WO2006049300A1 - 血小板血栓症又は臓器障害の検出方法 - Google Patents

血小板血栓症又は臓器障害の検出方法 Download PDF

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WO2006049300A1
WO2006049300A1 PCT/JP2005/020451 JP2005020451W WO2006049300A1 WO 2006049300 A1 WO2006049300 A1 WO 2006049300A1 JP 2005020451 W JP2005020451 W JP 2005020451W WO 2006049300 A1 WO2006049300 A1 WO 2006049300A1
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vwf
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thrombin
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Tomoko Ono
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Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting platelet thrombosis or organ damage, in particular, disseminated intravascular coagulation 3 ⁇ 4E ⁇ (Disseminated
  • DI intravascular Coagulation
  • the von Willebrand factor von in a biological sample eg, blood
  • a subject particularly DIC or SIRS patient
  • Willebrand factor (vWF) and / or its degradation factors to detect platelet thromboembolism or organ damage such as detection or prediction of the degree of platelet thrombus formation, prediction of the onset of thrombosis or organ damage (i.e. Assessment of the risk of onset), determination of the presence or absence of thrombosis or organ damage, prediction of prognosis of thrombosis or organ damage, monitoring, determination of therapy, etc.
  • DIC associated with sepsis activates cytostatic inca and neutrophils such as tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) and interleukin (IL-1) produced from monocytes (macrophages).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • IL-1 interleukin
  • monocytes themselves and vascular endothelial cells are activated, and tissue factors are expressed on the cell surface, so that microthrombi are formed.
  • Microthrombus formation further exacerbates microcirculatory disturbances and causes multiple organ failure (MOF).
  • MOF multiple organ failure
  • Non-patent Documents 1 and 2 In respiratory distress syndrome, platelets collect in the pulmonary circulation and cause pulmonary artery occlusion. SIRS does not cause an inflammatory reaction due to an increase in the amount of site force in response to a specific antigen, but without specific targets, an immune response is activated nonspecifically in response to an invasion to a living body. It is a group of diseases that cause severe MOF due to in-control of in-production (Non-patent Documents 1 and 2).
  • SIRS is classified as non-infectious SIRS and Sepsis, with the former occurring in shock, trauma, burns, or acute knee inflammation, and the latter in the bacteremia of various pathogens and other serious illnesses. Occurs with staining. SIRS is a bioimmune response to pathogen invasion, tissue damage, anoxia, etc., and is a non-specific systemic acute inflammatory response triggered by various endogenous mediators regardless of the type of invasion. Severe organ failure associated with SIRS can be caused by tissue ischemia or inflammation at an early stage.
  • SIRS organ dysfunction syndrome
  • the levels of inflammatory sites such as TNF_a, IL-1 (interleukin-l), and IL-6 (interleukin_6) in blood are high. This is thought to be a force that causes the activation of the sphere and the enhancement of the blood coagulation reaction.
  • Vascular endothelium When activation of neutrophils occurs beyond the cytoprotective action that the cell is doing, neutrophil elastase catecholin G causes proteases of vascular endothelial cells. As a result, microcirculation disturbances and microthrombosis occur. Activated neutrophils accumulate not only in the inflamed area, but also in remote organs such as the lungs and liver (low perfusion pressure and leukocytes tend to adhere).
  • Neutrophil elastase (e l as t ase) has a molecular weight of approximately 30,000 neutral protease present in ⁇ 's Lumpur granules.
  • Neutrophil elastase digests and degrades phagocytic bacteria and foreign bodies in neutrophils in the physiological state, and elastin, collagen (type III, type IV), fibronectin, and immunoglobulin outside neutrophils. Decomposes blood coagulation factor XIII and regulates tissue biosynthesis.
  • Neutrophil elastase in pathological conditions, is a component of the body, such as elastic fibers, proteodalycan, collagen fibers, antithrombin III, a plasmin inhibitor.
  • Neutrophil elastase activity Inactivates antithrombin m by acting on the heparin-binding site of antithrombin m, and causes die.
  • Neutrophil elastase is a protease inhibitor (a-protease) in the blood.
  • AT is an active oxygen released from neutrophils, myelin peroxidase, ratatov
  • neutrophil elastase As a result of being oxidized by erin, neutrophil elastase is not inactivated and is considered to damage tissues. Neutrophil elastase has low substrate specificity, so if it is released excessively, or if an inhibitor such as a-AT is deficient, it also degrades biological components, causing neutrophil elastase to damage its own tissue. May cause. Intensely damaged blood vessels Endothelial cells are detached, and platelets adhere and aggregate at the detached site, forming a thrombus.
  • vWF is required for the adhesion of this platelet, and this is triggered to form a thrombus after a series of platelet activation processes such as platelet aggregation and intracellular granule release, and hemostasis is performed.
  • vWF is secreted into the blood from the vascular endothelium as a macromolecule having a molecular weight of 20, OOOkDa or more, where it is cleaved by the meta-protease vWF-degrading enzyme and circulates in the blood as a multimer of 50 0-20, OOOkDa.
  • vWF changes and takes an extended structure.
  • vWF-degrading enzymes Unusually large vWF molecules exist in the blood and bind to platelets more effectively, thereby causing platelet aggregation in the blood vessel. It is believed to promote and form thrombus in the microcirculation.
  • platelet-based thrombus formation is indispensable for the physiological hemostasis mechanism, but platelets fuse and fibrin form thrombus formation due to the activity of coagulation factors (factor VII, factor II, etc.).
  • Non-Patent Document 1 Bone RC, “Critica ICare Medicine” (USA), 1 996, 24, p. 1 125— 1 128
  • Non-Patent Document 2 Davies MG. Et al., “Britishjoumal of Surgery” (UK), 1997, 84 ⁇ , p. 920-935 Disclosure
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting platelet thrombosis or organ damage in a subject (particularly a DIC or SIRS patient), and the detection kit.
  • the object is to analyze platelet thrombosis or organ damage in a patient with disseminated intravascular coagulation or systemic inflammatory response syndrome, which analyzes von Willebrand factor-degrading enzyme and Z or its degradation factor according to the present invention. It can be solved by a detection method.
  • the degradation factor is a protease selected from the group consisting of elastase, plasmin, and thrombin (more preferably elastase).
  • elastase plasmin
  • thrombin more preferably elastase.
  • Analysis of von Willebrand factor-degrading enzyme is performed by immunological method.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient an antagonist or inhibitor, an agonist or an activity regulator for a protease selected from the group consisting of elastase, plasmin, and thrombin. After administration, the analysis is performed.
  • the present invention also provides an antibody or fragment thereof that specifically binds to von Willebrand factor-degrading enzyme, and an antibody or fragment thereof that specifically binds to the degradation factor of Z or von Willebrand factor-degrading enzyme.
  • the present invention relates to a kit for detecting platelet thrombosis or organ damage in patients with disseminated intravascular coagulation syndrome or systemic inflammatory reaction syndrome.
  • kit of the present invention further comprises an antibody or fragment thereof that specifically binds to a vWF-degrading enzyme cleaved by a protease selected from the group consisting of elastase, plasmin, and thrombin.
  • analysis includes “detection” for determining the presence or absence of an analyte (for example, vWF), and quantitatively or semi-quantitatively determining the amount or activity of the analyte. You “Measurement” is included.
  • the present invention develops as a basic disease such as a subject such as a DIC or SIRS patient, more specifically, urinary tract infection with high elastase, metastatic lung cancer, and Z or acute myeloid leukemia. It enables detection of platelet thrombosis or organ damage in DIC and SIRS patients, and its clinical value is very high. According to the present invention, it is possible to detect platelet thrombosis or organ damage excellent in convenience, rapidity, and specificity.
  • FIG. 1 is a drawing showing the results of electrophoresis of a recombinant vWF-degrading enzyme antigen treated with elastase.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of electrophoresis of recombinant vWF-degrading enzyme antigen treated with plasmin or thrombin.
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between vWF-degrading enzyme and elastase.
  • FIG. 4 is a graph showing the distribution of vWF-degrading enzyme antigen levels in each patient group divided by elastase level.
  • the amount (concentration) or enzyme activity of vWF-degrading enzyme and / or its degradation factor is quantified and compared with the amount (concentration) or enzyme activity of vWF-degrading enzyme and / or its degradation factor in healthy individuals. This makes it possible to detect (diagnose) thrombosis or organ damage.
  • thrombosis or organ damage for example, detection or prediction of the degree of platelet thrombus formation, prediction of the onset of thrombosis or organ damage (that is, evaluation of the risk of onset), thrombosis It also includes determination of the presence or absence of organ damage, prediction of prognosis of thrombosis or organ damage, monitoring, and determination of treatment methods.
  • vWF degrading enzyme refers to tyrosine (842) and methionine (843) present in the A2 domain of von Willebrand factor (vWF). Is a meta-oral protease also referred to as ADAMTS 13.
  • a decrease in the concentration of vWF-degrading enzyme can be used as an index as compared with a healthy person.
  • DIC and SIRS patients with high levels of elastase have a statistically higher concentration of vWF-degrading enzyme contained in body fluid samples than healthy individuals.
  • Scientifically significantly decreased (50% or less).
  • the risk of developing thrombosis or organ damage is high, and furthermore, the prognostic status of thrombosis or organ damage can be determined to be poor.
  • the concentration of vWF-degrading enzyme is within the normal range, it can be determined that the degree of platelet clot formation is low, and that the risk of developing thrombosis or organ damage is low. Furthermore, it can be determined that the prognostic state of thrombosis or organ damage is good.
  • Subjects (subjects) to which the method of the present invention can be applied detect the degree of platelet thrombus formation, or develop thrombosis or organ damage (for example, renal damage or liver damage, preferably renal damage) As long as it is a subject requiring a prognostic prediction, for example, DIC or SIRS patients, preferably DIC or SIR S patients with high elastase, eg leukemia (eg acute myeloid Leukemia), infectious diseases (eg, urinary tract infections), or cancer (metastatic lung cancer).
  • DIC or SIRS patients preferably DIC or SIR S patients with high elastase, eg leukemia (eg acute myeloid Leukemia), infectious diseases (eg, urinary tract infections), or cancer (metastatic lung cancer).
  • thrombosis blood is solidified in blood vessels, and blood vessels are narrowed or completely blocked by blood clots adhering to the blood vessel wall, resulting in blood flow stagnation and damage to tissues and organs.
  • platelets in the blood collect at the wound and stop bleeding.
  • fibrin fibrin in the blood
  • fibrin aggregates to form a thrombus
  • completely hemostasis occurs, blood vessel wall cells grow, and blood vessels are repaired.
  • a component that dissolves thrombus (fibrin) works, and blood flow is restored. This fibrinolysis does not work properly, and blood clots Thrombosis is what prevents or completely blocks the flow of blood.
  • thrombosis thrombosis thrombosis thrombosis thrombosis .
  • cerebral embolism cerebral embolism
  • transient cerebral ischemic attack in the brain pulmonary thromboembolism in the lung
  • angina pectoris myocardial infarction
  • intra-atrial thrombus in the heart
  • mesenteric thrombus and deep vein thrombosis such as economy syndrome
  • the detection is performed by collecting specimens from healthy subjects and subjects (for example, patients with DIC or SIRS), measuring the respective vWF-degrading enzyme concentrations, and comparing the measured values.
  • the detection and / or prediction in the subject can be performed only by analyzing vWF-degrading enzyme with respect to the subject to be predicted. .
  • the normal value range or the threshold for determination is expected to change depending on various conditions such as the underlying disease, sex, age, etc. Those skilled in the art appropriately select an appropriate population corresponding to the subject. It is possible to determine the normal value range or threshold for judgment by performing statistical processing on the data obtained from the population.
  • an immunological technique using an anti-vWF-degrading enzyme antibody or a fragment thereof for example, an enzyme immunoassay, a latex agglutination immunoassay, chemiluminescence immunity
  • Measurement method fluorescent antibody method, radioimmunoassay method, immunoprecipitation method, immunohistochemical staining, Western plot, etc.
  • biochemical method eg, enzymological measurement method
  • molecular biological to measure mRNA level You can list techniques
  • the anti-vWF-degrading enzyme antibody or fragment thereof conforms to a known method, for example, the method described in WO 2004Z029242 pamphlet.
  • Various immunological measurements for example, It can be carried out according to the method described in WO 2004/029242.
  • an immunological method is preferred because of its sensitivity and simplicity.
  • the immunological method is a method in which an antibody against vWF-degrading enzyme is used to analyze vWF-degrading enzyme by, for example, ELISA method, latex method, or immunochromatography method.
  • immunological methods include competitive methods that label vWF-degrading enzymes, sandwich methods that label antibodies, latex beads methods that observe aggregation of antibody-coated beads, or binding to colored particles such as colloidal gold.
  • any method using an antibody against vWF-degrading enzyme is included in the preferred embodiment of the present invention.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Antibody fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, or Fv can also be used.
  • the test sample is preferably blood in plasma form, for example.
  • body fluids such as bone marrow fluid or saliva can also be used.
  • the plasma is preferably citrate plasma or heparin plasma.
  • the degradation factor of the vWF-degrading enzyme can be analyzed together with the analysis of the vWF-degrading enzyme or independently of the analysis of the vWF-degrading enzyme.
  • the degradation factor for example, at least one of proteases selected from the group consisting of elastase, plasmin, and thrombin can be analyzed.
  • the present inventor found that the vWF-degrading enzyme is degraded by elastase, plasmin, or thrombin, and the degradation mode differs depending on elastase, plasmin, or thrombin. I found out. Therefore, the decrease in vWF-degrading enzyme is due to vWF-degrading enzyme by elastase, plasmin, or thrombin.
  • platelet thrombosis or organ damage can be detected by analyzing either vWF-degrading enzyme or its degrading factor.
  • the degrading factor That is, more accurate detection or prediction can be performed by analyzing protease.
  • the change in the protease concentration is used as an index as compared with a healthy person. You can.
  • the protease concentration can be measured by various known methods, for example, by the following method.
  • Elastase is present in blood with more than 90% bound to ⁇ % antitrypsin.
  • This complex can be measured by the ELIS method using a monoclonal antibody.
  • thrombin produced in blood cannot be measured directly because it is rapidly neutralized by various factors.
  • TAT thrombin and antithrombin
  • plasmin Since plasmin disappears from the blood as rapidly as thrombin, it cannot be measured directly. It can be measured as a complex of plasmin and 2 antiplasmin (PIC).
  • TAT and PIC complexes are measured by ELISA or latex agglutination using monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the state of the patient (for example, evaluation of the degree of platelet thrombus formation, or the onset or prognosis of thrombosis or organ damage) is determined. It can also be used for monitoring.
  • the pharmaceutical composition is not particularly limited.
  • the pharmaceutical composition contains an antagonist or inhibitor for vWF-degrading enzyme or an agonist or activity regulator as an active ingredient, or elastase, plasmin.
  • a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, an antagonist or inhibitor, an agonist or an activity regulator for a protease selected from the group consisting of thrombin.
  • the present inventor controlled the generation of platelet thrombus and fibrin thrombus.
  • elastase degraded vWF degrading enzyme. It is thought that platelet thrombus is formed, and then fibrin is deposited to form fibrin thrombus, and secreted plasmin and thrombin break down vWF-degrading enzyme. For example, it is possible to determine the disease state more accurately by grasping which protease is responsible for the change factor of the vWF-degrading enzyme amount.
  • elastase is particularly preferred as a diagnostic index because it has the highest degradation activity of vWF-degrading enzyme and is involved in the early stage.
  • the kit of the present invention comprises at least an anti-vWF-degrading enzyme antibody or fragment thereof and an antibody or fragment thereof that specifically binds to a degradation factor of Z or vWF-degrading enzyme, and two or more different anti-vWF-degrading enzyme antibodies, and / or Or it is preferable to include two or more different anti-degradation factor antibodies.
  • the kit of the present invention may further contain an antibody or a fragment thereof that specifically binds to a vWF-degrading enzyme cleaved by a protease selected from the group consisting of elastase, plasmin, and thrombin, if desired.
  • the kit of the present invention can be used for carrying out the method of the present invention.
  • the anti-vWF-degrading enzyme antibody or anti-degrading factor antibody contained in the kit of the present invention can be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. If two or more different anti-vWF-degrading enzyme antibodies or two or more different anti-degrading factor antibodies are included, either one (second antibody) can be used as a labeled antibody, or labeled. Instead of this, the labeled antibody in which the label is bound to the antibody against the second antibody is further added to the kit.
  • vWF-degrading enzyme 1.5 xg is dissolved in Tris buffer / saline solution, and elastase is added to this to a final concentration of 20 nmol / L or 140 nmol / L.
  • elastase is added to this to a final concentration of 20 nmol / L or 140 nmol / L.
  • 0.5 / ig equivalent of vWF-degrading enzyme was collected. This was separated by non-reducing SDS electrophoresis (5-20% gel) and then transferred to a PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane by Western blotting.
  • Commercially available blocking agent After blocking at room temperature for 30 minutes with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical), the plate was washed with Tris buffer.
  • Each lane in FIG. 1 is as follows:
  • Lane 1 Calories without elastase
  • Lane 2 Reaction at 37 ° C for 15 minutes after addition of 20 nmol ZL elastase
  • Lane 3 Reaction at 37 degrees for 15 minutes after adding 140 nmol / L elastase
  • Lane 5 1 hour reaction at 37 degrees after addition of 20 nmol / L elastase
  • Example 2 Degradation of recombinant vWF-degrading enzyme antigen with plasmin or thrombin
  • Recombinant vWF-degrading enzyme 1.5 xg was dissolved in Tris buffer / saline solution, and plasminogen (final concentration 1 ⁇ mol) was added.
  • plasminogen final concentration 1 ⁇ mol
  • tPA tissue plasminogen activator
  • tPA tissue plasminogen activator
  • Each lane in FIG. 2 is as follows:
  • Lane 1 0.2 nmolZL _tPA added, reaction at 37 degrees for 15 minutes
  • Lane 8 Reaction for 1 hour at 37 degrees after addition of 20mmolZL thrombin
  • vWF-degrading enzyme antigen level and elastase level were measured using plasma from healthy subjects, DIC patients, and SIRS patients as test samples.
  • the amount of vWF-degrading enzyme antigen was measured using a commercial kit (vWF-degrading enzyme ELISA kit; Mitsubishi Chemical Jatron).
  • the amount of elastase can be determined by the sales kit (PMN Elastase / a 1-PI
  • FIG. 3 The results are shown in FIG. 3 and FIG.
  • “NS” means no significant difference.
  • neutrophil activation and blood coagulation reaction are promoted by site force-in such as TNF ⁇ , and neutrophil elastase is vascularized by a protease such as cathebsin G.
  • site force-in such as TNF ⁇
  • neutrophil elastase is vascularized by a protease such as cathebsin G.
  • elastase released into the blood to repair damaged tissue actively degrades vWF-degrading enzymes to promote platelet thrombus formation.
  • the present invention can be applied to the detection of platelet thrombosis or organ damage in a subject (for example, DIC or SIRS patient).
  • DIC is caused by the activation of the coagulation system or the decreased state of coagulation control factors under various basic diseases, and microthrombus occurs frequently in small blood vessels throughout the body. While this causes intravascular occlusion, the depletion of the thrombus formation is due to the consumption of platelets and coagulation fibrinolytic factors. It is a pathological condition in which blood disorders overlap, and severe bleeding tendency and organ damage are observed. Therefore, it is extremely important to detect microthrombus formation early and perform early treatment.

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Abstract

　フォンヴィルブランド因子分解酵素及び／又はその分解因子を分析する、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）患者における血小板血栓症又は臓器障害を検出する方法を開示する。フォンヴィルブランド因子分解酵素に特異的に結合する抗体又はその断片、及び／又はフォンヴィルブランド因子分解酵素の分解因子に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、ＤＩＣ又はＳＩＲＳ患者における血小板血栓症又は臓器障害の検出用キットを開示する。

Description

明 細 書
血小板血栓症又は臓器障害の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、血小板血栓症又は臓器障害の検出方法、特には、播種性血管内凝固 ¾E恢 (Disseminated
intravascular Coagulation； DI )又 fま全身十生炎 症 群 (systemic mflammator y response
syndrome ; SIRS)患者における前記検出方法に関する。本発明によれば、被験者（ 特には、 DIC又は SIRS患者）の生体試料 (例えば、血液）中のフォンヴィルブランド 因子 von
Willebrand factor ; vWF)及び/又はその分解因子を分析することにより、血小板血 栓症又は臓器障害の検出、例えば、血小板血栓形成の程度の検出又は予測、血栓 症又は臓器障害の発症の予測（すなわち、発症の危険性の評価）、血栓症又は臓器 障害の有無の判定、血栓症又は臓器障害の予後の予測、モニタリング、治療法の決 定などを行うことができる。
背景技術
[0002] DICでは、重篤な基礎疾患の存在下に、全身の細小血管内に微小血栓が形成さ れる。そのため、微小循環が障害され、臓器の機能不全や出血傾向が見られる。 DI Cの病態は、 SIRSとも関連する。 DICでは、以下の 3つの障害や反応が起こる。
(1)微小血栓形成による微小循環障害がおこり、虚血の為に多数の臓器が機能不全 に陥る。
(2)微小血栓形成による消費性凝固障害、すなわち、組織因子が細胞表面に多く発 現し、外因系血液凝固が促進される。また、血液凝固因子や血小板が消費され、出 血傾向が現われる。
(3)過剰線溶、すなわち、凝固の促進に応じて線溶系も活性化され、フイブリンを分 解するプラスミンが生成される。プラスミンを阻害する α プラスミンインヒビター ( a PI
2 2
)が消費され、正常の 60%未満に減少すると、プラスミンによってフイブリンが分解さ れ、出血傾向が現われる。
[0003] また、敗血症に伴う DICでは、単球（マクロファージ)から産生される、腫瘍壊死因 子 (TNF— α )やインターロイキン（IL— 1 ）などのサイト力インカ、好中球を活性化 させる。好中球から産生される好中球エラスターゼゃ活性酸素により血管内皮細胞 が障害され、血管内皮透過性の亢進、血管攣縮が起こり、循環が泥状化し、微小循 環が障害される。また、障害された血管内皮では、単球自身や血管内皮細胞が活性 化され、細胞表面に組織因子を発現させ、微小血栓が形成されると考えられる。微小 血栓形成は、微小循環障害を更に悪化させ、多臓器不全 (multiple organ failure ; M OF)を引き起こす。この MOFについて、近年普及している SIRSの概念では、全身 性の炎症反応により生じると説明している。 ARDS (adult
respiratory distress syndrome)では、血小板が肺循環に集まり、肺動脈閉塞を起こす 。 SIRSは、特定の抗原に反応してサイト力イン量が上昇し炎症反応を起こすのでなく 、具体的なターゲット無しに、生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫反応が 活性化し、サイト力イン産生が制御不能になって重篤な MOFを起こす疾患群である (非特許文献 1 , 2)。
[0004] SIRSは、非感染性 SIRSとセプシス（Sepsis)に分類され、前者はショック、外傷、熱 傷、又は急性膝炎などで起こり、後者は種々の病原菌の菌血症やその他の重症感 染症で起こる。 SIRSは、病原体侵入、組織損傷、又はァノキシァなどに対する生体 免疫反応そのものであり、侵襲の種類にかかわらず、種々の内因性メディエーターに より惹起される非特異的全身急性炎症反応である。 SIRSに合併する臓器不全は、 早期には組織の虚血ゃ炎症から発生するものもある力 SIRSが遷延して起こる多臓 器不全症候群 (Multiple
organ dysfunction syndrome ; MODS)には、種々のメディエーターを介する過乗 ljの 生体反応がその病態の重症化に関与しており、 SIRSは予後の予測が難しい疾患群 である。
[0005] SIRSでは、血中の TNF_ a、 IL- 1 (interleukin-l)、 IL— 6 (interleukin_6)など の炎症性サイト力インは高値を示し、中でも TNF—ひは SIRSで見られる好中球の活 性化や血液凝固反応の亢進を弓 Iき起こしてレ、るサイト力インと考えられる。血管内皮 細胞が行っている、サイトプロテクティブ（cytoprotective)な作用を超えた、好中球の 活性化が起こると、好中球エラスターゼゃカテブシン Gのようなプロテアーゼによって 、血管内皮細胞傷害が生じる。その為、微小循環障害や、また微小血栓形成が起き る。活性化された好中球は、炎症を起こした局所のみならず、肺や肝 (灌流圧が低く 、白血球が粘着しやすい)などの遠隔臓器にも集積する。微小循環障害により、血液 は泥状化（sludging)し、更に、微小血栓形成により、血流が停滞 (stasis)し、組織は 虚血状態に陥り、多臓器不全が引き起こされると考えられる。また好中球は、血管外 に浸潤して、実質臓器を障害する。微小血栓形成が続くと、血液凝固因子や血小板 が消費される。 SIRS状態が 3日以上続くと、 DICを合併しやすレ、。このように DICと S IRSの病態は非常に密接に関連している。
好中球エラスターゼ（elastase)は、分子量が約 3万の中性プロテアーゼであり、ァズ ール顆粒に存在する。好中球エラスターゼは、生理的状態では、好中球内で、貪食 した細菌や異物を、消化、分解し、好中球外では、エラスチン、コラーゲン (III型、 IV 型）、フイブロネクチン、免疫グロブリン、血液凝固第 XIII因子などを分解し、組織生合 成を調節する。好中球エラスターゼは、病的状態では、生体の構成成分、例えば、弾 性線維、プロテオダリカン、膠原線維、アンチトロンビン III、 a プラスミンインヒビタ
2
一を不活化する。好中球エラスターゼ力 アンチトロンビン mのへパリン結合部に作 用して、アンチトロンビン mを不活化させると、 Dieを引き起こす。好中球エラスターゼ は、血液中では、プロテアーゼインヒビター（a -protease
inhibitor ; a —AT)と結合しており、好中球から放出された好中球エラスターゼは、 血液中では、 3ミリ秒で ct —ATにより不活化される。しかし、炎症が起きている組織
1
では、 ひ 一ATは好中球から放出される活性酸素、ミエ口ペルォキシダーゼ、ラタトフ
1
エリンにより酸化される結果、好中球エラスターゼは不活化されずに組織を障害する とされる。好中球エラスターゼは、基質特異性が少ないため、過剰に放出されたり、 a —ATなどのインヒビターが欠乏していると生体構成成分をも分解し、好中球エラ スターゼによる自己の組織障害を引き起こす恐れがある。強度な障害を受けた血管 内皮細胞は剥離され、剥離された部位に、血小板が粘着 '凝集し、血栓が形成され る。 [0007] この血小板の粘着には血漿中ヒト vWFが必要とされ、これが引き金となり血小板凝 集、細胞内顆粒放出といった一連の血小板活性化過程の後に血栓が形成され、止 血が行われる。通常 vWFは分子量 20, OOOkDa以上の巨大分子として血管内皮より 血中へ分泌され、そこでメタ口プロテアーゼである vWF分解酵素により切断され、 50 0- 20 , OOOkDaのマルチマーとして血中を循環する。疾患時（閉塞などにより高ず り応力が生じた場合）においては、 vWFの立体構造の変化が起き伸展した構造をと る。このような vWFは vWF分解酵素による分解を受けにくぐ通常認められないような 巨大 vWF分子が過剰に血中に存在し、血小板とより効果的に結合することにより、血 管内で血小板の凝集を促進し、微小循環に血栓を形成すると考えられている。このよ うな血小板を主体とする血栓形成は生理的な止血機構に必要不可欠であるが、凝固 因子 (第 VII因子、第 II因子など）の活性ィ匕により血小板の融合とフイブリン形成による 血栓の形成が起こる。
[0008] 非特許文献 1 :ボーン'アールシー（Bone RC) , 「クリティカル.ケア'メデイシン（Critica ICare Medicine)」， （米国）， 1 996年， 24卷， p. 1 125— 1 128
非特許文献 2 :ディビース'ェムジ一（Davies MG. )ら, 「プリティシュ'ジャーナル'ォブ •サージエリー（Britishjoumal of Surgery)」（英国）， 1997年， 84卷， p. 920— 935 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 前記のように、血小板を主体とする血栓とフイブリンを主体とする血栓の形成の制御 機構を明確に説明する因子はこれまで報告されていないが、 DIC患者や SIRS患者 において見られる全身の微小血管中のフイブリンと血小板からなる微小血栓の形成 機構を明らかにすることにより、 DICや SIRS患者で多く見られる予後不良状態の改 善が行えると考えられる。また適切な治療を早期に行うことにより、臓器障害の発症を 防御できる可能性も考えられる。本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、エラスターゼ 、プラスミン、又はトロンビンにより vWF分解酵素が分解をうけること、その分解様式は エラスターゼ、プラスミン、又はトロンビンによって異なること、更には、エラスターゼ高 値 DIC又は SIRS患者の血漿中における vWF分解酵素の濃度が健常人と比べて顕 著に低下していることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明の課題は、被験者（特には、 DIC又は SIRS患者）において、血 小板血栓症又は臓器障害を検出する方法、及び前記検出用キットを提供することに ある。
課題を解決するための手段
[ooio] 前記課題は、本発明による、フォンヴィルブランド因子分解酵素及び Z又はその分 解因子を分析する、播種性血管内凝固症候群又は全身性炎症反応症候群患者に おける血小板血栓症又は臓器障害の検出方法により解決することができる。
本発明方法の好ましい態様によれば、前記分解因子が、エラスターゼ、プラスミン、 及びトロンビンからなる群から選んだプロテアーゼ（より好ましくはエラスターゼ）である また、本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、フォンヴィルブランド因子分 解酵素の分析を免疫学的方法により実施する。
[0011] また、本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、フォンヴィルブランド因子分 解酵素に対するアンタゴニスト若しくは阻害剤又はァゴニスト若しくは活性調節剤を 有効成分として含有する医薬組成物を投与した後に、前記分析を実施する。
また、本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、エラスターゼ、プラスミン、及 びトロンビンからなる群から選んだプロテアーゼに対するアンタゴニスト若しくは阻害 剤又はァゴニスト若しくは活性調節剤を有効成分として含有する医薬組成物を投与 した後に、前記分析を実施する。
[0012] また、本発明は、フォンヴィルブランド因子分解酵素に特異的に結合する抗体又は その断片、及び Z又はフォンヴィルブランド因子分解酵素の分解因子に特異的に結 合する抗体又はその断片を含む、播種性血管内凝固症候群又は全身性炎症反応 症候群患者における血小板血栓症又は臓器障害の検出用キットに関する。
本発明のキットの好ましい態様によれば、エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビン 力 なる群から選んだプロテアーゼにより切断された vWF分解酵素に特異的に結合 する抗体又はその断片を更に含む。
[0013] 本明細書における用語「分析」には、分析対象物質 (例えば、 vWF)の存在の有無 を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定す る「測定」とが含まれる。
発明の効果
[0014] 本発明は、被験者、例えば、 DIC又は SIRS患者、より具体的には、エラスターゼが 高値である尿路感染症、転移性肺がん、及び Z又は急性骨髄性白血病などを基礎 疾患として発症する DICや SIRS患者における血小板血栓症又は臓器障害の検出 を可能としたものであり、その臨床的価値は非常に高い。本発明によれば、簡便性、 迅速性、及び特異性に優れた、血小板血栓症又は臓器障害の検出が可能となる。 図面の簡単な説明
[0015] [図 1]エラスターゼ処理した組み換え vWF分解酵素抗原の電気泳動の結果を示す 図面である。
[図 2]プラスミン又はトロンビン処理した組み換え vWF分解酵素抗原の電気泳動の結 果を示す図面である。
[図 3]vWF分解酵素とエラスターゼとの相関を示すグラフである。
[図 4]エラスターゼ量で区分した各患者群における vWF分解酵素抗原量の分布を示 すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0016] [1]本発明の検出方法
本発明方法では、 vWF分解酵素及び/又はその分解因子の量 (濃度）又は酵素 活性を定量し、健常人の vWF分解酵素及び/又はその分解因子の量 (濃度）又は 酵素活性と比較することにより、血栓症又は臓器障害の検出（診断)を行うことができ る。本明細書において、血栓症又は臓器障害の検出には、例えば、血小板血栓形 成の程度の検出又は予測、血栓症又は臓器障害の発症の予測（すなわち、発症の 危険性の評価）、血栓症又は臓器障害の有無の判定、血栓症又は臓器障害の予後 の予測、モニタリング、治療法の決定などが含まれる。
本発明方法では、 vWF分解酵素又はその分解因子の量 (濃度)又は酵素活性の いずれを分析することもできるが、量 (濃度)を分析することが好ましい。以下、本発明 を、 vWF分解酵素又はその分解因子の量 (濃度）を分析する態様に基づいて主に説 明する力 以下の説明は、酵素活性を分析する態様にも当てはまる。 [0017] 本明細書にぉレ、て「フォンヴィルブランド因子分解酵素 (vWF分解酵素）」とは、フ オンヴィルブランド因子（vWF)の A2ドメインに存在するチロシン（842)とメチォニン（ 843)を特異的に切断し、 ADAMTS 13とも称されるメタ口プロテアーゼである。
[0018] 本発明方法では、健常人と比較して、 vWF分解酵素濃度の低下を指標とすること ができる。後述する実施例 3に示すように、エラスターゼが高値 (例えば lOOngZmL 以上）である DICおよび SIRS患者では、健常人と比較して、体液試料中に含まれて レ、る vWF分解酵素の濃度が統計学的に有意に低下している（50%以下）。このよう に、本発明方法では、 vWF分解酵素濃度を定量し、健常者の正常値範囲よりも低値 を示す場合 (例えば、閾値を超える場合）には、血小板血栓形成の程度が高いと判 定することができ、また、血栓症若しくは臓器障害の発症の危険性が高いと判定する ことができ、更には、血栓症若しくは臓器障害の予後の状態が不良であると判定する こと力 Sできる。一方、 vWF分解酵素濃度が正常値範囲内である場合には、血小板血 栓形成の程度が低いと判定することができ、また、血栓症若しくは臓器障害の発症の 危険性が低いと判定することができ、更には、血栓症若しくは臓器障害の予後の状 態が良好であると判定することができる。
[0019] 本発明方法を適用することのできる対象 (被験者）は、血小板血栓形成の程度の検 出、又は血栓症若しくは臓器障害 (例えば、腎障害又は肝障害、好ましくは腎障害） の発症若しくは予後の予測が必要な対象である限り、特に限定されるものではないが 、例えば、 DIC又は SIRS患者、好ましくは、エラスターゼが高値である DIC又は SIR S患者、例えば、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、感染症 (例えば、尿路感染 症）、又は癌（転移性肺がん）などを基礎疾患とする DIC又は SIRS患者を挙げること ができる。
[0020] 血栓症では、血管の中で血液が固まり、血管壁に付着した血栓により、血管が狭く なったり、完全にふさがれ、血液の流れが滞り、組織や臓器に障害を引き起こす。血 管が傷ついたり破れたとき、血液中の血小板がその傷口に集まり、止血する。そこへ フイブリン (血液中の線維素）が凝集して血栓となり、完全に止血し、血管壁細胞の増 殖が起こり、血管が修復される。通常であればその後、血栓 (繊維素）を溶かす成分 が働き、血流が元通りになる。この線溶作用が正常に働かず、血栓が血液の流れを 妨げたり、完全に血液の流れを遮断してしまうものが血栓症である。 日本人の 40歳台 の 5人に 1人、 50歳台で 3人に 1人、 60歳台で 2人に 1人、 70歳台ではほぼ全員血栓 症であるといわれている。血栓症の主な症状としては、脳では脳血栓、脳塞栓、一過 性脳虚血発作を起こし、また肺では、肺血栓塞栓症、心臓では狭心症、心筋梗塞、 心房内血栓を起こし、その他、腸間膜血栓、深部静脈血栓症 (エコノミー症候群など )がある。
[0021] 本発明方法では、健常者と被験者 (例えば、 DIC又は SIRS患者）とから、それぞれ 検体を採取し、それぞれの vWF分解酵素濃度を測定した後、測定値を比較すること により、前記検出及び/又は予測を行うこともできるが、通常は、健常者から採取した 検体を用いて vWF分解酵素濃度の正常値範囲又は判定用閾値を予め決定してお くことが好ましレ、。正常値範囲又は判定用閾値が予め決定されている場合には、予 測対象である被験者に関して vWF分解酵素の分析を行うだけで、前記被験者にお ける前記検出及び/又は予測を行うことができる。前記正常値範囲又は判定用閾値 は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想される 、当業者であれば、被験者に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団か ら得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決 定すること力 Sできる。
[0022] 本発明方法にぉレ、て、 vWF分解酵素を分析する方法としては、 vWF分解酵素量 を定量的又は半定量的に決定することができる力、あるいは、 vWF分解酵素の存在 の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなぐ例えば、抗 vWF分 解酵素抗体又はその断片を用いる免疫学的手法 (例えば、酵素免疫測定法、ラテツ タス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫 沈降法、免疫組織染色、又はウェスタンプロット等）、生化学的手法 (例えば、酵素学 的測定法）、又は mRNA量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる
[0023] vWF分解酵素の分析方法として免疫学的手法を用いる場合には、抗 vWF分解酵 素抗体又はその断片は、公知の方法、例えば、国際公開第 2004Z029242号パン フレットに記載の方法に遵つて調製することができ、各種免疫学的測定も、例えば、 国際公開第 2004/029242号パンフレットに記載の方法に従って実施することがで きる。
[0024] vWF分解酵素を測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫学的方法が好 ましレヽ。ここで免疫学的方法とは、 vWF分解酵素に対する抗体を用いて、 vWF分解 酵素を、例えば、 ELISA法、ラテックス法、又はィムノクロマトグラフ法で分析する方 法である。免疫学的方法としては、例えば、 vWF分解酵素を標識する競合法、抗体 を標識するサンドイッチ法、抗体をコートしたビーズの凝集を観察するラテックスビー ズ法、あるいは、金コロイドなどの着色粒子に結合した抗体を用いる方法等、様々な 方法があるが、 vWF分解酵素に対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好まし い態様に含まれる。抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。 また、抗体断片、例えば、 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 、又は Fvを用いることもできる。
2
[0025] 本発明方法において、被検試料としては、例えば、血漿形態の血液が好ましいが、 それ以外にも、例えば、細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、勝臓 液、骨髄液、又は唾液等の各種体液を用いることもできる。また、前記血漿は、クェン 酸血漿又はへパリン血漿であることが好ましレ、。
[0026] 本発明方法では、 vWF分解酵素の分析と共に、あるいは、 vWF分解酵素の分析と は別に独立して、 vWF分解酵素の分解因子を分析することができる。前記分解因子 としては、例えば、エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビンからなる群から選んだプロ テアーゼの少なくとも 1つを分析することができる。後述の実施例 1及び 2に示すとお り、本発明者は、エラスターゼ、プラスミン、又はトロンビンにより vWF分解酵素が分 解をうけること、そして、その分解様式はエラスターゼ、プラスミン、又はトロンビンによ つて異なることを見出した。従って、 vWF分解酵素の低下は、エラスターゼ、プラスミ ン、又はトロンビンによる vWF分解酵素によるものである。
本発明方法では、 vWF分解酵素又はその分解因子のいずれか一方を分析するこ とにより、血小板血栓症又は臓器障害の検出を行うこともできるが、 vWF分解酵素の 分析に加え、前記分解因子（すなわち、プロテアーゼ）の分析を行うことにより、より正 確な検出又は予測を行うことができる。
[0027] 本発明方法では、健常人と比較して、前記プロテアーゼ濃度の変動を指標とするこ とができる。
前記プロテアーゼ濃度は、各種の公知方法で測定することができ、例えば、以下の 方法で測定することができる。エラスターゼは、血中では 90%以上が α ΐアンチトリプ シンと結合した状態で存在する。この複合体は、モノクローナル抗体を用いた ELIS Α法により測定することができる。また血中に生じたトロンビンも、各種因子により急速 に中和されるため、直接測定することはできない。しかし、トロンビンとアンチトロンビン ΠΙとの複合体 (TAT)として血中に生じたトロンビンの量をある程度予測することが可 能である。プラスミンもトロンビン同様、急速に血中より消失するのでこれを直接測定 することは不可能で、プラスミンとひ 2アンチプラスミンの複合体（PIC)として測定する こと力 Sできる。これら、 TATや PICの複合体の測定にはモノクローナル抗体やポリクロ ーナル抗体を使用した ELISA法やラテックス凝集法などが用いられてレ、る。
[0028] 本発明方法は、所望の医薬組成物を投与した後、その患者の状態（例えば、血小 板血栓形成の程度の評価、あるいは、血栓症若しくは臓器障害の発症若しくは予後 の予測）をモニタリングするのに使用することもできる。前記医薬組成物は、特に限定 されるものではなレ、が、例えば、 vWF分解酵素に対するアンタゴニスト若しくは阻害 剤又はァゴニスト若しくは活性調節剤を有効成分として含有する医薬組成物、あるい は、エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビンからなる群から選んだプロテア一ゼに対 するアンタゴニスト若しくは阻害剤又はァゴニスト若しくは活性調節剤を有効成分とし て含有する医薬組成物を挙げることができる。
[0029] また、先述した各種プロテアーゼによる vWF分解酵素の分解様式の違いから、本 発明者は、血小板血栓とフイブリン血栓の生成の制御を、第一にエラスターゼが vW F分解酵素を分解することで血小板血栓を形成し、続いて、フイブリンが沈着しフイブ リン血栓を形成し、これにより分泌されたプラスミンやトロンビンが vWF分解酵素を分 解するものと考えている。例えば、 vWF分解酵素量の変化の要因が、どのプロテア ーゼに基づくものであるかを把握することにより、より正確に病態を判断することが可 能である。
[0030] 例えば、エラスターゼ量の上昇と vWF分解酵素量の減少とが観察された場合、血 小板血栓が形成される初期ステージであると判断することができ、あるいは、プラスミ ン又はトロンビン量の上昇と vWF分解酵素量の減少とが観察された場合、フイブリン 血栓が形成された後の後期ステージであると判断することができる。より正確な病態 を把握することにより、より適切な治療方針を選択することができる。前記プロテア一 ゼの中でも、 vWF分解酵素の分解活性が最も高いこと、そして、初期ステージに関 与することから、診断指標としてはエラスターゼが特に好ましレ、。
[0031] [2]本発明の検出用キット
本発明キットは、抗 vWF分解酵素抗体又はその断片、及び Z又は vWF分解酵素 の分解因子に特異的に結合する抗体又はその断片を少なくとも含み、異なる 2種類 以上の抗 vWF分解酵素抗体、及び/又は異なる 2種類以上の抗分解因子抗体を含 むことが好ましい。また、本発明キットは、所望により、エラスターゼ、プラスミン、及び トロンビンからなる群から選んだプロテアーゼにより切断された vWF分解酵素に特異 的に結合する抗体又はその断片を更に含むことができる。本発明キットは、本発明方 法を実施するのに用いることができる。
[0032] 本発明キットに含まれる抗 vWF分解酵素抗体又は抗分解因子抗体としては、モノ クローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもできる。また、異なる 2 種類以上の抗 vWF分解酵素抗体又は異なる 2種類以上の抗分解因子抗体を含む 場合には、いずれか一方（第 2抗体）を標識抗体とすることもできるし、あるいは、標識 化の代わりに、第 2抗体に対する抗体に標識を結合させた標識抗体を更にキットに追 カロすることちでさる。
実施例
[0033] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
[0034] 《実施例 1：エラスターゼによる組み換え vWF分解酵素抗原の分解》
組み換え vWF分解酵素 1. 5 x gをトリス緩衝液/生理食塩水に溶解し、これにエラ スターゼを終濃度 20nmol/L又は 140nmol/Lとなるように添加し、 37度で 15分 間又は 1時間インキュベーション後に、 0. 5 /i g相当の vWF分解酵素を分取した。こ れを非還元下の SDS電気泳動（5— 20%ゲル）にて分離後、ウェスタンブロット法に て、 PVDF (polyvinylidene difluoride)膜にトランスファーした。市販のブロッキング剤（ ブロックエース；大日本製薬）で室温にて 30分間ブロッキングした後、トリス緩衝液で 洗浄した。 l g/mL抗 vWF分解酵素モノクローナル抗体（WH2— 22— 1A : VWF 分解酵素のデイスインテグリン領域をェピトープとする） /トリス緩衝液 (pH7. 4) /1 0%ブロックエースにて 1時間室温で反応させた後、トリス緩衝液 (pH7. 4) /0. 05 %NP_40で 3回洗浄後、 2000倍希釈した HRP (horseradish
peroxidase)標識抗マウス IgG抗体（バイオラッド） Zトリス緩衝液 (pH7. 4) Zl0%ブ ロックエース溶液で 1時間室温でインキュベーションした。トリス緩衝液（pH7. 4) /0 . 05。/οΝΡ_40で 3回洗浄後、 ΤΜΒ溶液（ピアス社）にて発色を行った。結果を図 1 に示す。
[0035] 図 1における各レーンは以下のとおりである：
レーン 1：エラスターゼ未添カロ
レーン 2 : 20nmolZLエラスターゼ添加後 37度で 15分間反応
レーン 3： 140nmol/Lエラスターゼ添加後 37度で 15分間反応
レーン 4：エラスターゼ未添カロ
レーン 5： 20nmol/Lエラスターゼ添加後 37度で 1時間反応
レーン 6： 140nmol/Lエラスターゼ添加後 37度で 1時間反応
[0036] 20nmol/Lエラスターゼを添カ卩し 37度で 15分間反応させた場合、 vWF分解酵素 は 160KDaのバンドのほとんどが 50KDaに切断され、 1時間反応させた場合、 160 KDaのバンドは消失し、 50KDaのバンドもほとんど消失していた。一方、 140nmol /Lエラスターゼを添加した場合、 15分以上のインキュベーションで 160KDaのバン ドのすべてが消失した。この結果は、 vWF分解酵素がエラスターゼ濃度依存的及び 時間依存的に分解されることが示唆された。
[0037] 《実施例 2：プラスミン又はトロンビンによる組み換え vWF分解酵素抗原の分解》 組み換え vWF分解酵素 1. 5 x gをトリス緩衝液/生理食塩水に溶解し、これにブラ スミノーゲン (終濃度 1 μ mol/L)及び組織プラスミノーゲンァクチベータ（tPA) (終 濃度 0. 2nmol/L又は 2nmol/L)を添カロ、あるレヽは、トロンビンを終濃度 20mU又 は 200mUとなるように添カロし、 37度で 15分間又は 1時間インキュベーション後、 0. 相当の vWF分解酵素を分取した。これを SDS電気泳動にて分離後、実施例 1 と同様の方法でウェスタンブロット法を行い、 vWF分解酵素のバンドの検出を行った 。結果を図 2に示す。
[0038] 図 2における各レーンは以下のとおりである：
レーン 1 : 0. 2nmolZL _tPA添加後 37度で 15分間反応
レーン 2 : 2nmolZLtPA添加後 37度で 15分間反応
レーン 3 : 20mmolZLトロンビン添加後 37度で 15分間反応
レーン 4 : 200mmolZLトロンビン添加後 37度で 15分間反応
レーン 5：プロテア一ゼ未添カロ
レーン 6： 0. 2nmolZLtPA添加後 37度で 1時間反応
レーン 7 : 2nmolZLtPA添加後 37度で 1時間反応
レーン 8： 20mmolZLトロンビン添加後 37度で 1時間反応
レーン 9 : 200mmolZLトロンビン添加後 37度で 1時間反応
[0039] プラスミン又はトロンビンいずれの場合でも、 37度で 15分間反応させた場合では 1 60kDaのバンドはほとんど分解は認められなかった。プラスミンと 37度で 1時間反応 させた場合、いずれの濃度でも 160KDaのバンドの他に、 130kDa及び l OOkDaの 分解されたと思われるバンドが出現した。一方、トロンビン添加では、 200mUを添加 した方に 130kDaのバンドが現れた。このことより、プラスミンとトロンビンの vWF分解 酵素の切断部位は同じである力 切断の時間には両者に差があることが示された。
[0040] 《実施例 3 : vWF分解酵素とエラスターゼとの相関》
本実施例では、健常者、 DIC患者、及び SIRS患者由来の血漿を被検試料として、 vWF分解酵素抗原量及びエラスターゼ量を測定した。 vWF分解酵素抗原量は、巿 販キット (vWF分解酵素 ELISA kit ;三菱化学ャトロン）を使用して測定した。また、ェ ラスターゼ量は、巿販キット（PMN Elastase/ a 1-PI
Complex ELISA Kit ; CALBIOCHEM社）を使用して、エラスターゼ /ひ 1—アンチトリ プシン量として測定を行った。
[0041] 結果を図 3及び図 4に示す。図 3において、 X軸はエラスターゼ /ひ 1 _アンチトリプ シン量（単位 =ngZmL)であり、 Y軸は vWF分解酵素抗原量（単位 =。/。）である。ま た、図 4において、「N. S.」は有意差がないことを意味する。 エラスターゼ / a 1 アンチトリプシンと vWF分解酵素抗原量とは良好な逆相関 (y = - 0. 1382x + 74. 643 ; R2 = 0. 1549)を示し、エラスターゼ / α 1 アンチ卜リプ シン高値、すなわち、組織破壊が進行しているような MOFの状態では、 vWF分解酵 素抗原はエラスターゼにより分解を受けて、 vWF分解酵素抗原量が低下しているこ とが示された。また、エラスターゼが 100ng/mL以上の患者群では、 vWF分解酵素 抗原量が 46. 4 ± 23. 2% (Mean± SD)であるのに対し、エラスターゼが 50ng/m L以下の患者群では 71. 7 ± 29. 0%と、 vWF分解酵素抗原量が有意に低下してい る（P < 0. 05)ことが示された。
産業上の利用可能性
[0042] 本発明によってもたらされた知見により、 TNF αなどのサイト力インにより好中球 の活性化や血液凝固反応の亢進が起こり、好中球エラスターゼゃカテブシン Gのよう なプロテアーゼによって、血管内皮細胞傷害が生じた状態では、傷害を受けた組織 を修復するために血中に放出されたエラスターゼは、血小板血栓形成を促進するよ うに、 vWF分解酵素を積極的に分解する。一方で血液凝固反応の亢進が起こり血小 板血栓上にフイブリンの析出が起こりプラスミン系が働き始めるとエラスターゼの作用 よりも遅れてプラスミンが vWF分解酵素を分解し、微小血管中にフィブリンと血小板 力、らなる微小血栓の形成を惹起し、 DICや SIRSが発症するのではないかということ が示唆された。本知見は、血小板血栓とフイブリン血栓の形成に vWF分解酵素のセ リンプロテアーゼによる制御の関与を始めて示唆するものであると思われる。世の中 には未だフイブリン血栓分解物のみで説明のできない血栓症が多数存在する。本発 明はこのような血栓症のメカニズムを解明するのにも役立つ可能性がある。
本発明は、被験者 (例えば、 DIC又は SIRS患者）における血小板血栓症又は臓器 障害の検出の用途に適用することができる。
[0043] DICの多くは、悪性疾患あるいは重症疾患といった予後不良の病態に合併するこ とが多ぐその病像を更に悪化させる場合が少なくない。そのため、 DICの治療にあ たっては、 DICは種々の基礎疾患のもとで、凝固系の活性化、あるいは凝固制御因 子の低下状態が惹起され、全身の細小血管に微小血栓が多発して血管内閉塞を起 こす一方、この血栓形成に血小板及び凝固線溶因子が消費されて起こる消耗性止 血障害が重なって、重篤な出血傾向や臓器障害が見られる病態である。そのため微 小血栓形成を早期にとらえ早期治療を行うことが極めて重要となる。
SIRSにおける臓器障害を早期に予測診断する意義は下記の通りである。多臓器 障害に至った症例の救命率は決して高くなぐ高度は集中治療を行っても改善しな い症例も少なくない。そのため、少しでも早い時期に臓器障害へ移行する警戒信号 ( warning sign)をとらえて、 S蔵器不全への進展を防止することが非常に重要である。す なわち、 SIRSの段階で患者の病態 ·重症度を的確に判断し、その対策を講じること が必要となる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲
[1] フォンヴィルブランド因子分解酵素及び/又はその分解因子を分析する、播種性 血管内凝固症候群又は全身性炎症反応症候群患者における血小板血栓症又は臓 器障害の検出方法。
[2] 前記分解因子が、エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビンからなる群から選んだプ 口テアーゼである、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記分解因子が、エラスターゼである、請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] フォンヴィルブランド因子分解酵素の分析を免疫学的方法により実施する、請求項
：!〜 3のいずれか一項に記載の方法。
[5] フォンヴィルブランド因子分解酵素に対するアンタゴニスト若しくは阻害剤又はァゴ 二スト若しくは活性調節剤を有効成分として含有する医薬組成物を投与した後に、前 記分析を実施する、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[6] エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビンからなる群から選んだプロテアーゼに対す るアンタゴニスト若しくは阻害剤又はァゴニスト若しくは活性調節剤を有効成分として 含有する医薬組成物を投与した後に、前記分析を実施する、請求項：!〜 4のいずれ か一項に記載の方法。
[7] フォンヴィルブランド因子分解酵素に特異的に結合する抗体又はその断片、及び /又はフォンヴィルブランド因子分解酵素の分解因子に特異的に結合する抗体又は その断片を含む、播種性血管内凝固症候群又は全身性炎症反応症候群患者にお ける血小板血栓症又は臓器障害の検出用キット。
[8] エラスターゼ、プラスミン、及びトロンビンからなる群から選んだプロテアーゼにより 切断された vWF分解酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を更に含む、請求 項 7に記載のキット。
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