CN1328584C - 抗干扰鲎试剂的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属一种抗干扰鲎试剂的制备工艺，包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤，其特征在于后续步骤为：A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品。B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原。C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成100mg/ml的溶液，取若干P型抗干扰鲎试剂半成品，加入若干配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.2%。旋涡混合30分钟，-18℃过夜，再旋涡混合30分钟，加入1%～10%增活剂，使其灵敏度达到0.5～0.03EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-40℃左右冻干，在25℃以下封口或压盖制成品。

Description

抗干扰鲎试剂的制备工艺
技术领域
本发明属一种抗干扰鲎试剂的制备工艺。
背景技术
鲎试剂自我国1982年研制成功，在制药行业应用21年，但开始只应用于对鲎试验没有干扰的注射剂(主要五种大输液)。二000年版中国药典增加了167个品种都必须用鲎试剂检测其热原的药品，其中包括化学药品、生物制品、抗生素类，这些药品对鲎实验都有不同程度干扰作用。据国外报道，当检测样品含干扰物质时，多采用稀释法，但是有的药品(如多醣类)用稀释法也达不到目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型抗干扰鲎试剂，用于检测对普通鲎试剂有干扰的检品。在试验时有的用于减少被检的药品稀释倍数，有的用于稀释法不能消除干扰的药品检测。
本发明抗干扰鲎试剂的制备工艺包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤，其特征在于后续步骤为：
A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品即：采用亲和层析法，利用凝胶Dextransulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层析柱以及收集分离成份的设备，将鲎血细胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原等成份分别分离出来。弃去G因子和抗内毒素因子，收集其余成份即为P型抗干扰鲎试剂半成品。
B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原。
C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成80～150mg/ml的溶液，取若干P型抗干扰鲎试剂半成品，加入若干配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.1～0.5％。旋涡混合20～40分钟，以-15℃存放24小时以上，再旋涡混合20～40分钟，加入1～10％若干增活剂，使其灵敏度达到0.5～0.03EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-40℃以下冻干，在25℃以下封口或压盖制成品。
后续步骤B采用的专门除热原凝胶，为日本Daicel化学工业株式会社生产的Pyrodel-c。
所述的增活剂包括：0.1N的Na2SO4、KCl、NaF、MgCl2、CaCl2、KBr、SrCl2，0.2N PH7.5 Tris-HCl。
本发明采用国际上先进的亲和层析法，弃去G因子和抗内毒素因子，添加脂肪族二元醇类以保护鲎试剂中丝氨酸蛋白的Domain部分，使抗生素的甲基基团无法干扰丝氨酸蛋白活性化水解反应的原理，研制出P型抗干扰鲎试剂。与特异性鲎试剂阻断旁路原理不同，亦克服传统鲎试剂无抗干扰能力的缺点。该产品具有下述显著优点：
1本发明生产出的P型抗干扰鲎试剂，可用于原鲎试剂所无法检测或检测有困难的抗生素药品等，可实现对最广泛使用的药品——抗生素进行快速、灵敏、简便、经济的鲎试剂测试。因此，扩大了鲎试剂应用范围，对保障人民生命财产安全的意义更为重大。能适应我国与国际接轨和2000年及2005年药典扩大鲎试剂应用范围需求。不仅有利于促进我国抗生素药品出口，而且本产品自身也有出口优势。
2本发明产品生产工艺采用先进蛋白质提取新工艺-亲和层析法，摒除传统的氯仿提取技术，大大提高了收得率，故能节约鲎血原料，降低生产成本，从而有效地保护了世界上有限的鲎资源，并能够增加利税多创效益为各制药厂节省资金，提高企业经济效益。
附图说明
图1是亲和层析图，A峰：凝固酶原，B峰：凝固原，C、D峰：C因子、B因子，E峰：抗内毒素因子，F峰：G因子。
具体实施方式
实施例1工艺步骤包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤。其后续步骤：
A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品即：采用亲和层析法，利用凝胶Dextransulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层析柱以及收集分离成份的设备，将鲎血细胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原等成份分别分离出来。弃去G因子和抗内毒素因子，收集其余成份即为P型抗干扰鲎试剂半成品。
B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原。
C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成80mg/ml的溶液，取若干P型抗干扰鲎试剂半成品，加入若干配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.1％。旋涡混合20分钟，以-15℃存放24小时以上，再旋涡混合20分钟，加入1％增活剂，使其灵敏度达到0.5EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-40℃以下冻干，在25℃以下封口或压盖制成品。
实施例2工艺步骤包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤。后续步骤为
A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品即：采用亲和层析法，利用凝胶Dextransulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层析柱以及收集分离成份的设备，将鲎血细胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原等成份分别分离出来。弃去G因子和抗内毒素因子，收集其余成份即为P型抗干扰鲎试剂半成品。
B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原。
C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成100mg/ml的溶液，取若干P型抗干扰鲎试剂半成品，加入若干配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.2％。旋涡混合30分钟，以-18℃存放24小时以上，再旋涡混合30分钟，加入3％增活剂，使其灵敏度达到0.06EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-50℃以下冻干，在30℃以下封口或压盖制成品。
实施例3工艺步骤包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤。其后续步骤：
A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品即：采用亲和层析法，利用凝胶Dextransulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层析柱以及收集分离成份的设备，将鲎血细胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原等成份分别分离出来。弃去G因子和抗内毒素因子，收集其余成份即为P型抗干扰鲎试剂半成品。
B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原。
C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成150mg/ml的溶液，取若干P型抗干扰鲎试剂半成品，加入若干配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.5％。旋涡混合40分钟，以-21℃存放24小时以上，再旋涡混合40分钟，加入8％增活剂，使其灵敏度达到0.03EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-60℃以下冻干，在35℃以下封口或压盖制成品。

Claims (4)

1.一种抗干扰鲎试剂的制备工艺，包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤，其特征在于后续步骤为：
A.制取P型抗干扰鲎试剂半成品即：采用亲和层析法，利用凝胶Dextransulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层分柱以及收集分离成分的设备，将鲎血细胞中各因子：C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原成分分别分离出来，弃去G因子和抗内毒素因子，收集其余成分即为P型抗干扰鲎试剂半成品；
B.为脂肪族二元醇类去除热原：即采用专门除热原凝胶，过柱洗脱除去脂肪族二元醇类的热原；
C.将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成80～150mg/ml的溶液，
取P型抗干扰鲎试剂半成品，加入配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.1～0.5％，旋涡混合20～40分钟，以-15℃存放24小时以上，再旋涡混合20～40分钟，加入1～10％增活剂，使其灵敏度达到0.5～0.03EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-40℃以下冻干，在25℃以下封口或压盖制成品。
2.根据权利要求1所述的抗干扰鲎试剂的制备工艺，其特征在于：所述的后续步骤B采用的专门除热原凝胶，为日本Daicel化学工业株式会社生产的Pyrodel-c。
3.根据权利要求1所述的抗干扰鲎试剂的制备工艺，其特征在于：所述的后续步骤C的最佳配比步骤为，将制备好的脂肪族二元醇类用无热原水溶解配成100mg/ml的溶液，取若干抗干扰鲎试剂半成品，加入配好的脂肪族二元醇类，使其脂肪族二元醇类含量为0.2％，旋涡混合30分钟，以-18℃存放24小时以上，再旋涡混合30分钟，加入3％增活剂，使其灵敏度达到0.06EU/ml，将其分装到安瓿或西林瓶中后，放入冷冻干燥机-50℃以下冻干，在30℃以下封口或压盖制成品。
4.根据权利要求1、2或3所述的抗干扰鲎试剂的制备工艺，其特征在于：所述的增活剂包括：0.1N的Na2SO4、KCl、NaF、MgCl2、CaCl2、KBr、SrCl2以及0.2N，PH7.5的Tris-HCl中的一种或几种。
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