DE68915214T2 - Methode zur Bestimmung des Pyrogengehaltes. - Google Patents

Methode zur Bestimmung des Pyrogengehaltes.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Pyrogengehaltbestimmung, das sich sogar auf ein Spezimen anwenden läßt, welches bisher nur schwierig zu bestimmen war, und zwar wegen des Vorhandenseins von die Bestimmung störenden Substanzen und dgl..
  • Pyrogene sind pyrogenetische Substanzen, die die Körpertemperatur eines homothermen Lebewesens bereits in einer sehr kleinen Menge abnorm erhöhen. Wird ein Pyrogen in den menschlichen Körper eingeführt, z.B. durch intravenöse Injektion einer Arznei, die damit kontaminiert ist, verursacht das Pyrogen starkes Fieber, getrennt von der Hauptwirkung der Arznei. Wenn diese Wirkung eines Pyrogens sich verschlimmert, soll es starkes Fieber hervorrufen, zusammen mit Schüttelfrost und gegebenenfalls Tod durch Schock. Viele Substanzen wie bakterielle Substanzen, entzündende Substanzen, Pflanzen-Polysaccharide, Blutgruppensubstanzen und dgl. sind als Pyrogene bekannt geworden. Unter diesen üben den wichtigsten Einfluß auf das Fieber bakterielle Substanzen aus, die als bakterielle Toxine bezeichnet werden. Im allgemeinen werden bakterielle Toxine in Exotoxine und Endotoxine eingeteilt. Insbesondere soll ein Endotoxin, das als sogenanntes O-Antigen wirkt, dessen Hauptkomponente ein Zellwand-Lipopolysaccharid (nachfolgend bezeichnet mit LPS) eines Gram-negativen Bakteriums ist, die stärkste Pyrogenizität aufweisen.
  • Demzufolge ist es sehr wichtig, den Pyrogengehalt nachzuweisen oder zu bestimmen, um beispielsweise die Kontamination mit einem Pyrogen bei der Herstellung von Medikamenten zu verhindern.
  • Als Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung des Pyrogengehalts sind bisher z.B. ein Fiebertest unter Heranziehen von Kaninchen oder der Limulus-Test bekannt, wobei ein Blutzellen-Extrakt von Limulus polyphenus verwendet wird. Insbesondere ist aus Gründen der Empfindlichkeit, Einfachheit, der quantitativen Eigenschaften und dgl. der Limulus-Test oft angewandt worden.
  • Allerdings wird der Limulus-Test durch verschiedene bei der Bestimmung vorhandene Substanzen gestört oder aktiviert, daher sind komplizierte Vorbehandlungsstufen erforderlich, oder es wird manchmal schwierig, den Pyrogengehalt zu ermitteln, abhängig vom Spezimen. Ferner gibt es einige Substanzen, die sich von Pyrogenen unterscheiden, welche auf den Limulus-Test positiv wirken, und sie stören eine präzise Bestimmung des Pyrogengehalts. Zur Lösung dieses Problems ist vorgeschlagen worden, hochgereinigte Reagentien zu verwenden. Solche Reagentien sind jedoch sehr teuer. Ferner ist davon auszugehen, daß es schwierig ist, eine sehr kleine Menge von Pyrogenen zu bestimmen, die in einer Substanz mit niedriger Löslichkeit enthalten sind.
  • Kürzlich ist zum Nachweis eines Endotoxins, das eines der Pyrogene darstellt, ein Verfahren vorgeschlagen worden, wobei man eine pyrogenfreie Aktivkohle, erhalten durch Säurebehandlung, in Kontakt mit einem Spezimen bringt und die Aktivkohle mit Limulus-Lysat reagieren läßt, um den Limulus- Test leicht und schnell durchzuführen (JP-OS 152425/1981). Jedoch ist dieses Verfahren hinsichtlich Spezifität, Empfindlichkeit und quantitativer Eigenschaften für Pyrogene immer noch unbefriedigend. Ferner wird in US 3 944 391 und 4 491 660 offenbart, daß ein bestimmtes Polvmer, das ein Endotoxin zu adsorbieren vermag, zum Konzentrieren und Nachweis des Endotoxins verwendet werden kann. Jedoch ist auch dieses Polymer immer noch unbefriedigend hinsichtlich Spezifität, Empfindlichkeit und quantitativer Eigenschaften für Pyrogene.
  • Die hier auftretenden Erfinder haben bereits herausgefunden, daß Pyrogene durch ein Adsorbens spezifisch adsorbiert werden, das eine Stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung enthält, die an einen wasserunlöslichen Träger direkt oder über einen Spacer gebunden ist, und sie haben die Patentanmeldung GB-A 2092470 eingereicht. Sie haben dann weitere Untersuchungen durchgeführt und haben herausgefunden, daß sich bei Verwendung von ein wenig eines solchen Adsorbens der Pyrogengehalt mit dem Limulus-Test in hoher Spezifität und Empfindlichkeit ermitteln läßt, sogar in der Gegenwart verschiedener störender Substanzen oder weiterer Limulus-Test positiver Substanzen.
  • Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts durch einen Limulus-Test zur Verfügung zu stellen.
  • Dieser Gegenstand sowie weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Durchschnittsfachmann aus der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen erkennbar.
  • Fig. 1 bis 3 stellen Beispiele von Eichkurven dar, die jeweils im Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung herangezogen werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts bereitgestellt, wobei man ein Spezimen in Kontakt mit einem Adsorbens bringt, das aus einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Verbindung zusammengesetzt ist, die an einen wasserunlöslichen Träger über einen Spacer gebunden ist, und wobei man ohne Eluierung des am Adsorbens adsorbierten Pyrogens den Pyrogengehalt des adsorbierten Pyrogens mit der Limulus-Methode bestimmt, worin die genannte stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung Verbindung (I) der Formel ist:
  • R-A-X (I)
  • worin R eine stickstoffhaltige heterozyklische Gruppe mit einem Imidazol- oder Purin-Kern,
  • A eine Einfachbindung oder eine Alkylengruppe, und
  • X eine funktionelle Gruppe sind,
  • wobei die Alkylengruppe mit einer Carboxylgruppe substituiert sein kann, und worin der genannte Spacer eine Verbindung der Formel ist:
  • NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;,
  • NH&sub2;(CH&sub2;)nCOOH,
  • NH&sub2;(CH&sub2;)nOH oder
  • HOOC(CH&sub2;)nCOOH,
  • worin n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist.
  • Im oben genannten erfindungsgemäß zu verwendenden Absorbens schließen Beispiele einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Verbindung der Formel (I) jene ein, worin R eine stickstoffhaltige heterozyklische Gruppe mit einem Imidazol - oder Purin-Kern, A eine Einfachbindung oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen wie eine Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylen-, Hexylen-, Octylen-, Decamethylen- oder Dodecamethylengruppe und X eine funktionelle Gruppe wie eine Amino-, Hydroxy- oder Carboxylgruppe sind. Die Alkylengrupe von A kann gegebenenfalls mit einer Carboxylgruppe substituiert sein. Bevorzugte Beispiele der stickstoffhaltigen heterozyklischen Verbindungen sind jene der Formel (I), worin R eine stickstoffhaltige heterozyklische Gruppe mit Imidazol- oder Purin-Kern, A eine Einfachbindung, Ethylen- oder mit einer Carboxylgruppe substituierte Ethylengruppe und X eine Aminogruppe sind.
  • Als wasserunlöslicher Träger kann jeder wasserunlösliche Träger, der an die stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung der allgemeinen Formel (I) über einen Spacer gebunden werden kann, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Repräsentative Beispiele des wasserunlöslichen Trägers schleißen jene ein, die eine Hydroxy-, Amino-, Carboxylgruppe oder ein Halogenatom aufweisen. Bevorzugte Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einer Hydroxygruppe sind Polysaccharide, z.B. Cellulose, Agarose, vernetztes Dextran usw.), hydroxyalkylierte Polystyrolharze (z.B. hydroxyalkyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer usw.), Polyvinylalkohol oder dgl.. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einer Aminogruppe sind aminoalkylierte Polysaccharide (z.B. aminoalkylierte Cellulosen wie Aminoethylcellulose oder Aminohexylcellulose, aminoalkylierte Agarose wie Aminohexylagarose), ein p- aminobenzyliertes Polysaccharid (z.B. p-Aminobenzylcellulose, p-Aminobenzylagarose usw.), Chitosan, aminoalkylierte Polystyrolharze (z.B. aminoalkyliertes Styrol-Divinylbenzol- Copolymer usw.), Polyacrylamide, aminoalkylierte Polyacrylamide (z.B. Polyaminoethylacrylamid usw.), aminoalkyliertes poröses Glas (z.B. mit Aminopropylgruppen substituiertes poröses Glas usw.) und dgl.. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einer Carboxylgruppe sind carboxalkylierte Polysaccharide (z .B. carboxalkylierte Agarose wie Carboxyhexylagarose oder Carboxypentylagarose, carboxalkylierte Cellulosen wie Carboxymethylcellulose, carboxalkyliertes vernetztes Dextran wie mit Carboxymethylgruppen vernetztes Dextran usw.), Carboxylsäureharze (z.B. Acrylsäure-Divinylbenzol-Copolymer usw.) und dgl.. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einem Halogenatom sind Halogenalkylpolystyrolharze (z.B. chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer usw.) und dgl..
  • Bevorzugte Beispiele des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Adsorbens sind diejenigen, die erhalten werden, indem eine stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung (I) wie Histidin, Histamin oder Adenin an ein wasserunlösliches Polysaccharid über Alkylendiamin als Spacer gebunden wird, wobei mindestens ein Monoepoxid (z.B. Epichlorhydrin usw.) und ein aliphatischer Dialdehyd (z.B. Glutaraldehyd usw.) verwendet werden.
  • Weitere bevorzugte Beispiele des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Adsorbens sind diejenigen, die erhalten werden, indem Histidin, Histamin oder Adenin an ein wasserunlösliches Polysaccharid, das aus Cellulose und Agarose ausgewählt ist, über ein Älkylendiamin durch Epichlorhydrin gebunden werden.
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Adsorbens ist dadurch gekennzeichnet, daß es nur Pyrogene spezifisch adsorbiert. Somit läßt sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchführen, indem das Adsorbens in Kontakt mit einem Spezimen gebracht wird, um ein im Spezimen vorhandenes Pyrogen zu adsorbieren, das behandelte Spezimen gewaschen wird, um andere Substanzen als das Pyrogen zu beseitigen, ohne das adsorbierte Pyrogen zu eluieren, und indem es einem herkömmlichen Limulus-Test unterzogen wird, um den Pyrogengehalt zu ermitteln.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren sollte das zu untersuchende Spezimen in gelöstem Zustand eingesetzt werden, z.B. als wasserhaltige Lösung oder wässrige Lösung. Eine wässrige Lösung ist bevorzugt. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Adsorbens adsorbiert störende Substanzen nicht, z.B. Aminosäuren (z.B. L-Cystein usw.), Antibiotika (z.B. Penicillin G, Streptomycin usw.), Protein- Denaturierungsmittel (z.B. Harnstoff usw.), Serin-Protease- Inhibitoren (z.B. Diisopropylfluorphosphorsäureester usw.), Saccharide (z.B. Glucose usw.), Zuckeralkohole, Natriumchlorid, Ringer's Lösung und dgl. - Das Adsorbens adsorbiert andere Limulus-Test positive Substanzen als Pyrogene nicht, z.B. auch nicht Polysaccharide wie Dextran (1T3)-β-D-Glucan und dgl.. Deshalb läßt sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch auf ein Spezimen anwenden, das diese Substanzen enthält, bei denen es bisher schwierig war, den Pyrogengehalt zu ermitteln.
  • Der Adsorptionsvorgang des Pyrogens kann ausgeführt werden, indem man das Spezimen mit dem Adsorbens in Kontakt bringt, z.B. indem man ein Spezimen mit einem Adsorbens in einen Behältnis vermischt und rührt oder indem man das Spezimen durch eine mit dem Adsorbens gefüllte Säule laufen läßt. Die Bedingungen des Adsorptionsvorgangs können in geeigneter Weise gemäß dem besonderen Spezimen ausgewählt werden. Gewöhnlich kann das Pyrogen spezifisch und wirksam adsorbiert werden, indem 3 bis 100 mg, vorzugsweise 7 bis 40 mg, des Adsorbens pro 1 ml Spezimen eingesetzt und die Adsorption bei einer Temperatur von 4 bis 40ºC, einem pH von 4 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7, und einer Ionenstärke von nicht mehr als 0,1, vorzugsweise 0 bis 0,5, durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen, bei denen der Adsorptionsvorgang ca. 30 Minuten lang oder länger durchgeführt wird, ist das Pyrogen im Spezimen fast vollständig am Adsorbens adsorbiert, und das Pyrogen verdichtet sich am Adsorbens. Ferner läßt sich auch eine Readsorption nach Beendigung der Adsorption durchführen, und dadurch kann die Empfindlichkeit der Bestimmung gesteigert werden.
  • Das Adsorbens, das das Pyrogen adsorbiert enthält, wird vom Spezimen in an sich bekannter Weise abgetrennt und dann mit pyrogenfreiem Wasser, einer pyrogenfreien Pufferlösung oder dgl. gewaschen, um andere Substanzen als das Pyrogen zu beseitigen.
  • In der vorliegenden Erfindung kann das so gewaschene Adsorbens dem Limulus-Test direkt unterzogen werden, so wie es ist.
  • Im allgemeinen wird der Limulus-Test in ein Verfahren mit synthetischem Substrat und ein Gelierungsverfahren eingeteilt, und das Verfahren mit synthetischem Substrat läßt sich ferner in ein kolorimetrisches und fluorimetrisches gemäß der besonderen Art des Substrats einteilen. In der vorliegenden Erfindung kann jedes dieser Verfahren angewandt werden. Beispielsweise wird das Adsorbens, worin das Pyrogen adsorbiert worden ist, mit Limulus-Lysat bei 25 bis 40ºC, gewähnlich bei 37ºC, 10 bis 120 Minuten lang zur Reaktion gebracht, es wird die aufgrund von Gelierung eingetretene Trübung der Reaktionslösüng im Zeitablauf gemessen, und dann kann die Konzentration des Pyrogens im Spezimen ermittelt werden, bezogen auf eine Eichkurve, die getrennt aufgestellt wird, indem man eine authentische Probe (z.B. LPS, usw.) gemäß derselben wie oben beschriebenen Verfahrensweise heranzieht. Alternativ dazu wird das Adsorbens, worin das Pyrogen adsorbiert worden ist, mit Limulus-Lysat und einem synthetischen Substrat, das einen Chromophor oder Fluorophor aufweist, unter denselben Bedingungen zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion werden die Reaktionsmischung einer Kolorimetrie oder Fluorimetrie unterzogen und dann der Pyrogengehalt im Spezimen gemäß einer Eichkurve bestimmt, die gemäß derselben wie oben beschriebenen Weise getrennt aufgestellt worden ist. Im Fall von Kolorimetrie kann die Bestimmung durch Verwendung eines synthetischen Substrats, z.B. Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (worin Boc die t-Butoxycarbonylgruppe und pNA p-Nitroanilin sind), durchgeführt werden, und es wird das Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Im Falle von Fluorimetrie kann die Bestimmung durch Verwendung eines synthetischen Substrats, z.B. Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (worin Boc dieselbe Bedeutung wie oben hat und MCA 7-Amino-4- methylcumarin ist), durchgeführt werden, und es wird die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 460 nm gemessen.
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Adsorbens kann z.B. gemäß derselben Weise wie der in GB-A-2092470 beschriebenen hergestellt werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich die Bestimmungsempfindlichkeit des Limulus-Tests extrem verbessern, und es kann auch der Pyrogengehalt eines Spezimen, das sogar störende Substanzen enthält, bestimmt werden, was bisher als schwierig zu ermitteln erachtet wurde. Ferner lassen sich, sogar wenn andere Limulus-Test positive Substanzen als Pyrogene im Spezimen enthalten sind, Trennung und Bestimmung von Pyrogenen durchführen. Schließlich ist es möglich, ein billigeres Reagens anstatt Limulus-Reagens zu verwenden. Somit eignet sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung des Pyrogengehaltes und zur Anwendung bei der Überprüfung während der Produktion von Medikamenten und dgl..
  • Die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele verdeutlichen die vorliegende Erfindung im Detail noch weiter.
  • Beispiel 1 Untersuchung an einer Eichkurve
  • Zu pyrogenfreiem Wasser (3 ml) wurde eine vorbestimmte Menge an LPS (abgeleitet aus E. coli 0128: B12) gegeben, um eine wässrige LPS-Lösung (Konzentration von LPS: 0, 1, 2 oder 3 pg/ml) herzustellen. Der Lösung wurde dann das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (30 mg, Naßgewicht) zugefügt und die Mischung bei 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Dann wurde sie bei 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert, und das ausgefällte Adsorbens wurde gründlich mit pyrogenfreiem Wasser (3 ml) gewaschen. Zum Niederschlag wurde eine Substrat-Lösung gegeben, d.h. eine wässrige Lösung von 0,4 mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (50 ul) und Limulus-Amebocyt- Lysat (hergestellt durch Auflösen von 1 Röhrchen (für 0,2 ml, Empfindlichkeit: geliert bei 0,1 ng/ml als FDA-Bezugs- Endotoxin-EC-2-Konzentration) von Limulus-Einzeltest-Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0,4 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,0, 1,5 ml), enthaltend 0,04 M Magnesiumchlorid) (50 ul), und man ließ die Mischung bei 37ºC 30 Minuten lang reagieren. Nach Beendiugng der Reaktion wurde eine 12,5-%-ige wässrige Essigsäurelösung (2,3 ml) zugefügt, um die Reaktion anzuhalten, dann wurde die Mischung bei 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde eine Fluorimetrie bei 380 nm Ahregungswellenlänge und 460 nm Fluoreszenzwellenlänge durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Durch Auftragen der erhaltenen Meßdaten in einem Diagramm, worin auf der Ordinate die relative Intensität (RI) der Fluorimetrie und auf der Abszisse die LPS-Konzentration angegeben sind, wird die in Fig. 1 gezeigte Eichkurve erhalten.
  • Wie aus Fig. 1 ersichtlich, zeigt die Eichkurve eine gute lineare Beziehung, sogar im niedrigen LPS- Konzentrationsbereich. Tabelle 1 Lauf-Nummer LPS-Konzentration (pg/ml)
  • Beispiel 2 Reproduzierbarkeit der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Meßdaten
  • Zu pyrogenfreiem Wasser (3 ml) wurde eine vorbestimmte Menge an LPS (abgeleitet aus E. coli 0128: B12) gegeben, und es wurde gerührt, um eine wässrige LPS-Lösung , enthaltend LPS mit 2 pg/ml, zu erhalten. Gemäß derselben Verfahrensweise wie in Beispiel 1 wurde der LPS-Gehalt (relative Intensität RI der Fluorimetrie) in der LPS-Lösung oder in pyrogenfreiem Wasser (3 ml), entsprechend einer LPS-Konzentration von 0 pg/ml) durch Verwendung des im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellten Adsorbens (30 mg) bestimmt. Die in vier Durchläufen pro jeweiliger Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Menge an LPS
  • Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, sind, wenn Art und Gehalt von LPS konstant sind, die durch die quantitative Bestimmung (relative Intensität RI der Fluorimetrie) erhaltenen Messdaten ebenfalls konstant. Somit ist die Reproduzierbarkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hoch.
  • Beispiel 3 Anwendbarkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Pyrogene
  • Die Anwendbarkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Pyrogene (LPS) wurde wie folgt untersucht.
  • (1) Bestimmung des LPS-Gehalts gemäß dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
  • Zu pyrogenfreiem Wasser (3 ml) wurde verschiedenes LPS, abgeleitet aus Mikroorganismen, wie in Tabelle 3 beschrieben, gegeben, um verschiedene wässrige LPS-Lösungen mit LPS- Konzentrationen von 1,25 bis 6 pg/ml zu erhalten. Gemäß derselben Verfahrenswiese wie in Bespiel 1 wurde der LPS- Gehalt in jeder Lösung unter Verwendung des im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellten Adsorbens (30 mg) bestimmt. Es wurden die Endotoxin-Einheiten (EU) der unterschiedlichen LPS-Arten bestimmt, bezogen auf den LPS-Gehalt einer jeden Spezimen-Lösung, durch Heranziehen von LPS als Endotoxin- Standard, welches aus E. coli 0128: B12 (10,4 EU/ng; EU bedeutet Endotoxin-Einheiten) abgeleitet war.
  • (2) Bestimmung des LPS-Gehalts gemäß Limulus-Methode unter Anwendung eines fluoreszierenden synthetischen Substrats (Kontroll-Verfahren)
  • Zu wässrigen Lösungen von unterschiedlichem LPS mit Konzentrationen von 2,5 bis 6 pg/ml (100 ul) wurde die in Beispiel 1 verwendete Substrat-Lösung (50 ul) bzw. das in Beispiel 1 verwendete Limulus-Amebocyt-Lysat (50 ul) gegeben, und man ließ die Mischung bei 37ºC 65 Minuten lang reagieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer 12,5%-igen wässrigen Essigsäurelösung (3 ml) angehalten. Dann wurde gemäß derselben Verfahrensweise wie in Beispiel 1 der LPS-Gehalt durch Messung der relativen Intenstiät der Fluorimetrie bestimmt. In derselben Weise wie oben wurden die Endotoxin- Einheiten der verschiedenen LPS-Sorten durch Heranziehen des LPS als Endotoxin-Standard ermittelt, das aus E. coli 0128: 12 abgeleitet war. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Erfindungsgemäßes Verfahren (EU/ng) Kontrollverfahren (EU/ng) LPS, abgeleitet aus 10,4 E. coli 0128: B12 LPS, abgeleitet aus Klebsiella pneumoniae
  • Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, läßt sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf die Gehaltsbestimmung unterschiedlicher LPS-Sorten als bekanntes Limulus-Verfahren unter Verwendung eines fluoreszierenden synthetischen Substrats anwenden.
  • Beispiel 4 Messung der Pyrogen-Konzentration in einer wässrigen Phenylanalin-Lösung
  • Zu einer 2%-igen wässrigen Phenylalanin-Lösung (30 ml) wurde das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (500 mg, Naßgewicht) gegeben und die Mischung bei 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Dann wurde das Adsorbens beseitigt, um eine pyrogenfreie wässrige Phenylalanin-Lösung herzustellen.
  • Zu dieser wässrigen Phenylalanin-Lösung wurde LPS (abgeleitet aus E. coli 0128: B12) gegeben, so daß die Konzentration von LPS auf 1 pg/ml und 2 pg/ml eingestellt war, und die Mischung wurde gerührt, um eine LPS-Lösung zu erhalten. Der Lösung (3 ml) wurde das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (30 mg, Naßgewicht) zugefügt, und die Mischung bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Dann wurde sie bei 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert und das ausgefällte Adsorbens mit pyrogenfreiem Phosphat-Puffer (pH 7,0, u = 0,02) (3 ml) gewaschen. Zum Niederschlag wurden eine wässrige-Lösung von 0,4 mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (50 ul) als Substratlösung und Limulus-Amebocyt-Lysat (hergestellt durch Auflösen von 1 Röhrchen (für 0,2 ml, Empfindlichkeit: geliert bei 0,1 ng/ml als FDA-Bezugs-Endotoxin-EC-2-Konzentration) von Limulus-Einzeltest-Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0,4 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,0, 1,5 ml), enthaltend 0,04 M Magnesiumchlorid) (50 ul), gegeben und die Mischung bei 37ºC 30 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurde eine 12,5%-ige wässrige Essigsäurelösung zugefügt, um die Reaktion anzuhalten, und es wurde bei 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde eine fluorimetrische Messung bei 380 nm Anregungswellenlänge und 460 nm Fluoreszenzwellenlänge durchgeführt. Die Konzentration des Pyrogens wurde durch die relative Intensität auf der Grundlage der Eichkurve ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Menge an LPS (pg/ml) LPS-Gehalt (pg/ml) keine
  • Bisher lag die Bestimmungsgrenze dieses Typs von LPS durch Limulus-Test bei einer Konzentration von 1 pg/ml in einer 0,5%-igen wässrigen Phenyl-analin-Lösung, d.h. bei 200 pg pro 1 g Aminosäure. Demgegenüber kann, wie aus Tabelle 4 klar ersichtlich, LPS von 1 pg/ml in einer 2%-igen wässrigen Phenylalanin-Lösung, d.h. 50 pg/1 g Aminosäure,gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Somit ist die Empfindlichkeit extrem verbessert.
  • Beispiel 5 Messung der Pyrogen-Konzentration in einer wässrigen Lösung von Methionin
  • Zu einer 5%-igen wässrigen Methionin-Lösung (30 ml) wurde das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (500 mg, Naßgewicht) gegeben und die Mischung bei 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Dann wurde das Adsorbens beseitigt, um eine pyrogenfreie wässrige Methioninlösung herzustellen.
  • In derselben Weise wie in Beispiel 4 wurde LPS der entstandenen Lösung zugefügt, um den Pyrogengehalt zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Menge an LPS (pg/ml) LPS-Gehalt (pg/ml keine
  • Im Falle einer wässrigen Methionin-Lösung lag bisher die Bestimmungsgrenze des LPS-Gehalts bei 100 pg pro 1 g Aminosäure. Wie allerdings aus Tabelle 5 klar ersichtlich, kann LPS von 1 pg/ml in einer 5%-igen wässrigen Methionin- Lösung, d.h. 20 pg pro 1 g Aminosäure, gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Somit ist die Empfindlichkeit extrem verbessert.
  • Beispiel 6 Messung der Pyrogen-Konzentration in einer wässrigen Lösung von Cystein-Hydrochlorid
  • Eine 0,25%-ige wässrige Cystein-Hydrochlorid-Lösung wurde auf pH 6,1 mit Natriumhydroxid eingestellt und der Lösung LPS zugefügt, um wässrige Cystein-Hydrochlorid-Lösungen, enthaltend 1 pg/ml bzw. 2 pg/ml LPS, herzustellen.
  • In derselben Weise wie in Beispiel 4 wurde der LPS-Gehalt unter Verwendung des im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellten Adsorbens ermittelt. Pyrogenfreies Wasser (3 ml) wurde zum Waschen des Adsorbens verwendet. Die Ergegbnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 Menge an LPS (pg/ml) LPS-Gehalt (pg/ml) keine
  • Im Fall einer wässrigen Cystein-Hydrochlorid-Lösung lag die Bestimmungsgrenze von LPS bisher bei 1000 bis 2000 pg pro 1 g Aminosäure. Wie allerdings aus Tabelle 6 klar ersichtlich, kann LPS von 1 pg/ml in einer 0,25%-igen Cystein- Hydrochlorid-Lösung, d.h. 400 pg pro 1 g Aminosäure, gemäß der vorliegenden ERfindung bestimmt werden, und die Empfindlichkeit ist extrem verbessert.
  • Beispiel 7 Messung der Pyrogen-Konzentration in einer wässrigen Lösung von Penicillin G
  • Zu einer 1%-igen wässrigen Lösung von Penicillin G (30 ml) wurde das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (1 g, Naßgewicht) gegeben und die Mischung bei 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Dann wurde das Adsorbens beseitigt, um eine pyrogenfreie wässrige Lösung von Penicillin G zu ergeben.
  • In derselben Weise wie in Beispiel 4 wurde der Lösung eine vorbestimmte Menge LPS zugefügt, und der LPS-Gehalt unter Verwendung des im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellten Adsorbens ermittelt. Pyrogenfreies Wasser (3 ml) wurde zum Waschen des Adsorbens verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Menge an LPS (pg/ml) LPS-Gehalt (pg/ml) keine
  • Im Falle einer wässrigen Lösung von Penicillin G lag die Bestimmungsgrenze von LPS bisher bei 200 pg pro 1 g Penicillin G. Wie allerdings aus Tabelle 7 klar ersichtlich, kann LPS von 1 pg/ml in einer 1%-igen Lösung von Penicillin G, d.h. 100 pg pro 1 g Penicillin G, gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, und die Empfindlichkeit ist extrem verbessert.
  • Beispiel 8 Durchführung der Bestimmung des Pyrogengehalts gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Zu pyrogenfreiem Wasser (3 ml) wurde die vorbestimmte Menge LPS (abgeleitet aus E. coli 0128: B12) gegeben und die Mischung gerührt, um eine wässrige Lösung von LPS (Konzentration von LPS: 0, 10 und 20 pg/ml) herzustellen. Zu der Lösung wurde das im späteren Bezugsbeispiel 1 hergestellte Adsorbens (100 mg, Naßgewicht) gegeben und die Mischung mit 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Dann wurde sie mit 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert. Zum ausgefällten Adsorbens wurde 0,2 M pyrogenfreier Tris- Hydrochlorid-Puffer (pH 8,0, 0,5 ml), enthaltend 0,02 M Magnesiumchlorid, gegeben, die Mischung gerührt und dann 30 Minuten lang stehengelassen. Nach dem Stehenlassen wurde sie zentrifugiert und die Konzentration von LPS im Überstand gemäß Limulus-Verfahren unter Verwendung eines fluoreszierenden synthetischen Substrates wie folgt bestimmt.
  • Die überstehende Flüssigkeit wurde anschließend mit pyrogenfreiem Wasser verdünnt, um eine Probenlösung zu ergeben. Zur Probenlösung (100 ul) wurde eine Lösung von Substrat (50 ul) und Limulus-Amebocyt-Lysat (50 ul) gegeben, und man ließ die Mischung bei 37ºC 90 Minuten lang reagieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer 12,5%-igen wässrigen Essigsäurelösung (2,3 ml) beendet, dann wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 die relative Intensität fluorimetrisch ermittelt und der LPS-Gehalt unter Verwendung von aus E. coli 0128: B12 abgeleitetem LPS als LPS-Standard bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 Lauf-Nr. zugefügtes LPS (pg) gemessenes LPS (pg)
  • Wie aus Tabelle 8 klar ersichtlich, wurde zugefügtes LPS im eluierten Überstand fast wiedergewonnen. Daher ist es möglich, die Konzentration von LPS zu messen, wobei es am Adsorbens adsorbiert und dann eluiert wird.
  • Beispiel 9 Untersuchung an einer Eichkurve
  • Zu pyrogenfreiem Phosphat-Puffer (pH 7,0, u = 0,02, 3 ml) wurde eine vorbestimmte Menge an LPS (abgeleitet aus E. coli 0128: B12) gegeben, um eine wässrige Lösung von LPS (Konzentration von LPS: 0, 5, 10 oder 15 pg/ml) herzustellen. Zur Lösung wurde das im späteren Bezugsbeispiel 2 hergestellte Adsorbens (30 mg, Naßgewicht) gegeben und die Mischung mit 50 U.p.m. bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Dann wurde sie mit 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert. Zum Niederschlag wurden eine wässrige Lösung von 0,4 mM Boc- Leu-Gly-Arg-MCA (50 ul) als Substratlösung und Limulus- Abmebocyt-Lysat (hergestellt durch Auflösen von 1 Röhrchen (für 0,2 ml, Empfindlichkeit geliert bei 0,1 ng/m1 als FDA- Bezugs-Endotoxin-EC-2-Konzentration) von Limulus-Einzeltest- Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0,4 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,0, 1,5 ml), enthaltend 0,04 M Magnesiumchlorid) (50 ul) gegeben, und man ließ die Mischung bei 37ºC 20 Minuten lang reagieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde eine 12,5%-ige wässrige Essigsäurelösung (2,3 ml) zugefügt, um die Reaktion anzuhalten, und es wurde mit 3000 U.p.m. 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde eine fluorimetrische Messung bei 380 nm Anregungswellenlänge und 460 nm Fluoreszenzwellenlänge durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben.
  • Die erhaltenen Meßdaten wurden in einem Diagramm aufgetragen, worin die Ordinate die relative Intenstiät (RI) der fluorimetrischen Messung und die Abszisse die LPS- Konzentration angeben, um die in Fig. 2 gezeigte Eichkurve zu erhalten. Die Kurve von Fig. 2 weist eine gute lineare Beziehung auf, sogar im niedrigen LPS-Konzentrationsbereich. Tabelle 9 Lauf Nr. LPS-Konzentration (pg/ml)
  • Beispiel 10 Untersuchung an einer Eichkurve
  • In derselben WEise wie in Beispiel 9 wurde eine fluorimetrische Messung durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das im nachfolgenden Bezugsbeispiel 3 hergestellte Adsorbens anstatt des in Bezugsbeispiel 2 hergestellten Adsorbens eingesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben.
  • Die erhaltenen Meßdaten wurden in einem Diagramm aufgetragen, worin auf der Ordinate die relative Intensität (RI) der fluorimetrischen Messung und auf der Abszisse die LPS- Konzentration angegeben sind, um die in Fig. 3 gezeigte Eichkurve zu erhalten. Die Kurve von Fig. 3 zeigt eine gute lienare Beziehung, sogar im niedrigen LPS- Konzentrationsbereich. Tabelle 10 Lauf Nr. LPS-Konzentration (pg/ml)
  • Bezugsbeispiel 1
  • (1) Sepharose CL-4B (Handelsname eines Agarosederivats, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, 30 g, Naßgewicht) wurde in destilliertem Wasser suspendiert. 2N wässriges Natriumhydroxid (200 ml) und Epichlorhydrin (50 ml) wurden zugefügt und die Mischung bei 40ºC 2 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand mit destilliertem Wasser gewaschen, um Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose CL-4B zu erhalten. Die so erhaltene Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose CL-4B wurde in einer 0,6%-igen wässrigen Lösung von Hexamethylendiamin (1,4 l) suspendiert, die auf 60ºC erwärmt worden war, und die Suspension wurde bei 60ºC 2 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand mit destilliertem Wasser gewaschen, um 3-(6-Aminohexylamino)- 2-hydroxypropylierte Sepharose CL-4B (370 g, Naßgewicht) zu ergeben. Bei Bestimmung des Aminohexylgehalts der sich ergebenden Sepharose durch Titration betrug er ca. 37,6 u Mol/g (Naßgewicht).
  • (2) 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxypropylierte Sepharose CL- 4B (370 g, Naßgewicht) wurde in 4N wässrigem Natriumhydroxid (700 ml) suspendiert. Epichlorhydrin (700 ml) wurde der Suspension bei 65ºC zugefügt und die Mischung gerührt. Nachdem die Temperatur der Mischung 90ºC erreicht hatte, wurde die Mischung weitere 8 Minuten lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde Wasser der Mischung zugefügt, um sie auf 50ºC oder darunter abzukühlen. Dann wurde die Mischung filtriert und der Rückstand mit destilliertem Wasser gewaschen, um Epichlorhydrin-aktivierte, 3-(6- Aminohexylamino)-2-hydroxypropylierte Sepharose CL-4B zu ergeben. Diese wurde in einer wässrigen Lösung von 20% Histidinhydrochlorid-Hydrat (eingestellt auf pH 12 mit wässrigem Natriumhydroxid, 2,1 l) suspendiert, welche auf 90ºC erwärmt worden war, und die Suspension wurde bei 80 bis 90ºC 30 Minuten lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser (1 l) suspendiert, einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC 20 Minuten lang unterzogen und filtriert. Der Rückstand wurde gründlich nacheinander mit 0,2 N wässriger Salzsäure, 0,2 N wässrigem Natriumhydroxid, 1,5 M wässrigem Natriumchlorid und destilliertem Wasser gewaschen. Somit wurde wasserunlösliches Adsorbens, enthaltend Agarose als Träger, Histidin als Ligand und Hexamethylendiamin als Spacerzentrum, erhalten (390 g, Naßgewicht). Der Gehalt an Histidin pro 1 g (Naßgewicht) Adsorbens betrug 20,4 uMol.
  • Bezugsbeispiel 2
  • Dasselbe Verfahren wie in Bezugsbeispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Cellulofine GCL-200-m (Handelsname eines Cellulosederivats, hergestellt von Chisso Co., Ltd., 350 g) anstatt Sepharose CL-4B verwendet wurde.Somit wurde ein wasserunlösliches Adsorbens, enthaltend Cellulose als Träger, Histidin als Ligand und Hexamethylendiamin als Spacerzentrum, erhalten (340 g, Naßgewicht). Der Gehalt an Histidin pro 1 g (Naßgewicht) Adsorbens betrug 58 uMol.
  • Bezugsbeispiel 3
  • 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxypropylierte Sepharose CL-4B, hergestellt in derselben Weise wie im Bezugsbeispiel 1 (18 g, Naßgewicht), wurde in 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 7,0, 45,6 ml) suspendiert. Eine 25%-ige wässrige Lösung von Glutaraldehyd (19,2 ml) wurde der Suspension zugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand gründlich mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) gewaschen, um Glutaraldehyd-aktivierte, 3-(6-Aminohexylamino)-2- hydroxypropylierte Sepharose CL-4B zu erhalten. Diese wurde in 15 mM Histamin-0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0, 59,6 ml) suspendiert und die Suspension bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand mit 1 M wässriger Lösung von Natriumchlorid (600 ml) gewaschen. Der Rückstand wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 30 ml) suspendiert. Natriumborhydrid (0,3 g) wurde der Suspension zugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand gründlich mit 1 M wässriger Natriumchloridlösung und destilliertem Wasser gewaschen. Somit wurde ein wasserunlösliches Adsorbens, enthaltend Agarose als Träger, Histamin als Ligand und Hexamethylendiamin als Spacer- Zentrum, erhalten (20,7 g, Naßgewicht). Der Histamingehalt pro 1 g (Naßgewicht) des Adsorbens betrug 4,1 uMol.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts, wobei man ein Spezimen in Kontakt mit einem Adsorbens bringt, das aus einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Verbindung zusammengesetzt ist, die an einen wasserunlöslichen Träger über einen Spacer gebunden ist, und wobei man ohne Eluierung des am Adsorbens adsorbierten Pyrogens den Pyrogengehalt des adsorbierten Pyrogens mit der Limulus-Methode bestimmt,
worin die genannte stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung Verbindung (I) der Formel ist:
R-A-X (I)
worin R eine stickstoffhaltige heterozyklische Gruppe mit einem Imidazol- oder Purin-Kern,
A eine Einfachbindung oder eine Alkylengruppe, und
X eine funktionelle Gruppe sind,
wobei die Alkylengruppe mit einer Carboxylgruppe substituiert sein kann, und worin der genannte Spacer eine Verbindung der Formel ist:
NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;,
NH&sub2;(CH&sub2;)nCOOH,
NH&sub2;(CH&sub2;)nOH oder
HOOC(CH&sub2;)nCOOH,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Verbindung (I) A eine Einfachbindung oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt, die mit einer Carboxylgruppe substituiert sein kann, und worin X eine Amino-, Hydroxy - oder Carboxylgruppe ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Verbindung (I) A eine Einfachbindung, Ethylen- oder mit einer Carboxylgruppe substituierte Ethylengruppe und X eine Aminogruppe darstellen.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die stickstoffhaltige heterozyklische Verbindung (I) aus Histidin, Histamin und Adenin ausgewält ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin der wasserunlösliche Träger ein wasserunlöslicher Träger mit einer Hydroxygruppe, Aminogruppe oder einem Halogenatom im Molekül davon ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Adsorbens Verbindung (I) ist, die an den wasserunlöslichen Träger über ein Alkylendiamin als Spacer gebunden ist, durch Verwendung von mindestens einem Monoepoxid und einem aliphatischen Aldehyd.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Adsorbens Verbindung (I) ist, die an den wasserunlöslichen Träger über den Spacer durch Verwendung von Epichlorhydrin als Monoepoxid gebunden ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, worin der wasserunlösliche Träger ein wasserunlösliches Polysaccharid ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin der wasserunlösliche Träger Agarose oder Cellulose ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Spezimen eine wasserhaltige Lösung oder eine wässrige Lösung ist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Adsorbens in einer Menge von 3 bis 100 mg pro 1 ml eines Spezimen verwendet und die Adsorption unter Bedingungen einer Temperatur von 4 bis 40ºC, einem pH von 4 bis 8 und einer Ionenstärke von nicht mehr als 0,1 durchgeführt werden.
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