DE3937660C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Körperflüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Es ist bekannt, daß Tumorgewebe, die im menschlichen oder tierischen Körper wachsen, tumorassoziierte Substanzen abscheiden. Die zeitliche Entwicklung der Konzentration bestimmter Antigene erlaubt Rückschlüsse auf das Tumorwachstum (L. Melson et al., Cancer Research 35 (1975), 2594-2599; L. Dipersio et al., Exp. Cell Biol. 48 (1980), 429-438).

Deshalb werden beispielsweise in der Nachsorge bei Krebs­ patienten laufend entsprechende krebsspezifische Antigenbe­ stimmungen im Blut durchgeführt, um den Verlauf der Therapie überwachen zu können.

Das karzinoembryonale Antigen (CEA) ist hierbei eines der wichtigsten Antigene. Methoden zur Bestimmung dieses Anti­ gens im Patientenblut sind bekannt vgl. etwa H. J. Hansen et al., Human Pathology 5 (1974), 139-147; H. J. Staab et al., Tumor Diagnostik & Therapie 3 (1982), 183-194.

Bei einer radioimmunologischen Bestimmungsmethode wird das CEA aus dem Plasma bzw. dem Serum des Patientenblutes extra­ hiert und mit einem spezifischen Ziegen-Anti-CEA-Serum zur Reaktion gebracht. Danach wird eine definierte Menge ¹²⁵J- CEA zugesetzt, das mit der Proben-CEA-Menge um die Bindungs­ stellen des Antikörpers konkurriert. Nach Gleichgewichts­ einstellung wird das ungebundene ¹²⁵J-CEA zum Beispiel mit Hilfe von Zirkonylphosphat-Gel abgetrennt.

Mit einem Gammaszintillationzähler wird die Menge an gebun­ denem ¹²⁵J-CEA bestimmt und aus dem Verhältnis von gebun­ denem zu freiem ¹²⁵J-CEA die ursprünglich im Plasma vor­ handene Menge an CEA errechnet bzw. anhand einer Standard- Inhibitionskurve abgelesen. Diese Standard-Inhibitionskurve wird mit Hilfe von Standard-Substanzen, die in einer be­ stimmten Verdünnungsreihe eingesetzt werden, aufgestellt. Die Standard-Substanzen enthalten aus menschlichen Geweben bzw. Flüssigkeiten gewonnenes Antigen, das im allgemeinen einer chemischen Behandlung unterworfen werden muß, um störende Begleitsubstanzen zu entfernen bzw. zu inakti­ vieren.

Da im jeweiligen Einzelfall nur begrenzte Mengen individu­ ellen menschlichen Materials zur Verfügung stehen, kommt in der Regel Material von verschiedenen Individuen zur Aufar­ beitung, weshalb die biologische Aktivität des Standard-Anti­ gens je nach Herkunft und Aufbereitung Unterschiede auf­ zeigt.

Bei einer enzymimmunologischen Bestimmungsmethode werden anstelle eines Antiserums beispielsweise Kugeln verwendet, die mit CEA-Antikörpern beladen sind. Das CEA aus der zu untersuchenden Probe wird durch diese Antikörper gebunden und z.B. mit Hilfe Peroxidase-markierter polyklonaler CEA-Antikörper nach Entfernen von überschüssigen Substanzen durch Waschung und Inkubation mit einer Substratlösung durch eine Enzymreaktion zwischen der Peroxidase und dem Substrat nachgewiesen. Hierbei tritt eine Färbung ein, deren Inten­ sität der Konzentration des CEA in der Probe proportional ist. Diese Färbung wird mit einem Photometer gemessen und daraus die CEA-Konzentration ermittelt. Auch hier wird mit Hilfe von Standards mit bekannter CEA-Konzentration zunächst eine Standardkurve erstellt, indem die Extinktionswerte der Standards in ein Diagramm aufgetragen und miteinander ver­ bunden werden. Auch hier werden Standards verwendet, die aus menschlichem Material gewonnen wurden und ebenfalls indivi­ duelle Unterschiede aufzeigen.

Nach Transplantation von menschlichen und tierischen Geweben, Tumoren oder Zellen in immundefiziente Tiere wurde beobachtet, daß mit dem Wachstum des Transplantats Antigene in das Blut der Tiere abgegeben und in der Regel keine Antikörper gegen diese fremden Antigene gebildet werden.

Nach J. E. Dick, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 152 (1989), 219-224, war es in verschiedenen Experimenten z. B. mit der SCID-Maus gelungen, menschliche hematopoetische Zellen in immundefiziente Tiere zu übertragen, um eine im immundefizierten Tiersystem funktionierende heterologe Differenzierung, verbunden mit Sekretion heterologer Substanzen hervorzurufen. So war es nach K. Dorshkind, et al., J. Immunology 137 (1986) 11, 3457-3463 auch möglich, nach isologer Transplantation von Lymphocyten aus Langzeitknochenmarkskulturen isologes IgG im Blut der transplantierten Tiere nachzuweisen, ohne daß eine idiotypische Immunantwort auftrat.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß aus immundefizienten Tieren gewonnene Antigene bzw. das antigenhaltige Serum und andere antigenhaltige Körperflüssigkeiten für die Bestimmung des Antigengehaltes in Körperflüssigkeiten von zu untersuchenden Lebewesen verwendet werden können.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren mit den Merkmalen im Anspruch 1.

Unter immundefizienten Tieren werden solche verstanden, die keine normale Immunreaktion gegen das xenogene Transplantat bzw. gegen von diesem abgegebene Substanzen zeigen. Hierzu gehören auf genetischer Grundlage immundefiziente Tiere wie die Nacktmaus (athymische Maus), die Nacktratte und Nacktmeerschweinchen. Diese Tiere besitzen keine bzw. keine funktionierende Thymusdrüse. Weiterhin gehören hierzu die durch Behandlung immundefizient gemachten Tiere, wie thymektomierte und/oder bestrahlte Tiere sowie Tiere, die aufgrund chemischer Behandlung mit Medikamenten, z. B. Steroid-Präparaten, keine oder eine ausreichend niedrige Immunantwort zeigen.

Unter xenogenen Transplantaten versteht man genetisch einheitliche Zellen bzw. Zellgewebe von artfremden Lebewesen und im vorliegenden Fall besonders von Menschen. Von besonderer Bedeutung sind hier maligne Tumoren, benigne Tu­ moren sowie Normalgewebe aus verschiedenen Organen.

Als Körperflüssigkeiten kommen hauptsächlich Blut, Urin und Ascites in Frage.

Die vom xenogenen Transplantat abgegebenen biologischen Substanzen können unterschiedlicher Natur sein, wie bei­ spielsweise Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine und andere Proteine. Von besonderer Bedeutung sind biolo­ gische Substanzen, die als Tumormarker verwendet werden können. Dabei ist das CEA-Antigen menschlichen Ursprungs besonders hervorzuheben.

Durch die Erfindung können die qualitative und quantitative Bestimmung von Antigenen in Körperflüssigkeiten von Pa­ tienten, die von körpereigenen Geweben, insbesondere Tumor­ geweben abgegeben werden, einfacher und sicherer durchge­ führt werden. Hierbei ist von großem Vorteil, daß die bio­ logischen Substanzen, die vom xenogenen Transplantat abge­ geben werden und mit den Körperflüssigkeiten der immunde­ fizienten Tiere gewonnen werden können, individuell gene­ tisch einheitlich sind. Dies ist darauf zurückzuführen, daß als xenogenes Transplantat Zellen bzw. Gewebe verwendet werden können, die von einem Individuum stammen und somit genetisch einheitlich sind.

Weiterhin stehen die biologischen Substanzen, die aus den immundefizienten Tieren gewonnen werden, in verhältnismäßig großer Menge zur Verfügung, da sich die Transplantation des genetisch einheitlichen Materials beliebig oft wiederholen läßt. Man ist somit nicht mehr darauf angewiesen, das Anti­ gen, das zur Herstellung der Standardkurve oder als Referenz zur Eichung der Standardkurve benötigt wird, direkt aus menschlichen Geweben bzw. Flüssigkeiten zu gewinnen. Auch entfällt das Zusammenfassen von Antigenproben unterschied­ licher Herkunft von verschiedenen Menschen, das zwangsläufig zu genetisch uneinheitlichen Standardsubstanzen führte. Hinzu kommt noch, daß die aus den immundefizienten Tieren gewonnenen Körperflüssigkeiten aufgrund der Immundefizienz dieser Tiere keine Antikörper gegen die entsprechenden Sub­ stanzen enthalten, so daß keine störenden Immunreaktionen bei den Bestimmungen zu befürchten sind, was bei Verwendung von humanen Poolseren grundsätzlich nicht auszuschließen ist. Dies hat zur Folge, daß die aus den immundefizienten Tieren gewonnenen Körperflüssigkeiten, ggf. nach ausreichen­ der Verdünnung, unmittelbar als Testflüssigkeit eingesetzt werden können. Sofern erwünscht, können natürlich andere Begleitstoffe entfernt oder die interessierenden biologischen Substanzen isoliert werden.

Bei der bevorzugten Verwendung der aus den immundefizienten Tieren gewonnenen Körperflüssigkeiten, insbesondere des Serums, als Referenzsubstanz zur Kalibrierung von Tumormar­ kertesten wird die Körperflüssigkeit vorzugsweise so weit verdünnt, daß der Antigengehalt in der Flüssigkeit in den üblichen Testbereichen liegt.

So kann ein CEA-Antigen enthaltendes Serum z B. mit neu­ tralem Pferdeserum verdünnt werden, bis der Antigengehalt in der gewünschten Größenordnung liegt. Die Festlegung des Gehalts der biologischen Substanzen in den aus den immun­ defizienten Tieren gewonnenen Körperflüssigkeiten kann z. B. mit Hilfe des WHO-Standards vorgenommen werden.

Nachdem die Konzentration einmal festgelegt ist, kann dann später stets eine genaue Eichung jeder Standardkurve erfol­ gen, auch wenn ihre Reagenzien aus unterschiedlichen Produk­ tionschargen stammen. Die Gewinnung der Körperflüssigkeit aus den immundefizienten Tieren kann grundsätzlich in der Weise erfolgen, wie dies in der Veröffentlichung von A. G. Grant und D. Duke in Br. J. Cancer (1981) 44, 388-395 beschrieben ist.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Herstellungsmethode sei am Beispiel der tumorassoziierten biologischen Substanz CEA oder CA 19-9 abgeleitet.

Beispiel 1 CEA

Nach Transplantation eines humanen, CEA produzierenden, individuell genetisch einheitlichen Tumors in immundefiziente Tiere, z. B. Nacktratten wird nach Erreichen einer bestimmten Tumormasse, z. B. 2000 mg, Serum der Tiere gewonnen und vereinigt.

Dieses Serum enthält die xenogene Substanz CEA in der Konzentration z. B. 2000 µg/l. Als Referenzsubstanz wird das CEA z. B. in der Konzentration (x), x/10 und x/100, x/1000 notwendig. Somit kann das CEA unmittelbar (x) oder nach geeigneter Verdünnung x/10, x/100, x/1000 als Referenzsubstanz verwendet werden. Ist es erforderlich, eine xenogene Substanz von wirtseigenen Proteinen zu trennen, können Trennungsschritte jederzeit eingeleitet werden.

Beispiel 2 CA 19-9

Nach doppelseitiger Transplantation eines humanen CA 19-9 produzierenden individuell genetisch einheitlichen Tumors in immundefiziente Tiere, z. B. athymische Mäuse, wird nach Erreichen einer bestimmten Tumormasse (z. B. 300 mg) (Tumorgröße 8×8 mm) Serum der Tiere gewonnen und vereinigt.

Dieses Serum enthält die xenogene Substanz CA 19-9 in der Konzentration z. B. 200 000 U/l. Als Referenzsubstanz wird das CA 19-9 z. B. in der Konzentration (x), x/5 und x/50, x/500 notwendig. Somit kann das CA 19-9 unmittelbar (x) oder nach geeigneter Verdünnung x/5, x/50, x/500 als Referenzsubstanz verwendet werden. Ist es erforderlich, eine xenogene Substanz von wirtseigenen Proteinen zu trennen, können Trennungsschritte jederzeit eingeleitet werden.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Körperflüssigkeiten, insbesondere durch Radioimmuno- oder Enzymimmuno- Tests, dadurch gekennzeichnet, daß der Antigengehalt der zu untersuchenden Proben durch Vergleich mit dem Antigengehalt von Körperflüssigkeiten bestimmt wird, die aus immundefizienten, ein das Antigen freisetzendes Transplantat tragenden Tieren gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von aus immundefizienten, ein xenogenes Transplantat tragenden Tieren gewonnenen Körperflüssigkeiten mit aus dem Transplantat stammenden, auf individueller genetischer Grundlage einheitlichen biologischen Substanzen zur Bestimmung von Antigenen in Körperflüssigkeiten von zu untersuchenden Lebewesen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflässigkeiten aus Tieren gewonnen sind, denen Transplantate humanen Ursprungs implantiert wurden, und deren Körperflüssigkeiten vom Transplantat freigesetzte biologische Substanzen enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Körperflüssigkeiten als Standard-, Referenz- oder Kontrollsubstanzen bei der Bestimmung des entsprechenden Antigens in Körperflüssigkeiten von Patienten oder zur Kalibrierung bestehender Tests verwendet werden.