JP2004261067A - フォンビルブランド因子切断酵素機能の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ｖＷＦ−ＣＰの発現と組織の関係を検討し、より確実なｖＷＦ−ＣＰの生理学的な機能及び意義を見出すことを課題とした。
【解決手段】血小板中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの発現を見出した。定量的評価を可能とするＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲは、六人の健康被験者において、すべての該被験者の血小板では恒常的な量をもってＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡが存在することを示した。血小板中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの存在は、血管損傷の部位における血小板機能の調節におけるｖＷＦ−ＣＰの重要な役割を意味し、そしてこの酵素の定量及び／又は機能の分析のための有用なツールを提供できる。
【解決手段】血小板中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの発現を見出した。定量的評価を可能とするＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲは、六人の健康被験者において、すべての該被験者の血小板では恒常的な量をもってＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡが存在することを示した。血小板中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの存在は、血管損傷の部位における血小板機能の調節におけるｖＷＦ−ＣＰの重要な役割を意味し、そしてこの酵素の定量及び／又は機能の分析のための有用なツールを提供できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフォンビルブランド因子切断酵素機能の検出方法に関する。特に、検体として血液、詳しくは血液から得られる血小板分画、更に詳しくは血小板を使用することを特徴とするフォンビルブランド因子切断酵素（以下、ｖＷＦ−ＣＰと略称することもある）のｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法であり、この方法を使う診断方法及び検査手段に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
フォンビルブラント因子（以下、ｖＷＦと略称することもある）は、血管内皮細胞と巨核球で産出され、血液中だけでなく、内皮細胞下のマトリックスにも存在する蛋白質であり、血小板蛋白質ＧＰＩｂと血管内皮組織の間に介在してこれらを結合させる接着因子として、止血において重要な役割を果たす。また、ｖＷＦは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成しキャリア蛋白質として機能している。
【０００３】
循環血流中のｖＷＦの１５％〜２５％は血小板のα顆粒中に保存されている。トロンビン又はＡＤＰによる内皮細胞若しくは血小板への刺激が、高重合ｖＷＦ（以下、ＵＬ−ｖＷＦと略称することもある）を血液中へ遊離する。高重合ｖＷＦは、それよりサイズが小さい低重合ｖＷＦよりも高い活性を示す。このことは、低重合ｖＷＦは血小板凝集惹起能が弱いが、高重合ｖＷＦは血小板凝集惹起能が強いことを示している。つまり、血液中の低重合ｖＷＦの割合が高い（高重合ｖＷＦに対して）状態の時に、微小血管で損害を受けると血小板凝集作用が弱く、出血時間延長傾向となる。逆に、血液中の高重合ｖＷＦの割合が高い状態では、全身の微小血管に血栓を生じて、血栓症の症状を伴うさまざまな疾病となる。
【０００４】
血液中のｖＷＦの重合サイズの割合は、フォンビルブラント因子切断酵素（ｖＷＦ−ＣＰ）の機能及び／又は発現量に依存している。該切断酵素は、ｖＷＦのチロシン８４２とメチオニン８４３残基間のペプチド結合を切断することにより、５００〜２００００ｋＤａのサイズの範囲の重合体に分解する（非特許文献１及び２）。
【０００５】
ｖＷＦの量的異常と質的異常による疾患としては、フォンビルブランド病が挙げられる。フォンビルブランド病の臨床的所見としては、出血時間延長、第ＶＩＩＩ因子活性低下、血小板粘着能の低下等が挙げられる。フォンビルブランド病には、主にｖＷＦの量的な異常である１型と質的異常を伴う２型がある。１型は血液のｖＷＦが量的に減少しているが、重合体の構造は正常を示す型であり、１型患者の血液ではｖＷＦの高重合体の欠如を特徴としている。
【０００６】
最近の研究では、血栓性血小板減少性紫斑病（以下ＴＴＰ）患者の血液中で高重合ｖＷＦの割合が高い状態であることが報告されている。これは、ｖＷＦ切断酵素活性の低下により高重合ｖＷＦが増加した状態であり、循環血流中での血小板凝集、それに続く微小血栓を形成する。高重合ｖＷＦの割合が高い状態の素因は、ｖＷＦ−ＣＰに対する後天性自己抗体によっておこされるｖＷＦ−ＣＰ活性の損失によるもの（非特許文献３及び４）、またはＴＴＰの先天性形態をもつ患者のｖＷＦ−ＣＰの先天的な欠損によるるもの（非特許文献５）である。また、ＴＴＰは血小板減少、細小血管障害性溶血性貧血、動遥性精神症状、腎機能障害及び発熱の５徴候を特徴とする疾患である。
【０００７】
フォンビルブラント因子切断酵素の研究では、ｖＷＦ−ＣＰの部分的精製と該蛋白質の性質が特定された（非特許文献１及び２）後、すぐにヒトｖＷＦ−ＣＰの精製がなされた。このことが、そのＮ末端アミノ酸配列の決定、またｖＷＦ−ＣＰをコードするｃＤＮＡ配列の決定を可能とした。ｖＷＦ−ＣＰはメタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳファミリーに分類され、ＡＤＡＭＴＳ１３と命名された。命名の由来は、トロンボスポンジンタイプ１（ＴＳＰ１）モチーフをもつディスインテグリン様でありそしてメタロプロテアーゼドメインから構成されているからである（非特許文献６及び７）。
【０００８】
Ｚｈｅｎｇら、Ｌｅｖｙら、そしてＳｏｅｊｉｍａらのグループは、ノーザンブロット法分析を使い、ＡＤＡＭＴＳ１３のｍＲＮＡ発現分布を報告した（非特許文献６、８及び９）。４．７ｋｂＡＤＡＭＴＳ１３転写産物は特異的に肝臓で検出された。また、２．３ｋｂに近い転写産物は、胎盤でわずかに検出された（非特許文献８）。これらのデータは、血液中のｖＷＦ−ＣＰが肝臓由来であるかもしれないことを示唆している。ＡＤＡＭＴＳ１３の部分ｃＤＮＡは脳と前立腺から分離されている。卵巣における強いＲＴ−ＰＣＲシグナルと他の器官での変量的発現は、ＡＤＡＭＴＳ１３における他の潜在的な機能の根拠となるかもしれない（非特許文献８）。ＡＤＡＭＴＳ１３の弱いｍＲＮＡ発現は、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、小腸、そして末梢血白血球で明らかにされた。半定量ＰＣＲ分析による、ヒト器官パネルにおけるＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現のレベルが報告されている。骨髄での発現は低いレベルではあるが見られる、しかし末梢血白血球での発現は否定された（非特許文献１０）。いずれの報告でも、血小板中での発現については知られていない。ＡＤＡＭＴＳ１３はｖＷＦを分解するが、他の基質については知られていない。上記述べた器官で発現するＡＤＡＭＴＳ１３の生理学的関連についてはまだ明らかではない。
【０００９】
以下に、ここで引用した文献を列記する。
【先行文献】
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２２３−４２３４，１９９６
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２３５−４２４４，１９９６
【非特許文献３】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３９：１５８５−１５９４，１９９８
【非特許文献４】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３９：１５７８−１５８４，１９９８
【非特許文献５】Ｂｌｏｏｄ． ８９：３０９７−３１０３，１９９７
【非特許文献６】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６：４１０５９−４１０６３，２００１
【非特許文献７】Ｂｌｏｏｄ． ９８：１６６２−１６６６，２００１
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ． ４１３：４８８−４９４，２００１
【非特許文献９】Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｔｏｋｙｏ）． １３０：４７５−４８０，２００１
【非特許文献１０】Ｂｌｏｏｄ． １００：３６２６−３６３２，２００２
【非特許文献１１】Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０２：８２９−８４０，１９９８
【００１０】
【発明の課題】
本発明者らは、上記のようなｖＷＦ−ＣＰ（ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現と組織の関係を検討し、より確実なｖＷＦ−ＣＰ（ＡＤＡＭＴＳ１３）の生理学的な機能及び意義を見出すことを課題とした。また、血液中のｖＷＦ−ＣＰの機能と発現量を測定できる検出方法を検討し、ｖＷＦ−ＣＰの機能と発現量を素因とした疾病の断診断方法及び検査手段を確立することを課題とした。
【００１１】
【課題の解決手段】
本発明者らは、血小板血栓形成の観点から、血小板中のｖＷＦ−ＣＰの存在と機能に焦点をあてた。その結果、血液中の血小板にｖＷＦ−ＣＰをコードするｍＲＮＡの有意な存在を確認し本発明を完成した。
【００１２】
つまり本発明は、以下からなる。
１．検体として血液を使用することを特徴とするフォンビルブランド因子切断酵素（以下ｖＷＦ−ＣＰ）のｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
２．検体として末梢血液から得られる血小板分画を使用することを特徴とするｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
３．血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとする前記１の方法。
４．ＰＣＲ法による前記１から３のいずれかの１項の方法。
５．前記１〜４の方法を使う以下の診断方法。
１）易血栓性の診断。
２）血栓症の疾病素因の予測診断。
３）血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断。
４）遺伝子異常診断。
６．血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡを使用することを特徴とする、当該ｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ転写物が機能性蛋白質として生じるかを検討するための手段。
【００１３】
【発明の実施の態様】
本発明の特徴は、ｖＷＦ−ＣＰの測定にあたり検体として血液を使うこと、特に血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとする。血液から血小板分画及び血小板を得る方法としては、遠心分離法、ゲルろ過法、密度差を用いる方法およびフィルター法等が挙げられる。また、検体としては、血液より調製される血小板多血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）を用いることもできる。血液中の血小板の分画は遠心分離で分画され、血小板ペレットを分取し、試験に供される。血小板ペレットから、血小板ＲＮＡの分取は、Ｈ． Ａｎｂｏ等の方法〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０２（１９９８），８２９−８４０〕に詳しく記載されている。分取されたＲＮＡは、次いで逆転写ＰＣＲによって増幅される。増幅法は、市販試薬キットに準じて行えば十分である。逆転写のためのプライマーは、配列表１及び２に示した。このプライマーは、ｖＷＦ−ＣＰのエクソン１〜７に一致し、ｃＤＮＡの増幅に使われる。これらの増幅されたｃＤＮＡは、市販の試薬を用いてＰＣＲによって更に増幅される。フォーワードプライマーには配列表３、リバースプライマーには配列表４で示される各ヌクレオチドを使用した。本発明では、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲによって増幅を行い好結果を得た。マーカープライマーとして、レポーター色素とクエンチャー色素が結合した蛍光オリゴヌクレオチド（配列表５）を使用した。
【００１４】
本発明では、ｖＷＦ−ＣＰのエキソン１〜７に一致するプライマーをＲＴ−ＰＣＲに使用し、そして増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。さらに、エキソン１５−１６に位置する蛍光オリゴヌクレオチドをＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲで使用した。これらの結果は、試験サンプル中のゲノムＤＮＡのコンタミネーションの可能性はまったくなく、少なくもエキソン１５−１６と一致するＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは血小板中で発現していることを証明していた。
【００１５】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲとは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、ＰＣＲでの増幅産物量の生成過程をリアルタイムでモニタリング、解析する方法である。本発明においては、特異的プローブの５’上流にレポーター色素（ＦＡＭ）、３’下流にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）が結合している蛍光オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによる増幅を行った。また、ＦＡＭとは波長が異なるＴＥＴなどの蛍光物質を変異体ｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ検出用プローブとして用いれば、遺伝子の点変異検出への応用も可能になり、ｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの遺伝子異常診断も可能となる。
【００１６】
以上の様な手段で、本発明は、血液中での、特に血小板での、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの発現を初めて見出した。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量評価をするための有用な方法としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを確立した。本発明のデータから、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは、六人の健康被験者において、恒常的にほとんど差がなく、血小板中で発現することが示された。
【００１７】
本発明の結果は、血小板がＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡを保持していることを明確にし、間接的にはＡＤＡＭＴＳ１３蛋白質が血小板に存在していることを示した。血小板中のｖＷＦ−ＣＰは、ｖＷＦの重合体構造を決定するための調節因子であることが考えられるため、血小板中のｖＷＦ−ＣＰ活性、特にｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を測定することは易血栓性の診断になると考える。
【００１８】
局所組織中の血小板血栓形成は血小板由来のｖＷＦの性質によるものであり、本発明の血小板中のｖＷＦ−ＣＰの活性を評価するための方法の確立、特に本発明のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を測定することは血栓症の疾病素因を予測するために有用である。更に、血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断ができる。ここで言う該素因としては、ｖＷＦ−ＣＰ活性異常、血管内皮細胞障害および血液凝固異常等が挙げられる。
【００１９】
本発明に係る診断方法及び検査手段においては、血液中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を定量的に測定できることにより、患者の血液中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ量と健康検体の血液中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ量を比較することにより、血液中のｖＷＦ重合体の量の診断及び検査が可能となる。よって、上記に示すようにｖＷＦの量的異常による易血栓性の診断、血栓症の疾病素因の予測診断、更に血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断が可能となった。
【００２０】
血小板由来のｖＷＦ−ＣＰが不完全発現である場合には、通常発現である血液のｖＷＦ−ＣＰに対して拮抗阻害によって局所組織中の血栓形成を促進する可能性をもっている。また、血小板由来の不完全発現ｖＷＦ−ＣＰは、疾患における、診断ターゲットマーカーとして利用できる可能性がある。不完全発現ｖＷＦ−ＣＰの判定は、例えば、血小板由来のｖＷＦ−ＣＰをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを自体公知の遺伝子組換え技術を用い蛋白質を発現させてその機能を判定可能である。また、その機能により遺伝子異常を確認することができる。その手段の一として、遠藤等のコムギ胚芽無細胞蛋白質合成手段と組合わせて検定することは簡便な方法である。無論、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の系で、蛋白質を発現させてその機能を判定することは有用である。
【００２１】
完全長ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡが血小板で発現しているかどうかを決定するために、さらなる検討は意義がある。加えて、血小板構造中のＡＤＡＭＴＳ１３の局在についての形態的研究は、血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３の詳しい知見を得るための手掛かりとなる。また本発明は、血小板中で、当該転写物が機能性蛋白質として生じるかを検討するための良いツールとなることを見出した。
【００２２】
ＴＴＰ患者の血小板に結合するｖＷＦ−ＣＰの自己抗体の存在は、ＴＴＰ患者の病因を複雑にする自己免疫性血小板減少の可能性の根拠となる。該抗体の存在は治療における重要な焦点となる。血小板に結合する抗ｖＷＦ−ＣＰ抗体は、ＴＴＰの診断において重要なツールとなる可能性がある。
【００２３】
本発明によって、ｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡが末梢血から容易に入手できることは、ｖＷＦ−ＣＰ欠損患者における遺伝子異常の意義を容易に調べることが出来る。例えば、ゲノムでスプライシング異常を来たす変異が見つかった場合、血小板ｍＲＮＡを調べればＲＮＡレベルでどのような異常につながるかの判定が可能となる。
【００２４】
上記結論として、本発明からなる血小板中のｖＷＦ−ＣＰの存在の確認は、血小板血栓形成の病因を分析するための意義のある事実であることは間違いない。
【００２５】
【実施例】
以下、製造例、実験例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２６】
実施例１：
１）解析の材料
測定用検体は血液を用いた。血液は過去及び現在に病歴のない六人の被験者から採取した血液を用いた。すべての実験において、六人の被験者にインフォームド・コンセントを行った。
【００２７】
２）血小板のｍＲＮＡの解析
血小板ＲＮＡは、Ｈ．Ａｎｂｏ等の方法〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０２（１９９８），８２９−８４０〕に少し変更を加えて分離した。血小板多血漿（ＰＲＰ）は、最終量の１０分の１量の３．８％クエン酸ナトリウム濃度になるように採取した静脈血を調製し、つづいて室温において１５分間７００ｒｐｍで遠心分離した。血小板ペレット（血小板分画）は、さらにＰＲＰを室温において７分間２０００ｒｐｍで遠心分離することによって得た。血小板ペレットは、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。
【００２８】
全ＲＮＡは、クロロホルムで溶解した血小板ペレットから抽出され、そしてイソプロパノールで沈殿させた。乾燥させた血小板ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で溶解した。ＲＮＡの分解をさけるために、できるだけ早く、血小板ＲＮＡを逆転写ＰＣＲによって増幅させた。血小板ＲＮＡの３μｇを７０℃、１０分間で加熱し、製造元の使用説明書に従って最終容量２０μｌのｔｈｅ ＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ （Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｑｕｎｏｌｏｇｙ， Ｔｏｋｙｏ）を用いて４２℃、６５分間で逆転写反応を行った。
【００２９】
逆転写ＰＣＲには、逆転写用の特別なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。ｖＷＦ−ＣＰのエクソン１−７に一致し、ｃＤＮＡの増幅ためのプライマーは、ＲＴ１（５’−ＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＧ−３’）（配列番号１）であるセンスプライマーであり、ＲＴ２（５’−ＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＧＡ−３’）（配列番号２）であるアンチセンスプライマーである。
【００３０】
ｃＤＮＡ溶液はＧＣ ｂｕｆｆｅｒによるＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ ｓｈｕｚｏ． ＣＯ．，ＬＴＤ，Ｓｈｉｇａ，ＪＡＰＡＮ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ中の０．５Ｕポリメラーゼ、４μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ０．５μＭ フォーワードプライマー及びリバースプライマーを含む５０μｌ全容量で行った。サンプルは９６℃、５分間で保温し、そして以下のサイクル条件で３５サイクルで増幅した（サイクル条件：９６℃１分間、５２℃ １分間、７２℃ １分間を１サイクルとした）。
サンプルは、エチジウムブロミドで染色した２％アガロースゲルで画分した。増幅したＤＮＡは製造元の手順に従ってＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ ｋｉｔ （Ｂｉｏ １０１， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製と再回収した。ヌクレオチド配列は、３１０ ＤＮＡ ａｎｔｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）を用いてａｎ ＡＢＩＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｃｈｉｂａ， Ｊａｐａｎ）により直接シークエンス法によって決定した。
【００３１】
３）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
それぞれのサンプルからＲＮＡ分離とｃＤＮＡ調製後、ターゲットｃＤＮＡと基準となるβ−アクチンｃＤＮＡを別々に５’上流にレポーター色素（ＦＡＭ）、３’下流にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）が結合している蛍光オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ中、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼの５’から３’のヌクレアーゼ活性は、レポーターを遊離し、該レポーター色素の蛍光が増大し、そして該蛍光をｔｈｅ ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ蛍光検出器によって検出した。蛍光スレッシュホールドがクロッシングした後、ＰＣＲ−増幅がＰＣＲ産物と一致するリニアカーブとなった。スレッシュホールド蛍光強度を設定し、これが起こったサイクルの地点をスレッシュホールドサイクルの起点として決定した。内部のポジティブ又はネガティブコントロール（ポリメラーゼなしのサンプル）は、同等な測定状態を確認するために異なった定量測定中の間、平行して行った。
【００３２】
以下に使用したオリゴヌクレオチドを示す。
ｆｏｒｗａｒｄ ＡＤＡＭＴＳ １３ プライマー：５’−ＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＡ−３’ （エキソン １５）（配列番号３）、
ｒｅｖｅｒｓｅ ＡＤＡＭＴＳ １３ プライマー：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＡＴＡＧＣ−３’ （エキソン １６）（配列番号４）、
プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’ （エキソン １５−１６）（配列番号５）。
【００３３】
ＰＣＲ反応混合物（５０μｌ）は、０．５μＭ それぞれプライマー、０．２５μＭ プローブ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２ｘ）から成っている。以下のサイクル条件を使用し（サイクル条件：最初９６℃１０分間、続いて９５℃１５秒間、６０℃ １分間、７２℃ １分間を１サイクルとし、４０サイクル行った）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のｔｈｅ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲから得られたデータは蛍光変化の割合を基にして相対的量として表した。標準曲線は、ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドのモレキュラーカウントを基にして得た。
【００３４】
４）結果
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３のＲＴ−ＰＣＲ分析
クエン酸血小板多血漿の血小板分画から分離した血小板ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡは、アガロースゲルから精製と再回収をした。予期したサイズのｃＤＮＡフラグメント（６６０ｂｐ）を得て、直接シークエンス法により分析した。配列決定したヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴ プログラムを用いて検索したことにより、ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡと同定した。
【００３５】
（２）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
血小板分画中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現を蛍光を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲによって定量分析した。ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは六人の健康被験者において、恒常的な量でほとんど差がなく存在することが示された（図１）。ＰＣＲ増幅を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する特別なプライマーと蛍光プローブを用いて六人の被験者からのｍＲＮＡで個別に行った。時間（ＰＣＲ サイクル数）に対するｒｅｌａｔｉｖｅ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｈａｎｇｅ（相対正常化蛍光変化△Ｒｎ）をそれぞれのサンプルにプロットした。スレッシュホールド蛍光強度を設定した後に、スレッシュホールドサイクルを決定した。相対的遺伝子発現をターゲットとする遺伝子と内部標準スレッシュホールドサイクルによって決定した。ＡＤＡＭＴＳ１３（３回）のスレッシュホールドサイクルは以下の通りである。
サンプル１：２３．３８，２９．０２，２８．１８、
サンプル２：２８．４６，２７．８３，２８．１９、
サンプル３：２８．７９，２９．０５，２９．３９、
サンプル４：２９．７８，２９．６０，２９．４７、
サンプル５：２８．９２，２９．０１，２８．５６、
サンプル６：２９．９８，３０．８５，３０．５９。
【００３６】
内部標準 β−アクチンのスレッシュホールドサイクルとＡＤＡＭＴＳ１３のそれの比を以下に示す。
サンプル１：０．５６３±０．００７、
サンプル２：０．５７０±０．００５、
サンプル３：０．５６７±０．００５、
サンプル４：０．５７２±０．００３、
サンプル５：０．５８３±０．００４、
サンプル６：０．５６３±０．００７。
【００３７】
これらの値は、３回の独立した測定の平均と標準偏差である（表１）。
【表１】
内部標準β−アクチンのスレッシュホールドサイクルとＡＤＡＭＴＳ１３のそれの比
【００３８】
血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの絶対量を計算するために、本発明者等は既知濃度のプラスミドｃＤＮＡサンプルの分析に基づく検量線（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｓｔｕｄｙ）を用いた（図２）。この検量線により、１ｎｇ全ＲＮＡ中にＡＤＡＭＴＳ１３ ｍＲＮＡが５．５±２．５×１０−８ｎｇ存在していることを示した。
サンプル１：６．９±２．１、
サンプル２：９．１±０．２、
サンプル３：５．２±１．０、
サンプル４：３．５±０．３、
サンプル５：６．０±０．９、
サンプル６：２．０±０．４。
これらの値は、３回の独立した測定の平均と標準偏差である。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、血小板中でのＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの発現を初めて見出した。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量評価をするための有用な方法としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを確立した。本発明の結果は、血小板がＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡを明らかに恒常的に持っていることを明確にし、量比が変化すれば何等かの血栓性疾患が疑える。また、間接的にはＡＤＡＭＴＳ１３蛋白質が血小板に存在していることを示した。このことに基づき、血小板中のｖＷＦ−ＣＰ活性を測定することの生理学的意義を見出すことの基盤を確立した。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを用いた血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡ（×１０−８ｎｇ／３００ｎｇＲＮＡ）を含むプラスミドの検量線を基にした絶対量。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明はフォンビルブランド因子切断酵素機能の検出方法に関する。特に、検体として血液、詳しくは血液から得られる血小板分画、更に詳しくは血小板を使用することを特徴とするフォンビルブランド因子切断酵素（以下、ｖＷＦ−ＣＰと略称することもある）のｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法であり、この方法を使う診断方法及び検査手段に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
フォンビルブラント因子（以下、ｖＷＦと略称することもある）は、血管内皮細胞と巨核球で産出され、血液中だけでなく、内皮細胞下のマトリックスにも存在する蛋白質であり、血小板蛋白質ＧＰＩｂと血管内皮組織の間に介在してこれらを結合させる接着因子として、止血において重要な役割を果たす。また、ｖＷＦは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と複合体を形成しキャリア蛋白質として機能している。
【０００３】
循環血流中のｖＷＦの１５％〜２５％は血小板のα顆粒中に保存されている。トロンビン又はＡＤＰによる内皮細胞若しくは血小板への刺激が、高重合ｖＷＦ（以下、ＵＬ−ｖＷＦと略称することもある）を血液中へ遊離する。高重合ｖＷＦは、それよりサイズが小さい低重合ｖＷＦよりも高い活性を示す。このことは、低重合ｖＷＦは血小板凝集惹起能が弱いが、高重合ｖＷＦは血小板凝集惹起能が強いことを示している。つまり、血液中の低重合ｖＷＦの割合が高い（高重合ｖＷＦに対して）状態の時に、微小血管で損害を受けると血小板凝集作用が弱く、出血時間延長傾向となる。逆に、血液中の高重合ｖＷＦの割合が高い状態では、全身の微小血管に血栓を生じて、血栓症の症状を伴うさまざまな疾病となる。
【０００４】
血液中のｖＷＦの重合サイズの割合は、フォンビルブラント因子切断酵素（ｖＷＦ−ＣＰ）の機能及び／又は発現量に依存している。該切断酵素は、ｖＷＦのチロシン８４２とメチオニン８４３残基間のペプチド結合を切断することにより、５００〜２００００ｋＤａのサイズの範囲の重合体に分解する（非特許文献１及び２）。
【０００５】
ｖＷＦの量的異常と質的異常による疾患としては、フォンビルブランド病が挙げられる。フォンビルブランド病の臨床的所見としては、出血時間延長、第ＶＩＩＩ因子活性低下、血小板粘着能の低下等が挙げられる。フォンビルブランド病には、主にｖＷＦの量的な異常である１型と質的異常を伴う２型がある。１型は血液のｖＷＦが量的に減少しているが、重合体の構造は正常を示す型であり、１型患者の血液ではｖＷＦの高重合体の欠如を特徴としている。
【０００６】
最近の研究では、血栓性血小板減少性紫斑病（以下ＴＴＰ）患者の血液中で高重合ｖＷＦの割合が高い状態であることが報告されている。これは、ｖＷＦ切断酵素活性の低下により高重合ｖＷＦが増加した状態であり、循環血流中での血小板凝集、それに続く微小血栓を形成する。高重合ｖＷＦの割合が高い状態の素因は、ｖＷＦ−ＣＰに対する後天性自己抗体によっておこされるｖＷＦ−ＣＰ活性の損失によるもの（非特許文献３及び４）、またはＴＴＰの先天性形態をもつ患者のｖＷＦ−ＣＰの先天的な欠損によるるもの（非特許文献５）である。また、ＴＴＰは血小板減少、細小血管障害性溶血性貧血、動遥性精神症状、腎機能障害及び発熱の５徴候を特徴とする疾患である。
【０００７】
フォンビルブラント因子切断酵素の研究では、ｖＷＦ−ＣＰの部分的精製と該蛋白質の性質が特定された（非特許文献１及び２）後、すぐにヒトｖＷＦ−ＣＰの精製がなされた。このことが、そのＮ末端アミノ酸配列の決定、またｖＷＦ−ＣＰをコードするｃＤＮＡ配列の決定を可能とした。ｖＷＦ−ＣＰはメタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳファミリーに分類され、ＡＤＡＭＴＳ１３と命名された。命名の由来は、トロンボスポンジンタイプ１（ＴＳＰ１）モチーフをもつディスインテグリン様でありそしてメタロプロテアーゼドメインから構成されているからである（非特許文献６及び７）。
【０００８】
Ｚｈｅｎｇら、Ｌｅｖｙら、そしてＳｏｅｊｉｍａらのグループは、ノーザンブロット法分析を使い、ＡＤＡＭＴＳ１３のｍＲＮＡ発現分布を報告した（非特許文献６、８及び９）。４．７ｋｂＡＤＡＭＴＳ１３転写産物は特異的に肝臓で検出された。また、２．３ｋｂに近い転写産物は、胎盤でわずかに検出された（非特許文献８）。これらのデータは、血液中のｖＷＦ−ＣＰが肝臓由来であるかもしれないことを示唆している。ＡＤＡＭＴＳ１３の部分ｃＤＮＡは脳と前立腺から分離されている。卵巣における強いＲＴ−ＰＣＲシグナルと他の器官での変量的発現は、ＡＤＡＭＴＳ１３における他の潜在的な機能の根拠となるかもしれない（非特許文献８）。ＡＤＡＭＴＳ１３の弱いｍＲＮＡ発現は、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、小腸、そして末梢血白血球で明らかにされた。半定量ＰＣＲ分析による、ヒト器官パネルにおけるＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現のレベルが報告されている。骨髄での発現は低いレベルではあるが見られる、しかし末梢血白血球での発現は否定された（非特許文献１０）。いずれの報告でも、血小板中での発現については知られていない。ＡＤＡＭＴＳ１３はｖＷＦを分解するが、他の基質については知られていない。上記述べた器官で発現するＡＤＡＭＴＳ１３の生理学的関連についてはまだ明らかではない。
【０００９】
以下に、ここで引用した文献を列記する。
【先行文献】
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２２３−４２３４，１９９６
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ． ８７：４２３５−４２４４，１９９６
【非特許文献３】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３９：１５８５−１５９４，１９９８
【非特許文献４】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３９：１５７８−１５８４，１９９８
【非特許文献５】Ｂｌｏｏｄ． ８９：３０９７−３１０３，１９９７
【非特許文献６】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６：４１０５９−４１０６３，２００１
【非特許文献７】Ｂｌｏｏｄ． ９８：１６６２−１６６６，２００１
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ． ４１３：４８８−４９４，２００１
【非特許文献９】Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｔｏｋｙｏ）． １３０：４７５−４８０，２００１
【非特許文献１０】Ｂｌｏｏｄ． １００：３６２６−３６３２，２００２
【非特許文献１１】Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０２：８２９−８４０，１９９８
【００１０】
【発明の課題】
本発明者らは、上記のようなｖＷＦ−ＣＰ（ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現と組織の関係を検討し、より確実なｖＷＦ−ＣＰ（ＡＤＡＭＴＳ１３）の生理学的な機能及び意義を見出すことを課題とした。また、血液中のｖＷＦ−ＣＰの機能と発現量を測定できる検出方法を検討し、ｖＷＦ−ＣＰの機能と発現量を素因とした疾病の断診断方法及び検査手段を確立することを課題とした。
【００１１】
【課題の解決手段】
本発明者らは、血小板血栓形成の観点から、血小板中のｖＷＦ−ＣＰの存在と機能に焦点をあてた。その結果、血液中の血小板にｖＷＦ−ＣＰをコードするｍＲＮＡの有意な存在を確認し本発明を完成した。
【００１２】
つまり本発明は、以下からなる。
１．検体として血液を使用することを特徴とするフォンビルブランド因子切断酵素（以下ｖＷＦ−ＣＰ）のｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
２．検体として末梢血液から得られる血小板分画を使用することを特徴とするｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
３．血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとする前記１の方法。
４．ＰＣＲ法による前記１から３のいずれかの１項の方法。
５．前記１〜４の方法を使う以下の診断方法。
１）易血栓性の診断。
２）血栓症の疾病素因の予測診断。
３）血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断。
４）遺伝子異常診断。
６．血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡを使用することを特徴とする、当該ｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ転写物が機能性蛋白質として生じるかを検討するための手段。
【００１３】
【発明の実施の態様】
本発明の特徴は、ｖＷＦ−ＣＰの測定にあたり検体として血液を使うこと、特に血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとする。血液から血小板分画及び血小板を得る方法としては、遠心分離法、ゲルろ過法、密度差を用いる方法およびフィルター法等が挙げられる。また、検体としては、血液より調製される血小板多血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）を用いることもできる。血液中の血小板の分画は遠心分離で分画され、血小板ペレットを分取し、試験に供される。血小板ペレットから、血小板ＲＮＡの分取は、Ｈ． Ａｎｂｏ等の方法〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０２（１９９８），８２９−８４０〕に詳しく記載されている。分取されたＲＮＡは、次いで逆転写ＰＣＲによって増幅される。増幅法は、市販試薬キットに準じて行えば十分である。逆転写のためのプライマーは、配列表１及び２に示した。このプライマーは、ｖＷＦ−ＣＰのエクソン１〜７に一致し、ｃＤＮＡの増幅に使われる。これらの増幅されたｃＤＮＡは、市販の試薬を用いてＰＣＲによって更に増幅される。フォーワードプライマーには配列表３、リバースプライマーには配列表４で示される各ヌクレオチドを使用した。本発明では、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲによって増幅を行い好結果を得た。マーカープライマーとして、レポーター色素とクエンチャー色素が結合した蛍光オリゴヌクレオチド（配列表５）を使用した。
【００１４】
本発明では、ｖＷＦ−ＣＰのエキソン１〜７に一致するプライマーをＲＴ−ＰＣＲに使用し、そして増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。さらに、エキソン１５−１６に位置する蛍光オリゴヌクレオチドをＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲで使用した。これらの結果は、試験サンプル中のゲノムＤＮＡのコンタミネーションの可能性はまったくなく、少なくもエキソン１５−１６と一致するＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは血小板中で発現していることを証明していた。
【００１５】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲとは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、ＰＣＲでの増幅産物量の生成過程をリアルタイムでモニタリング、解析する方法である。本発明においては、特異的プローブの５’上流にレポーター色素（ＦＡＭ）、３’下流にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）が結合している蛍光オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによる増幅を行った。また、ＦＡＭとは波長が異なるＴＥＴなどの蛍光物質を変異体ｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ検出用プローブとして用いれば、遺伝子の点変異検出への応用も可能になり、ｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡの遺伝子異常診断も可能となる。
【００１６】
以上の様な手段で、本発明は、血液中での、特に血小板での、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの発現を初めて見出した。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量評価をするための有用な方法としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを確立した。本発明のデータから、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは、六人の健康被験者において、恒常的にほとんど差がなく、血小板中で発現することが示された。
【００１７】
本発明の結果は、血小板がＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡを保持していることを明確にし、間接的にはＡＤＡＭＴＳ１３蛋白質が血小板に存在していることを示した。血小板中のｖＷＦ−ＣＰは、ｖＷＦの重合体構造を決定するための調節因子であることが考えられるため、血小板中のｖＷＦ−ＣＰ活性、特にｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を測定することは易血栓性の診断になると考える。
【００１８】
局所組織中の血小板血栓形成は血小板由来のｖＷＦの性質によるものであり、本発明の血小板中のｖＷＦ−ＣＰの活性を評価するための方法の確立、特に本発明のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を測定することは血栓症の疾病素因を予測するために有用である。更に、血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断ができる。ここで言う該素因としては、ｖＷＦ−ＣＰ活性異常、血管内皮細胞障害および血液凝固異常等が挙げられる。
【００１９】
本発明に係る診断方法及び検査手段においては、血液中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ量を定量的に測定できることにより、患者の血液中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ量と健康検体の血液中のｖＷＦ−ＣＰｍＲＮＡ量を比較することにより、血液中のｖＷＦ重合体の量の診断及び検査が可能となる。よって、上記に示すようにｖＷＦの量的異常による易血栓性の診断、血栓症の疾病素因の予測診断、更に血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断が可能となった。
【００２０】
血小板由来のｖＷＦ−ＣＰが不完全発現である場合には、通常発現である血液のｖＷＦ−ＣＰに対して拮抗阻害によって局所組織中の血栓形成を促進する可能性をもっている。また、血小板由来の不完全発現ｖＷＦ−ＣＰは、疾患における、診断ターゲットマーカーとして利用できる可能性がある。不完全発現ｖＷＦ−ＣＰの判定は、例えば、血小板由来のｖＷＦ−ＣＰをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを自体公知の遺伝子組換え技術を用い蛋白質を発現させてその機能を判定可能である。また、その機能により遺伝子異常を確認することができる。その手段の一として、遠藤等のコムギ胚芽無細胞蛋白質合成手段と組合わせて検定することは簡便な方法である。無論、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の系で、蛋白質を発現させてその機能を判定することは有用である。
【００２１】
完全長ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡが血小板で発現しているかどうかを決定するために、さらなる検討は意義がある。加えて、血小板構造中のＡＤＡＭＴＳ１３の局在についての形態的研究は、血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３の詳しい知見を得るための手掛かりとなる。また本発明は、血小板中で、当該転写物が機能性蛋白質として生じるかを検討するための良いツールとなることを見出した。
【００２２】
ＴＴＰ患者の血小板に結合するｖＷＦ−ＣＰの自己抗体の存在は、ＴＴＰ患者の病因を複雑にする自己免疫性血小板減少の可能性の根拠となる。該抗体の存在は治療における重要な焦点となる。血小板に結合する抗ｖＷＦ−ＣＰ抗体は、ＴＴＰの診断において重要なツールとなる可能性がある。
【００２３】
本発明によって、ｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡが末梢血から容易に入手できることは、ｖＷＦ−ＣＰ欠損患者における遺伝子異常の意義を容易に調べることが出来る。例えば、ゲノムでスプライシング異常を来たす変異が見つかった場合、血小板ｍＲＮＡを調べればＲＮＡレベルでどのような異常につながるかの判定が可能となる。
【００２４】
上記結論として、本発明からなる血小板中のｖＷＦ−ＣＰの存在の確認は、血小板血栓形成の病因を分析するための意義のある事実であることは間違いない。
【００２５】
【実施例】
以下、製造例、実験例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２６】
実施例１：
１）解析の材料
測定用検体は血液を用いた。血液は過去及び現在に病歴のない六人の被験者から採取した血液を用いた。すべての実験において、六人の被験者にインフォームド・コンセントを行った。
【００２７】
２）血小板のｍＲＮＡの解析
血小板ＲＮＡは、Ｈ．Ａｎｂｏ等の方法〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０２（１９９８），８２９−８４０〕に少し変更を加えて分離した。血小板多血漿（ＰＲＰ）は、最終量の１０分の１量の３．８％クエン酸ナトリウム濃度になるように採取した静脈血を調製し、つづいて室温において１５分間７００ｒｐｍで遠心分離した。血小板ペレット（血小板分画）は、さらにＰＲＰを室温において７分間２０００ｒｐｍで遠心分離することによって得た。血小板ペレットは、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。
【００２８】
全ＲＮＡは、クロロホルムで溶解した血小板ペレットから抽出され、そしてイソプロパノールで沈殿させた。乾燥させた血小板ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で溶解した。ＲＮＡの分解をさけるために、できるだけ早く、血小板ＲＮＡを逆転写ＰＣＲによって増幅させた。血小板ＲＮＡの３μｇを７０℃、１０分間で加熱し、製造元の使用説明書に従って最終容量２０μｌのｔｈｅ ＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ （Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｑｕｎｏｌｏｇｙ， Ｔｏｋｙｏ）を用いて４２℃、６５分間で逆転写反応を行った。
【００２９】
逆転写ＰＣＲには、逆転写用の特別なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。ｖＷＦ−ＣＰのエクソン１−７に一致し、ｃＤＮＡの増幅ためのプライマーは、ＲＴ１（５’−ＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＧ−３’）（配列番号１）であるセンスプライマーであり、ＲＴ２（５’−ＡＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＧＡ−３’）（配列番号２）であるアンチセンスプライマーである。
【００３０】
ｃＤＮＡ溶液はＧＣ ｂｕｆｆｅｒによるＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ ｓｈｕｚｏ． ＣＯ．，ＬＴＤ，Ｓｈｉｇａ，ＪＡＰＡＮ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ中の０．５Ｕポリメラーゼ、４μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ０．５μＭ フォーワードプライマー及びリバースプライマーを含む５０μｌ全容量で行った。サンプルは９６℃、５分間で保温し、そして以下のサイクル条件で３５サイクルで増幅した（サイクル条件：９６℃１分間、５２℃ １分間、７２℃ １分間を１サイクルとした）。
サンプルは、エチジウムブロミドで染色した２％アガロースゲルで画分した。増幅したＤＮＡは製造元の手順に従ってＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ ｋｉｔ （Ｂｉｏ １０１， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製と再回収した。ヌクレオチド配列は、３１０ ＤＮＡ ａｎｔｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）を用いてａｎ ＡＢＩＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｃｈｉｂａ， Ｊａｐａｎ）により直接シークエンス法によって決定した。
【００３１】
３）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
それぞれのサンプルからＲＮＡ分離とｃＤＮＡ調製後、ターゲットｃＤＮＡと基準となるβ−アクチンｃＤＮＡを別々に５’上流にレポーター色素（ＦＡＭ）、３’下流にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）が結合している蛍光オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ中、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼの５’から３’のヌクレアーゼ活性は、レポーターを遊離し、該レポーター色素の蛍光が増大し、そして該蛍光をｔｈｅ ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ蛍光検出器によって検出した。蛍光スレッシュホールドがクロッシングした後、ＰＣＲ−増幅がＰＣＲ産物と一致するリニアカーブとなった。スレッシュホールド蛍光強度を設定し、これが起こったサイクルの地点をスレッシュホールドサイクルの起点として決定した。内部のポジティブ又はネガティブコントロール（ポリメラーゼなしのサンプル）は、同等な測定状態を確認するために異なった定量測定中の間、平行して行った。
【００３２】
以下に使用したオリゴヌクレオチドを示す。
ｆｏｒｗａｒｄ ＡＤＡＭＴＳ １３ プライマー：５’−ＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＡ−３’ （エキソン １５）（配列番号３）、
ｒｅｖｅｒｓｅ ＡＤＡＭＴＳ １３ プライマー：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＡＴＡＧＣ−３’ （エキソン １６）（配列番号４）、
プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’ （エキソン １５−１６）（配列番号５）。
【００３３】
ＰＣＲ反応混合物（５０μｌ）は、０．５μＭ それぞれプライマー、０．２５μＭ プローブ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２ｘ）から成っている。以下のサイクル条件を使用し（サイクル条件：最初９６℃１０分間、続いて９５℃１５秒間、６０℃ １分間、７２℃ １分間を１サイクルとし、４０サイクル行った）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のｔｈｅ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲから得られたデータは蛍光変化の割合を基にして相対的量として表した。標準曲線は、ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドのモレキュラーカウントを基にして得た。
【００３４】
４）結果
（１）ＡＤＡＭＴＳ１３のＲＴ−ＰＣＲ分析
クエン酸血小板多血漿の血小板分画から分離した血小板ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡは、アガロースゲルから精製と再回収をした。予期したサイズのｃＤＮＡフラグメント（６６０ｂｐ）を得て、直接シークエンス法により分析した。配列決定したヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴ プログラムを用いて検索したことにより、ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡと同定した。
【００３５】
（２）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ
血小板分画中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現を蛍光を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲによって定量分析した。ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡは六人の健康被験者において、恒常的な量でほとんど差がなく存在することが示された（図１）。ＰＣＲ増幅を、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する特別なプライマーと蛍光プローブを用いて六人の被験者からのｍＲＮＡで個別に行った。時間（ＰＣＲ サイクル数）に対するｒｅｌａｔｉｖｅ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｈａｎｇｅ（相対正常化蛍光変化△Ｒｎ）をそれぞれのサンプルにプロットした。スレッシュホールド蛍光強度を設定した後に、スレッシュホールドサイクルを決定した。相対的遺伝子発現をターゲットとする遺伝子と内部標準スレッシュホールドサイクルによって決定した。ＡＤＡＭＴＳ１３（３回）のスレッシュホールドサイクルは以下の通りである。
サンプル１：２３．３８，２９．０２，２８．１８、
サンプル２：２８．４６，２７．８３，２８．１９、
サンプル３：２８．７９，２９．０５，２９．３９、
サンプル４：２９．７８，２９．６０，２９．４７、
サンプル５：２８．９２，２９．０１，２８．５６、
サンプル６：２９．９８，３０．８５，３０．５９。
【００３６】
内部標準 β−アクチンのスレッシュホールドサイクルとＡＤＡＭＴＳ１３のそれの比を以下に示す。
サンプル１：０．５６３±０．００７、
サンプル２：０．５７０±０．００５、
サンプル３：０．５６７±０．００５、
サンプル４：０．５７２±０．００３、
サンプル５：０．５８３±０．００４、
サンプル６：０．５６３±０．００７。
【００３７】
これらの値は、３回の独立した測定の平均と標準偏差である（表１）。
【表１】
内部標準β−アクチンのスレッシュホールドサイクルとＡＤＡＭＴＳ１３のそれの比
血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの絶対量を計算するために、本発明者等は既知濃度のプラスミドｃＤＮＡサンプルの分析に基づく検量線（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｓｔｕｄｙ）を用いた（図２）。この検量線により、１ｎｇ全ＲＮＡ中にＡＤＡＭＴＳ１３ ｍＲＮＡが５．５±２．５×１０−８ｎｇ存在していることを示した。
サンプル１：６．９±２．１、
サンプル２：９．１±０．２、
サンプル３：５．２±１．０、
サンプル４：３．５±０．３、
サンプル５：６．０±０．９、
サンプル６：２．０±０．４。
これらの値は、３回の独立した測定の平均と標準偏差である。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、血小板中でのＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡの発現を初めて見出した。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量評価をするための有用な方法としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを確立した。本発明の結果は、血小板がＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡを明らかに恒常的に持っていることを明確にし、量比が変化すれば何等かの血栓性疾患が疑える。また、間接的にはＡＤＡＭＴＳ１３蛋白質が血小板に存在していることを示した。このことに基づき、血小板中のｖＷＦ−ＣＰ活性を測定することの生理学的意義を見出すことの基盤を確立した。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲを用いた血小板中のＡＤＡＭＴＳ１３ｍＲＮＡ発現の定量。
【図２】ＡＤＡＭＴＳ１３ｃＤＮＡ（×１０−８ｎｇ／３００ｎｇＲＮＡ）を含むプラスミドの検量線を基にした絶対量。
【配列表】
Claims (6)
- 検体として血液を使用することを特徴とするフォンビルブランド因子切断酵素（以下ｖＷＦ−ＣＰ）のｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
- 検体として末梢血液から得られる血小板分画を使用することを特徴とするｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとするｖＷＦ−ＣＰ機能の検出方法。
- 血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡをマーカーとする請求項１の方法。
- ＰＣＲ法による請求項１から３のいずれか１項の方法。
- 請求項１〜４の方法を使う以下の診断方法。
１）易血栓性の診断。
２）血栓症の疾病素因の予測診断。
３）血栓性微小血管障害の疾病素因の予測診断。
４）遺伝子異常診断。 - 血小板中のｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡを使用することを特徴とする、当該ｖＷＦ−ＣＰのｍＲＮＡ転写物が機能性蛋白質として生じるかを検討するための手段。
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