CN101657545A - 使用包括经间隔子附着于大分子的底物的修饰的底物的酶测量分析 - Google Patents

使用包括经间隔子附着于大分子的底物的修饰的底物的酶测量分析 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测相对于结合化合物的游离化合物的新的试剂和方法。通过使用因空间位阻不与A2M结合的凝血酶反应的修饰的底物，尤其可用于在所述A2M结合的凝血酶存在下检测未与A2M结合的凝血酶。

Description

使用包括经间隔子附着于大分子的底物的修饰的底物的酶测量分析
技术领域
本发明涉及修饰的底物以及使用该修饰的底物来测定相对于结合的蛋白实体的游离的蛋白实体的分析和方法。
发明背景
α-2-巨球蛋白(A2M)与相关的蛋白均具有作为分子陷阱(moleculartrap)起作用的功能。多种类型的化合物，诸如激素、生长因子、细胞因子和蛋白，能够被A2M“诱捕”。A2M能够结合宿主的和异体的肽和颗粒。因为A2M能够与广泛多种的蛋白酶相互作用，有时其被称为全蛋白酶抑制剂(panproteinase inhibitor)。当蛋白酶被A2M捕获时，蛋白酶被保护而免于大的蛋白酶抑制剂和大底物，但其仍能与小的抑制剂和底物相互作用。
已充分研究的一种A2M-蛋白酶结合是在A2M中诱捕凝血酶。
凝血酶是凝血级联的关键酶(2、3)，因为除了其它事以外，还能够活化纤维蛋白原以形成纤维蛋白(4、5)，反馈以活化XI因子、VIII因子和V因子在凝血级联中升高以及活化血小板(2)。对凝血酶的控制部分地经过来自血浆蛋白抗凝血酶(AT)、肝素辅因子II和A2M的抑制作用而发生。与AT的反应通常是控制成人中凝血酶活性的主要抑制性机理。然而，在新生儿和儿童中，由于比成人更高的A2M血浆浓度，与A2M的反应被认为是显著的(6、7、8)。通过A2M多肽链的切割，导致A2M三维结构的构象变化而形成凝血酶被捕获到所述A2M分子中的产物，从而使凝血酶的活化被A2M位阻(9、10、11)。在该凝血酶-A2M复合物中，通过凝血酶氨基基团与A2M上的硫内酯基团的进一步反应，凝血酶还可共价地与A2M连接(9、12)。
由于凝血酶在凝血系统中的重要性，日益需要开发测量患者的血浆或血液中的凝血酶生成潜能的系统以评价患者的止血状态。先前测量凝血酶生成的方法涉及对活化血浆的二次抽样以检测凝血酶活性(13、14、15)或者连续使用与所述凝血酶生成活化血浆混合的底物检测凝血酶(16、17、18)。先前测定凝血酶生成的方法的主要缺点在于用于检测凝血酶活性的试剂检测与A2M结合的凝血酶以及未与A2M结合的凝血酶。在二次抽样方法的情况中，从对总凝血酶活性的分析中减去对凝血酶-A2M与底物反应的分析中的活性(用添加的AT+肝素中和游离的未结合的凝血酶之后检测)以获得游离的生理活性的凝血酶的浓度。然而，这些实验是费力的并且需要在每一血浆样品上进行两种凝血酶生成分析。此外，不能在凝结的血浆或血液中完成二次抽样分析。可选择地，使用添加至活化的凝血酶生成系统(血浆、血液等)中的凝血酶底物连续测量凝血酶生成不能直接测量未与A2M结合的凝血酶的生成。在连续分析中，通过从测量的凝血酶+凝血酶-A2M数据减去计算的凝血酶-A2M生成的假想曲线来测定生理活性的凝血酶的理论量。
已进行了多种尝试以开发能够测量血浆和血液中凝血酶潜能的分析。例如，Hemker等人的美国专利第5,192,689号涉及测定血浆和血液的内源性凝血酶潜能的方法。然而，该专利方法测量总凝血酶活性，包括单独的凝血酶以及与A2M结合的凝血酶。使用小的生色/荧光底物测量凝血酶活性，接着通过计算估计与A2M结合的凝血酶，随后将其从总凝血酶活性中减去以给出游离的生理活性的凝血酶的估计值。
澳大利亚专利申请第2003248589号涉及测量凝血酶潜能的另一方法。然而，该方法也包含从总凝血酶活性减去通过小底物检测的凝血酶-A2M复合物。
美国专利申请公开第US 2005/0221414号涉及用于测量患者血液或血浆样品中的凝血酶生成潜能的试剂盒。在该公开所描述的试剂盒中，诸如活化剂、底物、CaCl2等的全部试剂，在容器是以干燥的混合物形式等待加入血浆或血液以分析。然而，该试剂盒还是会测量游离凝血酶以及与A2M结合的凝血酶两者。
Hemker的美国专利第6,740,496号描述了空间位阻的底物系统，该系统相较于对游离的蛋白水解酶，对蛋白酶-A2M复合物具有降低的反应性。然而，要求的底物发明完全限于具有最小10kDa大小的水溶性底物分子。通过该水溶性的位阻的底物测定游离凝血酶限于凝结的血浆或血液，这是由于很多问题，诸如：归因于通过蛋白或细胞的猝灭的对报告分子的有问题的检测；所述底物在细胞或聚合纤维蛋白上的潜能吸收或聚集；以及由极大分子的表面位阻产生的所述底物与游离凝血酶自身反应能力的丧失。
尽管在该领域有很多进展，但仍未满足对与测量游离凝血酶和与A2M结合的凝血酶相对照的，能够测量游离凝血酶的分析的需求。本发明解决了对这样的方法的需求。
发明概述
本发明提供评估出血倾向或高凝倾向以及评价抗出血剂和抗凝血剂的标准化方法和试剂。在本发明的一方面，能够将未与A2M结合的凝血酶(游离凝血酶)和与A2M结合的凝血酶(凝血酶-A2M复合物)区别开。
在本发明的一方面，提供了能够与游离酶反应而不与结合于分子陷阱中的酶反应的修饰的底物。该修饰的底物优选包括通过间隔子附于大分子的底物。在优选的实施方案中，所述间隔子包括3个至50个原子，优选9个至15个原子，更优选12个原子。在优选的实施方案中，所述酶是蛋白酶，优选凝血酶。
所述大分子可以选自：琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、达可纶、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。在优选的实施方案中，所述大分子为琼脂糖珠。在另一优选的实施方案中，所述大分子为聚苯乙烯。
另一方面，本发明提供修饰底物的方法。该方法包括修饰所述底物以致所述底物不能与结合酶相互作用。在一种实施方案中，该方法包括将所述底物与诸如琼脂糖珠的大分子相连接。在另一实施方案中，该方法包括改变所述底物的电荷、疏水性或亲水性以致所述底物被与所述酶结合的分子排斥。在另一实施方案中，所述底物被修饰为与所述酶结合分子的远离所述结合酶的暴露活性部位的区域具有亲和力。
本发明还提供了检测样品中相对于结合酶的游离酶的方法。该方法包括获得如上定义的修饰的底物；将该底物与所述样品结合；以及检测生色信号、荧光信号或化学发光信号。
在另外的方面，本发明还提供了包括被修饰为仅与游离酶反应的底物的测量酶活性的试剂盒。
本发明的概述没有必要描述本发明的全部特征。
附图的简要描述
本发明的这些和其它特征将由对附图提供参考的以下说明变得更明显，其中：
图1是说明现有技术的分析的示意图；
图2说明根据本发明的实施方案的修饰的底物可以如何结合；
图3说明所述间隔子的长度可以如何影响结合；
图4说明本发明的一方面的分析；以及
图5说明凝血酶生成分析的结果。
详细说明
以下说明属于优选实施方案。
本发明提供可以用于检测相对于结合分子的游离分子的新的方法和试剂。特别地，可以将游离蛋白酶和与A2M结合的蛋白酶区别开。该方法和试剂还可以用于检测相对于“结合”态的“游离”态的各种功能的其它蛋白。
本文使用的术语“游离的”是指不在复合物中的部分。术语“游离的凝血酶”是指未与A2M结合的凝血酶，尽管所述凝血酶可以与其它分子结合。
本文使用的术语“结合”是指已形成复合物的部分。术语“结合的凝血酶”是指被诱捕于A2M中的凝血酶。
本文自由使用的术语“底物”和“酶”是指相互作用的组分。“底物”是指可以与可以被分子陷阱螯合的另一部分反应的任一部分。虽然本文描述具体关于凝血酶及其底物的发明，但很明显本发明可以应用于很多其它蛋白-蛋白反应、受体-配体反应、酶-底物反应。
使用能够与所述游离化合物反应但与所述结合化合物的反应被位阻的信号试剂检测相对于所述结合化合物的所述游离化合物。能够直接或间接地标记该信号试剂。信号试剂的一种实例是能够靠近游离酶上的活性部位但不能靠近结合酶的活性部位的化学发光的底物。
在本发明的一方面，提供了修饰的底物。修饰该底物以致其能够与游离酶反应但不与被诱捕于分子笼(molecular cage)中的酶反应。这可以通过将所述底物与大的载体偶联、通过改变所述疏水性或亲水性、或通过改变所述亲和力来达到。在优选的实施方案中，将小的底物与大分子偶联，所述大分子诸如琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、达可纶、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。当底物附于大分子时，所述底物受到空间位阻而不能靠近螯合于分子陷阱中的酶的活性部位。
本发明还提供了测定活跃地游离的酶的量和/或活性的方法与分析。该方法包括如上所述修饰底物并测定其与溶液中的酶反应的能力。可以通过检测生成信号的切割产物来测量该酶-底物反应。
还提供了测量酶活性的试剂盒。该试剂盒包括仅与游离酶反应的修饰的底物。该试剂盒还可以包含反应缓冲液及诸如标准化酶对照的其它试剂或诸如组织因子的其它反应物。该试剂盒可以包含诸如微量滴定板孔或类似物的表面，所述表面用修饰的底物包被。
在优选的实施方案中，提供了受位阻而无法靠近被A2M诱捕的凝血酶的凝血酶-反应性底物。所述A2M(含有结合的凝血酶)物理地阻止、排斥或限制底物与结合A2M的凝血酶的活性部位相互作用。在一种实施方案中，这是通过构建过大的底物或对于所述底物的凝血酶-可切割区域过短的间隔子，从而不能在凝血酶-A2M复合物的A2M部分的周围突出并且不能靠近(接触)被A2M捕获的凝血酶的活性部位来完成的。在另一实施方案中，可以将基团结合至凝血酶-可切割底物，所述基团为A2M上的区域所排斥(通过电荷、疏水性/亲水性等)，从而防止所述底物向凝血酶-A2M复合物中的凝血酶移动。在另外的实施方案中，可以将对凝血酶-A2M的A2M组分的一处或多处区域具有亲和力的基团工程化至凝血酶-可切割底物，以致由于与A2M上远处的吸引位点结合而使所述底物的凝血酶-可切割部分远离A2M-结合的凝血酶的活性部位。
提供了使用所述修饰的底物测量凝血酶活性的方法和分析以及实施该方法的试剂盒。
目前可获得的测定凝血酶活性的商业分析使用与游离凝血酶以及结合在A2M内部的凝血酶发生反应的底物。这在图1中说明。已表明游离凝血酶10和在A2M 14中结合的凝血酶12均与底物16反应。因此，为了获得对所述游离凝血酶的估计，必须减去理论凝血酶-A2M活性量。
如图2示意说明，通过将凝血酶特异底物连接至大基质上解决了现有技术的问题。凝血酶显示为游离凝血酶10和A2M 14中的结合凝血酶12。所述凝血酶包含可以与底物16反应的活性部位15。当将底物16连接至大基质18时，所述底物16受空间位阻无法靠近被诱捕于A2M的凝血酶。为了达到游离凝血酶10与结合凝血酶12之间的最适区分，应仔细控制所述底物16与所述基质18的表面键合。如果使用很短的间隔子20，该基质的表面甚至可以位阻所述游离酶与所述底物反应(参见图3A)。如果所述间隔子20太长，所述底物可以足够自由而靠近所述结合酶(参见图3B)。为了检测游离凝血酶，优选约5个至15个原子的间隔子20。该间隔子足够长以允许所述底物与所述游离酶反应，但没有长到允许其靠近所述结合酶(参见图3C)。8个至14个原子的，优选12个原子的间隔子特别可用于将底物偶联至琼脂糖珠。
图4说明本发明的修饰的底物可以怎样用于分析。微量滴定板的孔30用基质修饰的化学发光的凝血酶底物32包被。将血浆或血液34加入该孔。来自活化的血液或血浆的凝血酶与该底物反应并且信号被产生且由光度计检测。虽然优选使用化学发光的检测器，但是明显无疑地，可以使用本领域技术人员已知的其它检测装置来检测所述修饰的底物与所述游离酶的结合。显然，还可以将修饰的底物包被在诸如试管和管的其它表面上。同样地，应理解包被修饰的底物可以是通过与表面的共价连接或非共价连接。
图5说明本发明可以如何用于测量凝血酶生成。结果说明本发明的修饰的底物可以区分游离凝血酶和凝血酶-A2M复合物。
本发明提供了直接测量未与A2M结合的凝血酶而在凝血酶-A2M复合物存在下不检测凝血酶-A2M的新的方法。本发明提供了在不必做任何另外的操作或数学推导以测定生成的游离凝血酶水平的情况下测量游离凝血酶的简单方法。本发明的修饰的底物限制与结合至A2M的凝血酶的反应。然而，位于一些表面的凝血酶可以与受空间位阻而无法接近保持在A2M复合物内凝血酶的底物反应。这可以由本发明的特定特征来完成，借此使用最适长度的间隔子将所述空间位阻大分子连接至所述反应性底物。可以与表面上的凝血酶(诸如纤维蛋白或血小板)反应但不与结合至A2M的凝血酶反应的底物可以模拟纤维蛋白原(或其它生物大分子/体系)与体内生成的凝血酶的反应性。
本发明的底物的另一优势在于，当所述凝血酶-反应性底物结合至大至足以被沉淀、手工除去、离子地提取或疏水地吸收的分子时，可以将该底物与该反应凝血酶分离。
本方法允许人使用单一分析(一步)在凝血酶-A2M存在下测定未与A2M结合的凝血酶。当在凝结的血浆或血液中进行连续的凝血酶生成分析时，前述方法依靠在所述血浆/血液中反应的荧光凝血酶底物。然而，在这些实验中的荧光产物遭受来自所述血浆或血液中的分子和细胞的激发干扰和发射猝灭。本发明通过将凝血酶底物附于所述容器壁以致可以通过直接观察穿过所述容器壁远离(而不是穿过)所述血浆/血液环境的产物光来测量来自所述凝血酶-可切割产物的任何信号，从而克服对在所述液相中检测荧光的这种干扰。
本发明可用于直接测量体外随时间的血浆或血液中的凝血酶生成而不必提取凝血酶-A2M的污染测量结果。该直接凝血酶活性检测底物允许血浆或血液中凝血酶潜能的简单的简化分析并且提供出血倾向或高凝倾向的标准测量以及用于常规临床实践的抗出血剂或抗凝血剂的评价。
受空间位阻而无法通过共价/非共价结合至透明容器内表面与凝血酶-A2M反应的底物实现检测所述凝血酶底物切割产物(即，生色产物、荧光产物或化学发光产物)而无所述反应混合物中其它分子(诸如血浆/血液蛋白)的任何干扰。
此外，当对凝血酶具有高亲和力的基团被固定在空间上妨碍结合至与A2M结合的凝血酶的表面时，这种物质可以用于从所述培养基中分离非-A2M结合的凝血酶。这有助于免疫学研究、精细结构研究及其它研究。
此外，当修饰的底物结合液相中的凝血酶并通过大小、电荷或对A2M的单独区域的亲和力抑制A2M结合时，可以研究随后的依赖其它结合机理的凝血酶相互作用，包括在多种情况下结合至血小板或血管内皮表面的凝血酶的定位。
虽然已详细描述了本发明的优选实施方案，但显然，修饰为与游离酶反应但不与结合酶反应的底物将可用于多种分析和应用中。
以上公开内容总体上描述了本发明。据信，本领域普通技术人员可以使用前述说明制备并使用本发明的组合物并且实施本发明的方法。通过参考以下的具体实施例可以获得更全面的理解。描述这些实施例仅仅为了说明本发明的优选实施方案并非旨在限制本发明的范围。在条件可能提示或导致有利时，涉及形式上的改变和等价替换。其它一般性配置对本领域技术人员将是明显的。本文提及的所有期刊文章和诸如专利或专利申请的其它文件，通过引用并入本文。
实施例
虽然在这些实施例中使用了特定术语，但这样的术语意在描述而不是为了限制的目的。在本公开内容和这些实施例中提及但未清楚描述的生物化学方法及化学方法是在科学文献中报导的并且是本领域技术人员公知的。
实施例1.制备S2238-琼脂糖修饰的底物
根据厂商的说明，使凝血酶底物S2238(Diapharma，West Chester，OH，USA)与环氧-琼脂糖(Sigma，Mississauga，Ontario，Canada；具有末端带反应性环氧化物官能团的12原子间隔子的琼脂糖珠基质)反应以产生S2238-琼脂糖(通过12原子间隔子基团连接至琼脂糖的S2238)。将一瓶25mg的S2238+来自DiaPharma的其它固体(批号N0548870)溶解于2mL的H2O中，并取出1mL的所得溶液用于与1g干燥的环氧-活化的琼脂糖(在与S2238混合前溶胀并清洗的珠)偶联。使用pH 9.0的磷酸盐进行偶联反应(反应溶液在23℃下倒转混合16小时)。过量的环氧基团通过与1M的Tris.HCl pH 9.0反应4小时而被封闭。交替使用由浓HCl滴定至pH 4.0的0.1M乙酸Na(乙酸盐缓冲液)和0.1M H3BO30.5M NaCl pH 8.0清洗来自所述最终反应混合物的珠。然后将所述S2238-琼脂糖珠在4℃以乙酸盐缓冲液的50％悬浮液储存。
实施例2.底物和修饰的底物的反应性的比较
测定凝血酶底物S2238和S2238-琼脂糖与游离凝血酶和凝血酶A2M复合物的反应性。
制备0.05M HEPES 0.15M NaCl pH 7.5(HBS)的溶液。通过40μL的5mg A2M(Sigma)/mL+40μL的0.2mg凝血酶(Enzyme ResearchLaboratories，South Bend，IN，USA)/mL HBS在23℃反应40分钟至60分钟来制备凝血酶-A2M(溶液#1)。制备40μL的5mg A2M/mL+40μL HBS的溶液(溶液#2)和40μL的0.2mg凝血酶/mL+40μL HBS的溶液(溶液#3)。
在96-孔板的孔中进行与S2238的以下反应。
1.将5μL溶液#1加入10μL 0.5mg抗凝血酶(纯化的抗凝血酶III蛋白，Affinity Biologicals，Ancaster，Ontario，Canada)/mL HBS+1μL 100U肝素(Leo Laboratories，Ajax，Ontario，Canada)/mL HBS+74μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mg S2238/mL H2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
2.将5μL溶液#2加入10μL 0.5mg抗凝血酶/mL HBS+1μL 100U肝素/mL HBS+74μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mg S2238/mLH2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
3.将5μL溶液#3加入10μL 0.5mg抗凝血酶/mL HBS+1μL 100U肝素/mL HBS+74μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mg S2238/mLH2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
4.将5μL溶液#1加入85μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mgS2238/mL H2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
5.将5μL溶液#2加入85μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mgS2238/mL H2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
6.将5μL溶液#3加入85μL HBS。10分钟后，加入10μL 3.192mgS2238/mL H2O并混合，每10秒测量405nm吸光度读数100秒并且记录随那段时间的吸光度的变化(ΔA)。
将S2238-琼脂糖珠(用等体积的乙酸盐缓冲液储存)很好地混合并取0.25mL等分试样的所得同质悬浮液入离心小管。离心并仔细除去上清液之后，将每一试管中的所述珠与0.5mL 0.02M Tris.HCl 0.15M NaCl 0.6％聚乙二醇8000pH 7.4(TSP)混合，离心并除去上清液。将所述珠再次与TSP混合，离心并仔细除去上清液以准备与多种物质反应。进行与已清洗的S2238-琼脂糖珠的以下反应。
1.将30μL溶液#1与570μL HBS混合，并将0.25mL所得溶液与已清洗的珠在离心小管中混合。在23℃下3分钟或10分钟后，将所述管离心1分钟并将所述上清液迅速(但仔细地)置于离心小管中。将100μL反应上清液置于96孔板的孔中并测量405nm处的吸光度(终点读数)。
2.将30μL溶液#3与570μL HBS混合，并将0.25mL所得溶液与已清洗的珠在离心小管中混合。在23℃下3分钟或10分钟后，将所述管离心1分钟并将所述上清液迅速(但仔细地)置于离心小管中。将100μL反应上清液置于96孔板的孔中并测量405nm处的吸光度(终点读数)。
3.将30μL溶液#3与60μL 0.5mg抗凝血酶/mL HBS+6μL 1000U肝素/mL HBS+504μL HBS混合，并将0.25mL所得溶液与已清洗的珠在离心小管中混合。在23℃下3分钟或10分钟后，将所述管离心1分钟并将所述上清液迅速(但仔细地)置于离心小管中。将100μL反应上清液置于96孔板的孔中并测量405nm处的吸光度(终点读数)。
4.将0.25mL HBS与已清洗的珠在离心小管中混合。在23℃下3分钟或10分钟后，将所述管离心1分钟并将所述上清液迅速(但仔细地)置于离心小管中。将100μL反应上清液置于96孔板的孔中并测量405nm处的吸光度(终点读数)。
所述反应的结果如下表1和表2所示。
表1.与可溶的S2238反应。
Figure G2006800534479D00111
表2.与S2238-琼脂糖反应。
Figure G2006800534479D00112
以上表1和表2所示的数据表明当S2238与游离凝血酶或凝血酶-A2M容易地反应时，所述S2238-琼脂糖珠与游离凝血酶显著地反应但不与凝血酶-A2M反应。
实施例3.进一步比较反应性
将凝血酶和凝血酶-A2M加入S2238和S2238-琼脂糖的样品中。检测吸光度的变化且结果如下表3所示。
表3
Figure G2006800534479D00121
结果表明修饰的底物S2238-琼脂糖与游离的凝血酶强烈地反应但不与结合的凝血酶反应。
实施例4.通过S2238与CNBr-活化的琼脂糖凝胶的反应而固定的S2238 与凝血酶的反应
为了证实在底物和位阻大分子表面之间的间隔子中所需原子的最小数量，测试通过小CNBr活化基团与琼脂糖凝胶珠连接的S2238与凝血酶的反应。
制备S2238-琼脂糖凝胶珠
将一瓶含有25mg S2238的未悬浮的(干燥的)粉末(Chromogenix批号NO526873)悬浮于2mL H2O中。移出1mL该悬浮液并置于含有0.75mL的1.75mL 0.2M NaHCO31M NaCl pH 8.0的50mL有盖塑料离心管中。将1g CNBr-活化的琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences批号299594)悬浮(溶胀)于10mL 0.001M HCl中，然后用200mL 0.001M HCl在烧结的玻璃滤器上清洗。将已清洗的CNBr-活化的琼脂糖凝胶与所述S2238溶液置于管中，并在23℃下在摇板上孵育2小时，然后在4℃下在摇板上孵育18小时。反应后，将反应混合物中的珠在烧结的玻璃滤器上用100mL0.1M NaHCO30.5M NaCl pH 8.0清洗。将清洗过的珠加入含有15mL 0.1M Tris.HCl pH 8.0的有盖塑料离心管，并在23℃下在摇板上孵育2小时。然后在烧结的玻璃滤器上用10mL 0.1M Tris.HCl 0.5M NaCl pH 8.0清洗珠，接着用20mL 0.1M乙酸钠0.5M NaCl pH 4.0清洗珠。用Tris.HCl/NaCl和乙酸钠/NaCl的这在后的清洗被再重复5次。最后，在4℃将该珠与等体积(与压紧的珠等体积)的0.1M乙酸钠0.5M NaCl pH 4.0储存在有盖的塑料管中。这批储存的珠命名为S2238-琼脂糖凝胶。S2238-琼脂糖凝胶珠悬浮液的小的子样品与等体积的4M NaOH的混合物在液相中发出强的黄色(在405nm吸收)，证实完整的S2238底物附着于所述琼脂糖凝胶珠。
与凝血酶的反应
将0.5mL重悬的S2238-琼脂糖凝胶珠置于2个微量离心管(1.5mL容量)的每一个中，然后以12000g离心1分钟并除去所得的上清液。将每一管中的珠重悬于0.5mL 0.02M Tris-HCl 0.15M NaCl 0.6％聚乙二醇8000pH 7.4(TSP)中，离心1分钟并弃去所得上清液。制备溶于TSP的100nM的人α凝血酶(Enzyme Research Laboratories)溶液。将0.5mL凝血酶加入压紧的S2238-琼脂糖凝胶珠的一个管(管1)，并将0.5mL TSP加入S2238-琼脂糖凝胶珠的另一管(管2)。在单独空管中加入0.05mL游离的(未与珠偶连的)S2238储液(12.5mg S2238/mL H2O)+0.15mL TSP+0.5mL 100nM凝血酶(管3)。最后，在单独的空管中加入0.05mL游离的S2238储液+0.65mL TSP(管4)。将所有的管盖上，并将管+内容物在23℃通过用手工翻转轻轻摇动10分钟。翻转混合后，将管以12000g离心1分钟并将来自每管的0.2mL的上清液迅速移至96孔微量滴定板的单独的孔，并在405nm下测量吸光度。
结果
不同孵育混合物的吸光度读数如下所示。
  管号 孵育混合物   在10分钟孵育和1分钟离心后，上清液在405nm的吸光度
  1   S2238-琼脂糖凝胶珠+凝血酶+TSP缓冲液   0.050
  2   S2238-琼脂糖凝胶珠+TSP缓冲液   0.052
  3   游离未结合的S2238+凝血酶+TSP缓冲液   1.143
  4   游离未结合的S2238+TSP缓冲液   0.043
这些数据明确地表明，通过CNBr活化基团(即-NH-(C＝NH)-O-键)附于宏观珠的S2238不允许其自身与凝血酶的反应。因此，所述底物和大分子表面通过含有相对小数量的原子的间隔子的键合，不允许对甚至于所述游离酶与所述底物反应的空间位阻的足够缓解。
实施例5.由游离S2238或S2238-琼脂糖测定的血浆凝血酶生成
取血浆，并且通过与安克洛酶反应以形成缠绕的纤维蛋白凝块，来除去纤维蛋白原，从而产生所得的脱纤维蛋白的血浆。在时间零点，加入组织因子(Thromborel S)+CaCl2以在预热的脱纤维蛋白血浆中开始凝血酶生成。在某些时间点，取反应混合物的子样品加入Na2EDTA中以通过螯合所述Ca2+而停止进一步的凝血酶生成。然后通过与缓冲液中游离的S2238底物混合或与悬浮于缓冲液中的空间位阻的S2238底物(S2238-琼脂糖珠)混合以检测当时样品(含有游离的凝血酶以及与α-2-巨球蛋白(A2M)结合的凝血酶)的凝血酶活性。为了测定游离S2238或S2238-琼脂糖检测凝血酶-A2M的能力，进行与以上方法类似的试验，除了在与底物孵育前通过与抗凝血酶+肝素混合而首先将全部的游离凝血酶抑制。在血浆凝血酶生成时间过程期间，首先将凝血酶原转变为凝血酶，然后通过血浆抗凝血酶(对游离S2238没有生色活性)或A2M(与A2M结合的凝血酶对小的生色S2238底物保持活性)逐渐抑制游离的凝血酶。因此，早期时间点的样品(即60秒)会含有比凝血酶-A2M多的游离凝血酶，而后期时间点的样品(即300秒)会含有比游离凝血酶多的凝血酶-A2M。
血浆中总凝血酶(游离凝血酶+凝血酶-A2M)生成的测量
血浆凝血酶生成使用12mm(内径)×75mm(长)的聚碳酸酯塑料试管。
1.使血浆脱纤维蛋白：
a.将800μL血浆与10μL 30U/mL安克洛酶储液在37℃孵育10分钟。
b.孵育后，形成的纤维蛋白凝块缠绕于塑料棒上，使上清液成为脱纤维蛋白的血浆。
c.将试管置于冰上10分钟。
d.10分钟的孵育后，使任何更多的凝块缠绕出。
e.将脱纤维蛋白的血浆储存在冰上。
2.将所述活化剂溶液(12.5μL Thromborel S+4.0μL 1M CaCl2+183.5μL HBS)在37℃下于管中温热。在单独的管中，150μL脱纤维蛋白的血浆在37℃温热。
3.在t＝0时，将150μL活化剂溶液与150μL脱纤维蛋白的血浆在37℃混合。
4.在t＝60秒和t＝300秒时，移出25μL所述反应混合物并立即在冰上加入475μL 0.005M Na2EDTA。
5.一旦全部时间点均用EDTA中和，用135μL悬浮于HBS的珠(约75μL压紧的珠，所述珠悬浮液中的最终S2238浓度为0.35mM)与50μL每一EDTA/时间样品在37℃下于微量离心管中混合。将时间样品等分试样+珠悬浮液通过翻转在随后的整个孵育过程中混合。
6.在单独的管中，将50μL的所述EDTA/时间样品在37℃加入110μL的溶于HBS的0.00016M S-2238。
7.与游离S2238底物或S2238-琼脂糖珠孵育10分钟后，将40μL50％的乙酸加入各个管以阻止底物水解。
8.将含有乙酸中和的珠悬浮液的微量离心管微量离心1分钟。
9.将各样品的200μL上清液的等分试样置于96-孔板的孔中并在405nm测量吸光度。
测量血浆中生成的凝血酶-A2M
除了在步骤4中将25μL时间样品在冰上加入5μL 50U抗凝血酶/mL PBS(7.2mg抗凝血酶/mL)+2μL 100U肝素/mL 0.15M NaCl，重复以上所述的实验。1分钟后加入468μL 0.005M Na2EDTA并如前继续所述程序。在405nm检测的吸光度本质上归因于底物与凝血酶-A2M单独的反应(游离的凝血酶已被抗凝血酶+肝素中和)。
所述时间样品中归因于游离凝血酶的底物切割的吸光度可以通过从初始实验中(其中时间样品未用抗凝血酶+肝素中和并且含有游离凝血酶+凝血酶-A2M)的吸光度减去归因于凝血酶-A2M的吸光度而测定。
图5所示的数据说明，在含有生成的游离凝血酶+与A2M复合的凝血酶的血浆样品中，在血浆活化后60秒时通过可溶的(游离的)S2238以及S2238-琼脂糖珠均检测到显著的活性。在血浆活化后300秒时，使用可溶的S2238测量到显著的凝血酶底物活性，但S2238-琼脂糖珠给出相对减少量的凝血酶活性(在405nm的吸光度)。然而，在保留生成的凝血酶-A2M复合物但未保留游离的凝血酶(游离的凝血酶被抗凝血酶+肝素中和)的血浆样品中，通过可溶的S2238检测出显著的凝血酶活性(尤其是在300秒时间点)而通过空间位阻的S2238-琼脂糖珠仅测量到基线背景吸光度。对含有生成的游离凝血酶+凝血酶-A2M的血浆样品与仅含有凝血酶-A2M的血浆样品的比较表明，加入钙+组织因子300秒后，绝大部分可溶的S2238活性归因于凝血酶-A2M。对于S2238-琼脂糖珠的情况，在60秒或300秒时间点仅检测到游离的凝血酶。
所有引用以参考的方式并入本文。
已描述关于一种或多种实施方案的本发明。然而，对于本领域技术人员明显的是，在不偏离如权利要求书所定义的本发明的范围的情况下，可以做出很多变形和修饰。
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Claims (17)

1.修饰的底物，所述修饰的底物能够与游离酶反应而不与结合于分子陷阱的酶反应，所述修饰的底物包括经间隔子附于大分子的底物。
2.如权利要求1所述的修饰的底物，其中所述间隔子包含3至50个原子。
3.如权利要求2所述的修饰的底物，其中所述间隔子包含9至15个原子。
4.如权利要求3所述的修饰的底物，其中所述间隔子包含12个原子。
5.如权利要求1所述的修饰的底物，其中所述底物是肽并且所述酶是蛋白酶。
6.如权利要求5所述的修饰的底物，其中所述酶选自凝血酶、Xa因子、活化的蛋白C、纤溶酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B。
7.如权利要求6所述的修饰的底物，其中所述酶是凝血酶。
8.如权利要求1所述的修饰的底物，其中所述大分子选自琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、达可纶、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。
9.如权利要求8所述的修饰的底物，其中所述大分子是琼脂糖珠。
10.如权利要求8所述的修饰的底物，其中所述大分子是聚苯乙烯。
11.检测样品中相对于结合酶的游离酶的方法，所述方法包括：
i.获得如权利要求1定义的修饰的底物；
ii.将所述底物与所述样品结合；以及
iii.检测生色信号、荧光信号或化学发光信号。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述修饰的底物与容器表面非共价地结合。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述修饰的底物与容器表面共价地结合。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述酶是凝血酶。
15.测量游离酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1定义的修饰的底物。
16.如权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒还包含反应缓冲液和组织因子。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述修饰的底物与反应容器的表面结合。
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