA-MB-231-RFP y células de cáncer de ovario humano fluorescentes MLS-mBanana (5x106 en 100 µ? de solución salina) se trataron con tripsina y se colectaron a subconfluencia y se inocularon entonces en el dorso o almohadilla adiposa de la mama de ratones hembras. Se dejó que los tumores se desarrollaran hasta dos tamaños deseados - tumores necróticos (aproximadamente 1 cm3, dentro de 3-4 semanas) y tumores no necróticos (aproximadamente 0.5 cm3 dentro de 1-2 semanas). (vii) Formación de imágenes de fluorescencia de cuerpo entero -Se anestesió a ratones por inyección i.p. de 30 µ? de mezcla de 85:15 de cetamina.xilazina. Para el monitoreo de la acumulación del fármaco en la almohadilla adiposa de la mama, se inyectó i.v. a los ratones en la vena de la cola con 15 mg de fármaco/kg de peso corporal del compuesto 13, compuesto 25 o compuesto 24. Se monitoreó la fluorescencia de la proteína fluorescente roja (RFP), de pRSETB-mBanana y de los fotosensibilizadores, por el sistema de formación de imágenes óptico in vivo IVIS®100 (Xenogen Corp., Alameda, CA). El ajuste del filtro principal para la formación de imágenes del tumor comprendió filtro de excitación a 500-550 nm y filtro de emisión a 575-650 nm; el ajuste del filtro de fondo para la sustracción de la autofluorescencia del tejido, comprendió filtro de excitación a 460-490 nm y filtro de emisión a 575-650 nm. El ajuste del filtro principal para la formación de imágenes de los fármacos comprendió filtro de excitación a 665-695 nm y filtro de emisión a 810-875 nm. Se obtuvieron imágenes durante el mismo tiempo de exposición, y se ilustran en la misma escala de color lineal que permite una comparación cualitativa. (viii) Medición de la señal de fluorescencia en tumores necróticos - Márgenes del tumor - la región de interés (ROI) de las imágenes in vivo de cuerpo entero fue notable, y la señal de fluorescencia dentro de los márgenes encerrados en un círculo se expresó en fotones/segundo. La misma ROI se usó para medir los fotones/segundo en el lado colateral. Además, para las mediciones de fondo, se midieron ROIs del lado colateral y del tumor en tres ratones no tratados y se promediaron. Los valores medidos de la fluorescencia de cada ROI se dividieron entre el área para proveer una intensidad de la señal de fluorescencia normalizada en fotones/segundo/cm3. Se recabaron mediciones de la señal de 15 minutos a 216 horas posteriores a la inyección del compuesto 13. En cada punto de tiempo, el fondo se restó y el promedio se calculó como fue la relación entre la fluorescencia en los márgenes del tumor y el lado colateral. (ix) Prueba de competencia entre el compuesto 13 y la unión a c(RGDfK) libre - Se inyectó a ratones con exceso (8.5 pmoles) de péptído de c(RGDfK) libre una hora antes de la inyección del compuesto 13 (140 nmoles). Se inyectó al grupo control sólo con el compuesto 13 (140 nmoles). Se tomaron imágenes fluorescentes 24 horas posteriores a la inyección del compuesto 13. El ajuste del filtro principal para la formación de imágenes de fluorescencia se usó como se describió en el inciso (vii). (x) Formación de imágenes de fluorescencia del tumor extirpado - Se inyectó i.v. a ratones en la vena de la cola con 15 mg/kg del compuesto 13. Se sacrificó a los ratones, se extirparon los tumores (los cuales se cortaron a la mitad) y se formó una imagen de los mismos a diferentes intervalos de tiempo: 10 minutos, 1 , 4 y 24 horas, y 3, 5 y 7 días para MDA-MB-231-RFP, y 7 días para MLS-mBanana, usando el sistema Xehogen IVIS®. Los ajustes del filtro usados para la formación de imágenes de fluorescencia se describen en el inciso (vii). (xi) Histología - Después de los experimentos de excisión, los tumores fueron fijados en formaldehído a 3.7% e incluidos en bloques de parafina. Se tiñeron secciones con hematoxilina y eosina (H&E) bajo condiciones estándar. (xii) Protocolo de PDT - Se inyectó i.v. a los ratones anestesiados con 7.5 ó 15 mg/kg del compuesto 13. Se iluminaron los tumores por 10 ó 30 minutos. El intervalo de iluminación del fármaco fue de 8 ó 24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Se usó iluminación transdérmica con láser diódico de 755 nm a 100 mW/cm2 (CeramOptec, Alemania). En el grupo control bajo oscuridad, se inyectó i.v. a los ratones con el fármaco, y se pusieron en una jaula oscura por 24 horas. En el grupo control bajo iluminación, no se inyectó a los ratones con el fármaco, pero fueron iluminados por 10 minutos con 100 mW/cm2. Durante los dos primeros días post-PDT, los ratones recibieron analgesia según fuese necesario (2.5 mg/kg de Flunexin diariamente).

EJEMPLO 1 Transfección de células tumorales con proteínas de fluorescencia Se llevó a cabo el procedimiento de transfección para crear una línea de células que expresara la RFP en una manera estable. Dicha línea de células puede detectarse por microscopía fluorescente y otros medios de formación de imágenes de fluorescencia in vivo e in vitro (tejidos/células). Para este propósito, se eligió a la línea de células DA-MB-231 de cáncer de mama humano, conocida por generar necrosis central espontánea. Se usaron dos plásmidos (figuras 1A, 1C) y se obtuvieron y se detectaron clones estables por microscopio de fluorescencia (véase las figuras 2A-2B). Los clones generados del plásmido pDsRed-Monomer-Hyg-C1 modificado (figura 1C), presentaron una fluorescencia más fuerte. Se eligió para uso posterior el clon 3 (figura 2B), transfectado con pDsRed-Monomer-Hyg-C1 modificado. Las células transfectadas expresaron la RFP constitutivamente sin reducción en la intensidad de fluorescencia con el tiempo in vitro e in vivo. Las células no transfectadas no tuvieron autofluorescencia roja.

EJEMPLO 2 Modelo de tumor necrótico - análisis histopatológico Para verificar que las células MDA-MB-231 -RFP generan un modelo necrótico adecuado, se dejó que tumores MDA-MB-231 -RFP se desarrollaran en dos tamaños. Se llevó a cabo análisis histológico e histopatológico como se describe en la sección de materiales y métodos (xi). Los resultados se muestran en las figuras 3A y 3B. Los tumores grandes de aproximadamente 1 cm3 mostraron un dominio necrótico muy notable (figura 3A), mientras que los tumores pequeños de aproximadamente 0.5 cm3 no mostraron dominio necrótico (figura 3B).

EJEMPLO 3 Formación de imágenes de fluorescencia in vivo de la captación del compuesto 13 en tumores de xenoinierto MDA-MB-231-RFP necróticos primarios Se examinó el patrón de acumulación del compuesto 13 en tumores necróticos MDA-MB-231 -RFP (> 1 cm3) in vivo. Las figuras 4A-4B y 5A-5B ilustran la acumulación de la señal de fluorescencia del compuesto 13 en el tumor primario MDA-MB-231-RFP de mama humano ortotópico en la almohadilla adiposa de la mama de ratones hembras desnudos CD-1 , usando el sistema Xenogen IVIS®. Se registraron concomitantemente imágenes del animal entero, usando los ajustes del filtro como se describió en la sección de materiales y métodos (vii) anterior. Se adquirieron imágenes de fluorescencia dinámica cada 1-1.5 horas por 9 horas y a 24 horas posteriores a la inyección del compuesto 13 (figuras 4A-4B), y entonces por cada 24 horas por los, siguientes 7 días (figuras 5A-5B). Poco después de la inyección del compuesto 13, pudo detectarse fluorescencia del NIR del cuerpo entero del animal, reflejando una alta concentración de fármaco en la circulación. Depuración rápida de la circulación, acompañada de acumulación en el hígado, y hasta cierto grado en el tumor, se observaron en las primeras 9 horas después de la inyección (figura 4B). En los días siguientes, el compuesto 13 siguió acumulándose en el tumor mientras estaba siendo depurado por completo del hígado, proveyendo una formación de imágenes selectiva del tumor a = 3 días hacia el final del período de seguimiento a 7 días posteriores a la inyección (figura 5B), y una depuración extremadamente lenta posteriormente. El tamaño y la ubicación del tumor no cambiaron a lo largo del experimento, como se observa por las imágenes de cuerpo entero in vivo rojas (figuras 4A y 5A). Se observaron resultados similares en 9 animales examinados con tamaño de tumor = 1 cm3.

EJEMPLO 4 Formación de imágenes de fluorescencia in vivo de la captación del compuesto 13 en tumores de xenoinjerto MDA-MB-231-RFP no necróticos primarios Se examinaron a continuación los mismos parámetros en tumores = 0.5 cm3, los cuales son no necróticos. Las figuras 6A-6B y 7A÷7B presentan la señal de fluorescencia del compuesto 13 y la RFP en ratones hembras desnudos CD-1 que fueron injertados con MDA-MB-231-RFP. Se formó una imagen del patrón de acumulación del fármaco usando el sistema IVIS® como se describió anteriormente, y a intervalos de tiempo similares como en el ejemplo 3, pero limitados a 3 días debido a la depuración completa del fármaco alrededor de ese tiempo. El patrón de acumulación en estos tumores no necróticos fue notablemente diferente del observado en los tumores necróticos. La fluorescencia del NIR del compuesto 13 alcanzó valores pico en el tumor a aproximadamente 2 horas posteriores a la inyección, y poco después en el hígado (3.5 horas posteriores a la inyección del fármaco) (figura 6B). En contraste con la fluorescencia resuelta del compuesto 13 de tumores necróticos, prácticamente no pudo observarse fluorescencia 2 días posteriores a la inyección de los tumores no necróticos (figura 7A). En mediciones promediadas de fluorescencia de 16 animales, se detectó fluorescencia pico del tumor a 1-6.5 horas posteriores a la inyección del fármaco.

EJEMPLO 5 Cinética de la captación del compuesto 13 y depuración en tumores necróticos MDA-MB-231-RFP Para evaluar semi-cuantitativamente el patrón de acumulación del compuesto 13 en tumores necróticos, se calculó la señal de fluorescencia promedio para el compuesto 13 en tumores necróticos de 9 ratones, y se gráfico durante 216 horas, a varios puntos de tiempo (figura 8). A partir de 12 horas posteriores a la inyección y hacia adelante, la señal de fluorescencia del tumor llegó a ser distintivamente más fuerte que la de una región control equivalente en el lado colateral. La relación de la fluorescencia entre el tumor y el lado colateral se incrementó con el tiempo y alcanzó una meseta a aproximadamente 8 de 192 horas.

EJEMPLO 6 Captación del compuesto 24 en tumores de xenoinjerto necróticos primarios MDA-MB-231 -RFP ortotópicos El patrón de acumulación in vivo del conjugado metalado compuesto 24 (c(RGDfK)-Pd-MLT) en el tumor MDA-MB-231 -RFP primario necrótico, se examinó usando la misma serie de experimentos descrita en el ejemplo 3. Los resultados mostrados en las figuras 9A-9B y 10A-10B, demuestran que pudo detectarse fluorescencia poco después de la inyección del compuesto 24, reflejando una alta concentración de fármaco en la circulación. Se observó depuración rápida de la circulación acompañada de acumulación en el hígado, y hasta cierto grado en el tumor, en las primeras 8 horas después de la inyección (figura 9B). En los días siguientes, el compuesto 24 siguió acumulándose en el tumor; sin embargo, no se observó depuración completa del hígado (figura 10B). Parece ser que el compuesto 24 puede actuar como una molécula de formación de imágenes selectiva del tumor a partir de aproximadamente 3 días posteriores a la inyección, con una depuración extremadamente baja posteriormente. Sin embargo, es un poco menos específico que el compuesto 3. El tamaño y la ubicación del tumor no cambiaron a lo largo del experimento, como se observa por las imágenes de cuerpo entero in vivo rojas (figuras 9A y 10A). Estos resultados, con el tamaño del tumor = 1 cm3, se observaron en 3 animales.

EJEMPLO 7 Captación del compuesto 24 en tumores de xenoinierto no necróticos primarios MDA-MB-231-RFP ortotópicos La señal de fluorescencia del compuesto 24 y la RFP se examinó además en tumores no necróticos MDA-MB-231-RFP (~0.5 cm3) injertados en ratones hembras desnudos CD-1 como se describió en el ejemplo 4 anterior, usando intervalos de tiempo similares como se indicó en el ejemplo 6, pero limitados a 2 días debido a una depuración completa del fármaco del tumor alrededor de ese tiempo. Los resultados mostrados en las figuras 1 1A-11 B y 12A-12B demuestran que, como para el compuesto 13, el patrón de acumulación en tumores no necróticos fue notablemente diferente del observado en tumores necróticos. La fluorescencia del NIR del compuesto 24 alcanzó valores pico en el tumor a aproximadamente 2.5 horas posteriores a la inyección, y poco después en el hígado (5.5 horas posteriores a la inyección del fármaco, figura 11 B). En contraste con la fluorescencia resuelta del compuesto 24 de tumores necróticos, prácticamente ninguna fluorescencia pudo observarse 24 horas posteriores a la inyección de los tumores no necróticos (figura 12B). Se detectó fluorescencia pico del tumor (mediciones promedio de fluorescencia de 5 animales) a 1-4.5 horas posteriores a la inyección del fármaco.

EJEMPLO 8 Captación del compuesto 13 en tumores necróticos primarios MLS- m Banana implantados en la almohadilla adiposa de la mama de ratón Para establecer la generalidad de los resultados obtenidos en los experimentos anteriores, la acumulación del compuesto 13 en el dominio necrótico se examinó además en un tipo de tumor diferente, generado de una línea de células de cáncer de ovario humano MLS-mBanana. Los resultados mostrados en las figuras 13A-13B y 14A-14B, ilustran la acumulación de la señal de fluorescencia del compuesto 13 en tumores primarios MLS-mBanana de ovario humano subcutáneos (s.c.) que fueron injertados en la almohadilla adiposa de la mama de ratones hembras desnudos CD-1 , usando el sistema Xenogen IVIS® como se describe en la sección de materiales y métodos (vii). El patrón de acumulación se monitoreó a intervalos de tiempo similares como se describió anteriormente en la presente en el ejemplo 3, limitado a 4 días debido a una depuración completa del fármaco alrededor de ese tiempo. Poco después de la inyección, la fluorescencia del NIR del compuesto 13 se detectó principalmente del hígado y el tumor. Depuración rápida de la circulación, acompañada de acumulación en el hígado, y el tumor, ocurre en las primeras 8 horas después de la inyección (figura 13B). Después de 2 días, el compuesto 13 siguió acumulándose en el tumor mientras estaba siendo depurado por completo del hígado, proveyendo una formación de imágenes selectiva del tumor sin interferencia circundante (figura 14B). La depuración de los tumores necróticos MLS-mBanana fue notablemente más rápida que la depuración de los tumores necróticos MDA-MB-231-RFP, y concluyó casi en el día 3. El tamaño y la ubicación del tumor no cambiaron a lo largo del experimento como se observa por las imágenes de cuerpo entero in vivo rojas (figuras 13A y 14A). Estos resultados se observaron en 3 animales con tamaño de tumor > 1 cm3.

EJEMPLO 9 Captación del compuesto 13 en tumores no necróticos primarios MLS- mBanana implantados en la almohadilla adiposa de la mama de ratón En vista de los resultados en tumores MDA-MB-231-RFP no necróticos que no muestran acumulación prolongada del fármaco, se examinó la acumulación prolongada en tumores no necróticos MLS-mBanana. Los resultados mostrados en las figuras 15A-15B y 16A-16B, muestran la señal de fluorescencia del compuesto 13 en tumores no necróticos MLS-mBanana. Se monitoreó el patrón de acumulación como se describe en la sección de materiales y métodos (vi) usando intervalos de tiempo similares como se describió en el ejemplo 4, limitados a 4 días debido a la depuración casi completa del fármaco alrededor de ese tiempo. El patrón de acumulación en tumores no necróticos fue un poco similar al de los tumores necróticos. La fluorescencia del NIR del compuesto 13 alcanzó valores pico en el tumor a aproximadamente 1 hora posteriores a la inyección (figura 15B). Se detectó acumulación en el hígado a partir de la primera hora. Cuando se comparan tumores necróticos y no necróticos en la misma escala de fluorescencia lineal, la concentración del compuesto 13 en los tumores necróticos parece ser mucho mayor que en los tumores no necróticos como se muestra en las figuras 17A- 7B. Se detectó fluorescencia pico del tumor (mediciones promedio de fluorescencia de 4 animales) a 1-3.5 horas posteriores a la inyección del fármaco.

EJEMPLO 10 Dependencia que tiene la acumulación del compuesto 13 por la porción c(RGDfK) Se llevaron a cabo dos experimentos para determinar si la captación del compuesto 13 por el tumor y la acumulación resultante dé la señal de fluorescencia del NIR, son dirigidas por la porción RGD. En el primer experimento, se comparó la acumulación de la señal de fluorescencia a diferentes tiempos después de la inyección del compuesto 13, con la dé la inyección de 2H-MLT (compuesto 25) libre para ratones desnudos CD-1 injertados con tumores MDA-MB-231-RFP no necróticos (< 0.5 cm3) y necróticos (-1 cm3), en la almohadilla adiposa de la mama. El segundo experimento fue una prueba de competencia entre el compuesto 13 y c(RGDfK) libre. 10.1 Captación del compuesto 25 en tumores necróticos y no necróticos primarios MDA-MB-231 -RFP Se adquirieron imágenes de fluorescencia dinámica para tumores necróticos y no necróticos cada 1-1.5 horas por 8.5-9 horas, y a 24 horas después de la inyección inicial del compuesto 25 (figuras 18A-18B y 20A-20B) y por cada 24 horas por los siguientes tres días (figuras 19A-19B y 21A-21B). La señal de fluorescencia del NIR del compuesto 25 alcanzó una concentración máxima en el tumor a 5-10 minutos posteriores a la inyección, si se observaba alguna concentración en lo absoluto. Los valores de la señal de fluorescencia fueron aproximadamente 2 órdenes de magnitud más pequeños que los valores máximamente observados para el compuesto 13 (a intervalos de tiempo mucho más largos). La señal de fluorescencia disminuyó hasta valores no significativos ya a 20 minutos posteriores a la inyección. Mientras, la señal de fluorescencia se acumuló principalmente en el hígado y · en el corazón. El mismo comportamiento se observó en 3 animales con tumores necróticos (figura 18B), y en 2 animales con tumores no necróticos (figura 20B). 10.2 Prueba de competencia entre el compuesto 13 y c(RGDfK) libre que se une a tumores no necróticos primarios MDA-MB-231-RFP Se realizaron experimentos que intentaron bloquear la acumulación del compuesto 13 por el ligando c(RGDfK) libre, para demostrar unión específica. Se administró el compuesto 13 con o sin inyección previa de c(RGDfK) como se describió en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en las figuras 22A-22D. Cuando se administró el compuesto 13 después de la administración de c(RGDfK) libre, no se detectó acumulación en el tumor después de 24 horas (figura 22C), mientras que cuando el compuesto 13 se administró solo, en el grupo control, la acumulación en el tumor fue detectable (figura 22D), indicando unión específica del compuesto 13 al tumor, por medio de la porción c(RGDfK).

EJEMPLO 11 Acumulación específica del compuesto 13 en dominios necróticos del tumor MDA-MB-231-RFP Los patrones de fluorescencia dinámica notablemente diferentes de los xenoinjertos de tumor de mama necrótico y no necrótico implantados en las almohadillas adiposas de la mama, motivaron la investigación de la correlación entre la histología del tumor y la acumulación de la señal de fluorescencia del compuesto 13. Por lo tanto, se extirparon tumores a tiempos indicados después de la inyección del compuesto 13, y se cortaron a la mitad.

Se tomaron imágenes en varios puntos de tiempo (10 minutos, 1 , 4 y 24 horas, 3, 5 y 7 días posteriores a la inyección) usando el sistema Xenogén IVIS® como se describe en la sección de materiales y métodos (vii). Los resultados mostrados en las figuras 23A-29F muestran la acumulación de fluorescencia del compuesto 13 en diferentes puntos de tiempo. Por cada punto de tiempo, se pusieron a prueba 3 animales. De 10 minutos a 4 horas posteriores a la inyección del fármaco, la fluorescencia del fármaco sólo se observó en el área viable (figuras 23A-25F). A 4 horas, hubo cierta difusión hacia el dominio necrótico. A partir de 3 días posteriores a la inyección, el patrón de acumulación revertió: la fluorescencia cambió por completo a la zona necrótica, con cierta difusión de fluorescencia residual hacia las células viables circundantes (figura 27F). Estos resultados se observaron también por cinco y siete días (figuras 28A-29F). De modo importante, a 24 horas posteriores a la inyección, la fluorescencia específica del tumor se obseryó ya claramente con mayor fluorescencia del fármaco del dominio necrótico, pero los límites del tumor fueron menos agudamente definidos en comparación con el intervalo de tres días (figura 26F). En esta serie de experimentos, se mostró que conforme el tiempo transcurre, el compuesto 13 se mueve a través del dominio viable en el dominio necrótico, y se acumula ahí específicamente por un largo período.

EJEMPLO 12 Acumulación específica del compuesto 24 en dominios necróticos del tumor MDA-MB-231 -RFP En vista del patrón de acumulación observado para el compuesto 13, se pusieron a prueba otros derivados de Bchl. Se monitoreó el patrón de acumulación del compuesto 24, y se obtuvieron resultados similares. Los resultados para tumores extirpados 9 días posteriores a la inyección del fármaco, se muestran en las figuras 30A-30F. Se tomaron imágenes usando el sistema Xenogen IVIS® como se describió anteriormente. Como se observa en la figura 30F, nueve días posteriores a la inyección del fármaco, el fármaco estuvo claramente presente en el dominio necrótico del tumor. Estos resultados se observaron en todos los animales examinados (N = 3). Se observaron resultados similares cuando los tumores fueron extirpados 3 y 5 días posteriores a la inyección del fármaco (N = 3 para cada punto de tiempo).

EJEMPLO 13 Acumulación específica del compuesto 13 en dominios necróticos del Í ; ¦ tumor MLS-mBanana La acumulación observada del compuesto 13 y el compuesto 24 en el dominio necrótico de tumores MDA-MB-231 -RFP, proveyó una motivación para examinar la generalidad de este fenómeno y su aplicación potencial en la terapéutica y la formación de imágenes. Por lo tanto, se usó un diferente tipo de tumor - cáncer de ovario humano MLS-mBanana. En este caso, los resultados fueron un poco diferentes. En la mayoría de los casos, el patrón de necrosis en este tipo de tumor no fue central, a saber, hubo una amplia necrosis extendida y no se localizó específicamente a la mitad del tumor, o se generó desde un sitio en el tumor. En estos casos, la acumulación no fue tan prolongada. En los pocos casos en donde se observó necrosis central, el patrón de acumulación fue similar al de tumores MDA-MB-231-RFP. Las figuras 31A-32F muestran los resultados obtenidos 7 días posteriores a la inyección del fármaco. Como se observa, el fármaco estuvo claramente presente en el dominio necrótico del tumor, cuando se observó necrosis central (figura 31 F), y no estuvo presente en donde no había necrosis central (figura 32F).

EJEMPL0 14 Imagen del tumor extirpado v secciones histológicas de tumores hecróticos Se extirpó el tumor necrótico MDA-MB-231-RFP y se tiñeron secciones histológicas del tumor (hematoxilina y eosina (H&E)). Las figuras 33A-33D muestran secciones histológicas del tumor viable y dominios necróticos del tumor extirpado, 4 horas después de la inyección del fármaco. Estas observaciones deben complementar la formación de imágenes de la distribución de la RFP y el compuesto 13 en el tejido obtenida previamente. Como se observa en la figura 33A, el volumen de la masa está compuesto de tejido opaco, canela y necrótico. De la figura 33B, puede notarse una correlación entre las características macroscópicas y microscópicas. El tejido necrótico en el centro era eosinofílico a hipereosinofílico, con cariólisis extendida y menor picnosis y cariorrexis. Hubo infiltración neutrofilica multifocal leve en el tejido necrótico, principalmente en los márgenes del dominio necrótico. Las áreas viables estuvieron limitadas a la periferia del tumor. Estaban compuestas de la proliferación desorganizada de células neoplásicas dispuestas en hojas densamente celulares (figura 33D). Las células neoplásicas eran redondas a irregulares, con una alta relación nuclear: citoplásmica y núcleos vesiculares irregulares. La fluorescencia del compuesto 13 a 4 horas posteriores a la inyección, correspondió exactamente a los resultados histológicos, para los dominios viable y necrótico (figura 25F). Se obtuvo una correlación similar para todos los tumores necróticos examinados, incluyendo tumores control que no fueron inyectados con el fármaco.

EJEMPLO 15 Estudios de PPT in vivo usando el compuesto 13 En general, para estudios de PDT in vivo, se generan modelos de tumor de ratón inoculando células de cáncer de mama MDA-MB-231-RFP fluorescentes o células de cáncer de ovario MLS-mBanana subcutáneamente en el dorso o almohadilla adiposa de la mama de ratones hembras como se describió anteriormente, y se deja que crezcan hasta tamaño necrótico (>1 cm3) o no necrótico (-0.5 cm3). Se inyecta i.v. a los ratones anestesiados con el fármaco a diferentes concentraciones entre 7.5-15 mg/kg. Se ilumina a los tumores por 10 ó 30 minutos, y el intervalo de iluminación del fármaco está entre 4-24 horas posteriores a la inyección del fármaco. Se aplicaron varios protocolos que examinan el efecto del compuesto 13 sobre tumores MDA-MB-231-RFP en ratones CD-1 desnudos, para obtener condiciones de tratamiento óptimas, y los resultados se resumen en el cuadro 1. Como se observa en el cuadro 1 , parece ser que 7.5 rng de fármaco/kg del cuerpo e iluminación por 10 minutos, proveen los mejores resultados de tratamiento fotodinámico para tumores necróticos y no necróticos. Los resultados mostrados en las figuras 34A-34B demuestran una curación completa en un tumor MDA-MB-231-RFP no necrótico. Un día después del tratamiento se detectó edema, seguido de necrosis leve y entonces más extensiva en los siguientes 4 días. Alrededor del día 7, se observó aplanamiento del tumor. La herida sanó y el animal fue curado 90 días post-PDT. Los resultados se examinaron también usando el sistema Xenogen IVIS® como se describió anteriormente para la fluorescencia; de la RFP. Después de 90 días, no hubo señal de fluorescencia del tumor.

CUADRO 1 Resultados de los protocolos de PPT para el tratamiento de tumores MDA-MB-231-RFP EJEMPLO 16 Establecimiento del modelo de carcinoma ductal in situ (DCIS) localizado en la almohadilla adiposa de la mama de ratas/ratones desnudos Se usan varias líneas de células para establecer el modelo de DCIS en ratones y ratas. Primero, células MADB106 que son singénicas con ratas F-344 han sido ya implantadas exitosamente (ortotópicas) en la almohadilla adiposa de la mama de la rata. Este modelo se ha usado hasta ahora para identificar la eficacia de la PDT con diferentes derivados de RGD-Bchl y el desarrollo subsiguiente de inmunidad antitumoral a largo plazo. El mismo protocolo que se usa para los tumores de carcinoma de mama de la rata, se usa para implantar ortotópicamente dos líneas de células humanas y una línea de células de ratón adicional, y para obtener metástasis en pulmones y nódulos linfáticos. Las primeras dos, hT47D y HCC1395, son líneas de células de carcinoma ductal (HCC1395 es un carcinoma ductal primario de etapa 1 , el cual está tan cerca como es posible al DCIS) que se cultivan de acuerdo con las regulaciones de la ATCC y la literatura (Gazdar et al., 1998), y se inyectan como aloinjertos en la almohadilla adiposa de la; mama de los animales desnudos. La tercera (4T1) es una línea de células dé la mama de ratón que genera metástasis pulmonar unas cuantas semanas después de la inyección de las células en la vena de la cola. Esta variedad de líneas de células permite estudiar el efecto de los derivados de Bchl/Bchl-RGD-PDT sobre lesiones primarias, reiteradas localmente, y metástasis remotas de carcinoma de la mama como modelos de cáncer de mama. Las células 4T1 son transfectadas con luciferasa, así como las otras dos líneas de células. La transfección de 4T1 con pDsRed1-C1 está actualmente en progreso. Dicha fluorescencia permite: (1) Evaluación de la precisión de la detección usando fluorescencia basada en Bchl-RGD o MRI; (2) monitoreo en línea del crecimiento y la regresión del tumor bajo Bchl-PDT en animales intactos a una sensibilidad muy alta.

EJEMPL0 17 Establecimiento del concepto de acumulación de necrosis como un concepto general Existen tipos de tumores que desarrollan necrosis central tras desarrollo. Dos de dichos tumores se seleccionan para el examen de tumores desarrollados de las siguientes líneas de células: cáncer de mama DCIS MCF7 humano, DCIS MCF10DCIS humano (Tait et al., 2007), glioblastoma U87 humano, cáncer de mama inflamatorio (IBC) humano WIBC-9 (Shirakawa er a/., 2001) y RCC. Las líneas de células seleccionadas sufren transfección usando el plásmido pDsRed-Monomer-Hyg-C1 modificado y el reactivo de transfección Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™), como se describe en la sección de materiales y métodos (iii) anterior. Las células son implantadas (1-5x106 células, de acuerdo con Jos requerimientos para cada tipo de Célula) ortotópicamente, si es posible, o s.c. en ratones desnudos CD-1 , se deja que crezcan hasta el tamaño límite deseado (aproximadamente 1 cm3), y se desarrolla necrosis. La región necrótica es seguida histológicamente. Dos modelos de tumor adecuados desarrollados de las líneas de células anteriores se seleccionan para mayor estudio con base en los parámetros de zona necrótica, velocidad de crecimiento y formación de imágenes. Para la formación de imágenes de fluorescencia de cuerpo entero, se anestesia a los ratones como se describió anteriormente, y se inyecta el compuesto 13 i.v. en la vena de la cola (15 mg/kg). La fluorescencia del fármaco y el tumor se monitorea usando el sistema de formación de imágenes IVIS®100 (Xenogen), como se describió anteriormente. Para la formación de imágenes de fluorescencia del tumor extirpado, se inyecta i.v. a los ratones en la vena de la cola con 15 mg/kg del compuesto 13. Se sacrifica entonces a los ratones en diferentes puntos de tiempo, y se extirpan los tumores y se cortan a la mitad. La formación de imágenes de los tumores extirpados y su tinción histológica para evaluar los dominios necróticos, se llevan a cabo de acuerdo con las secciones de! materiales y métodos (x) y (x¡) anteriores. Se espera la acumulación del compuesto 13 en los dominios necróticos centrales de los tumores, independiente del origen de la línea de células.

EJEMPLO 18 Patrón de acumulación del compuesto 25 conjugado con diferentes porciones RGD Para establecer adicionalmente la relevancia de la determinación del blanco de RGD, se usan diferentes péptidos de RGD y controles negativos para examinar el patrón de acumulación en tumores MDA-MB-231-RFP. Se implantan células MDA-MB-231 -RFP (5*106 células) ortotópicamente en ratones hembras desnudos CD-1 , y se deja que crezcan hasta un tamaño necrótico de 1 cm3. Se anestesia a los ratones y se inyecta a los mismos i.v. en la vena de la cola, con 15 mg/kg del compuesto 26 (GRGDSP-2H-MLT lineal), compuesto 45 (c(RADfK)-2H-MLT) y compuesto 36 (c(RGDyK)2-2H-MLT). La formación de imágenes de fluorescencia in vivo del fármaco en el animal intacto, y la histología y formación de imágenes de fluorescencia del tumor extirpado, se llevan a cabo como se describió anteriormente en las secciones de materiales y métodos (vii), (x) y (xi), respectivamente.

EJEMPLO 19 Acumulación de otros derivados de Bchl-RGD en el área necrótica Se examinan derivados de Bchl-RGD adicionales para investigar si el patrón de acumulación en la necrosis es un paradigma general para todos los derivados de Bchl-RGD que tienen potencial terapéutico y/o de formación de imágenes. Específicamente, se examinan los derivados del i compuesto 15 (c(RGDfK)-Cu-MLT) y compuesto 14 (c(RGDfK)-Mn-MLT). Se implantan células MDA-MB-231-RFP (5x106 células) ortotópicamente en ratones hembras desnudos CD-1 , y se deja que crezcan hasta un tamaño de tumor de 1 cm3. En el caso en donde la fluorescencia de la Bchl es extinguida debido a metalación (por ejemplo, Cu y Mn), las concentraciones de los compuestos en los tejidos tumorales y no tumorales se determinan por espectrometría de masa de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS), usando un instrumento ELAN-6000 (Perkin Elmer, CT) como es descrito por Brandis et al. (Brandis ef al., 2005).

EJEMPLO 20 Pruebas de biodistribución , Este experimento pretende cuantificar el curso de la difusión y acumulación del fármaco en varios órganos del cuerpo, y demostrando en una forma imparcial, que el fármaco se acumula por supuesto finalmente en el tumor. Se inyecta i.v. a ratones anestesiados que poseen tumores MDA-MB-231-RFP con el compuesto 13, 15 mg/kg. Se sacrifica a los ratones en varios puntos de tiempo después de la inyección. Se colectan tejidos (sangre, ríñones, hígado, piel, grasa, músculo, bazo, intestino, cerebro, corazón, pulmones y tumor) en viales pesados previamente, y se congelan los mismos. Se homogenizan muestras de tejido y el fármaco se extrae en metanol (~1 mi de metanol por 100 mg de tejido). Se analizan entonces las muestras para contenido de fármaco por análisis de fluorescencia. La cuantificación de la acumulación del compuesto 13 en los varios tejidos se realiza por mediciones de la intensidad de fluorescencia, y evaluando la concentración del fármaco usando, como referencia, una curva de calibración obtenida midiendo la intensidad de fluorescencia de diferentes concentraciones del compuesto 13 en etanol. Las imágenes de fluorescencia del NIR in vivo obtenidas en el ejemplo 3 anterior en varios puntos de tiempo, se comparan con la intensidad de fluorescencia de los extractos de la prueba de biodistribución. Los resultados se usan para validar las mediciones in vivo. Se espera encontrar una correlación lineal entre las mediciones de fluorescencia in vivo e in vitro. Se espera también que el análisis cuantitativo muestre más precisamente la diferente acumulación y depuración de los tejidos tumoral y normal. Dicha determinación puede ser muy útil para el área clínica.

EJEMPLO 21 Derivados de RGD-bacteríoclorofila metalados con un radioisótopo para formación de imágenes v terapia Otra opción terapéutica, es el reemplazo del metal central del fármaco con uno radiactivo. La acumulación de dicho derivado de RGD-M-Bchl, en donde M tiene una duración de vida relativamente larga (para terapia), puede usarse para la radioterapia del tumor. El fármaco podría administrarse también en dichos intervalos en los cuales el fármaco permanece a bajas concentraciones en el cuerpo, pero es acumulado cada vez más en la región necrótica. La incorporación de Cu al fármaco se realiza mediante un método desarrollado en el laboratorio de los presentes inventores, que permite la metalación cuantitativa de 2H-Bchl-RGD dentro de 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. El compuesto obtenido es muy estable, y no ocurre desmetalación bajo condiciones fisiológicas. Se espera demostrar la acumulación del compuesto radiactivo en el tejido tumoral, y observar la regresión del tumor después de uno o dos tratamientos.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un conjugado de un péptido que contiene RGD o un peptidomimético de RGD y un fotosensibilizador de clorofila o bacterioclorofila para preparar un medicamento para la formación de imágenes dirigida hacia tumores, terapia fotodinámica (PDT) dirigida hacia tumores, y/o el pronóstico en línea de tumores necróticos, en donde dicho fotosensibilizador es una clorofila o bacterioclorofila de la fórmula I, II o III:

(I) (II) en donde: M representa 2H o un átomo seleccionado del grupo que consiste de Mg, Pd, Pt, Co, Ni, Sn, Cu, Zn, Mn, In, Eu, Fe, Au, Al, Gd, Dy, Er, Yb, Lu, Ga, Y, Rh, Ru, Si, Ge, Cr, Mo, P, Re, Te y TI, e isótopos y radioisótopos de los mismos; X es O ó N-R7; R t R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-R&, -NRgR'g o -N+R9R'9R"g A"; o Ri y R6 forman juntos un anillo que comprende un residuo de péptido de RGD o peptidomimético de RGD; Y es O ó S; R2 es H, OH o COOR9; R3 es H, OH, alquilo de C1-C12 o alcoxi de C1-C12; R4 es -CH=CR9R'9, -CH=CR9Hal, -CH=CH-CH2-NR9R'9, -CH=CH-CH2- N+R9R,9 ,,9 A", -CHO, -CH=NR9, -CH=N+R9R'9 A~, -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal, -CH2-R9| -CH2-NR9R'9>

A~, -CH2-CH2R9, -CH2-CH2Hal, -CH2-CH2OR9> -CH2-CH2SR9, -CH2-CH2-NR9R'9, -CH2-CH2-N+R9R'gR"9 A~ -COCH3, C(CH3)=CR9R'9, -C(CH3)=CR9Hal, -C(CH3)=NR9, -CH(CH3)=N+R9R'9A~, -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-OR9, -CH(CH3)-SR9, -CH(CH3)-NR9R'9, -CH,(CH3)-N+RgR'9 R'gA~ o -C=CR9; R'4 es metilo o formilo; R5 es O, S, N-R9, N+R9R'9 A~, CR9R 9 o CRg-Hal; R7, Re, R9, R'g y R"9 es cada uno independientemente: (a) H; (b) hidrocarbilo de CrC25; (c) hidrocarbilo de C C25 sustituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, -CONRR', -COR, COOR, -OS03R, -SO3R, -S02R, -NHS02R, - SO2NRR' -NRR', =N-OR, =N-NRR', -C(=NR)-NRR',-NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', 0<-NR-, >C=NR, -(CH2)n-NR-COR', -(CH2)h-CO-NRR', -0-(CH2)n-OR, -0-(CH2)n-0-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -P02HR y -P03RR\ en donde R y R' es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, R' puede ser además un residuo de un péptido de RjGD o peptidomimético de RGD, o R y R' junto con el átomo de N al cual están unidos forman un anillo saturado de 5 a 7 miembros conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de O, S y N, en donde el átomo de N adicional puede ser sustituido, y R" es H, un catión, hidrocarbilo o heterociclilo; (d) hidrocarbilo de C1-C25 sustituido por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de grupos cargados positivamente, grupos cargados negativamente, grupos básicos que son convertidos a grupos cargados positivamente bajo condiciones fisiológicas, y grupos ácidos que son convertidos a grupos cargados negativamente bajo condiciones fisiológicas; (e) hidrocarbilo de C-i-C25 conteniendo uno o más heteroátomos y/o una o más porciones carbociclicas o heterocíclicas; (f) hidrocarbilo de C1-C25 conteniendo uno o más heteroátomos y/o una o más porciones carbociclicas o heterocíclicas y sustituido por uno o más grupos funcionales como se define en los incisos (c) y (d) anteriores; (g) hidrocarbilo de CrC25 sustituido por un residuo de un aminoácido, un péptido, dé preferencia un péptido de RGD, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, o un ligando polidentado y sus complejos quelantes con metales; o (h) un residuo de un aminoácido, un péptido, de preferencia un péptido de RGD o un peptidomimético de RGD, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido o un polisacárido; o un ligando polidentado y sus complejos quelantes con metales; R7 puede ser además -NRR', n donde R y R' es cada uno H o hidrocarbilo de C1-C25, opcionalmente sustituido por un grupo cargado negativamente, de preferencia SO3 ; Re puede ser además H+ o un catión R+io cuando R1 ( R'2 y R6 es cada uno independientemente Y-Re; R+io es un metal, un grupo amonio o un catión orgánico; A es un anión fisiológicamente aceptable; m es 0 ó 1 ; la línea de puntos en las posiciones 7-8 representa un doble enlace opcional; y sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos del mismo. 2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la línea de puntos en las posiciones 7-8 está ausente, y el fotosensibilizador es una bacterioclorofila de la fórmula I o II en donde: (i) cualquiera del hidrocarbilo de C1-C25 es preferiblemente un alquilo, alquenilo o alquinilo de C1-C10, preferiblemente de C2-C3; (¡i) M es 2H o un metal seleccionado de Pd, Mn, o Cu; (ni) cada R4, independientemente, es acetilo, vinilo, etilo o radical 1-hidroxietilo, o un éter o éster de dicho radical 1-hidroxietilo, preferiblemente R4 en la posición 3 es acetilo, y R4 en la posición 8 es etilo; y (iv) R'4 es metilo, dicha bacterioclorofila contiene por lo menos un grupo seleccionado de: (a) un grupo cargado negativamente seleccionado de COO , COS , S03 o P03 '< (b) un grupo ácido que es convertido a un grupo cargado negativamente al pH fisiológico, seleccionado de COOH, COSH, S03H o PO3H2, o una sal del mismo; (c) un grupo cargado positivamente seleccionado de un grupo onio tal como -0+(RR'), -S+(RR'), -Se+(RR'), -Te+(RR'), -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -Sb+(RR'R") y -Bi+(RR'R"), un catión derivado de un grupo que contiene N seleccionado de un grupo -Nf(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), 0 -N+(RR')-, >C=N+(RR'), -C(=NR)-N+RR'R" o -(R)N-C(=NR)-N+RR'R", preferiblemente N+(RR'R"), o un catión derivado de un compuesto heteroaromáticp que contiene uno o más átomos de N y opcionalmente átomos de O o S tales como pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, isoquinolinio, pirimidinio, 1 ,2,4-triazinio, 1 ,3,5-triazinio o purinio; o (d) un grupo básico que es convertido a un grupo cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas, seleccionado de -NRR', -C(=NR)-NR"R", -NR-NR'R", -(R)N-C(=NR)-NR'R", 0<-NR- o >C=NR, o el grupo básico es un radical heteroaromático que contiene N seleccionado de pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilo, 1 ,2,4-triazinilo, 1 ,3,5-triazinilo o purinilo, en donde R, R' y R" es cada uno independientemente H, hidrocarbilo o , heterociclilo opcionalmente sustituido, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al cual están unidos forman un anillo saturado de 3 a 7 miembros, opcionalmente conteniendo uno o más heteroátomos seleccionados de O, S o N, y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional, dicho anillo se selecciona del grupo que consiste de aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionalmente sustituido en el átomo de N adicional por alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido por halo, hidroxilo o amino, y en donde dicho al menos un grupo es un grupo de extremo o un grupo localizado dentro de una cadena alquilo. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha bacterioclorofila es de fórmula II, y F¾6 es -NRgR'g, en donde R9 es H y R'g se selecciona de: (i) alquilo de C1-C10 sustituido por SO3H o una sal alcalina del mismo; o (ii) alquilo de C1-C6 sustituido por un grupo básico TNRR' o -NH-(CH2)2-6-NRR', en donde cada uno de R y R' es independientemente H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido por NH2, o R y R' junto con el átomo de N forman un anillo saturado de 5 a 6 miembros, opcionalmente conteniendo un átomo de O o N, y opcionalmente sustituido además en el átomo de N adicional por -(CH2)2-6-NH2.

4. - El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde R6 es (i) -NH-(CH2)2-S03K o -NH-(CH2)3-S03K; o (ii) -NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2, -NH-(CH2)2-1-morfolino o -NH-(CH2) 3-piperazino-(CH2)3-NH2.

5.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el fotosensibilizador es una bacterioclorofila de fórmula II, y R1 y R6 forman juntos un anillo cíclico que comprende un péptido de RGD o peptidomimético de RGD.

6.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el péptido que contiene RGD es un péptido todo L, todo D o un péptido L,D lineal o cíclico compuesto de 4-100, de preferencia 5-50, 5-30, 5-20, más preferiblemente, 5-10 aminoácidos naturales, naturales modificados o no naturales en donde los aminoácidos naturales se seleccionan de Ala, Arg, Asn, Asp, Cys.His, Gln, Glu, Gly, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val, y la modificación de dichos aminoácidos naturales modificados o no naturales incluye D-modificación, alquilación o acilación del grupo amino terminal o del grupo amino libre de lisina, esterificación o amidación del grupo carboxi terminal o del grupo carboxi libre de ácido de ácido glutámico o aspártico, y eterificación o esterificación del grupo hidroxilo libre de serina o tirosina.

7. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde el péptido que contiene RGD es un péptido cíclico seleccionado de c(RGDfK) (SEQ ID NO: 1), en donde f indica D-Phe, c(RGDK) (SEQ ID NO: 3), c(RGDf-n(Me)K) (SEQ ID NO: 4), (RGDyK)(SEQ ID NO: 5), en donde y es DrTyr o CDCRGDCGC (SEQ ID NO: 9), de preferencia el pentapéptido c(RGDfK), o el péptido que contiene RGD es un péptido lineal seleccionado del hexapéptido GRGDSP (SEQ ID NO: 6), el heptapéptido GRGDSPK (SEQ ID NO: 7) o el miembro de 25 elementos (GRGDSP)4K (SEQ ID NO: 8).

8. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde el conjugado se selecciona del compuesto: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-rodobacterioclorin 13 -(2-sulfoetil)amida-173-c(RGDfK)amida, también designado en la presente como c(RGDfK)-2H-MLT; y el compuesto: sal de potasio de 31-oxo-15-metoxicarbonil-metil-rodobacterioclorin 131-(2-sulfoetil)amida-173-c(RGDfK)amida de paladio, también designado en la presente como c(RGDfK)-Pd-MLT.

9. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el tumor es un tumor primario o un tumor metastásico con dominios necróticos, tales como melanoma, tumores de próstata, cerebro, colon, ovario, mama, colorrectal, de cabeza y cuello y de la pared del tórax que surgen de cáncer de mama, cánceres de piel, pulmón, esófago y vejiga, y tumores.

10. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el tumor es cáncer de mama localizado, en particular carcinoma ductal in situ (DCIS).