JPH02193072A - パイロジェン定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はパイロツエン定量方法、さらに詳しくは、定電
阻害物質等の存在により従来定量が困難であった検体に
も適用できる定量感度の優れたパイロジエンの定量方法
に関する。

従来の技術及び課題 パイロジエン（発熱物質）は極微量で恒温動物の体温を
異常に上昇させる物質であり、例えば、静脈注射等の薬
剤に混入して人体に入ると、薬剤の主作用とは別に強い
発熱を惹き起こし、過度にこの作用が起こると悪寒戦慄
を伴う発熱や、時にはショック死に至ると言われている
。パイロジエンとしては、細菌性物質、炎症性物質、植
物多糖体又は血液型物質等が知られており、これらの中
で最も発熱に関与する物質は細菌性のもので、細菌毒素
と称されている。細菌毒素は、一般に、外毒素（Ｅｘ（
＋ｔｏｘｉｎ）及び内毒素（Ｅ　ｎｄｏｔｏｘ　ｉｎ）
に大別され、このうち、ダラム陰性菌の細胞壁リン脂質
多糖体（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：　Ｌ
　Ｐ　Ｓ　）を主とするいわゆる０抗原としての内毒素
が最も発熱性が強力であるとされている。

従って、パイロジエンの検出、定量は、例えば、薬剤製
造におけるパイロジエンの混入防止等から非常に重要で
ある。

従来、パイロジエンの検出、定量方法としては、ウサギ
を用いた発熱試験やカブトガニ血球抽出物を用いたリム
ルステスト等が知られているが、感度、簡便さ、定量性
等の観点からリムルステストがよく用いられている。

しかしながら、リムルステストは定員時に共存する種々
の物質により阻害や活性化を受け、複雑な前処理を必要
としたり、検体によっては定量が困難な場合がある。又
、パイロジエン以外にもリムルステストで陽性を示す物
質があり、正確な定量を妨げる場合がある。これを解消
するために、高度に精製した試薬の使用が提案されてい
るが、試薬が非常に高価になる問題がある。更に、溶解
度の低い物質に微量含まれるパイロジエンの定量は困難
とされている。

近年、パイロジエンの１種である内毒素の検出に、酸処
理によりパイロジエンフリーとした活性炭を検体と接触
させ、この活性炭をリムルス・ライセードと反応させて
簡便、迅速にリムルステストを行なう方法が提案されて
いる（特開昭５６−１５２４２５号）。しかしながら、
この方法はパイロジエンに対する特異性、感度、定量性
の点で十分なものとはいいがたい。又、米国特許第４４
９１６６０号には、内毒素を吸着するある種のポリマー
が内毒素の濃縮と検出に利用できることが開示されてい
る。しかしながら、このポリマーもパイロジエンに対す
る特異性、感度、定量性の点で十分なものとはいいがた
い。

本発明者らは、先に、含窒素複素環式化合物が水不溶性
担体に直接またはスペーサーを介して結合してなる吸着
体がパイロジエンを特異的に吸着することを見出し、特
許出願した（特開昭５７−１８３７１２号）。その後、
更に研究を重ねる間に、この吸着体を用いることにより
、リムルステストによるパイロジエンの定量を簡便に、
かつ、阻害物質や他のリムルステスト陽性物質の存在下
でも特異的に、非常に高感度で行なえることを知り、本
発明を完成するに至った。

課題を解決するための手段 本発明は、含窒素複素環式化合物が水不溶性担体に直接
又はスペーサーを介して結合してなる吸着体に検体を接
触させ、次いで吸着体に吸着したパイロジエンをそのま
ま、或いは溶出させた後、リムルス法で定量することを
特徴とするパイロジエンの定量方法を提供するものであ
る。

本発明に用いる吸着体は本発明者らの特開昭５７−１８
３７１２号に開示されるものでよく、このような吸着体
としては、例えば、含窒素複素環式化合物が、一般式： Ｒ−Ａ−Ｘ　　　　　［１］ （式中、Ｒは異種原子として窒素原子を持つ複素環式基
を表し、Ａは単結合手、アルキレン基又はアルケニレン
基を表し、ＸはＡが単結合手のときは水素原子又は官能
基を表し、Ａがアルキレン基又はアルケニレン基のとき
は官能基を表し、該複素環式基及びアルキレン基は置換
基を有していてもよい。） で示される化合物であり；水不溶性担体が水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基又はハロゲン原子を有する水不溶
性担体であり；スペーサーが、式二Ｎ　Ｈ２（ＣＨｔ）
ｎＮ　Ｈｔ Ｎ　Ｈ！（ＣＨｔ）ｎＣＯＯＨ Ｎ　Ｈｔ（ｃ　Ｈｔ）ｎｏ　Ｈ及び ＨＯＯＣ（ＣＨｔ）ｎｃＯＯＨ （各式中、ｎは１−１２の整数を表す。）で示される化
合物等である吸着体が挙げられる。

ここで、含窒素複素環式化合物［１１の例としては、例
えば、記号Ｒがイミダゾール骨格、ピラゾール骨格、ピ
リミジン骨格、ピリダジン骨格、ピラジン骨格、プリン
骨格、アクリジン骨格、トリアゾール骨格、オキサジア
ゾール骨格、テトラゾール骨格、インダゾール骨格、ベ
ンゾトリアゾール骨格、ベンゾピリダジン骨格、ベンゾ
ピリミジン骨格、ベンゾピラジン骨格、ナフチリジン骨
格などを有する含窒素複素環式基であり、記号Ａが単結
合手であって、記号Ｘが水素原子又はアミノ基、水酸基
又はカルボキシ基等の官能基であるか、あるいは記号Ａ
がメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基
、ヘキシレン基、オクチレン基、デカメチレン基、ドデ
カメチレン基のごとき炭素数１〜１２のアルキレン基で
あるか、又はビニレン基、プロペニレン基、ブテニレン
基、ヘキセニレン基、オクテニレン基のごとき炭素数２
〜１２のアルケニレン基であって、Ｘがアミノ基、水酸
基又はカルボキシル基などの官能基である化合物が挙げ
られる。なお、記号Ｒで示される含窒素複素環式基及び
記号Ａで示されるアルキレン基には置換基（例えば、カ
ルボキシル基、オキソ基、アルキル基、水酸基、アミノ
基、アルクキシ基）を有していてもよい。上記のごとき
含窒素複素環式化合物のうち好ましい例としては、一般
式［Ｔ］において記号Ｒがイミダゾール骨格、ピリミジ
ン骨格、プリン骨格又はアクリジン骨格を有する含窒素
複素環式基であり、Ａが単結合手、エチレン基、カルボ
キシル置換エチレン基であり、Ｘがアミノ基、カルボキ
シル基又は水酸基である化合物か挙げられる。

一方、本発明で使用される水不溶性担体としては、前記
一般式［１］で示される含窒素複素環式化合物を直接又
は間隔子（スペーサー）を介して結合しうるちのであれ
ばいずれでもよい。かかる水不溶性担体の代表的な例と
しては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基又はハロゲ
ン原子を有する水不溶性担体が挙げられる。これらのう
ち、水酸基を有する水不溶性担体としては、例えば、セ
ルロース、アガロース、架橋デキストランなどの多糖類
あるいはヒドロキシアルキル化ポリスチレン樹脂（例え
ば、ヒドロキシアルキル化されたスチレン・ジビニルベ
ンゼン共重合体）、ポリビニルアルコールなどが好適に
挙げられる。アミノ基を有する水不溶性担体としては、
例えば、アミノアルキル化多糖１ｆＲ（例えば、アミノ
エチルセルロース、アミノヘキシルセルロースのごとき
アミノアルキル化セルロース、アミノへキシルアガロー
スのごときアミノアルキル化アガロース、ｐ−アミノベ
ンジル化多糖類（例えば、ｐ−アミノベンジルセルロー
ス、ｐ−アミノベンジルアガロース）、キトサン、アミ
ノアルキル化ポリスチレン樹脂（例えば、アミノアルキ
ル化されたスチレン・ジビニルベンゼン共重合体）、ポ
リアクリルアミド、アミノアルキル化ポリアクリルアミ
ド（例えば、アミノエチルポリアクリルアミド）、アミ
ノアルキル化多孔性ガラス（例えば、アミノプロピル多
孔性ガラス）などが挙げられる。また、カルボキシ基を
有する水不溶性担体としては、例えば、カルボキシアル
キル化多糖類（例えば、カルボキシへキシルアガロース
、カルボキシペンチルアガロースのごときカルボキシア
ルキル化アガロース、カルボキシメチルセルロースのご
ときカルボキシアルキル化セルロース、カルボキシメチ
ル架橋デキストランのごときカルボキシアルキル化架橋
デキストラン）、カルボキシアルキル化ポリアクリルア
ミド（例えば、カルボキシメチルポリアクリルアミド）
、カルボン酸樹脂（例えば、アクリル酸、ジビニルベン
ゼン共重合体）などが挙げられる。更に、ハロゲン原子
を有する水不溶性担体としては、例えば、ハロゲノアル
キルポリスチレン樹脂（例えば、クロロメチル化された
スチレン・ジビニルベンゼン共重合体）などが挙げられ
る。

本発明に用いる吸着体のうち好ましいものとしては、例
えば、前記のごとき含窒素複素環式化合物［１コのうち
ヒスチジン、ヒスタミン、ウロカニン酸、ウラシル、オ
ロチン酸、シトシン、５−メチルシトシン、２−アミノ
−４，６−ジメチルピリミジン、２−アミノ−４−ヒド
ロキシ−６−メチルピリミジン、アデニン又は６．９−
ジアミノ−２−エトキシアクリジンと水不溶性多糖類と
をモノエポキシド（例えば、エビクロロヒドリン）及び
脂肪族ジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）の
うち少なくともいずれか一方を用いる方法によりスペー
サーとしてアルキレンジアミンを介して結合せしめた吸
着体が挙げられる。

本発明で用いる吸着体はパイロジエンのみを特異的に吸
着する性質を有している。かくして、本発明の方法は、
該吸着体を検体と接触させ、検体中のパイロジエンを吸
着体に吸着させ、この吸着体を洗浄し、パイロジエン以
外の物質を除去した後、そのまま、あるいは吸着されＩ
こパイロジエンを溶出し、公知のリムルステストに付し
てパイロジエンを定ｌすることにより実施できる。

本発明方法において、対象とする検体は溶液状態で使用
する必要があり、例えば、含水溶液あるいは水溶液の状
態、とりわけ水溶液の状態であるのが好ましい。更に、
本発明の方法は、用いる吸着体がリムルステストの定量
阻害物質、例えば、Ｌ−システィン等のアミノ酸、ペニ
シリンＧ等の抗生物質、尿素等の蛋白質変性剤、ジイソ
プロピルフルオロリン酸等のセリンプロテアーゼ阻害剤
、グルコース等の糖類、糖アルコール、ストレプトマイ
シン等の抗生物質、塩化ナトリウム、リンゲル液等や、
パイロジエン以外のリムルステスト陽性物質、例えば、
デキストラン等の多糖類、（ｌ−３）−β−Ｄ−グルカ
ン等を吸着しないため、従来定量が困難であったこれら
の物質を含む検体についても適用できる。

パイロジエンの吸着操作は、例えば、容器中で吸着体と
検体を混合、撹拌して接触させるか、あるいは吸着体を
充填し１こカラムに検体を通液さ什ることにより行なう
ことができる。吸着操作条件は、個々の検体に応じて適
宜選択できるが、通常、検体１ｏ２当り、３〜１００ｊ
１９、好ましくは７〜４０Ｒ９の吸着体を用い、４〜４
０℃でｐＩ−Ｉ４〜８、好ましくは６〜７、イオン強度
０．１以下、好ましくは０−０．０５でパイロジエンが
特異的に、効率よく吸着される。この条件下、約３０分
間以上吸着操作を行なうことにより、検体中のパイロジ
エンはほぼ完全に吸着体に吸着され、吸着体上で濃縮さ
れた形となる。又、−度吸着させた後、再吸着させるこ
ともでき、これにより、測定感度を上昇させることがで
きる。

パイロジエンを吸着した吸着体は遠心分離等の常法に従
って検体と分離し、パイロジエンフリーの水、緩衝液等
でよく洗浄し、パイロジエン以外の物質を除去する。

本発明においては、洗浄した吸着体をそのままリムルス
テストに付してもよく、あるいは、常法により、０．０
４Ｍ塩化マグネシウムを含む０．４Ｍトリス−塩酸緩衝
ｅＬ（ｐＨ８，０）等で吸着されＩコパイロジェンを溶
出し、その溶出液を公知のリムルステストに付してもよ
い。

リムルステストは、一般に、合成基質法とゲル化法に大
別され、又、合成基質法は用いる基質の種類により比色
法と蛍光法に区別される。本発明においては、これらい
ずれの方法も採用できる。

具体的には、例えば、パイロジエンを吸着した吸着体又
はその溶出液を２５〜４０℃、通常、３７℃にて１０〜
１２０分間リムルス・ライセードと反応させ、ゲル化に
よる反応液の濁度を経時的に測定し、別途、標準品（例
えば、ＬＰＳ）を用いて同様に操作して作成した検量線
に基づいて検体中のパイロジエン濃度を算出することが
できる。別法として、パイロジエンを吸着した吸着体又
はその溶出液を、同様な条件下、リムルス・ライセード
及び発色団又は蛍光団を有する合成基質と反応させ、反
応停止後、比色又は蛍光測定を行ない、別途、同様にし
て作成した検量線から検体中のバイロンエンａ変を算出
することができる。比色による場合は、例えば、式：　
Ｂｏｃ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｒｇ−ｐＮＡ（式
中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ｐＮＡ
はｐ−ニトロアニリンを表わす。）で示される合成基質
を用い、波長４０５ｎｍで測定することにより定量でき
る。蛍光測定による場合は、例えば、式：　Ｂｏａ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（式中、Ｂｏｃは前記と
同一意味を有し、ＭＣＡは７−アミノ−４−メチルクマ
リンを表わす。）で示される合成基質を用い、励起波長
３ＢＯｒ＋ｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定することによ
り定量できる。

なお、本発明において使用する吸着体は、例えば、特開
昭５７−１８３７１２号に記載された方法に従って製造
することができる。

Ｘ寒皿 次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ （検量線の検討） パイロジエンフリーの水３ｍＱに所定量のＬＰＳ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ　　ＯＩ　２８：Ｂ　Ｉ　２．ＬＰＳ）を添
加、混合し、ＬＰＳ水溶液を調製（ＬＰＳ濃変；０．１
．２又は３　ｐｇ／　ｍＱ＞　した。これに後記参考例
１で調製した吸着体３Ｑｕ（湿重量）を加え、５０　ｒ
、ｐ、ｎ＋にて室温で１時間撹拌した。次いで、３００
０ｒ、２口、にて５分間遠心分離し、沈澱した吸着体を
パイロジエンフリーの水３ｘＱでよく洗浄した。　この
沈澱に基質溶液である０　、　４　ｍＭ　　Ｂｏｃ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ水溶液５０μｇ及
びリムルス・アメボサイト・ライセード［リムルス・ン
ングルテスト・ワコー（和光純薬社製）ｌバイアル（０
゜２１Ｑ用、感度・ＦＤＡレファレンスエンドトキシン
ＥＣ−２ａ度がＯ、！　ｒ＋ｇ／ｍＱでゲル化する）を
００４Ｍ塩化マグネシウムを含む０．４Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）１．５ａ＋Ｃに溶解して調製］５０
μＱを加え、３７℃で３０分間反応さ仕た。

反応後、１２．５％酢酸水溶液２　、３　ｖＱを加えて
反応を停止させ、３０００　ｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心
分離し、励起波長３８０ｒ＋ｍ及び蛍光波長４６０＋＋
ａ＋で蛍光測定を行なった。測定結果を第１表に示す。

また、縦軸を蛍光測定における相対強Ｋ（Ｒ１）、横軸
をＬＰＳｉ度とするグラフにプロットすると、添付の第
１図に示すごとく、ＬＰＳ濃度が低い領域でも良好な直
線性を示す検塁線が得られた。

実施例２ （本発明方法の定量値の再現性） パイロジエンフリーの水３村をそのまま、又は所定量の
ＬＰＳ（Ｅ、ｃｏｌｉ　　０１２８：ＢＩ２由来のＬＰ
Ｓ）を添加、混合し、Ｏｐｇ／ｙ（ｌ又は２　ｐｇ／ｌ
の濃度のＬＰＳ水溶液とした。これらの溶液それぞれに
前記実施例１と同様に後記参考例１で調製され１こ吸着
体３０１９を用いてＬＰＳの定Ｉｔ（蛍光測定における
相対強度Ｒ１の測定）を行った。

上記ＬＰＳ定量を各濃度の溶液につき４回ずつ行つ１こ
結果を第２表に示す。

第２表 上記第２表から明らかなとおり、ＬＰＳの種類及び含有
量が一定のとき、定量値（蛍光測定における相対強度、
ＲＩ）も一定の値を示し、本発明方法は再現性が高いこ
とがわかる。

実施例３ （種々のパイロジエンに対する本発明方法の適合性） 種々のパイロジエン（ＬＰＳ）に対する本発明方法の適
合性について次のようにして検討した。

（＋）本発明方法によるＬＰＳの定量 パイロツエンフリーの水３ｊ！（をそのまま、又は下記
第３表に記載の各種微生物由来のＬＰＳを添加し、１．
２５〜６　ｐｇ／パＱの濃度のＬＰＧ水溶液とした。こ
れらの溶液のそれぞれに後記参考例１で調製した吸着体
３０＊ｙを用いて前記実施例１と同様にしてＬＰＳの定
量を行った。各検体溶液のＬＰＳ定量値をもとに、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　　Ｏ１２８：Ｂ１２由来のＬＰＳ（ｌ　０
．４ＥＩＪ／ｎｇＳＥＵはエンドトキシン・ユニットを
表す）を標準エンドトキシンとして各種ＬＰＳのエンド
トキシン・ユニットを求めた。

（２）蛍光合成基質を用いるリムルス法によるＬＰＧの
定ｉｌ（対照方法） ２．５〜６　ｐｇ／村の濃度の各種ＬＰＳ溶液１００μ
Ｑに実施例１で用いた基質溶液５０μｇとリムルス・ア
メボサイト・ライセード５０μｇを加え、３７℃で６５
分間反応させた。１２．５％酢酸２゜３ｘＱを加えて反
応を停止させた後、実施例１と同様に蛍光測定における
相対強度を求めＬＰＳの定量を行っ几ゎ前記（１）と同
様にＥ　　ｃｏｌｉ　　０１２８：Ｂ１２由来のＬＰＳ
を標準エンドトキシンとして各種ＬＰＳのエンドトキシ
ン・ユニットを求めに、結果を下記第３表に示す。

第３表 上記第３表かみ明らかなとおり、本発明方法は公知の蛍
光合成基質を用いるリムルス法と同様、種々のＬＰＳの
定量に適用しうるちのである。

実施例４ （フェニルアラニン水溶液中のパイロジエンの測定） ２％フェニルアラニン水溶液３０ｉ（：に後記参考例１
で調製した吸着体５００！！９（湿重量）を加え、５０
　ｒ、ｐ、ｓ＋、にて室温で４時間撹拌し、次いで吸着
体を除去し、パイロジエンを除去したフェニルアラニン
水溶液を調製した。

このフェニルアラニン水溶液にｌｐｇ／ｉｇ及び２ｐｇ
／　ｘ（ｌの濃度になるようにＬＰＳ（Ｅ　　ｃｏｌｉ
　　０１２８：Ｂ１２由来のＬＰＳ）を添加、混合し、
ＬＰＳ水溶液を調製した。これに後記参考例１で調製し
た吸着体３０ｉ９（湿重量）を加え、５０　ｒ、ｐ、ｍ
。

にて室温で１時間撹拌した。次いで、３０００ｒｐ、ｔ
にて５分間遠心分離し、沈澱した吸着体をパイロジエン
フリーのｐＨ７，０，μ＝０．０２のリン酸緩衝液３ｘ
Ｑで洗浄した。この沈澱に基質溶液である０、４＋ｍＭ
　　Ｂｏａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ水溶液５
０μＱ及びリムルス・アメボサイト・ライセード［リム
ルス・シングルテスト・ワコー（和光純薬社製）！バイ
フル（０，２ｉ＆用、感度：ＰＤＡレファレンスエンド
トキシンＥＣ−２１度が０゜１ｎｇ／ｘＱでゲル化する
）を０．０４Ｍ塩化マグネンウムを含む０．４Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８、０）１．５ｇ＋５に溶解して調
製］５０μＱを加え、３７℃で３０分間反応させた。反
応後、１２，５％酢酸水溶液２　、３　ｘ（ｌを加えて
反応を停止させ、３０００　ｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心
分離し、励起波長３８０ｎｍおよび蛍光波長４６０ｎｍ
で蛍光測定を行い、その相対強度から検量線法によりパ
イロジエン濃度を求めた。結果を第４表に示す。

第４表 ）酸のＬＰＳが定量でき、感度が著しく上昇する。

実施例５ （メチオニン水溶液中のパイロジエンの測定）５％メチ
オニン水溶液３０ｘＱに後記参考例！で調製した吸着体
５００ｏ（湿重量）を加え、５０ｒ。

ｐ、ｍ、にて室温で４時間撹拌し１、次いで吸着体を除
去し、パイロジエンを除去したメチオニン水溶液を調製
した。

前記実施例４と同様に、ＬＰＳを添加し、定量を行なっ
た。結果を第５表に示す。

第５表 従来、この種のＬＰＳのリムルステストによる測定限界
は０．５％フェニルアラニン水溶液中、１　ｐｇ／ＭＱ
の濃度、即ち、２００　ｐｇ／ｇアミノ酸であった。こ
れに対し、第４表から明らかなごとく、本発明の方法に
よれば、２％フェニルアラニン水溶液中、１　ｐｇ／肩
ｇの濃度、即ち、５０ｐｇ／９アミ従来、メチオニン水
溶液の場合、ＬＰＳの測定限界は１１００ｐ／ｙアミノ
酸であったが、第５表から明らかなごとく、本発明の方
法によれば５％メチオニン水溶液中ｌｐｇ／ｊ１１２、
すなわち、２０ｐｇ／９アミノ酸のＬＰＳが定量でき、
感度か著しく上昇する。

実施例６ （システィン塩酸塩水溶液中のパイロジエンの測定） ０．２５％システィン塩酸塩水溶液を水酸化ナトリウム
でｐＨ６，１に調製し、これにＬＰＳを添加し、各々、
１　ｐｇ／村及び２　ｐｇ／村の濃度のＬＰＳを含有す
るシスティン塩酸塩水溶液を調製した。

実施例４と同様に、後記参考例１で調製した吸着体を用
いＬＰＳの定量を行なうｔコ。なお、唾着体の洗浄はパ
イロジエンフリーの水３１を用いた。

結果を第６表に示す。

第６表 従来、システィン塩酸塩水溶液の場合、ＬＰＳの測定限
界は１０００〜２０００ｙｇ／９アミノ酸であったが、
第６表から明らかなごとく、本発明の方法によれば、０
．２５％システィン塩酸塩水溶液中１　ｐｇ／屑Ｑ１す
なわち、４００ｙｇ／ｙアミノ酸のＬＰＳが定量でき、
感度が著しく上昇する。

実施例７ （ペニシリンＧ水溶液中のパイロジエンの測定）１％の
ペニシリンＧ水溶液３０ｘＱに後記参考例１で調製した
吸着体１ｇ（湿重量）を加え、５０ｒ。

ｐ、ｍ、にて室温で４時間撹拌し、吸着体を除去し、パ
イロジエンを除去したペニシリンＧ水溶液を得た。

これに所定量のＬＰＳを加え、後記参考例１で調製した
吸着体を用い、実施例４と同様に定量した。なお、吸着
体の洗浄はパイロジエンフリーの水３友ρを用いた。結
果を第７表に示す。

第７表 従来、ペニシリンＧ水溶液の場合、ＬＰＳの測定限界は
２００ｙｇ／９ペニシリンＧであったが、本発明の方法
によれば、第７表から明らかなごとく、１％ペニシリン
Ｇ水溶液中１　ｐｇ／ｘＱ、すなわち、１００ｙｇ／ｆ
ペニシリンＧのＬＰＳが定量でき、感度が著しく上昇す
る。

実施例８ （本発明の定量操作） パイロジエンフリーの水３酎に所定量のＬＰＳ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ　Ｏ１２８：Ｂ　１２、ＬＰ’Ｓ）を添加・混
合し、ＬＰＳ溶液を調製（ＬＰＳ濃度；０、ｉｏ。

２０ｙｇ／１Ｉ２）した。これに後記参考例１で調製し
た吸着体１００ｎ（湿重Ｉｔ）を加え、５０　ｒ、ｐ、
ｍにて室温で１時間攪拌した。次いで３０００　ｒ、ｐ
、ａ＋にて５分間遠心分離した。沈澱した吸着体にパイ
ロツエンフリーの０．０２Ｍ塩化マグネシウムを含む０
　、２　Ｍ　トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．５
ｙ（ｌを加え攪拌後３０分間放置した。その後、遠心分
離し、上清のＬＰＳｉ１度を蛍光合成基質を用いるリム
ルス法により以下のようにして定量した。

上清をパイロジエンフリー水で連続希釈し、試料溶液と
した。試料溶液１００μｇに基質溶液５０μＱとリムル
ス・アメボサイト・ライセード５０μｇを加え、３７℃
で９０分間反応させた。１２５％酢酸２　、３　ｍＱを
加えて反応を停止させた後、実施例１と同様に蛍光測定
における相対強度を求め、Ｅ、　ｃｏｌｉｏ　１２８：
Ｂ　１２由来のＬＰＳを標準ＬＰＳとしてＬＰＳの定量
を行った。結果を第８表に示す。

第８表 第８表から明らかなとおり、添加したＬＰＳは溶出させ
た上滑にほぼ回収され、吸着体に吸着しｌこＬＰＳを溶
出してから測定することも可能である。

実施例９ （検量線の検討） パイロジエンフリーのｐＨ７，０、μ＝０．０２のリン
酸緩衝液３ｘＱに所定量のＬＰＳ（Ｅ、　ｃｏｌｉ０１
２８：Ｂ１２、ＬＰＳ）を添加混合し、ＬＰＳ溶液を調
製（ＬＰＳｆｉ度：０．５．１０又は１５ｐｇ／蛙）シ
た。これに後記参考例２で調製した吸着体３０１９（湿
重１ｋ）を加え、５０ｒ、ｐ、＋ａにて室温で１時間攪
拌した。次いて３０００　ｒ、Ｐ、Ｉｌｌにて５分間遠
心分離した。沈澱しＬ吸着体に基質溶液である０、４ｍ
ＭＢｏｃ−Ｌｅｊ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、−ＭＣＡ水溶液５
０μａおよびリムルス・アメボサイト・ライセードしリ
ムルス・シングルテスト・ワコー（和光紬薬社製）ｌバ
イフル（０，２ｉＣ用、感度：Ｆ’ＤＡＬ／ファレンス
エンドトキシンＥＣ−２濃度が０．１ｎｇ／＊（ｌでゲ
ル化する）を０．０４Ｍ塩化マグネシウムを含む０．４
Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１．５３１１２に
溶解して調製］５０μｇを加え、３７℃で２０分間反応
させた。反応後、１２．５％酢酸水溶液２　、３　ｘＱ
を加えて反応を停止させ、３０００ｒ、ｐ、ａで５分間
遠心分離し、励起波長３８０　ｎｍ。

蛍光波長４６０ｎｆｆｉで上清の蛍光測定を行った。測
定結果を第９表に示す。

また、縦軸を蛍光測定における相対強度（ＲＩ　）、横
軸をＬＰＳ濃度とするグラフにプロットすると、添付の
第２図に示すごとく良好な直線性を示す検量線が得られ
た。

第９表 第１Ｏ表 実施例１Ｏ （検量線の検討） 後記参考例２で調製した吸着体のかわりに後記参考例３
で調製した吸着体を用いる以外は実施例９と同様にして
反応させ、蛍光測定を行った。測定結果を第１θ表に示
す。

また、縦軸を蛍光測定における相対強度（Ｒ１）、横軸
をＬＰＳ濃度とするグラフにプロットすると添付の第３
図に示すごとく良好な直線性を示す検量線が得られた。

参考例１ （１）セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製の商
品名）３５０９（湿重量）を５００ｘＲの蒸留水に懸濁
し、該懸濁液に２Ｎ水酸化ナトリウム２００１ｇ及びエ
ビクロロヒドリン５０ｘｌ！を加え、４０℃にて２時間
撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残渣を蒸留水
で洗浄することによりエビクロロヒドリン活性化セファ
ロースＣＬ−４Ｂを得る。木兄を予め６０℃に加温した
０、６％へキサメチレンジアミン水溶液１．４１２に懸
濁し、６０℃にて２時間撹拌する。反応終了後、混合物
をろ過し、残渣を蒸留水で洗浄することにより３−（６
−アミノへキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−プロピル
化セファロースＣＬ−４Ｂ３７０９（星型ＩＩ）を得る
。該セファロースのアミノヘキシル基の含量を滴定によ
り求めたところ、３７．６μ５ｏｌｅ／９（湿重量）で
あった。

（２）３−（６−アミノへキシルアミノ）−２−ヒ下ロ
キシーブロピル化セファロースＣＬ−４Ｂ３７０ｇ（湿
重量）を４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液７００ｙＱに懸濁
し、該懸濁液に６５℃にてエビクロロヒドリン７００ｘ
（ｌを加え、撹拌する。温度か９０℃に達した後、更に
８分間撹拌する。反応終了後、混合物に水を加え５０℃
以下に冷却して、ろ過し、残渣を蒸留水で洗浄すること
によりエビクロロヒドリン活性化３−（６−アミノへキ
シルアミノ）−２−ヒドロキシ−プロピル化セファロー
スＣＬ−４Ｂを得る。本島を予め９０℃に加温した２０
％ヒスチジン塩酸塩・水和物の水溶液（水酸化ナトリウ
ム水溶液にてｐＨ１２に調製したもの）２．１１２に懸
濁し、８０〜９０℃で３０分間撹拌する。反応終了後、
該混合物をろ過し、残渣を蒸留水で充分洗浄する。該残
渣を蒸留水１１２に懸濁し、１２０℃で２０分オートク
レーブした後、該混合物をろ過する。残漬を０．２Ｎ塩
酸水溶液、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、１．５Ｎ
塩化ナトリウム水溶液及び蒸留水で充分洗浄する。かく
して、アガロースを担体とし、ヒスチジンをリガンドと
し、ヘキサメチレンジアミンをスペーサー中心とする水
不溶性吸着体３９０９（湿重量）が得られる。該吸着体
のヒスチジン含量は２０．４μｍｏｌｅ／ｆ（湿重量）
吸着体であった。

参考例２ 参考例１においてセファロースＣＬ−４Ｂの代わりにセ
ルロファインＧＣＬ−２０００−＋ｎ（チッソ（株）製
の商品名）３５０９を用いる他は参考例１と同様に処理
する。かくしてセルロースを担体とし、ヒスチジンをリ
ガンドとし、ヘキサメチレンジアミンをスペーサー中心
とする水不溶性吸着体３４０ｙ（星型りが得られる。上
記吸着体のヒスチジン含量は５８μｍｏｌｅ／ｇ（湿重
量）吸着体であった。

参考例３ 参考例１（１）と同様にして調製した３〜（６−アミノ
へキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−プロピル化セファ
ロースＣＬ−４Ｂ　１　Ｂ？（ａ重量）ヲ０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）４５．６ｘｉ２に懸濁し、該
懸濁液に２５％グルタルアルデヒド水溶液１９．２１１
２を加え、室温で２時間攪拌する。反応終了後、混合物
を濾過し、残渣を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で十分洗浄することにより、グルタルアルデヒド活性化
３−（６−アミノヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−
プロピル化セファロースＣＬ−４Ｂを得る。本島を１５
ｍＭヒスタミン−０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
５９．６ｘ１２に懸濁し、室温で２時間攪拌する。反応
終了後、混合物を濾過し、残渣を１Ｍ塩化ナトリウム水
溶液６００ｊ１１２で洗浄する。残渣を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）３０肩ｇに懸濁し、該懸濁液にソ
ジウムボロヒドリド０，３９を加え室温で１時間攪拌す
る。反応終了後、混合物を濾過し、残渣を１Ｍ塩化ナト
リウム水溶液および蒸留水で十分洗浄する。かくしてア
ガロースを担体とし、ヒスタミンをリガンドとし、ヘキ
サメチレンジアミンをスペーサー中心とする水不溶性吸
着体２０．７９（星型１１）が得られる。該吸着体のヒ
スタミン含量は４゜１　ａ　ｍｏｌｅ／　Ｉ？（星型Ｉ
ｌ）吸着体であった。

１吸旦舛見 本発明の方法←よれば、リムルステストにおける定量感
度を著しく上昇でき、従来測定が困難とされた阻害物質
を含有する検体でも定量できる。

又、パイロジエン以外のリムルステスト陽性物質が存在
しても分離、足動ができ、その上、リムルス試薬に替わ
る安価な試薬を用いることも可能となり、本発明の方法
は、例えば、薬剤の製造工程におけるチエツク等に適用
するのに好適なパイロジエンの定量法となる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、各々、本発明の定量法に用いる検量
線の具体例である。 第１図 １．０ ２．０ ＬＰＳＪ、ａ（ｐｇ／ｍ１） ３．０ 第２図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）含窒素複素環式化合物が水不溶性担体に直接又は
   スペーサーを介して結合してなる吸着体に検体を接触さ
   せ、次いで吸着体に吸着したパイロジェンをそのまま、
   或いは溶出させた後、リムルス法で定量することを特徴
   とするパイロジェンの定量方法。
2. （２）ヒスチジン、ヒスタミン、ウロカニン酸、ウラシ
   ル、オロチン酸、シトシン、５−メチルシトシン、２−
   アミノ−４，６−ジメチルピリミジン、アデニン又は６
   ，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジンと水不溶性多
   糖類とがスペーサーを介して結合してなる吸着体を用い
   る請求項（１）記載の定量方法。
3. （３）含水溶液状又は水溶液状の検体を使用する請求項
   （１）記載の定量方法。