DE2657089A1

DE2657089A1 - Verfahren und vorrichtung zur schwangerschaftsbestimmung

Info

Publication number: DE2657089A1
Application number: DE19762657089
Authority: DE
Inventors: Upendra Kumar Banik; Morris Lincoln Givner; Guenther Schilling
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1975-12-17
Filing date: 1976-12-16
Publication date: 1977-06-23
Also published as: FR2335846B1; AT354639B; AU1994076A; CA1054515A; FI60935C; JPS5276423A; IL50929A; HK31980A; NZ182697A; ATA931476A; IT1067269B; US4033723A; GB1537537A; DK516976A; BE849555A; IE44238B1; IE44238L; IL50929A0; BR7608467A; MX145110A

Description

PATENTANWÄLTE

PROF. DR. D!*. J. REITSTOTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

D-eOOO MÜNCHEN AO. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (ΟΘ8) 37 63 63 · TELEX 8210206 18A^T U* >* / W O ^ POSTANSCHRIFT: POSTFACH 78O. D-8OOO MÜNCHEN 43

München, 16. Dezember 1976

AMERICAN HOME PRODUCTS

CORPORATION

685 Third Avenue

New York, N.Y.10017 / USA

M/17290

Verfahren und Vorrichtung zur Schwangerschaftsbestimmung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur SchwangerSchäftserkennung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein einfaches und empfindliches Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Erkennung der Schwangerschaft von Frauen. Das Verfahren und die Vorrichtung sind besonders geeignet zur sehr frühzeitigen Erkennung der Schwangerschaft.

Eine einfache und empfindliche Untersuchungsmethode zur Frühdiagnose der menschlichen Schwangerschaft wäre als ein bedeutender Beitrag zur Medizin und für die Gesellschaft anzusehen. Sie wäre beispielsweise vorteilhaft in Fällen unerwünschter Schwangerschaften oder in Fällen mit Abortgefahr, die aus einer frühen

709825/0791

Therapie Hetzen ziehen könnten. Sie wäre auch nützlich für den Mediziner, der Kenntnis von einer frühen Schwangerschaft erlangen würde, vor Verschreiben eines Arzneimittels, das zu Mißbildungen führen kann oder in Fällen, bei denen eine Frau, ohne es zu wissen, einem möglicherweise teratogen wirkenden Arzneimittel ausgesetzt war. Nicht zu vergessen ist auch der wichtige psychologische Faktor für die Frau, sicher zu wissen, ob sie schwanger ist oder nicht.

Die derzeit am häufigsten verwendeten Schwangerschaftstests basieren, auf der Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropine (HCG) in Urinproben durch immunologische Methoden. Diese Untersuchungen beruhen darauf, daß das HCG,das Schwangerschaftsgonadotropin ist und vom Choriongewebe der Placenta schon bald nach der Implantation eines befruchteten Ovums in erhöhten Mengen zur Sekretion gelangt. /Die maximale Sekretion von HCG von über 50 000 i.E. (i.u.) in einer 24—stündigen HarnanSammlung tritt zwischen 56 und 84 Tagen nach der letzten Menstruationsperiode auf, E.H. Venning in ''Text Book of Gynecologic Endocrinology", J.J. Gold, Ed., Harper und Row, New York, 1968, Seiten 95-97/· Diese Untersuchungen sind im allgemeinen zuverlässig zur Schwangerschaftsbestimmung nach etwa dem zwölften Tag, folgend auf die ausgebliebene Menstruationsperiode (d.h. etwa dem vierzigsten Tag der Amenorrhoe) mit einem Fehler von 2 bis 6 % bei korrekter Durchführung, vgl. B.M. Hibbard, Brit. Med. J., 1, 593 (1971) und CA. Horwitz et al., Obstet. Gynecol., 4-3, 693 (197^)· Vor dieser Zeit sind die Untersuchungen jedoch nicht verläßlich, da sie lediglich zur Bestimmung bis zu minimalen Konzentrationen an HCG von etwa 1000 bis 3000 m.i.E./ml Urin geeignet sind. Der Hauptgrund dafür, daß die Empfindlichkeit dieser Tests nicht erhöht werden kann, ist die Vermeidung falscher Resultate durch Substanzen, die kreuzweise mit dem HCG-Antiserum reagieren, B.M. Hobson, J. Reprod. Fertil., 12, 33 (1966).

In jüngerer Zeit wurden empfindlichere Testmethoden entwickelt. Diese neueren Untersuchungen basieren auf empfindlichen, Jedoch manchmal unspezifischen Radioimmunountersuchungstechniken (RIA).

709825/0791

Die. Unspezifität dieser Untersuchungen kommt daher, da sie auch positive Ergebnisse mit anderen Gonadotropinen ergeben, wie dem menschlichen luteinisxerenden, Hypophysen-Hormon (LH), d.h. die Antisera für HCG können kreuzweise mit LH reagieren. Bei der Anwendung der unspezifischen RIA-Techniken hat es sich gezeigt, daß LH-HCG, beginnend 10 bis 14 Tage nach- dem Mittelzyklus-LH-Peak im ersten Schwangerschaftsmonat scharf anzusteigen beginnen. Vergl. beispielsweise R.B. Jaffe et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 29, 1281 (1969); A.F. Parlow et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 31, 213 (1970); D.P. Goldstein et al., Fertil, Steril., 23, 817 (1972), L. Vide, Lancet, 2, 863 (1969) und D.H. Mishell, Jr. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 117, 631 (1973).

Es wurde auch eine RIA entwickelt, die spezifisch für die Beta-Untereinheit von HCG ist. Diese letztere Untersuchung wurde zur Messung von Serum- oder Plasma-HCG durch RIA in Anwesenheit von zirkulierendem LH vrährend der gleichen frühen Schwangerschaftsperiode verwendet. Vergl. beispielsweise L. Wide, Lancet, 2, (1969), T.S. Kosasa et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 36, 622 (1973); un-d T.S. Kosasa et al., Obstet. Gynecol., 42, 868 (1973).

Die RIA-Techniken sind zwar empfindlich, sind jedoch kostspielig und komplex. Ihre Durchführung erfordert ein gut geschultes Personal, die Anwendung von Isotopen-Material und eine hochentwickelte Ausrüstung.

Einen weiteren Test stellt die Radio-Rezeptor-Untersuchung auf HCG dar, die kürzlich von B.B. Saxena et al., Science, 184, 793 (1974) entwickelt wurde. Diese Untersuchung ist zwar weniger zeitaufwendig als die RIA, erfordert jedoch sowohl eine spezielle Ausrüstung als auch ein Personal, das besonders geschult ist.

Eine weitere Gruppe von Schwangerschaftsuntersuchungsmethoden stellen die biologischen Tests einschließlich des bekannten "Kaninchentests" dar. Hierzu und bezüglich anderer Untersuchungsme-

709825/0791

thoden sei auf B.M. Hobson, loc. cit. hingewiesen. Es ist jedoch bekannt, daß diese biologischen Tests mühsam und zeitraubend sind. Darüberhinaus erfordern sie die Haltung von Tieren, wobei in Betracht zu ziehen ist, daß die Tiere in ihrer Empfindlichkeit jahreszeitlichen Schwankungen unterliegen.

Es wurden auch andere Schwangerschaftstests beschrieben. Diese anderen.Untersuchungsmethoden hängen von der Bewertung der Serumsteroidspiegel oder der Beobachtung der Abbruchblutungen ab nach der Therapie von Progestogen allein oder von Progestogenöstrogen. Diese Untersuchungen werden als weniger zuverläßlich angesehen als die anderen, vorstehend diskutierten Methoden.

Im Hinblick auf das Bedürfnis nach einer einfachen und empfindlichen Untersuchungsmethode zur Schwangerschaftsbestimmung werden durch die vorliegende Erfindung eine Methode und eine Vorrichtung für eine derartige Untersuchung geschaffen, die auf dem Konzept der Ultrafiltration von Körperflüssigkeit (z.B. Urin, Serum oder Plasma) gefolgt von der immunologischen Bestimmung von HCG basiert. Die Ultrafiltration wurde zum Konzentrieren von ursprünglich hohen Titern an "tromboplastischem Tumor-HCG" in Urin verwendet, vgl. M.L. Taymor et al., J. Endocrinol., 36, 4-17 (1966) und S. Lok, Asian J. Med., 9» 319 O973)· Derartige Tumore produzieren hohe Spiegel an "tromboplastischem HCG", die weit über den durch die Schwangerschaft bedingten liegen. Taymor et al. konzentrierten den Urin mit hohem "tromboplastischem HCG-Titer" in einer auf die Reinigung dieses Gonadotropins gerichteten Stufe. Zufällig treten diese Tumore nur selten auf. Es sei erwähnt, daß tromboplastische Tumore erfindungsgemäß einen positiven Test ergeben. Erweist sich dementsprechend, in einem Falle, bei dem die erfindungsgemäße Methode zu einem positiven Test geführt hat, später, daß keine Schwangerschaft vorliegt, so sind derartige HCG bildende Tumore zu vermuten.

. Durch die Erfindung werden eine zweckmäßige Methode und Vorrichtung zur Schwangerschaftserkennung, insbesondere zur Früherkennung

709825/0791

geschaffen, wobei die Methode zuverlässig und leicht durchzuführen ist. Darüberhinaus wird durch die Erfindung ein Verfahren geschaffen, das im Vergleich zu bekannten, nicht radioaktiven Methoden zu einer Verringerung falscher positiver und falscher negativer Ergebnisse führt.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird eine einfache und empfindliche Schwangerschaftsuntersuchungsmethode zur Bestimmung von HCG oder seiner Beta-Untereinheit im Urin oder dem Serum eines Lebewesens, insbesondere im Urin oder Serum von Frauen, durch ein Verfahren bewirkt, das darin bes'teht:

(a) die Urin- oder Serumprobe durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekülsperre ("Molekül-cut-off"), die die Membran für menschliches Choriongonadotropin impermeabel macht, zu konzentrieren und

(b) die Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin oder seiner Beta-Untereinheit in der konzentrierten Probe auf immunologische oder physikalische Weise, vorzugsweise durch einen Agglutinations- oder Agglutinationsinhibierungs-Test zu ermitteln.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorstehenden Methode umfaßt eine Klärungs-Stufe für die Urinprobe durch Filtrieren oder Zentrifugieren vor dem Konzentrieren.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird eine Vorrichtung geschaffen, die zur Schwangerschaftsermittlung einschließlich der Frühermittlung mittels durch Ultrafiltration konzentrierter biologischer Flüssigkeit aus der Gruppe von Urin und Serum, die menschliches Choriongonadotropin und/oder eine Subeinheit davon enthält, geeignet ist. Die Vorrichtung umfaßt eine am oberen Ende offene und am unteren Ende geschlossene Kammer, bei der der obere Teil mindestens einer Wand aus einer Ultrafiltrationsmembran ge-

709825/0791

■i.

bildet wird, die für Urin oder Serum permeabel ist und dazu geeignet ist, menschliches Choriongonadotropin selektiv zurückzuhalten, und bei der alle übrigen Wände aus einem starren impermeablen Material bestehen. Die Vorrichtung umfaßt weiter eine Absorbensschicht, die dazu geeignet ist, Urin oder Serum, die durch die Membran gelangen, aufzusaugen, die sich in Nachbarschaft zur äußeren Oberfläche der Membran und in einem wirksamen Kontakt mit der Membran befindet. Die Kammer umfaßt darüberhinaus einen unteren Teil, dessen gesamte Wände impermeabel sind, um ein bestimmtes Volumen an Urin- oder Serum-Konzentrat, das menschliches Choriongonadotropin enthält, zurückzuhalten, Auslaßeinrichtungen im unteren Teil der Kammer, Einrichtungen zur öffnung der Auslaßeinrichtungen und einen Reagens-Aufnahmebehälter, der mit der Kammer durch die Auslaßeinrichtungen verbunden ist. Der Reagensaufnahmebehälter ist zur Aufnahme des Reagens zur immunologischen Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropine oder seiner Beta-Subeinheit geeignet und umfaßt Einrichtungen zur Überwachung der Reaktion des darin enthaltenen Reagens mit dem das menschliche Choriongonadotropin enthaltenden Urin- oder Serum-Konzentrat.

Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung schließt ein Filter ein, das zur Filtration von in die Kammer einzubringendem Urin angebracht ist.

Der hier verwendete Ausdruck "Molekülsperre" ("Molekül-cut-off") bezieht sich auf die Fähigkeit einer Ultrafiltrationsmembran 80 bis 100 % der Moleküle mit einem Molekulargewicht zurückzuhalten, das gleich oder größer ist als die Zahl, die diesem Ausdruck beigefügt wird, wohingegen Moleküle, die ein geringeres Molekulargewicht aufweisen, durch die Membran hindurchtreten.

Der hier verwendete Ausdruck "falsches positives Ergebnis" soll das Auftreten positiver Testergebnisse für den Fall bezeichnen, wo durch andere Methoden eindeutig gezeigt werden kann, daß das

709825/0791

M/17290 - ψ-

Testergebnis negativ sein sollte.

Der hier verwendete Ausdruck "erwarteter Menstruationszeitpunkt" bezieht sich auf den achtundzwanzigsten Tag nach dem ersten Tag der letzten Menstruation.

Für den Gonadotropin-Fachmann ist ersichtlich, daß die immunologische Bestimmung der Beta-Untereinheit von HCG möglich ist, unabhängig davon, ob die Beta-Untereinheit getrennt vorliegt oder in das HCG-Molekül eingearbeitet ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der Beta-Untereinheit in jeder Form wirksam.

Die erste Stufe der erfindungsgemäßen Schwangerschaftsuntersuchungsmethode besteht in der Konzentration einer Urin- oder Serum-Probe durch Ultrafiltration. Im Falle der Konzentration von Urin wird vorzugsweise eine Probe des ersten Korgenurins verwendet. Die Ultrafiltration wird mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran durchgeführt. Eine Anzahl derartiger Ultrafiltrationsmembranen ist in den folgenden -Literaturstellen beschrieben: V.F. Blatt in "Methods in Enzymology" "Vol. XXII, W.B. Jakoby, Ed., Academic Press, New York und London, 1971; 7.E. Pollak et al., J. Lab. Clin. Med., 71, 338 (1968); W.F. Blatt et al., Nature, 216, 51* (1967); und W.F. Blatt et al., Science, 150, 224 (1965); sowie in der US-Patentschrift 3 549 016 vom 22. Dezember 1970 und der US-Patentschrift 3 6I5 024 vom 26. Oktober 1971.

Beispiele für geeignete Ultrafiltrationsmembranen umfassen solche vom Typ anisotroper aromatischer Polymerer, beispielsweise mit den Handelsnamen Diaflö PK-10, Diaflo PM-20 (Amicon Corp) und Diaflo PM-30 (Amicon Corp) und lopor AP und lopor XP (Dorr-01iver, Stamford, Conn.); Membranen vom anisotropen Cellulosetyp, beispielsweise HFA-100 und HFA-200 (Abcor Inc., Cambridge, Mass.) und PSED (Millipore Corp., Bedford, Mass.); und Gelcellophan, wie beispielsweise hergestellt von du Pont Chemicals, Wilmington, Delaware oder von der Union Carbide, N.Y.C.

709825/0791

M/17290

Die Methoden und Vorrichtungen zur Konzentration durch Ultrafiltration der vorstehenden Probe sind in den vorstehenden Literatursteilen beschrieben, die die Ultrafiltrationsmembranen betreffen. Besonders nützliche Ausführungsformen für Ultrafiltrations-Konzentrationsvorrichtungen werden auch von E.M. Zipilivan et al.,, in der US-Patentschrift 3 817 379 vom 18. Juni 1974 beschrieben. Diese Literaturstelle soll in ihrer Gesamtheit durch die vorliegende Beschreibung umfaßt werden.

Die zweite Stufe der erfindungsgemäßen Verfahrensweise umfaßt die Bestimmung von HCG in der konzentrierten Probe. Bevorzugte Testmethoden zur Bestimmung der Anwesenheit von HCG in der konzentrierten Urin- oder Serumprobe sind immunologische Tests, die als Agglutinations- oder Agglutinations-Inhibierungs-Tests bezeichnet werden.

Die Agglutinationstest basieren auf der direkten Reaktion von HCG und einem HCG-Antikörper, vgl. beispielsweise H. Pink und A. Prie, Obstet. Gynecol., 28, 660 (1966).

Die Agglutinations-Inhibierungs-Tests basieren auf einer Inhibierung der Reaktion zwischen HCG-Antiserum und HCG auf einem Träger, beispielsweise roten Blutkörperchen oder Latexpartikeln. Der letztgenannte Test unter Anwendung roter Blutkörperchen ist als Hämagglutinations-Inhibierungs-Test bekannt und unter Anwendung von Latexpartikeln als Latex-Agglutinations-Inliibierungs-Test bekannt. Vgl. beispielsweise L. Wide und CA. Gemzell, Acta Endocrinol., 35, 261 (1960); B.M. Hobson, J. Reprod. Pert., 12, 33 (1966) und die dort genannten Literaturstellen, B.M. Hibbard, Brit. Med. J., 1, 593 (1971); US-Pateritschrift 3 548 051 vom 15. Dezember 1970, US-Patentschrift 3 551 555 vom 29. Dezember 1970 und US-Patentschrift 3 666 421 vom 30. Mai 1972.

Der für die vorstehenden Untersuchungen erforderliche HCG-Antikörper ist bekannt. Die Herstellung des Antikörpers wurde mehrfach beschrieben, beispielsweise von Wide und Gemzell, loc. cit.

709825/0791

und A.R. Midgley et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108, 85 (1961). Falls gewünscht, kann das HCG durch. Anwendung eines speziellen Antiserums für die Beta-Untereinheit von HCG bestimmt werden, vgl. J. Vaitukaitis et al., J. Clin. Endocrinol., 33, 988 (1971) und Amer. J. Obstet. Gynecol., 113, 751 (1972). Verwendet man das spezielle Antiserum für die Beta-Untereinheit von HCG, so wird selbstverständlich die Anwesenheit der Beta-Untereinheit als solche sowie von intaktem HCG bestimmt. (Es ist bekannt, daß die Beta-Unterheit von HCG leicht vom HCG abdisoziiert).

Testausrüstungen ("Test kits") zur Bestimmung von HCG in Urin- und Serumproben gemäß der erfindungsgemäßen Verfahrensweise sind im Handel erhältlich, beispielsweise Hämagglutinations-Inhibierungs-Testausrüstungen ("kits"), z.B. Pregnosticon All-in* (Organon, Holland und USA) und UCG* (Wampole Laboratories, Stamford, Conn.); Latexagglutinations-Inhibierungs-Testausrüstungen, z.B. Pianotest*, Pregnosticon-Dri-Dot* (Organon, Holland und USA), Gravindex* (Ortho, Raritan, N.J., USA) und Prepurex* oder Prepurin* (Burroughs Wellcome, USA und Großbritannien); und direkter Agglutinationstest, z.B. DAP-Test (Denver Biologicals Co., USA) und Gonavislide (Molter GmbH, Westdeutschland). (* Handelsnamen).

Insbesondere wird bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrensweise eine Probe von weiblichem Urin oder Serum (beispielsweise eine Probe von 5 bis 50 ml), wobei der Urin vorzugsweise durch Filtrieren durch ein geeignetes Filterpapier oder durch Zentrifugieren geklärt wurde, auf das 10- bis 500-fache, vorzugsweise das 10- bis 50-fache konzentriert, wobei man die Probe in Kontakt mit einer Ultrafiltrationsmembran bringt, die einen Molekülsperrbereich von etwa 10 000 bis etwa 50 000, vor zugsweise etwa 15 OOOIbis 35 000 aufweist.

Mit anderen Worten, haben sich eine untere Grenze von 10 000 oder vorzugsweise 15 000 und eine obere Grenze von 50 000, vorzugsweise eine obere Grenze von 35 000 als nützlich erwiesen.

709825/0791

Die Probe,wird durch die Membran filtriert, bis der nicht filtrierte Teil der Probe (Eetentat) das gewünschte Konzentrationsausmaß erreicht hat, beispielsweise bis ein Retentat mit einem Yolumen von 0,1 bis 5»0 ml erzielt wird. Die Konzentrationsstufe wird gewöhnlich bei Temperaturen von etwa O bis 40 C, vorzugsweise 4 bis 25°C durchgeführt und erfordert im allgemeinen 1 bis 2 Stunden. Das Filtrat wird verworfen und das Retentat einem immunologischen Test auf HCG entsprechend einer der vorstehend beschriebenen Methoden unterzogen.

Die wässrige Lösung des konzentrierten Urins oder Serums wird in einem Fläschchen bzw. einer Ampulle mit der regulär empfohlenen Menge einer lyophilisierten Mischung von HCG- oder Beta-HCG-Antiserum, Erythrocyten oder Latexteilchen, die mit HCG- sensibilisiert sind, Puffer, Konservierungsmittel und Excipienten vermischt, Nach Stehen der Mischung während etwa 1 bis 2 Stunden zeigt sich eine positive Reaktion durch ein spezielles Sedimentationsmuster in Form eines klar definierten Ringes am Boden der Ampulle, falls die Ampulle einen runden Boden aufweist, oder in Form eines Punktes bzw. Tupfans, falls das Fiäschchen einen konisch geformten Boden aufweist; eine negative Reaktion wird durch ein diffuses, gelbbraunes Sediment angezeigt.

Alternativ werden Latexagglutinations- oder direkte Agglutinationstests, wie vorstehend beschrieben, zur Bestimmung von HCG in der wässrigen Lösung des konzentrierten Urins verwendet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend gezeigten erfindungsgemäßen Praxis hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die innere Oberfläche der Könzentrationsvorrichtung, d.h. der Kammer, die die Ultrafiltrationsmembran enthält, einer Vorwäsche mit etwa einer 0,1 bis 5 %-igen, vorzugsweise 0,1 bis 1,0 %-igen wässrigen Lösung von Rinderserumalbuminlösung (BSA) zu unterziehen, um einen Kontakt der Innenflächen des Konzentrationsgefäßes während etwa 1 Minute vor dem Einbringen der Urinprobe in das Konzentrationsgefäß herzustellen. Diese Modifikation führt zu deutlicher definierten positiven und negativen Reaktionen und verbessert die

709826/0791

M/17290 S

Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Blockierung der Absorption von HCG an der Oberfläche der Vorrichtung.

Es wurde auch gefunden, daß man die gleichen vorteilhaften Ergebnisse erzielt, wenn BSA zur Wäsche des vorstehend genannten Filterpapiers verwendet wird, das zur Filtration der Urin- oder Serumprobe eingesetzt wird, oder wenn BSA direkt d'er ursprünglich gesammelten Urinprobe zugesetzt wird, unter Bildung einer Konzentration von 0,001 bis 1,0 %, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 %, BSA in dem Urin.

Andere Proteine als BSA sind ebenfalls für den vorstehenden Zweck geeignet; z.B. menschliches Serumalbumin, Gamma-Globulin (sowohl vom Rind als auch vom Menschen), Myoglobin, Fibrinogen, menschliches Hämoglobin, Gelatine und Hämocyanin der Schlüssellochschnecke sowie Ei-Albumin.

Die Konzentration einer verdünnten Lösung von HCG auf einen Wert für die HCG-Konzentration,der in den Empfindlichkeitsbereich eines bestimmten Tests fällt, steht in direktem Widerspruch zu der kumulativen Erfahrung mit immunologischen Tests zur Bestimmung von HCG in Körperflüssigkeiten. Zunächst ist ersichtlich, daß durch Konzentrieren von Körperflüssigkeiten, wie Urin und Serum, auch Substanzen konzentriert werden, die den.immunologischen Test stören. Außerdem wurde berichtet, daß man durch Konzentrieren von Körperflüssigkeiten, wie Urin, häufiger zu falschen positiven Ergebnissen gelangt; vgl. beispielsweise L. Wide, Acta Endocrinol., Suppl., 70 (1962), S. 95 und 100 und M. Hobson, loc. cit., Seite 4-3.

Insbesondere empfiehlt Wide sehr, immunologische^Untersuchungen so durchzuführen, daß ein positiver Test lediglich dann erhalten wird, wenn die Konzentration an HCG in Urin 1000 oder mehr miE/ml beträgt. Ansonsten kann der Gehalt an LH oder menschlichem Klimakteriums-Gonadotropin, das in einigen Proben vorliegen kann, die Spezifität der HCG-Untersuchung stören und zu falschen positiven

709825/0791

Ergebnissen führen.

Ein Versuch, diese Situation zu meistern, wird von R.T. Fisk in der US-Patentschrift 3-171 783 vom 2. März 1965 beschrieben. Nach der Methode von Fisk, die komplizierter ist als die erfindungsgemäße Ultrafiltrationsmethode, wird HCG im Urin durch Absorption an Kaolin konzentriert. Jedoch müssen nach der Absorption des HCG' gemäß dieser Verfahrensweise mindestens drei weitere Stufen durchgeführt werden, bevor ein immunologischer Test auf HCG durchgeführt werden kann. Eine ähnliche aufwenige Technik, die ebenfalls auf der Absorption von Kaolin basiert, wurde von E.H. Hon und J. McL. Morris, Yale J. Biol. Med., 27, 178 (.1954) beschrieben. Ein weiterer Hinweis auf die Kompliziertheit dieser beiden Methoden ist darin zu sehen, daß sie niemals in der Praxis Verbreitung gefunden haben, vgl. Hobson, loc. cit. und Hibbard, loc. cit. Auch führen diese letztgenannten Methoden und eine weitere verwandte bekannte Methode, B.M. Hobson und L. Wide, Acta Endocrinol., 46, 632 (1964), zu einem etwa 50 %-igen Aktivitätsverlust des Gonadotropins, wodurch sich ein Empfindlichkeitsverlust ergibt; auch besteht in einigen Fällen die Möglichkeit falscher positiver Ergebnisse, z.B. bei Urinproben, Frauen vor dem Klimakterium,während des Klimakteriums oder nach dem Klimakterium.

Die beigefügten Figuren 1 bis 14 zeigen verschiedene Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Die Figur 1 stellt eine perspektivische·- Ansicht der inneren und äußeren Komponenten einer Ausführungsform der Vorrichtung, räumlich getrennt vor der Einführung des Innenteils in den äußeren Teil dar.*

Die Figur 2 zeigt einen senkrechten Querschnitt des inneren und . äußeren Bestandteils der Figur 1 in fixierter Betriebsbeziehung/ vor der Urinkoüzentration.

709825/0791

Die Figur 3 zeigt einen senkrechten Schnitt der inneren und äußeren Bestandteile der Figur Λ in betriebsbereiter Beziehung nach der'Konzentration von Urin, wobei der innere Bestandteil teilweise herausgezogen wurde.

Die Figur 4 stellt einen waagerechten Querschnitt längs der Linie 4-4 der Figur 2 dar.

Die Figur 5 veranschaulicht einen vergrößerten Teilschnitt der Figur 2 und zeigt zusätzlich das Urinkonzentrat.

Die Figur 4 stellt einen senkrechten Schnitt ähnlich der Figur einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Anwendung auf ein vorgewähltes Urinvolumen dar.

Die Figur 6A zeigt einen vergrößerten Teilschnitt der Figur 6 ähnlich der Figur 5; sie befindet sich auf einem weiteren Bogen der beigefügten Zeichnungen.

Die Figur 6B stellt einen senkrechten Teilschnitt ähnlich der Figur 3 von der Ausführungsform der Figur 6 dar.

Die Figur 6C stellt einen vergrößerten Teilschnitt der Figur 6B dar.

Die Figur 7 stellt einen senkrechten Schnitt einer Ausführungsform ähnlich der in Figur 6 gezeigten dar, die jedoch eine abtrennbare Reaktionskammer aufweist; sie befindet sich auf dem gleichen Blatt wie die Figur 5·

Die Figur 7A stellt einen senkrechten Schnitt der Ausführungsform der Figur 7 dar, wobei der innere Bestandteil teilweise herausgezogen würde.

Die Figur 8 ist ein waagerechter Querschnitt längs der Linie 8-8 der Figur 6.

709825/0791

M/17290 W

Die Figur 9» die sich, auf dem Bogen mit der Figur 5 befindet, stellt einen Schnitt durch die getrennte Reaktionskammer der Figur 7» die zur Analyse montiert wurde, dar.

Die Figur 10 ist ein senkrechter Schnitt einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Die Figur 11 zeigt einen waagerechten Querschnitt längs der Linie 11-11 der Figur 10.

Die Figur 12 zeigt eine perspektivische Ansicht der Membran einschließlich des unteren impermeablen Abschnitts der Ausführungsform der Figur 10. · .

Die Figur 13 stellt einen senkrechten Schnitt durch eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar.

Die Figur 14 zeigt einen senkrechten Schnitt einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, und

die Figur 15 zeigt ein Schema der vorliegenden Erfindung.

Gemäß einem Beispiel für eine Ausführungsform der Erfindung wird eine Urinprobe durch Anwendung einer Minicon-B-15 (Handelsname) Ultrafiltrationskonzentrationsvorrichtung der Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA durchgeführt. Nach den Angaben des Herstellers basiert die Minicon-B-15-Vorrichtung auf dem Prinzip der Stützung einer anisotropen Diaflo-Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekülsperre von 15 000 durch Absorbensunterlagen. Bei einem anderen Ansatz würde die Konzentrationsvorrichtung Minicon-PM-30 des gleichen Herstellers verwendet. Diese Vorrichtung basiert auf dem gleichen Prinzip wie die Vorrichtung Minicon-ß-15 und weist eine Molekülsperre von 30 000 auf. Diese Konzentrations-. vorrichtungen sind in der vorstehend genannten US-Patentschrift 3 817 379 beschrieben.

709825/0791

M/17290 - - f

-At-

Bei der vorliegenden Ausführungsform wurde eine Probe von 5 ml des ersten Morgenurins durch ein Whatman-Filterpapier ITr. 1 filtriert und durch Einbringen der Probe in einen Schacht der Minicon-B-15-Konzentrationsvorrichtung konzentriert. Während der Konzentrationsstufe wurde die Konzentrationsvorrichtung bei einer Umgebungstemperatur von etwa 4⁰C stehengelassen. Nach etwa 2.Stunden war die Probe auf etwa 0,1 ml konzentriert. Der konzentrierte Urin (Retentät) wurde aus der Konzentriervorrichtung entnommen und mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 0,5 ml rückverdünnt, wobei man die wässrige Lösung des konzentrierten Urins erhielt. Die Entnahme des Retentats erfolgte mittels einer feinen Pasteur-Pipette. Anschließend wurde die wässrige Lösung des konzentrierten Urins auf die Anwesenheit von HCG mittels einer Testausrüstung zur Bestimmung von HCG im Urin besteht. Die Testausrüstung war eine sogenannte Pregnosticon-All-in-Ausrüstung auf der Basis des Hämagglutinations-Inhibierungstests.

Der innere Bestandteil 1 der Figur 1 besteht aus einem Stab 2 und AbStandsringen 3 und 4, die mit der Ultrafiltrationsmembran 5 verbunden sind-, die ein Absorbens 6 umgibt. Der Stab 2 ist mit einem Griff 7 zur leichteren Einführung und Entnahme ausgerüstet, sowie mit einem Endteil, das sich nach dem Ring 4- befindet und als Stopfen wirkt. Die Ringe 3 und 4 umgeben den Stab 2, wobei der Ring 4 sich impermeabel abgeschlossen am Stab 2 befindet und der Ring 3 derart gestaltet ist, daß Luft aus dem Absorbens 6 entweichen kann.

Der äußere Bestandteil 8 besteht aus Innenwänden und Außenwänden 9 bzw. 10, die durch ein Teil 11 verbunden sind, das eine trichterförmige obere öffnung 12 bildet. Die Innenwände und Außenwände 9 bzw. 10 umschließen ein Absorbens 13.

In der Figur 2 ist der Bestandteil 8 zur Aufnahme des inneren Bestandteils 1 unter Bildung eines ringförmigen Raumes 14 angepaßt

709825/0791

M/17290 y6

und am unteren Abschnitt seiner·Wand 15 zur Aufnahme des Ringes 4 und des unteren Endabschnitts des Stabes 2 unter für Fluide impermeablen Verschluß geeignet. Der äußere Bestandteil 8 umschließt völlig einen anhängenden Aufnahmebehälter 17 für das Reagens, der das Reagens 17a enthält. Auch die innere Wand 9 des äußeren Bestandteils 8 weist eine öffnung 18 in der Wand 9 auf, die zum Absorbens 13 führt.

Bei der Anwendung der in den Figuren 1 bis 5 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsformen für die Schwangerschaftsuntersuchung wird eine Urinprobe der Frau beispielsweise durch ein Filterpapier Whatman, Nr. 1, filtriert oder beispielsweise bei 3 000 Upm während 5 Minuten zentrifugiert und in die trichterförmige obere Öffnung 12 der in Figur 2 gezeigten Einheit gegossen. Der Urin fließt abwärts und füllt den ringförmigen Raum 14 und jeglicher Überschuß über beispielsweise 5 ml strömt durch die öffnung 18 und wird vom Absorbens 13 absorbiert. Die Ultrafiltrationsmembran 5 wird so gewählt, daß eine Molekülsperre von etwa 10 000 bis 50 000, vorzugsweise 15 000 bis 35 000, vorliegt, so daß menschliches Choriongonadotropin nicht passieren kann. Derartige Membranen sind im vorstehenden beschrieben.

Ein Teil des Urins im ringförmigen Raum 14 durchläuft die Ultrafiltrationsmembran 5 und wird vom Absorbens 6 absorbiert, wobei die verdrängte Luft -aufwärts durch den Ring 3 strömt. Erreicht das Konzentrat im ringförmigen Raum 14 die obere Fläche des Ringes 4, d.h. die impermeable Unterbrechungszone, nach etwa 2 Stunden, so kann keine weitere Konzentration stattfinden, wie bei in der Figur 5 gezeigt und das Konzentrat nimmt eine vorbestimmte Menge, beispielsweise 0,5 ml» ein. Der innere Bestandteil 1 wird aus dem äußeren Bestandteil 8 entnommen, wodurch das Konzentrat um den Endabschnitt des Stabes 2, der sich unterhalb des Ringes · 4 befindet (d.h. dem Stopfenteil des Stabes 2) in das Aufnahmegefäß 17 fließen kann.

709825/0791

2657Q89

M/17290 -f

In dem Aufnahmebehälter 17 befindet sich ein Reagens 17a, nämlich eine lyophilisierte Mischung von HCG- oder ß-HCG-Antiserum, Erythrocyten oder Latexteilchen, die mit HCG sensibilisiert wurden, Puffer, Konservierungsmittel und Excipienten.

Each 1 1/2 bis 2 Stunden erfolgt eine Ablesung und, falls eine Schwangerschaft vorliegt, tritt ein spezielles Sedimentationsmuster in Form eines klar definierten Ringes oder Tupfens, ^e nach der Form des Bodens des Behälters 17, d.h. einer runden oder keilförmigen Bodenform, auf. Erscheint kein Ring oder Tupfen, so liegt keine Schwangerschaft vor. Zur Ablesung der Testergebnisse kann der Stab 2 aus Glas oder einem klaren Kunststoffmaterial hergestellt sein, so daß der Ring'oder der Tupfen durch einen Blick entlang des Stabes sichtbar gemacht werden kann. In diesem Falle besteht der untere Teil der Kammer 17 aus einem lichtdurchlässigen Material. Ein Spiegel 20, der sich unter der Kammer 17, wie in Figur 6 gezeigt, befindet, erleichtert die Ablesung der Testergebnisse.

Die Figuren 6,- 6A, 6B, 6C und 8 zeigen eine altex'native Ausführungsform, bei der die Vorrichtung keine Uberströmungsmöglichkeit besitzt und eine vorherige Abmessung der Urinprobe erfordert. Daher ist die innere Komponente 1 gleich und die äußere Komponente weist keine Außenwand 10 und kein Absorbens 13 auf.

Die Figuren 7i 7 A und 9 zeigen eine weitere Ausführungsform,in der der Bestandteil 1 gleich ist und der äußerei-.iBestandteil aus zwei Stücken konstruiert ist. So besteht in der Figur 7 der äußere Bestandteil aus der Wand 9, dem unteren Teil der Wand 15 und dem Röhrchen 21. Der Behälter 22 umgibt von unten her in abziehbarer V/eise das Röhrchen 21 und weist eine abschließende Membran 23 auf, die einen geschlossenen Abschnitt 24 bildet, der das Reagens 17A enthält.

709825/0791

M/17290 - φ -

In der Figur 7A wird die Membran 23 in zerbrochener Weise nach weiterem Einführen des Röhrchens 21 in den Aufnahmebehälter 22 gezeigt, wobei der innere Bestandteil 1 teilweise wieder herausgezogen wurde bzw. sich in angehobener Stellung befindet.

Die Figur 9 zeigt das Aufnahmegefäß 22 getrennt vom Röhrchen 21 der Figur 7» montiert auf ein Trägergestellt 25» das auch einen Spiegel 20 aufweist.

In der Ausführungsform der Figuren 10 und 11 liegt die Kammer 26 in Form eines quadratischen Prismas vor und wird durch undurchlässige Wände 27, 28, 29 und 30 definiert. Innerhalb der Kammer 26 befindet sich die pyramidenförmige Ultrafiltrationsmembran 3^, die an ihrer Außenseite vom Absorbens 32 umgeben ist. Innerhalb des Raumes 32a, der durch die pyramidenförmige Membran 31 (einschließlich des pyramidenförmigen unteren Abschnitts 32b, der flüssigkeit sundurchlässig ist, d.h. einschließlich der "toten Unterbrechungszone") befindet sich eine Ampulle 33, die das unter Vakuum gehaltene Reagens 3^- enthält. Im unteren Abschnitt 32b befindet sich eine Vertiefung 35, die zur genau passenden Aufnahme des Rohrs 36 der Ampulle 33 geeignet ist. Bei dieser Ausführungsform befindet sich das Rohr 36 am Punkt 32c, der dem Boden des undurchlässigen unteren Teils 32b entspricht, in einer Vorspannung.

Die Pyramidenform des Teils 31 einschließlich seines unteren Abschnitts 32b der Ausführungsform der Figuren 10und 11 ist in der Figur 12 dargestellt.

Bei Betrieb der Ausführungsform der Figur 10 wird Urin in den die Ampulle 33 umgebenden Raum 32a eingebracht und auf ein Retentaο · konzentriert. Die Ampulle 33, cLie sich in die Vertiefung 35 eingepaßt befindet, wird anschließend an dem Punkt mit Vorspannung gebrochen.- Das Retentat wird so in die vorher evakuierte Ampulle 33 gezogen und in Kontakt mit dem Reagens 34- gebracht. Die Ampulle 33 wird umgedreht, der Inhalt sorgfältig vermischt und anschliessend in den gezeigten Ständer eingebracht. Eine weitere Ausfüh-

..709826/0791

M/17290 f

rungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird in der Figur 13 gezeigt. In der Figur I3 ist eine Basis 37 aufgeführt, die die äußere Wand 38 trägt. Die äußere Wand 58 stützt ein konisch geformtes Teil 39» dessen unterer Abschnitt 40 aus einem für Fluide impermeablen Material gebildet wird und dessen oberer Abschnitt 41 aus einer Ultrafiltrationsmembran besteht. Benachbart zur Membran 41 befindet sich das Absorbens 42 in wirksamem Kontakt mit der äußeren Oberfläche der Membran 41. Unterhalb des undurchlässigen Teils 40 des konisch geformten Teils 39 befindet sich der Reagensbehälter 43; unter dieser Aufnahmekammer 43 befindet sich ein Spiegel 20. Der Anteil der äußeren Wandung 38, die den Reagennbehälter umgibt sowie der Reagensbehälter selbst bestehen aus einem lichtdurchlässigen Material. Über der Außenwand 38 befindet sich eine Kappe 45 mit einer absteigenden Außenumwandung 46 und einem Tauchstift 47 mit spitzigem Ende 48.

Beim Betrieb wird Urin in die Kappe 45 eingemessen, der Urin wird in das konisch geformte Teil 39 gegossen, die Flüssigkeit durchläuft den oberen Abschnitt 41 und in das Absorbens 42 und das Retentat wird innerhalb des impermeablen unteren Abschnitts 40 gesammelt. Nach der Gewinnung des Retentats wird die Kappe 45 nach unten gedruckt, beispielsweise durch ein Schraubgewinde, derart, daß die Spitze 48 des Stößels 47 die undurchlässige Wand 40 des Teils 39 durchbricht. Wird der Stößel 47 herausgezogen, so fließt das Retentat durch die Bruchöffnung in den Reagensempfanger 43. Die Reaktion kann durch Entfernung des Reagensempfängers oder mittels eines Spiegels 20 abgelesen werden, der sich unter dem Reagensempfänger 43 befindet.

In der Figur 14 ist eine weitere Ausführungsform veranschaulicht. Diese Ausführungsform umfaßt eine Basis 49, die ein Teleskopteil

50 trägt. Das Teleskopteil 50 besteht aus einem äußeren Wandteil

51 und einem inneren Wandteil 52, wobei letzteresin dem äußeren Teil gleitend bewegt werden kann. Zwischen dem äußeren Wandteil 51 und der Basis 49 befindet sich ein entfernbares Widerlager 55»

709825/0791

M/17290 - 30 -

um die äußeren und inneren Wandglieder 51 und 52 einander anzupassen. Das äußere Wandteil 51 trägt ein pyramidal geformtes Teil 54, dessen unterer Abschnitt 55 in Form eines für Fluide impermeablen Materials ausgebildet ist und dessen oberer Abschnitt 56 aus einer Ultrafiltrationsmembran besteht. Benachbart zu dem Teil 54 befindet sich das Absorbens 57 in wirksamem Kontakt mit der äußeren Fläche des oberen Teils der Membran 56. Unter dem impermeablen Teil 55 befindet sich der Reagensempfänger 58, getragen von Klammern, die sich an dem unteren Wandteil 52 befinden, und der das Reagens 59 unter Vakuum verschlossen mit einem Gummipfropfen 60 enthält. Ein Hohlrohr 61 erstreckt sich vom Boden des unteren impermeablen Teils 55 abwärts und ist in fluider Fließverbindung mit dem unteren Teil 55» wobei der Pfropfen 60 den Boden des Rohres 61 verschließt. Über dem oberen Teil 5^- befindet'sich, getragen von dem äußeren Wandteil 51» das Filter 62. Die Vorrichtung dieser Ausführungsform ist ferner mit einer entfernbaren Staubkappe 65 und einem Spiegel 20 versehen, der sich unter dem Reagensbehälter 58 befindet.

Beim Betrieb wird-eine vorbestimmte Urinmenge durch das Filter 62 filtriert und in dem pyramidenförmigen Teil 54 gesammelt. Die absorbierbare Flüssigkeit tritt durch den oberen Teil 56 in das Absorbens 57 aus und das Retentat sammelt sich in dem für Fluide undurchlässigen unteren Teil 55 an. Nach Gewinnung des Retentats wird das Widerlager 53 entfernt und die obere Wandung wird gegen die Basis 49 nach unten gestoSen, so daß die untere Spitze des Eohlstabes 61 den Verschluß 60 durchbricht und das Retentat mit Hilfe des Vakuums in den Reagensempfänger 58 fließt. Von der Vorrichtung wird die äußere Wandung 51 von dem inneren Wandglied 52 abgenommen, wobei der untere Teil der Vorrichtung aus der Basis 49, dem inneren Wandteil 52, dem Spiegel 20 und dem Reagensempfänger 58 zurückbleiben. Nach der Reaktion von Retentat und Reagens werden die Reaktionsergebnisse mittels des Spiegels 20, der sich unter dem Empfänger 58 befindet, abgelesen.

709825/0791

M/17290 - φι-

-9H.

Die Figur 15 stellt schematisch die Konzentrationsstufen von Gonadotropin enthaltendem Urin oder Serum mittels der Ultrafiltrationsmembran dar, wobei sich die Membran in wirksamem Kontakt mit einem Absorbens befindet, das zur Absorption biologischer Flüssigkeit unter Bildung eines Retentats geeignet ist, worauf das Retentat mit einem Reagens umgesetzt wird, das zur Bestimmung von Gonadotropin geeignet ist.

Was die zur Herstellung der erfindungsgeinäßen Vorrichtung verwendbaren Materialien betrifft, so befinden sich eine Beschreibung der Ultrafiltrationsmembran und des Absorbens in den vorstehend genannten Literaturstellen, die sich auf Ultrafiltrationsmembranen beziehen, beispielsweise in der US-Patentschrift 3 817 379.

Die übrigen Teile der Vorrichtung können aus jedem geeigneten impermeablen Material bestehen, das leicht zu der gewünschten Form geformt werden kann. Es können Glas oder Kunststoff verwendet werden. Ein thermoplastisches Material oder katalytisch gehärtetes Kunststoffmaterial, beispielsweise Polyäthylen, Polypropylen oder Polystyrol, ist besonders wirtschaftlich und für diesen Zweck geeignet. Die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Methode zur Feststellung von HCG in Urin läßt sich durch ein Beispiel zeigen, bei dem vorbestimmte Mengen an HCG normalem Urin (d.h. HCG-freiem Urin) zugesetzt wurden, der anschließend mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht wurde. Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse solcher Untersuchungen, bei denen eine vorbestimmte HCG-Menge (APL, Handelsprodukt der Ayerst Laboratories, New York, USA) in Urin gelöst wird, der von Frauen am 16. und 17· Tag des regulären Cyclus und von einer Frau nach dem Klimakterium gesammelt wurde, wobei Urinproben mit einem Gehalt von 20, 4-0 und 80 miE/ml HCG hergestellt wurden. (Es sei erwähnt, daß bisher durchgeführte Schwangerschaftsuntersuchungen bei Urinproben solcher Frauen zu "falschen positiven" Ergebnissen führen können). Anschließend wurden die Proben gemäß der hier be-

709825/0791

M/17290

schriebenen Ausführungsform konzentriert und bestimmt, wobei das Konzentrationsgefäß mit Λ % BSA vorgewaschen wurde. Die Urinproben wurden als Kontrollen verwendet und alle Untersuchungen wurden doppelt durchgeführt.

Tabelle I

	Tage nach dem ersten	Gruppen (HCG,	beim erfindungsgemäßen
	Tag der letzten Men	πιϊξ7ει1. im	Verfahren erhaltene Er
Urin	struation oder Post	Urin	gebnisse, stark positiv (++), positiv ( + ;, unbe
probe	al imakt er ium (PM)		stimmt (+), negativ (-)
ITr.			-
I	16	Vergleich	±
I	16	plus HCG (20)	+
1	16	plus HCG (40)
I	16	plus HCG (80)	_
2	17	■Vergleich
2	.17	plus HCG (20)	+
2	17 *	plus HCG (40)	++
2	17	plui, HCG (öO)	-
3	PM	Vergleich	+
3 ·.	PM	plus HCG (40)
3	PM	plus HCG (80)	-
4	• FM	Vergleich	+
4	PM	plus HCG (40)	++
4	PM	plus HCG (00)

709825/0791

M/17290 - 2^

Die Ergebnisse der vorstehenden Untersuchung zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren HCG in Urin in Konzentrationen von 40 miE/ml oder darüber verläßlich aufzeigt. Die Ergebnisse zeigen an, daß die erfindungsgemäße Verfahrensweise bei der Bestimmung von HCG im Urin wesentlich empfindlicher ist als bisherige in vitro Untersuchungen mit Ausnahme der aufwendigen RIA-Methoden und Radiorezeptormethoden, die im vorstehenden erläutert wurden. Die Ergebnisse sind besonders bedeutsam, wenn man bedenkt, daß Konzentrationen von HCG von weniger als 500 miE/ml Urin mittels gegenwärtig weit verbreiteter Schwangerschaftstesteinrichtungen nicht bestimmt werden können (vgl. S.G. Driscoll et al., Am. <J. Obstet. Gynecol., 110, 1083 (1971), D-A. Edelman et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 119, 521 (197²O, H. Hepp und R.H. Richter, Med. Klin., 68, 920 (1973) und Ft.L. Taymor, Medical World News, Feb. 1, Seite 24 (1974). Vergl. auch Medical Letter, 17, 6 (1975). Wie vorstehend erwähnt, führt die Anwendung der üblichen Untersuchungseinrichtungen zur Bestimmung geringerer Konzentrationen an HCC-zu einem häufigen Auftreten von ''falschen positiven" Ergebnissen. Da Konzentrationen von HCG ir· Sch wanger schaft surin von etwa 40 mi E/ ml während der.ersten Schwangerschaftswoehe erhalten werden, "vgl. beispielsweise L. Wide, Lancet, 2, 863 (1969), stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine gute Untersuchungsmethode zur sicheren Bestimmung der Schwangerschaff bereits in der ersten Woche dar.

Die Zuverlässigkeit der erfindungsgeaäßen Methode im Vergleich mit bisher verwendeten in vitro Methoden zur Schwangerschaftεermittlung, insbesondere zur Frühermittlung der Schwangerschaft, zeigt sich bei einer Vergleichsuntersuchung, bei der aufeinanderfolgende tägliche Urinproben untersucht wurden. Beispielsweise veranschaulicht die folgende Tabelle II die Ergebnisse einer derartigen Untersuchung, bei der Urinproben aufeinanderfolgender Tage von Frauen, bei denen eine Schwangerschaft anschließend durch ärztliche Untersuchung bestätigt wurde, gesammelt und "untersucht wurden. Jede tägliche Probe wurde zunächst mittels eines anerkann-

709825/0791

M/17290 - y<

. Vh

ten Hämagglutinations-Inhibierungstests (HIT) anschließend mittels eines Hämagglutinations-Inhibierungstests an einer durch Acetonausfällung konzentrierten Urinprobe (AE-HIT) und schließlich durch Konzentrieren der Probe durch Ultrafiltration, gefolgt von einer Bestimmung des HCG mittels eines Hämagglutinations-Inhibierungstests (UF-HIT) untersucht. Bei der letztgenannten Untersuchung (UF-HIT) wurde die erfindungsgemäße Verfahrensweise unter Anwendung einer Vorwäsche des Konzentrationsgefäßes mittels 1 % BSA angewendet.

Für die HIT-Untersuchung wurde eine handelsübliche Pregnosticon All-in-Einrichtung verwendet. Eine Probe des ersten Morgenurins von 0,1 ml, die zunächst durch ein Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert wurde, wurde mit 0,4- ml destilliertem Wasser verdünnt und die resultierende Mischung einer immunologischen Untersuchung während etwa 2 Stunden unterzogen.

Bei der AE-HIT-Untersuchung .wurde eine bekannte Aceton-Ausfällungsmethode angewendet, vgl. beispielsweise L. Wide und C. Gemzell, Acta Endocrinol., 39> 539 0962). Genauer gesagt, wurden 50 ml des filtrierten (Whatman-Filterpapier Nr. 1) ersten Morgenurins (pH 5»0 durch Zugabe von 1 % Sssigsäure) zu 100 ml kaltem Aceton gefügt. Die Mischung wurde eine Stunde bei 4 bis 10°C gehalten und anschließend während 10 Minuten bei 20-25°C bei 4000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Ausfällung unter einem Luftstrom 10 Minuten und anschließend 10 Minuten in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet. Die getrocknete Ausfällung wurde in 1,25 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde wie vorstehend 5 Minuten zentrifugiert und ein aliquoter Teil von 0,5 ml (äquivalent zu 20 ml ursprünglichem Urin) der überstehenden Flüssigkeit wurde für die HIT-Untersuchung verwendet.

70982B/0791

M/17290

Tabelle II

chwangere

Patientin
ITr. a

untersuchte Urinproben Tor (-) oder nach' (+) uer erwarteten Menstrua-

•fcirm- (O)

Ergebnisse _un]?e_ positiv^+), negativ(-), stimmt (±)

.H!T ÄE-HIT

UF-HIT

65

+ I +2 +3 +4 +5 +6

66

+I' +2 +3 +4 +5 +6

98

-3 -2 -I

O + I

+2 +3

+4 to +8 +9

nicht untersucht

nicht
untersucht

nicht untersucht

709825/0791

M/17290

.2.3.

tabelle II (Fortsetzung)

schwanger- Patientin ITr ,^a	5 untersuchte Urin proben vor (-) ode nach (+) der erwar . teten Menstruation " (O)	Ergebnisse unbe- positiv(+), negativ -(-); stimmt (±)	*AE-HIT	IIF-MIT
I05	-3 . —2 -I O -I 2 3 ■ - · 4 5 6 7 ' ' 8	HIT	/ nicht ι N	+ + + + + + . + nicht unter sucht + + +
nicht unter sucht ' +	\ · mt er sucht /

^a Die Schwangerschaft wurde anschließend in allen Fällen klinisch bestätigt.

Aus den vorstehenden Vergleichsuntersuctiungen kann geschlossen werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren einfacher und zuverlässiger für die Schwangerschaftsbestimmung ist als die genannten bekannten Methoden. Larüberhinaus ist es geeignet, die Schwangerschaft früher.festzustellen als die bekannten Methoden, und ist daher eine empfindlichere Methode.

An einer anderen Gruppe von vier Patientinnen wurde die Schwangerschaft mittels der erfindungsgemäßen Verfahrensweise am zweiten und fünften Tag nach der erwarteten und ausgebliebenen Menstruationsperiode bestimmt. Eine Schwangerschaft konnte während dieser Periode an den gleichen Patientinnen mittels der vorste-

709825/0791

M/17290 -

hend genannten HIT-Bestimmungsmethode nicht festgestellt werden. Anschließend wurde klinisch eine Schwangerschaft in allen vier Fällen bestätigt.

Richtige Ergebnisse wurden auch in Fällen des Ausbleibens der erwarteten Menstruation, jedoch mit späterer Menstruation ermittelt. In diesen Fällen erwiesen sich die negativen Ergebnisse als 100 %-ig" richtig, was durch die nachfolgende Menstruation bestätigt wurde. In vielen Fällen verringerten die negativen Ergebnisse, die mittels der erfindungsgemäßen Arbeitsweise ermittelt werden konnten, Angstzustände während der verzögerten Menstruation sp er i ο de. Die Ergebnisse der letztgenannten Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt, die an Frauen durchgeführt wurden, bei denen später eine Schwangerschaft klinisch als nicht vorhanden bestätigt wurde.

70982B/0791

M/17290

Tabelle III

M-

- Patientin ITr.	untersuchte Urinpro ben Tage vor (-) odei nach (+) der erwarte ten Menstruation (O)	UF-HlT
53	-3 -2 -I erster ^ Cyclus^+I +2 +3 +4 +5	I I I I I I , I I I
	-5 -4 . zwei- -3 ter -2 Cyclus O + I +8	I I I I I I I
55	-I	-
56	+3	-
57	+30	-
58	+ 14	-
59	0	-
60	+ 18	-
6I	+2 +7	-
62	+9	-
65	+4	-
66	-I	-
67	-2	-
69	-6 -5 -4 -3 - O	-
	70982S/OVÖ1

M/17290

Tabelle III (Fortsetzung)

Patientin Nr.	untersuchte Urinpro ben Tage vor (-) ode nach (+) der erwarte ;en Menstruation (0)	UF-HIT
77	+5 + 12
. 83	+8	-
lOO	+2 +5
106	+4 +8
109	+2	-
IiO	-3 -2 0 + 1 +2 +3	-
II2	-4 -3 0 + 1 +2 +3	I I I I I I
II9	+4	-

Es hat sich gezeigt, daß durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise das Auftreten von falschen positiven Ergebnissen wesentlich verringert wird. Dies wird auch durch das Auftreten von sicheren negativen Untersuchungen bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf den Urin von Gruppen von in der Ovulation (Tabelle III) befindlichen und postklimakteriellen Frauen bestä-

709825/0791

M/17290 <

tigt. Es ist bekannt, daß Proben von derartigen Gruppen bei Untersuchung mit üblichen Untersuchungsmethoden zu falschen positiven Ergebnissen führen können.

Die vorstehenden Daten wurden an menschlichen Lebewesen ermittelt, jedoch kann die Erfindung auch zur Schwangerschaftsbestimmung von. weiblichen Lebewesen der Gattung Säugetiere, die ein Gonadotropin bei der Schwangerschaft als Sekret bilden, beispielsweise Pferdearten, verwendet werden.

Der Erfolg der erfindungsgemäßen-Verfahrensweise, die Möglichkeit, winzige Mengen an HCG mit hoher Genauigkeit zu ermitteln, die beträchtliche Verringerung falscher negativer Ergebnisse und die Verringerung falscher positiver Ergebnisse, sind der Wahl einer geeigneten Ultrafiltrationsmembran zu verdanken. Die Membran erlaubt den Durchtritt inerter Materialien sowie von Substanzen, die den nachfolgenden immunologischen Test stören, in das Filtrat, wohingegen das in der Probe der Körperflüssigkeit vorhandende HCG zurückgehalten wird. Auf diese Weise wurde es möglich, die Schwangerschaft schon am 26. Tag eines regulären 26-tägigen Menstruationscyclus festzustellen, ohne auf RIA- oder Eadiorezeptormethoden zurückgreifen zu müssen. In einigen Fällen bedeutet dies, daß die Schwangerschaft schon 10 bis 12 Tage nach der Konzeption festgestellt werden kann, wohingegen die meisten derzeit angewendeten Schwangerschaftsuntersuchungen nicht zu einer Schwangerschaftsbestimmung bis zu etwa 24· bis 26 Tagen nach der Konzeption geeignet sind.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Anwendung der vorstehenden Methode auf die Bestimmung der Hypophysen- und Gonadenfunktion, beispielsweise der Ovulation unter Anwendung von LH—Antikörpern und LH-Antigen im immunologischen Reagens anstelle von HCG-Antikörper und -Antigen.

70982B/0791

M/17290

Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Anwendung der Methode auf die Bestimmung von Östrogen-Mangelzuständen bei Menschen unter Anwendung von Antikörpern, auf die menschlichen Gonadotropine, das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das menschliche Klimakterium-Gonadotropin (HMG).

Geeignete Antikörper, d.h. Anti-LH, N.R. Moudgal und H.G. Madwa Raj, Pituitary Gonadotropins in "Methods of Hormone Eadioimmunoassay", B.M. Jaffe und H.R. Behrman, Ed., Academic Press, New York, 1974-, Seite 75; Anti-FSH, A.H.W.M. Schuurs und CJ. Van Wijngaarden, J. Clin. Endocrinol. Metabol., 40, 619 (1975); und Anti-HMG, B. Lunenfeld et. al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 21, 478 (1961) und Antigene (LH, FSH oder HMG) ersetzen dabei HGG-Antikörper und -Antigen als Basis für diese alternativen Ausführungsformen .

709825/0791

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung von Choriongonadotropin oder seiner Beta-Untereinheit in Urin- oder Serumproben zur Schwangerschaftsermittlung oder zur Ermittlung von physiologischen Zuständen, die zur Anwesenheit von G-onadotropinen im Urin oder Serum führen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die Urin- oder Serumprobe durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Molekülsperre bzw. mit einem Zurückhaltevermögen für Moleküle, die sie impermeabel für menschliches Choriongonadotropin macht, konzentriert und

(b) die Anwesenheit des menschlichen Chorioagonadotropins oder seiner Beta-Untareinheit in der konzentrierten Probe durch eine Agglutinations- oder Agglutinations-Inhibierungsuntersuchung feststellt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekülsperre von etwa 10_ 000 bis etwa 50 000 konzentriert.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mcai durch eine Ultrafiltrationmenoran mit einer Molekülsperre von etwa 15 000 bis etwa 35 000 konzentriert.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe auf das 10- bis 500-fache ihres ursprünglichen Volumens konzentriert.
5- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe auf das 10- bis 50-faohe ihres ursprünglichen Volumens konzentriert.
6. Verfahrer· gernäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man das menschliche Choriongonadotropin durch Agglutinationstests, Hämagglutinations-Inhibierungstests oder den Latex-Agglutina-

709825/0791

ORIGINAL INSPECTED

tions-Inhlbierungstest bestimmt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Urin vor dem Konzentrieren klärt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Urin mit einem Protein behandelt bzw. versetzt.
9. Verfahren gemäß Anspruch Ί- dadurch gekennzeichnet, daß man durch Eiltration durch ein mit einem Protein vorgewaschenes Pilter klärt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert, die vorher mit einem Protein gewaschen wurde.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekonnzeichnet, daß man als Prctein Rinderserumalbumin, menschliches Serumalbumin, ZDial'ournin, y-G-lobulin, Ljyoglobin, Fibrinogen, menschliches Hämoglobin, Gelatine oder Hämocyanin der· Schlüsselrochschnecke verwendet.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das menschliche Choriongonadotropin mittels eines Antiserums für die Beta-Untereinheit des Gonadotropins bestimmt.
13. Vorrichtungzur Durchführung der Schwangerschaftsuntersuchung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin oder seiner Beta-Untereinheit in Urin oder Serum, gekennzeichnet durch:

(a) eine Kammer, die eine Ultrafiltrationsmembran zum Konzentrieren des Urins oder Serums sowie Einrichtungen zur Sammlung des Konzentrats umfaßt;

(b) Einrichtungen zur Überführung des gesammelten Konzentrats in eine Auffangvorrichtung zur Bestimmung; und

70 98 25/0791 " §aq

(c) Auffangvorrichtungen zur Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropins oder seiner Beta-Untereinheit in dem Konzentrat durch immunologische oder physikalische Mittel.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13» gekennzeichnet durch

(a) eine am oberen Ende offene und am unteren Ende geschlossene· Kammer, deren oberer Teil zumindest an einer Wand aus einer für Urin und Serum permeablen Ultrafiltrationsmembran gebildet wird, die zur selektiven Zurückhaltung von menschlichem Choriongonadotropin geeignet ist, wobei die übrigen Wände aus einem steifen, impermeablen Material bestehen;

(b) eine Absorbensschicht, die zur Aufnahme des durch die Membran tretenden Urins oder Serums geeignet ist und sich benachbart zur äußeren Oberfläche der Membran in wirksamem Kontakt mit der Membran befindet;

(c) wobei diese Kammer einen unteren Teil aufweist, dessen gesamte Wandungen zur Zurückhaltung eines bestimmten Urin- oder Serum-Konzentrat-Volumens, das menschliches Choriongonadotropin enthält, impermeabel sind;

(d) Auslaßeinrichtungen im oberen Teil der Kammer und Einrichtungen zur öffnung dieser Auslaßeinrichtungen; und

(e) ein Reagens-Aufnahmegefäß, das mit der Kammer über die Auslaßeinrichtungen verbunden ist und zur Aufnahme eines Reagens zur immunologischen Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin oder seiner Beta-Untereinheit geeignet ist, sowie Einrichtungen zur Begutachtung der Umsetzung zwischen dem Reagens mit dem Urin- oder Serumkonzentrat, das das menschliche Choriongonadotropin enthält.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14» gekennzeichnet durch ein in die Kammer eingearbeitetes Filter zur Eiltration von Urin.'

709825/0791