JPH02221863A - エンドトキシンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カブトガニから得られるアメポサイト・ライ
セードに係わり、特に、エンドトキシンに対する特異性
の高いアメボサイト・ライセートに関するものである。

〔従来の技術〕

カブトガニの血リンパ液より取得されるアメボ凝固現象
は、「リムルステスト」の−船名でエンドトキシン特異
的検出法として医学、薬学の領域で広く利用されている
。この様なアメポサイト・ライセードの凝固を起こす物
質としては、エンドトキシン以外にトリプシン様プロテ
アーゼ（トリプシン、トロンビン等）及びβ−グルカン
類（β結合を有するグルコースポリマー及びその誘導体
）が知られている。

アメボサイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固
現象は、エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子に
よる凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働き
によるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換
により起こることが明らかにされている。一方、アメボ
サイト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象がβ
−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素
前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギ
ュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり
、アメボサイト・ライセートに含まれるエンドトキシン
性凝固酵素前駆体活性化因子とβ−グルカン性凝固酵素
前駆体活性化因子が異なるものであること力＜Ｍｏｒｉ
　ｔａらにより報告された（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
、　１２９．２．３１８−３２１）。硫酸化多糖類を担
体とする液体クロマトグラフィーを用いたβ−グルカン
性凝固酵素前駆体活性因子の除去を特徴とするエンドト
キシンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセート
の調製法が岩永らにより開示されている。（特開昭５９
−２７８２９号）〔発明が解決しようとする課題〕 公知の硫酸化多糖類を担体とする液体クロマトグラフィ
ーを用いたβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子の
除去を特徴とするエンドトキシンに対する特異性の高い
アメポサイト・ライセードの調製法に従って調製したア
メボサイト・ライセートには凝固成分であるコアギュロ
ーゲンがβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子と共
に除去されるため操作の煩雑な合成基質法による測定に
しか用いることができない。また高価で調製の面倒な、
硫酸化多糖類を吸着担体とする液体クロマトグラフィー
用充填剤を使用しなければならないという欠点があった
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、上述した従来技術の問題点を解決するために
提案されたもので、その目的は、カブトガニの血リンパ
液より取得されるアメボサイト・ライセートに水不溶性
β−グルカン類又はその誘導体及び／又はβ−結合を有
するヘミセルロースを適当量含有させることによりβ−
グルカンに対する感受性を消失せしめ、エンドトキシン
に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びβ
−グルカン類に対する感受性を消失させたアメボサイト
・ライセートの調整方法を提供することである。すなわ
ち、本発明者らはアメボサイト・ライセート中に水不溶
性β−グルカン類又はその誘導体及び／又はβ−結合を
有するヘミセルロースを過剰量含有させることによりア
メボサイト・ライセートのβ−グルカン類に対する感受
性が消失するという新規事実を見いだし本発明に到達し
たのである。

血球に触れることによって起因される。この反応は血球
中の３種のセリンプロテアーゼ前駆体とコるＣ因子のＣ
因子への活性化がトリガーとなる。

また、β−グルカンによっても凝固する。このときＣ因
子が関与する。

アメボサイト・ライセートの凝固機構を次に示す。

（本頁以下余白） 前述したように、アメボサイト・ライセート中には、エ
ンドトキシンで活性化され凝固する経路と、β−グルカ
ンによって活性化され凝固する経路との二経路が存在す
る。すなわち、アメボサイト・ライセートは、エンドト
キシン又はβ−グルカンの存在によって凝固するもので
ある。したがって、アメボサイト・ライセートがある試
料との接触によって凝固した場合に、その試料中にエン
ドトキシン、β−グルカンのどちらか存在していたのか
を特定することはできない。

しかしながら、本発明のアメボサイト・ライセートはエ
ンドトキシンに対する特異性を示すものであるので試料
中にエンドトキシンが存在することが確定できる。

本発明は、カブトガニの血リンパ液より取得されるアメ
ボサイトの抽出液であるアメボサイト・ライセートにβ
−グルカン類に対する感受性が消失する十分な量の水不
溶性β−グルカン類を存在させるものである。過剰に存
在する水不溶性β−グルカン類その誘導体又はβ−結合
を有するヘミセルロースは、β−グルカン類によって活
性化され凝固する経路をプロ・ツクする能力を有する。

次に本発明で用いるカブトガニのアメポサイト・ライセ
ードについて説明する。

アメボサイト・ライセートは、カブトガニ、たとえば北
米産カブトガニ学名Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍ
ｕｓ、日本産カブトガニ　学名Ｔａｃｈｐｌｅｕｓ　ｔ
ｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ等と称する各種のカブトガニの血
液リンパ液より取得されるアメボサイトを水系の抽出液
で抽出して得られる。たとえばイオン強度０．０５以下
の塩溶液、好ましくはＮａＣ１を含むトリス−塩酸緩衝
液を使用して抽出する。

本発明で用いる水不溶性β−グルカン類としてはリケナ
ン（シグマ社）、バキマン（ブクリヨウからアルカリ抽
出したもの）、ツヤガラン（イワタケから熱抽出したも
の）、スクレロタン（Ｓｃｌｅ−ｒｏｔｉｕｓ＋　ｓｐ
、生産物及び菌体よりアルカリ抽出したもの）等が含ま
れ、又、β−結合を有するヘミセルロースとしてはキシ
ラン等が含まれそれらは本発明のβ−グルカンに対する
感受性を消失させたアメボサイト・ライセートの成分と
して有効である。また、水不溶性β−グルカン類又はβ
−結合を有するヘミセルロースの使用濃度は、これら自
体が水不溶性であるため特に限定されるものでなくアメ
ボサイト・ライセートにβ−グルカン類に対する感受性
が消失するに十分な量であればいずれの濃度でもよい。

次に本発明のβ−グルカン類に対する感受性を消失させ
たアメボサイ＋・ライセードの調製法について説明する
。

本発明のβ−グルカン類に対する感受性を消失させたア
メボサイト・ライセートは、カブトガニから得られるア
メボサイト・ライセートに、このアメボサイト・ライセ
ートにβ−グルカン類に対する感受性を消失せしめ得る
に十分な量の水不溶性β−グルカン類又はその誘導体及
び／又はβ結合を有するヘミセルロースを共存させるこ
とにより調製できる。すなわちアメボサイト・ライセー
トと過剰量の上記物質とが共存していればよい。

その調整法は特定の方法によらなければならないもので
はないが、代表例を次に挙げ説明する。

その調製法には、第１の調製法としてカブトガニの血液
リンパ液により取得されるアメボサイトを水系の抽出剤
で抽出してアメボサイト・ライセートを得る際の該水系
抽出剤中に水不溶性β−グルカン類又はその誘導体及び
／又はβ−結合を有するヘミセルロースを添加しておく
方法（以下、抽出法という）がある。この方法では、ア
メボサイトからアメボサイト・ライセートを得る抽出と
同時に、水不溶性β−グルカン類又はその誘導体及び／
又はβ−結合を有するヘミセルロースを添加・懸濁共存
させることができるので効率的な調製方法である。抽出
に際して水不溶性β−グルカン類又はその誘導体及び／
又はβ−結合を有するヘミセルロースが共存していても
抽出工程上なんら障害は無く、抽出率等は良好である。

しかも得られたアメポサイト・ライセードのβ−グルカ
ン類に対する感受性の消失特性にもなんら影響を与えな
い。

抽出剤には、たとえばイオン強度０．０５以下の塩溶液
、好ましくはＮａＣ１を含むトリス−塩酸緩衝液が使用
される。

更に第２の調製方法として、カブトガニの血液リンパ液
により取得されるアメボサイトを水系の抽出剤で抽出し
て得たアメボサイト・ライセートに、水不溶性β−グル
カン類又はその誘導体及び／又はβ−結合を有するヘミ
セルロースを添加混合する方法（以下、添加法という）
がある。

そして、上記抽出法又は添加法のいずれかにおいても、
添加した水不溶性β−グルカン、その誘導体又はβ−結
合を有するヘミセルロースの過剰量は処理後に処理液か
ら遠心分離等の簡単な操作により容易に分離、回収でき
、更にそれらを再使用することができる。

以下に本発明の実施例を示すがこの実施例により本発明
の内容は拘束されるものでない。

〔実施例〕

アメリカ産カブトガニ（Ｌｉｎ＋ｕｌｕｓ　凹ｎ吐姐■
）血リンパ液よりアメボサイトを無菌的に採取し、この
アメボサイトを１２ｍＭのＭｇＣｈを含むｐＨ７，２の
２０ｆｆ１Ｍトリスー塩酸緩衝液で抽出する。さらに同
緩衝Ｗ１．１ＯＯＩｎｌに０．１　ｇのパキマンを加え
オートクレーブ滅菌し、抽出したアメボサイト・ライセ
ートｔｏｏｉに加える。−晩、撹拌し、４°Ｃにおいて
３０００ｘｇで２０分遠心後、上清を回収し、凍結乾燥
にかける。この凍結乾燥品に注射用蒸留水で溶解したラ
イセードはβ−グルカンに対して反応せずエンドトキシ
ンに対しては感受性を示すアメボサイト・ライセートが
得られる。

本アメポサイト・ライセードを用いてのエンドトキシン
の定量法は以下の通りである。本アメボサイト・ライセ
ートＯＡｍｌを試料あるいは既知濃度のエンドトキシン
をエンドトキシンフリーの水で希釈した水溶液０．１ｄ
を内径０．７ｍｍの試験管中に混合し振動を避けて３７
°Ｃで静置する。反応開始１時間後に試験管を静かに１
８０度転倒させ内容物が落下しないものを＋、内容物が
落下するものを−と判定する。エンドトキシンあるいは
試料について十判定を与えた希釈倍率より試料中のエン
ドトキシン濃度を求める。

第１表に上記の方法でエンドトキシンあるいはβ−グル
カンを本アメボサイト・ライセートと反応せしめた結果
をしめす。本結果より明らかなように本アメボサイト・
ライセートはエンドトキシンには感受性を示すがβ−グ
ルカンには感受性を示さない。

第１表　既知濃度のエンドトキシン、あるいはβ−グル
カンと本アメボサイト・ライセートとの反応結果結果を
示す０本結果より明らかなように水不溶性β−グルカン
類の一種であるパキマンをアメボサイト・ライセート中
に含ましめることよりβ−グルカンに対する感受性が消
失する。

第２表　既知濃度のエンドトキシン、あるいはβ−グル
カンと本アメボサイト・ライセートとの反応結果第２表
にパキマンを含まない緩衝液で抽出したアメボサイト・
ライセートを同じ反応方法でエンドトキシンあるいはβ
−グルカンと反応せしめた〔発明の効果〕 本発明によりβ−グルカン類に対しては反応せず、エン
ドトキシンに対して特異性の高いアメボサイト・ライセ
ートを容易に得ることができる。

本方法により取得されるアメボサイト・ライセートは、
β−グルカンに対しては反応せずエンドトキシンに対し
ては濃度依存的に反応するため、エンドトキシンに対す
る特異性の高い定量用試薬として利用できる。さらに、
エンドトキシンはグラム陰性菌の菌体成分であるので、
エンドトキシンの定量による敗血症の診断薬としても利
用できる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）カブトガニから得られるアメボサイト・ライセー
   トに水不溶性β−グルカン類又はその誘導体及び／又は
   β−結合を有するヘミセルロースとを接触させることを
   特徴とするβ−グルカン類に対する感受性を消失させた
   エンドトキシンに対する特異性の高いアメボサイト・ラ
   イセート。
2. （２）水不溶性β−グルカン類が、リケナン、パキマン
   、ツヤガラン、セルロース、スクレロタンであることを
   特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ライセート。
3. （３）水不溶性β−グルカン類が、キシランであること
   を特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ライセート
   。
4. （４）カブトガニ血リンパ液よりアメボサイトを採取し
   、次いで該アメボサイトを水不溶性β−グルカン類又は
   その誘導体及び／又はβ−結合を有するヘミセルロース
   を含有する懸濁抽出剤で抽出することを特徴とするβ−
   グルカン類に対する感受性を消失させたエンドトキシン
   に対する特異性の高いアメボサイト・ライセートを調製
   する方法。
5. （５）カブトガニ血リンパ液よりアメボサイトを採取し
   、次いで該アメボサイトを抽出剤で抽出することにより
   得たアメボサイト・ライセートに、水不溶性β−グルカ
   ン類又はその誘導体及び／又はβ−結合を有するヘミセ
   ルロースを添加することを特徴とするβ−グルカン類に
   対する感受性を消失させたエンドトキシンに対する特異
   性の高いアメボサイト・ライセートを鋼製する方法。