DE2208269C3

DE2208269C3 - Verfahren und Vorrichtung zum Schwangerschaftsnachweis

Info

Publication number: DE2208269C3
Application number: DE2208269A
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Omiya Ogawa (Japan)
Original assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Current assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Priority date: 1971-02-23
Filing date: 1972-02-22
Publication date: 1974-04-18
Also published as: DK142472B; NL166333B; AU3919972A; NL7202309A; DK142472C; FR2127723A5; US3873682A; NL166333C; AU471450B2; BR7200991D0; CA973071A; GB1379452A; DE2208269A1; SE372343B; JPS549078B1; CH563585A5; DE2208269B2

Description

ZO

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Filtrieren einer Harnprobe zum Schwangerschaftsnachweis durch immunologisehen Nachweis von menschlichem Choriongonadotropin im Harn.

Es ist bekannt, daß der Harn einer Schwangeren ausgeschiedenes menschliches Choriongonadotropin (im folgenden mit HCG bezeichnet) enthält. Eine Schwangerschaft wurde bisher biologisch durch Feststellung der HCG-Reaktion unter Verwendung von Versuchstieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen und Kröten, nachgewiesen. Vor kurzem wurde jedoch der sogenannte immunologische Schwangerschaftsnachweis bekannter, bei welchem HCG einfach in einem Reagenzglas oder auf einem Objekttäger durch eine immunologische Reaktion festgestellt wird. Dieser Nachweis beruht auf dem Prinzip, daß da? Anti-HCG, das im Blut eines Kaninchens oder eines Meerschweinchens, dem HCG injiziert wurde, gebildet wird, empfindlich und spezifisch mit dem in dem Harn einer Schwangeren enthaltenen HCG reagiert.

Im spezielleren findet eine Agglutinationsreaktion eines mit Anti-HCG sensibilisierten Latex (im nachfolgenden mit Latex-Agglutinationsreaktion bezeichnet) statt, wenn die Harnprobe mit einem Polystyrollatex, an dem Anti-HCG adsorbiert wurde, vermischt wird. Wenn HCG iii der Harnprobe vorhanden ist, so bricht die Emulsion von feinen Latexteilchen und agglomeriert zu einer sichtbaren Masse. Wird diese Veränderung auf einem Objektträger festgestellt, so ist »Schwangerschaft« nachgewiesen.

Die Latex-Agglutinationsinhibierungsreaktion, die eine indirekte Reaktion gegenüber der Latex-Aggiuiinationsreaktion isi, wird cbeniaiis zum Nachweis verwendet. Der Latex, der HCG adsorbier! hat, agglomeriert nämlich, wenn Anti-HCG zugegeben wird, doch findet, wenn mit einer HCG enthaltender« Harnprobe gemischtes Anti-HCG zu diesem Latex zugegeben wird, keine Agglutination des Latex statt, da das Anti-HCG sich bereits mit dem HCG in dem Harn verbunden hat. Bei Anwendung der Latex-Agglutirtationsinhibieningsreaktion zeigt daher das Fehlen einer Agglutination Schwangerschaft an.

Eine Agglutinationsinhibierungsreaktion unter Verwendung von sensitivieren Erythrozyten (im folgenden mit Härnagglutinationsinhibierungsreaktion bezeichnet) wird ebenfalls zum Schwangerschaftsnaehwcis verwendet, Dies^Methode beruht auf dem gleichen ^Prinzip wie'die obengenannte Latex-Agglutinations-%hibierungsreaktion, doch werden an Stelle des ^obengenannten Latex menschliche oder tierische ■Erythrozyten, an die HCG adsorbiert ist, verwendet ' Wie oben beschrieben, ist dieser immunologische Nachweis in seinem Durchführungsprinzip einfach, doch hat sich in der Praxis herausgestellt, daß diesei Nachweis verschiedentlich in einem sehr frühen Stadium der Schwangerschaft, die eine klinische Feststellung nicht ermöglicht, fehlerhaft sein kann, da in" diesem Stadium die Menge an in dem Harn ausgeschiedenem HCG sehr klein und demzufolge die Agglutinaiionsreaktion oder deren Inhibierungsreaktion schwach ist. Es ist daher erforderlich, den Latex oder die Erythrozyten so zu präparieren, daß sie auf die geringste Kombination von HCG und Anti HCG hin agglomerieren können. Feine Teilchen von Latex oder Erythrozyten werden durch die geringste Änderung in ihrem Dispersionss/stem leicln beeinflußt. Werden beispielsweise verschiedene Elektrolytionen, Säuren, Alkalien, oberflächenaktive Mittel oder wasserlösliche Hochpolymere zugegeben, s.. kann die Agglomerierung unabhängig von der HCCi und Anti-HCG-Reaktion induziert werden oder \w kann überhaupt nicht auftreten.

So kann bei der obengenannten immunologischen Methode der Prrfung von Harn mit einer komplexe:) Zusammensetzung die Reaktion durch die anderen Bestandteile des Harns als dem HCG gestört werden, und der Nachweis ist oft schwierig. Es wurden noch nicht alle die Reaktion störenden Bestandteile des Harns identifiziert, doch bestehen weite individuelle Unterschiede in ihrer Konzentration. Insbesondere im Sommer, wenn der Harn dazu neigt, konzentrier! zu sein, ist die Quote an fehlerhaften Nachweisen sehr hoch.

Abgesehen von diesen Störungen kann der Harn aus anderen Gründen trüb sein. Ein solcher trüber Harn führt, wenn er als solcher umgesetzt wird, zu einer falschen Diagnose. Es ist daher «bliche Praxis, den Harn Tür einen Reaktionstest nur nach Filtrieren durch ein Papierfilter oder Watte (absorbierende Baumwolle) zu verwenden.

Wie im folgenden noch erläutert wird, kann übliches Cellulosefilterpapier oder Watte die Trübung entfernen, doch adsorbieren sie gleichzeitig auch HCG. In den frühen Stadien der Schwangerschaft, wenn die Sekietion an HCG gering ist, wird daher die vorhandene Spur an HCG weiter durch das Filtrieren herabgesetzt, und es kann »keine Schwangerschaft« irrtümlich festgestellt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines einfachen Verfahrens und eintf Vorrichtung zur Entfernung der Trübung und der die Reaktion störenden Substanzen ohne Verlust der in dem Harn vorhandenen Spur an HCG.

Es wurde nun gefunden, daß sich sowohl die Trübung als auch die reaktionsstörenden Substanzen in dem Harn in ausreichender Weise entfernen lassen und somit die Fehlbestimmungsquote außerordentlich gesenkt werden kann, und zwar mit einem extrem kleinen Verlust an HCG, wenn als Filtermittel CeIIuloseacetatfaser und/oder synthetische Polyacrylnitrilfaser verwendet wird.

Somit besteht die Lösung der erfindungsgernäßen Aufgabe darin, daß bei dem Verfahren der eingangs-

genannten Art eine Fasermasse aus synthetischer Ipiyacryinitrilfaser und/oder Celluloseacetatfaser als Filtermaterial verwendet wird,
*,. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur ^Durchführung des obengenannten Verfahrens, die Tins einem Rohr besteht, daa an die Spitze, einer Pipette •'angesetzt werden kann und mit einer Fasermasse •Tius Celluloseacetatfaser und/oder synthetischer PoIyacrylnitrilfascr gefüllt ist. Vorzugsweise besteht dieses Rohr aus einem Kunststoffmaterial.

Die vorliegende Erfindung bietet den großen Vorteil, daß selbst bei Verwendung einer Harnprobe, die nur iine Spur HCG im frühen Stadium einer Schwangerschaft enthält, eine Schwangerschaft zuverlässig festgestellt werden kann. Selbst im Falle von konzentriertem Harr im Sommer ist der Nabhweis außerordentlich zuverlässig.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand einer bevorzugten Ausführungsform. unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigt

F i p. 1 eine Pipette mit daran angesetztem PoIyhyldiröhrchen, das Fasern enthält, F i g. 2 die Pipette und das Röhrchen gemäß Fig. I, wobei diese in eine Harnprobe eingetaucht sind, und F i j» 3 das Röhrchen und die Pipette, die anschließend getrennt sind.

Bei der in F i g. 1 gezeigten Darstellung ist ein Polyüthylenröhrchen 2, das mit einer Fasermasse 1 aus entweder Celluloseacetatfaser oder synthetischer Polyakrylnitrilfaser oder beiden Fasern gefüllt ist, an der Spitze einer Pipette 3 angesetzt. Wie in F i g. 2 gezeigt ist, ist diese Pipette mit dem daran angesetzten Röhrchen in die Harnprobe 4 eingetaucht, um eine gewisse Menge Harn in die Pipette 3 aufzusaugen. So kann ein klarer filtrierter Harn 5 leicht erhalten werden. Dann wird, v/ie in F i g. 3 dargestellt, das Röhrchen 2 von der Pipette abgenommen, und der filtrierte Harn 5 in der Pipette 3 kann unmittelbar für die Testreaktion verwendet werden.

Die Schwangerschaft kann durch die Latex-Aggluünatiüttsreaktion oder die Latex-Agglutinationsinhibierungsreaktion unter Verwendung eines Tropfens dieses Harns aif einem Objektträger oder durch die Hämagglutionationsinhibierungsreaktion unter Verwendung von 0,1 ml Harn in einem Reagenzglas vorgenommen werden.

■ Es seien nun Ttstbeispielc gegeben, bei denen die Wirksamkeit des Schwangerschaftsnachweises mit dem erfindungsgemäßen Filtrierverfahren unter Verwendung von Celluloseacetatfaser und/oder synthetischer Polyacrylnitrilfaser und der üblichen Filtriermclhode unter Verwendung eines Filterpapiers oder einer Walte verglichen wird.

Testbeispiel 1

Ein Polyäthylenrohr mit einem Innendurchmesser von 4,5 mm wurde mit 50 mg von jeweils Cellulos'?- acetallaser, synthetischer Polyacrylnitrilfaser und Watte gefüllt. Nach dem oben beschriebenen Vcrfahren wurden 0,3 ml gefilterter Harn erhalten, Das verwendete Filterpapier war Toyo-Filterpapier Nr. 5 B (5,5 cm Durchmesser, 220 mg Gewicht). Nach vierfachem Falten wurde dieses Filterpapier auf einen kleinen Trichter aufgebracht, und 2 ml Harn wurden durch das Papier filtriert.

In einem Vorversuch wurden 10 Proben mit beträchtlich starker Störung für die Reaktion von nichtschwangeren Frauen verwendet, während 10 Proben mit einer Spur von HCG (weniger als 31. E./ml) von Schwangeren verwendet wurden. Gemäß der oben beschriebenen Arbeitsweisen wurden diese Proben filtriert und der Latex-Agglutinationsreaktion und der Hämagglutinationsinhibierungf.reaktion unterzogen, und die Ergebnisse wurden verglichen. Gleichzeitig wurde ein nicht filtrierter Harn als Kontrolle geprüft. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und 11 zusammengestellt.

Im Falle des Harns der nichtschwangeren Frauen ergaben bei Umsetzung ohne Filtrieren zwei Fälle von 10 definitiv »positive« Ergebnisse, während fünf Fälle »zweifelhaft-positive« Ergebnisse, das heißt Ergebnisse zwischen »negativen« und »positiven« Ergebnissen zeigten.

Bei der Hämagglutinationsinhibierungsreaktion ergaben zwei Fälle »zweifelhaft-positiv«. Der Einfluß der reaktionsstörenden Substanzen, die zu Fehldiagnosen führen, ist daher bei der Latex-Agglutinationsreaktion merklich stärker, doch sind bei Verwendung von filtriertem Harn diese Substanzen entferni, und die Beurteilung ergibt richtig »negativ«, gleichgültig, welches Verfahren zum Filtrieren verwendet wird.

Tabelle I
Vergleich der Filtrierverfahren bei Anwendung auf H^rn von Nichtschwangeren

KiTfiproben von Nichtschwangeren

Latex-Agglutinationsreaktion

nicht filtriert

durch Watte filtriert

durch Filterpapier filtriert

durch Polyacrylnitrilfaser filtriert...

durch Ceiluloseacetatfaser filtriert ., HämagglutinatJonsinhibitionsreaktion

nicht filtriert

durch Watte filtriert

durch Filterpapier filtriert

•durch Polyacrylnitrilfaser filtriert.., durch Celluloseacetatfaser filtriert .

208 269

Tabelle Ji

Vergleich der Filtrierverfahren bei Verwendung von'Harn von Schwangeren \'"' „ ,'*,

, ,Harnproben von Schwangeren ,

6'»' 7/ '8

-, Latex-Aggl utinationsreaktion

nicht filtriert

durch Watte filtriert

durch Filterpapier filtriert

durch Polyacrylnitrilfaser filtriert

durch Celluloseacetatfaser filtriert

Hämagglutinationsinhibitionsreaktion

nicht filtriert -

durch Watte filtriert

durch Filterpapier filtriert

durch Polyacrylnitrilfaser filtriert

durch Celluioseacetatfaser filtriert

Im Falle von Harn von Schwangeren, der ein wenig HCG enthielt, ergaben alle Fälle »positiv« sowohl bei der Latex-Agglutinationsreaktion als auch bei der Hämagglutinationsinhibierungsreaktion, wenn, wie in Tabelle II gezeigt, der Harn nicht filtriert war. Wenn der Harn jedoch durch ein Filterpapier und Watte filtriert war, war die Reaktion sehr abgeschwächt, und die Latex-Agglutinationsreaktion war in fünf Fällen von zehn »negativ«, während die Hämagglutinationsinhibierungsreaktion in vier Fällen von zehn das Ergebnis »negativ« lieferte, was zeigt, daß anstatt Schwangerschaft in fehlerhafter Weise »NichtSchwangerschaft« nachgewiesen wurde.

Im Gegensatz hierzu ergab, wenn der Harn durch synthetische Polyacrylnitrilfaser oder Celluloseacetatfaser erfindungsgemäß filtriert wufde, kein Fall die Bewertung »negativ«, und nur in einem Fall trat die Bewertung »zweifelhaft-positiv« auf.

So können die Reaktionen von unfiltriertem Harn das Ergebnis »positiv« liefern, selbst wenn der Harn tatsächlich »negativ« ist. was die Möglichkeit, keine Schwangerschaft für eine Schwangerschaft zu halten, mit sich bringt. Wenn übliches Filterpapier oder Watte verwendet wird, so kann ein solcher Fehler vermieden werden, doch besteht dann in hohem Grade die Möglichkeit, eine Schwangerschaft für eine Nichlschwangerschaft zu halten, wenn der HCG-Gchalt im Harn sehr klein ist. Die Verwendung von PoIy-.-acrylnilrilfaser oder Celluloseacetatfaser als Filtermittel ermöglicht sowohl eine ausreichende Entfernung der die Reaktion störenden Substanzen als auch eine geringe Adsorption von HCG und somit eine erhebliche Herabsetzung der Fchlbcwcrtungs-C]UOtC.

Der folgende Test wurde zum quantitativen Vergleich der HCG-Adsorplion durch verschiedene Mittel zum Filtrieren durchgerührt.

Tcslbeispicl 2

In fünf Harnproben von gesunden, nichtschwangcidi Frauen wurde HCG in einer Menge von 41. E./ml gelöst. Diese Proben wurden unter absolut gleichen Bedingungen wie im Teslbcispicl I filtriert. Das restliche HCG im Filtrat wurde nach der quanli-

■r

tativen Hämagglutinationsinhibierungsmethoile von

L. Wi d e (Acta Endoc. Suppl. 70 [1962]) gemessen.

Wie Tabelle III zeigt, variieren die HCG-Adsorp-

tioncn durch verschiedene Filtermittel etwas von Probe zu Probe, doch werden die ursprünglich 4 I. E./ml

vor dem Filtrieren auf 1,0 bis 2,5 I. E./ml nach FH-

3" frieren Jurch Waiie und auf 2,0 bis 2,51. E./ml nach Filtrieren durch Papier herabgesetzt, im Gegensatz hierzu findet beim Filtrieren durch Polyacrylnitril- und Celluloseacetatfaser gemäß der Erfindung eine Herabsetzung auf 3,5 bis 3,75 I. E./ml steu, was eine

sehr geringe HCG-Adsorption klar zeigt. Diese Teste zeigen, daß in den 10 Fällen von Harnprüfungen von Schwangeren bei der Verminderung an HCG auf etwa 31. E./ml die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens so groß ist, daß selbst die Proben

mit einer Spur HCG richtig als »positiv«
werden können.

Tabelle III

Restliches HCG im Filtrat von Harn mit

einem Gehalt von 4 LE.HCG/ml (internationale

Einheiten/ml)

Filter

Walte

Papier

Polyacrylnitril

Celluloseacetat

	Harn probe	2	3	Λ
I	2,5	1,5	i,o
1,0	2,5	2,0	2,0
2,0	3,75	3,5	3,75
3.5	3,75	3,5	3,5
3,75

Testbeispiel 3

fto Der folgende Versuch würde durchgeführt, um die Beziehung zwischen dem Volumen des Filtermaterial und der Ausbeute an filtriertem Harn zu untersuchen. Unter Verwendung von 50, 75 und 100 ιημ synlhetiscncr Polyacrylnitrilfaser und Cclluloscaceliitlascr

<i5 und unter Anwendung des ohm beschriebe. <
fahrcns sowie unter Verwendung von 0,1. ο ■
1,0 ml Filtrat wurden 20 Proben von Harn von Schwangeren und 20 Proben von Harn von Nicht-

^S^gKjhwangersn einem Reaktivitätstest bei der Latex- ^^ppl^gfelutiriationsreaktiön uijd der Harnagglutinatiohs- ^fep§0nhibieningsreaktiön unterzogen.·In allen Fäljen waren |fe|&|Su||äeni Harn von Nichtschwahgeren^Hie reaktions- M^^Mörmäea Substanzen yollständig^.entfernt, ^nd ;das im^iiA^.i-Mn'si'-^.iii^. ...„i, ^„tin-i'Hv/i linffti·*¹. iiehl20 Fällen von

|5 'von ft

^K^SnWwriräigati^/^^^^Fäflfen * ^1?MSiiiHaftilvhn SchwaneÄergab bei Verwendung von

cfylnitrilfaser und »·"*-··'·- ifdas^ Ergebnis »

schriebjensn Arbeitsweise J*# Harnprobeivvon Frauen,

(die auf Schwangerschaft Mter&c|if werden sollten,

$itriert,i^i&y(w^

|wurdcn. Dieseif|n^ner^H|ini wuiräe ^em'ilätex-

Agglutinationstest und liem^; Härnagglutinationsinhi-

^ierüngsföst^ üri^rzo^ri^Ejtspi^hende jReaktipnen

?wurilenGünter Verwehdimg^eines vFiltarrörirchens,

h^p Dies

" _de a

Harrl

zur

l^ml nur ein "^positiv« und fzeigt, daß in der Praxis ,binationsn rwischcn «und der Ausbeute an

(der erforderlichen 1

immunologische Schwan

E)fe^g folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel I

78 Harnproben von Nichtschwangeren wurden gemäß dem schematisch erläuterten Verfahren unter Verwendung eines Polyäthylenfilterrohrchens mit einem Innendurchmesser von 4,5 nun, das mit 50 mg

triert, wobei jeweils 0,3 ml .— "-,"«>«« Λ,™*

wurden. Unter Verwendung eines Tropfens dieses flirierten Harns wurde ein Latex-Agglutinationstest auf eulem Objektträger und unter Verwendung von 0,1 ml dieses filtrierten Harns in einem Reagenzglas ein Hämagglutinatipnsinhibierungstest durchaelu 3QCn UUICMgClUIlIl. VJlIlWl ivilryiiuuiij, .u>~»-·

a,«.-.. irteniiiVbnlEi!termäteriaiiwurden^;yieiErgebnisse der Bewertung des nitrierten Harns verglichen.

In Tabelle IV sind diese Ergebnisse zusammengestellt. In 182 Fällen v/ar die richtige Bewertung »schwanger«, und in 11 Fällen war sie »nicht schwanger«. Bei Filtrieren durch Watte ergaben 18FaIIe bei Anwendung der Hämagglutinationsinhibierung und 21 Fälle bei Anwendung der Latex-Agglutination die Bewertung »nicht schwanger«. Dagegen ergaben bei Filtrieren durch die zwei erfindungsgemäßen Filtriermittel 11 Fälle bei beiden Reaktionen

. die Bewertung »nicht schwanger«, was mit der Anzahl der richtigen Bewertungen übereinstimmt. Bei Verwendung des Filtermaterials gsm&S der Erfindung ergaben nur 2 oder 3 Fälle dar Ergebnis »zweifelhaft-positiv« bei dem Harn im frühen Stadium einer Schwangerschaft. Dies ist weniger als die 7 Fälle von »zweifelhaft-positiv«, die bei Filtrieren durch Watte erhalten wurden.

Tabelle IV

Ergebnis der Bewertung von I93 Frauen, die auf Schwangerschaft untersucht wurden

Filter

Hämaggiuiinaiions-

r- „

2S3» Ä

,,.Jl„i«.„ nhne Filtrieren umgesetzt, Watte

2 Fälle »zweifelhaft-positiv«.

Beispiel 2

. , Celluloseacetat

richtig »negativ«. Bei ....

lieferten ₄₅ Latex-Agghitinatiomreaklion

Watte

Polyacrylnitril Unter Verwendung ein*.s polyäthylenröhrchens mit Celluloseacetat

positiv

Beweriung

pseudo» positiv

168 180 179

165 179 180

.-.if. H^x,

7 2 3

7 3 2

negativ

18 11 11

2! 11 Π

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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* 409 «16/429..,

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Claims

2 208 26S

Patentansprüche;

1, Verfahren zum Filtrieren einer ,Harnprobe zum Sehwangerschafi^nabhweis durch immuno* Mi .,jogisehen Nachweis von meflsOhlichem Cliorion- _; gonadotropin im Harn, d a d u r c h g e k e η η - '^'zeichnet, daß eine Fasermasse aus syntheti-' scher Polyakrylnitrilfaser und/oder Celluloseacetät- - faser als Filtermaterial verwendet wird. ι ο

< 2, Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspjruejvi', gekennzeichnet durch ejn.Rohr,._r \ das an die Spit?» einer^; Pipette angesetzt werden V. kann und mit einer Fasermasse aus Cellulose-. acetatfaser und/oder synthetischer Polyacrylnitrilfaser gefüllt ist,

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohr aus Kunststoff besteht.