CH647869A5 - Verfahren zur bestimmung eines freien chemischen stoffes. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines an Protein nicht gebundenen chemischen Stoffes, wie z.B. Hormone, in einer proteinhaltigen Probe, wie z.B. Serum. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung solcher Stoffe, welche mit Protein reversible Bindungen in Proben, welche den freien Stoff, das bindende Protein und eine Konzentration einer Komplexverbindung des Proteins und des Stoffes enthalten, eingehen können.

Die Methode der kompetitiven Bindung zum Messen der Konzentration verschiedener, biologisch aktiver Substanzen für diagnostische Zwecke ist bestens bekannt. Diese Technik umfasst ein Reaktionssystem, in welchem ein Antikörper, welcher sich zu dem zu bestimmenden chemischen Stoff (welcher im folgenden durch den Ausdruck «Spezies» bezeichnet wird) spezifisch verhält, zusammen mit der Testprobe und einer aliquoten Menge eines von der Probe unterscheidbaren Analogons inkubiert wird. Das Analogon und die natürliche Spezies konkurrieren zum Besetzen von Bindestellen am Antikörper. Nach dem Abtrennen des Antikörpers vom Rest des Reaktionssystems kann der Antikörper oder die überstehende Flüssigkeit auf das Analogon hin geprüft werden. Die Menge an mit dem Antikörper vereinigtem Analogon ist der Konzentration der zu bestimmenden Spezies in der Probe umgekehrt proportional.

Zwei zur Durchführung solcher kompetitiver Bestimmungen üblichen Methoden sind als «Flüssigphase-Radioimmunotest» und «Festphase-Radioimmunotest» bekannt. In jedem dieser Systeme muss die an den Antikörper gebundene,

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immunogene Substanz von der nicht gebundenen, îmmunoge-nen Substanz abgetrennt werden, um das Messen der Menge an markiertem Analogon auf dem Antikörper zu ermöglichen. Aus dieser Messung wird dann die Menge an immunogener Substanz in der Probe berechnet.

Bei den Radioimmunotestsystemen in flüssiger Phase werden der Antikörper, das marki'erte Analogon und die zu bestimmende immunogene Substanz in Lösung inkubiert. Dabei ist eine Anzahl von Bindestellen am Antikörper zugänglich und die Reaktionsdauer kurz. Zur Abtrennung der mit dem Antikörper eine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz von der keine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz wird die Komplexverbindung der immunogenen Substanz und des Antikörpers ausgefällt, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert.

Die Radioimmunotestsysteme in fester Phase vermeiden die Ausfällungsstufe. Der Antikörper ist an ein Glasstück oder an der Innenoberfläche eines Rohres gebunden. Durch Zentrifugieren des Glasstückes oder Dekantieren der überzogenen Rohre wird die mit dem Antikörper eine Komplexbindung eingegangene immunogene Substanz von der keine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz getrennt. Die Reaktionsdauer hierfür ist allerdings relativ lang, weil eine Anzahl der zugänglichen aktiven Stellen am Antikörper durch das Glasstück oder das Rohr blockiert ist.

Hormone, wie z.B. jene, die aus der Schilddrüse, den Hoden, den Ovarien, den Nebennieren und anderen tierischen Drüsen ausgeschieden werden, werden häufig durch das Zirkulationssystem in Verbindung mit hormonbindenden Proteinen oder Globulinen geführt. Häufig ist es von diagnostischer Bedeutung, dass man die Anwesenheit und die Konzentration eines freien Hormons im Gegensatz zu proteingebundenem Hormon oder Totalhormon bestimmen kann. So existiert beispielsweise Thyroxin (T») in der Blutbahn in einem dynamischen Gleichgewicht in Form einer Spezies, welche an Transportprotein gebunden ist (Thyroxin-binden-des Globulin, Albumin oder Prealbumin), und einer kleinen Fraktion (0,1 °'o oder weniger) als ungebundene Substanz (freies oder ungebundenes Ti). Freies T-i gilt als' die aktive Spezies des Thyroidhormonsystems. Leider hat sich die Methode zur Bestimmung des freien T» als langwierig, kompliziert und kostspielig erwiesen und sie bringt Fehlwerte mit sich wegen der Schwierigkeit im Standardisieren der Materialien und im Messen kleiner Mengen an nicht gebundenem Hormon in Gegenwart von überwiegenden Mengen an Hormon, welches mit dem Protein relativ locker gebunden ist. Mit der erwähnten Methode durch kompetitive Bindung ist es nicht möglich, Konzentrationen an freier Spezies zu bestimmen.

Unter den Methoden zum Messen von freiem Tt und anderen Hormonen, welche in vivo als Proteinkomplexverbindungen vorliegen, bietet jene durch Verwendung einer Dialysiermembrane ein hohes Ausmass an Genauigkeit. Ein Dialysesack, welcher bekannte Mengen an zu prüfendem Serum und markiertem Hormon enthält, wird in einer Pufferlösung suspendiert. Das markierte Hormon verteilt sich auf den freien und gebundenen Zustand in den gleichen Mengenverhältnissen wie das Serumhormon. Die zugesetzte Menge an markiertem Hormon muss äusserst gering sein, um das System nicht ernstlich zu beeinträchtigen, während der Zählwert hoch sein muss, um die Wahrnehmung von kleinen Mengen zu gewährleisten. Im Falle von radiaktiven Markierungen bedingt dies die Verwendung von markiertem Hormon von sehr hoher spezifischer Aktivität. Nach einer geeigneten Zeitspanne - ungefähr 24 Stunden - diffundieren das markierte und das natürliche, an Protein nicht gebundene Hormon durch den semipermeablen Dialysesack, während das an Protein (Molekulargewicht von mehr als 20 000) gebundene Hormon im Dialysesack verbleibt. Um die Menge an im Serum vorhandenem freiem Hormon zu bestimmen, prüft man eine aliquote Menge der Pufferlösung auf das markierte Hormon. Aus dem Ergebnis kann die Fraktion von markiertem Hormon, welche in die Pufferlösung eingedrungen ist, berechnet und die Fraktion vom Totalhormon, welche in freiem Zustand vorliegt, daraus gefolgert werden. Um diese Fraktion in Masseneinheiten (z.B. ng/dl) freien Hormons überzuführen, muss auch mit der Probe ein Gesamthormontest durchgeführt werden.

Wenngleich dieses System bei der Bestimmung von freiem Tt und anderen freien Hormonen brauchbare Resultate liefern kann, eignet es sich für den Routinegebrauch aber nicht. Es müssen nämlich zwei Teste durchgeführt werden, und die Genauigkeit des Endwertes kann durch jeden dieser Teste beeinträchtigt werden. Hinzukommt, dass man für jeden Test eher grosse Mengen Radioaktivität benötigt. Verunreinigungen im markierten Hormon können mitspielen und besondere Probleme verursachen. Ferner benötigt man eine lange Inkubationsdauer. Schliesslich kann man nur Serum verwenden und dieses muss noch ganz frisch sein. Hinzukommt, dass das Sammeln und das Standardisieren sämtlicher für den Test erforderlichen Materialien keine Routineangelegenheit ist. Daher ist die Anwendung dieser Methode wegen der hohen Kosten, des hohen Arbeitsaufwandes und des erforderlichen geschulten Personals sehr beschränkt.

Eine andere Testmethode für freies Hormon beruht auf der Reaktionskinetik und erfordert zwei getrennte Teste. Bei jedem wird eine kinetische Kurve aufgezeichnet über die Geschwindigkeit, mit welcher ein Antikörper das Hormon, z.B. T-i, von der entgegen gerichteten Anziehung des primären Bindemittels, z.B. des Thyroxin-bindenden Globulins, wegnimmt.

Bei diesem Testsystem verursachen verschiedene pathologische Bedingungen Ungenauigkeiten. Sind mehr proteinbindende Stellen als üblich vorhanden, so wird die effektive Anziehung des Globulins auf das Hormon grösser und die Geschwindigkeit der Bindung an den Antikörper nimmt ab. Im Falle einer Thyroxinbestimmung würde die Probe deshalb scheinbar wenig T» enthalten, obschon tatsächlich ein höherer Wert an Tt, jedoch alles in gebundener Form, vorhanden wäre.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren, ein Reagenz und einen Testsatz, die die direkte Bestimmung nicht gebundener Hormone und anderer solcher Stoffe erlauben. Der Test lässt sich in Gegenwart von Serumprotein und gebundenem Hormon durchführen.

Gemäss vorliegender Erfindung werden z.B. semipermeable Mikrokapseln, welche einen zum Hormon oder einen anderen zu bestimmenden Stoff sich komplementär verhaltenden Antikörper enthalten, mit sowohl einem von dem zu bestimmenden Stoff unterscheidbaren Analogon als auch mit der Testprobe inkubiert. Das Analogon kann vor der Inkubation in solchen Mengen in die Mikrokapseln eingeführt werden, dass der Antikörper an den den zu bestimmenden Stoff bindenden Stellen gesättigt ist. Die Mikrokapselwandungen bestehen aus Membranen, welche die Testprobe vom Antikörper trennen; sie besitzen eine ausreichende Porosität, um den Durchgang des freien Stoffes und dessen Analogons zu gewährleisten, sind aber nicht genügend porös, um den Durchgang des Antikörpers oder des proteingebundenen Hormons zu erlauben. Wird eine Testprobe einem aliquoten Teil der Mikrokapseln hinzugegeben, so diffundiert der ungebundene Stoff durch die Membran und konkurriert mit seinem Analogon um die Besetzung der vom Antikörper gebotenen Bindestellen. Die Verteilung des Analogons zwischen dem Antikörper und dem Rest des Reaktionssystems gilt

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daher als Wertmessung für die Menge an ursprünglich in der Probe vorhandenem zu bestimmendem Stoff. Dieses Verfahren vereinigt die Genauigkeit eines üblichen Radioimmunotests in flüssiger Phase und die Einfachheit und die bequeme Arbeitsweise eines Systems in fester Phase.

Darauf wird der Antikörper zusammen mit dem an ihn gebundenen zu bestimmenden Stoff (und gebundenem Analogon) von dem freien Stoff abgetrennt. Der Antikörper oder der Rest des Reaktionssystems wird hierauf in bezug auf das Analogon geprüft. Die Trennung kann dadurch bewirkt werden, dass man eine osmotische Veränderung vornimmt; dadurch fallen die Kapseln zusammen, und ungebundene Stoffe entweichen aus den Kapseln. Dies kann beispielsweise so geschehen, dass man dem System Serumalbumin oder Polyäthylenimin zugibt, wodurch ein Ausfliessen der intra-kapsulären Flüssigkeit bewirkt wird. Andererseits lässt sich der freie Stoff einfach aus den Mikrokapseln auswaschen. Die Resultate lassen sich durch Vergleich des bereits bestimmten Analogongehaltes mit einem Standard, z.B. einer Kurve der Konzentration an freiem Hormon als Funktion der Radioaktivitätsmenge, der Fluoreszenzintensität oder anderer Markierungseigenschaften, welche als Angabe der Anwesenheit des Analogons verwendet werden, interpretieren.

Der Test kann zur Bestimmung der Gegenwart und/oder der Konzentration an freiem Thyroxin, Trijodthyronin, neonatalem Thyroxin, Testosteron, Cortisol, anderen Steroidhormonen und anderen Substanzen, welche sich an Protein reversibel binden, verwendet werden. Dieser Test kann auch dazu verwendet werden, um Stoffe nachzuweisen, welche sich nicht in signifikantem Ausmasse an Protein binden, wie z.B. Arzneimittel, beispielsweise Digoxin. Im wesentlichen lässt sich ein beliebiges solches Material mit dem Test bestimmen, vorausgesetzt, dass ein sich komplementär verhaltender Antikörper und ein von besagtem Material unterscheidbares Analogon zugänglich sind oder erzeugt werden können. Dieser Test kann routinemässig unter Verwendung eines Testsatzes durchgeführt werden, welcher das Analogon, Antikörperstandards enthaltende Mikrokapseln und vorbestimmte Konzentrationen des zu bestimmenden Stoffes enthaltende, zum Vergleich dienende Blindproben und ein Reagenz zur Entfernung von nicht gebundenem Stoff und Analogon aus den Kapseln nach beendeter Inkubation aufweist. Für die Qualitätskontrolle kann die Lösung in den Mikrokapseln gefärbt sein. Eine gefärbte, überstehende Flüssigkeit - nach dem Absetzen oder Sedimentieren der Kapseln durch Zentrifugie-ren - würde in diesem Fall ein Aufbrechen der Mikrokapseln und ein allfälliges Austreten von Antikörper anzeigen. Im Gegensatz zu den üblichen Testmethoden sichert der neue Test die klinische Korrelation mit dem diagnostizierten Zustand über einen breiten Bereich der Konzentration an Protein, Hormonen und störenden Substanzen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer raschen, einfachen und reproduzierbaren Methode zur Bestimmung der Anwesenheit und Konzentration eines an Protein nicht gebundenen Stoffes in einer flüssigen Probe. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Zurver-fügungstellen eines für diese Bestimmungen geeigneten Reagenz und eines Testsatzes, welcher für eine rasche und bequeme Durchführung solcher Bestimmungen geeignet ist. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Methode zur Bestimmung von freiem Ti in Proben von menschlichem Blut, welche proteingebundenes Tt enthalten.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines wertvollen Verfahrens zur Bestimmung einer immunogenen Substanz, welches die Vorteile der radioimmunologischen Bestimmung in flüssiger und in fester Phase vereinigt. Schliesslich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein durchaus zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung des Digoxingehalts in Serum. Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Eichkurve, in der auf der y-Achse in linearem Massstab die Zählwerte pro Minute ( x 103) und auf der x-Achse in logarithmischem Massstab die Konzentration an freiem T» in ng/dl aufgetragen sind (Messwerte siehe Tabelle 1);

Fig. 2 eine zweite Eichkurve für die erfindungsgemässe Bestimmung von freiem Ti, in der auf der y-Achse in linearem Massstab die Zählwerte pro Minute und auf der x-Achse in logarithmischem Massstab die Konzentration an freiem Tj in ng/dl aufgetragen ist (Messwerte siehe Tabelle 2);

Fig. 3 eine graphische Darstellung, in der die Zählwerte pro Minute von mit 125J markiertem und an Tt-Antikörper gebundenem Ti, das in semipermeablen Mikrokapseln, welche in Standardlösungen von freiem Tt eingetaucht sind, enthalten ist, gegen die Zeit aufgetragen sind. Da das mit 125J markierte Ti an den Bindestellen des Ti-Antikörpers durch Serum Ti ersetzt wird, nehmen die Zählwerte von markiertem Tt, das an den Antikörper gebunden bleibt, ab. Es sei darauf hingewiesen, dass die Ersetzungsgeschwindigkeit für bis zu 2stündige Inkubation bei 37 °C weitgehend linear ist;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Korrelation zwischen den Ergebnissen der Bestimmung durch die Dialysemethode und jenen nach dem erfindungsgemässen Mikrokapsel-verfahren ;

Fig. 5 eine graphische Darstellung des normalen Bereiches der Konzentration an freiem T<t, ermittelt nach dem Mikrokapselverfahren ;

Fig. 6 eine graphische Darstellung der Korrelation zwischen der kinetischen radioimmunologischen Bestimmung und dem erfindungsgemässen Mikrokapselverfahren;

Fig. 7 eine Digoxin-Eichkurve, in der die Zählwerte pro Minute von an Antikörper gebundenem Digoxin in linearem Massstab gegen die Digoxinkonzentration (in ng/ml) in logarithmischem Massstab auf halblogarithmischem Papier mit 2 Dekaden aufgetragen ist (Messwerte siehe Tabelle 5);

Fig. 8 eine Kurve, in der der Prozentsatz an gebundenem Digoxin (relativ) gegen die Digoxinkonzentration aufgetragen ist, wobei % gebundenes Digoxin (relativ) = Mittelwert der Zählwerte pro Minute von gebundenem Digoxin/Mittelwert der Zählwerte von gebundenem Digoxin von 0 ng/dl Digo-xin-Standardlösung x 100 (Messwerte siehe Tabelle 8); und

Fig. 9 eine schematische Darstellung, die die Retention-von Antikörper und den freien Durchtritt von immunogener Substanz in erfindungsgemäss hergestellten Mikrokapseln zeigt.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Probe, welche den zu bestimmenden Stoff enthält, mit dem zu diesem Stoff komplementären Antikörper und einem von dem Stoff unterscheidbaren Analogon inkubiert, und die Probe und der Antikörper sind dabei durch eine oder mehrere semipermeable Membranen, welche den Durchlass hochmolekularer Proteine ausschliessen, getrennt.

Antikörper zum gewählten Stoff können nach bekannten Methoden erzeugt werden, beispielsweise durch Verabreichung eines Hormons, gegebenenfalls mit einem Hilfsstoff, an Versuchstiere. Die so erzeugten Antikörper können dann extrahiert und gereinigt werden. Viele solche Antikörper sind im Handel erhältlich. Manche unterscheidbare Analoga der Stoffe, welche mit dem vorliegenden Verfahren bestimmt werden können, sind gleichfalls im Handel erhältlich oder lassen sich nach bekannten Techniken herstellen. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «unterscheidbares Analogon» bezieht sich auf ein Molekül, welches anti5

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körperbindende Eigenschaften aufweist, welche ähnlich oder vorzugsweise die gleichen sind wie jene des zu bestimmenden Stoffes. Merkmal eines solchen Stoffes ist eine Eigenschaft, welche die Messung seiner Konzentration leicht zulässt. Bevorzugte Analoga umfassen eine Probe des zu bestimmen- 5 den Stoffes, welche mit einem radioaktiven Atom markiert ist. So kann man beispielsweise Thyroidhormone leicht mit l25J markieren, worauf man die Gammastrahlung quantitativ messen kann. Man kann aber auch andere Arten von Analoga verwenden, unter der Voraussetzung, dass deren Molekular- 10 gewichte und Dimensionen deutlich unterhalb jener der natürlichen Proteine und der verwendeten Antikörper liegen. Somit kann man Analoga herstellen, indem man eine Probe des zu bestimmenden Stoffes mit einem Enzym von relativ niedrigem Molekulargewicht, mit einem fluoreszierenden 15 Molekül oder einer anderen Komponente markiert, welche eine quantitative Messung der Konzentration des Analogons durch physikalische oder chemische Methoden ermöglichen.

Zur Durchführung des Testes muss der Antikörper durch eine oder mehrere Membranen von der Probe getrennt sein, 20 wobei diese Membranen eine ausreichende Porosität, um»den Durchlass von Antikörpern oder an Protein gebundenen Stoffen (welche durchwegs ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 Daltons haben) auszuschliessen, aber eine ausreichende Porosität, um dem zu bestimmenden Stoff und seinem 25 Analogon freien Durchlass zu gewähren, aufweisen müssen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Membranen in Form von semipermeablen Mikrokapseln ausgebildet, welche den Antikörper und das Analogon enthalten. 30

Die verwendeten semipermeablen Mikrokapseln sollen eine Permeabilität haben, welche den oben beschriebenen Dialysemembranen ähnlich ist. Die semipermeablen Mikro-kapselwandung ist aber mehrere hundert Male dünner als die üblichen Dialysemembranen, und ihre verfügbare Fläche pro 35 Gewichtseinheit ist um Zehnerpotenzen grösser. Freies Tt oder andere freie Hormone dringen ohne weiteres in die Mikrokapseln ein und verdrängen im Verhältnis zu ihrer Konzentration markiertes Tt vom Tt-Antikörper. Auf diese Weise stellt sich ein Gleichgewicht zwischen freiem Ti und 40 markiertem Tt während der Inkubationsperiode in den Kapseln ein.

Geeignete Methoden zur Einkapselung von biologischen Materialien in Membranen, welche die vorerwähnten Durchlässigkeitseigenschaften aufweisen, finden sich in den ameri- 45 kanischen Patentanmeldungen Nr. 606 166 (20. August 1975), 931 177 (4. August 1978), 30 847 (17. April 1979) und 24 600 (28. März 1979). Die zur Zeit bevorzugte Methode zur Herstellung solcher Mikrokapseln führt durch Polykondensation an der Grenzfläche zu semipermeablen Polyamidmembranen. 50 Miteinander nicht mischbare Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelsysteme können zu diesem Zweck ausgesucht werden, wie z.B. Wasser und ein auf Cyclohexan basierendes Lösungsmittel, und ein Monomer eines komplementären Paares, welches ein Copolymer bildet, kann in dem Wasser, zusammen mit 55 dem einzukapselnden Material, gelöst werden. Das wässrige Lösungsmittel, welches das einzukapselnde Material enthält, kann hierauf im anderen Lösungsmittel emulgiert werden, um eine Vielzahl einzelner Tröpfchen zu bilden. Dann kann das zweite komplementäre Monomer der kontinuierlichen Phase 60 der Emulsion hinzugegeben werden, um die Polymerisation rund um die Tröpfchen an der Phasengrenze in Gang zu setzen. Die Membranenpermeabilität und die Gleichmässigkeit der Polymerausscheidungen können durch Verändern der Affinität der kontinuierlichen Phase der Emulsion für das 65 eingekapselte Monomer während des Polymerisationsverlaufes und durch Einstellen der Konzentration des reagierenden Monomers und der Dauer der Polymerisation gesteuert werden.

Gemäss einer Variante ist die anfängliche kontinuierliche Phase ein Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelsystem, welches eine relativ hohe Affinität für das eingekapselte Monomer aufweist, so dass in einer ersten Stufe der Polymerisation rund um die Tröpfchen ein relativ dickes Polymernetzwerk gebildet wird. Hierauf kann diese kontinuierliche Phase so beeinflusst werden, dass die Affinität für das erste Monomer abnimmt, beispielsweise durch Verdünnen der kontinuierlichen Phase mit einem zweiten Lösungsmittel oder durch Ersetzen der kontinuierlichen Phase mit frischem Lösungsmittel. Nach der Zugabe des zweiten Monomers kann eine weitere Polymerisation vorzugsweise innerhalb des anfänglich gebildeten Polymernetzwerkes stattfinden, wodurch makroporöse defekte Stellen ausgeflickt werden und einheitliche Kapselmembranen gebildet werden, welche die Diffusion von gelöstem Material mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht erlauben.

Gemäss einer weiteren Variante wird zu Beginn eine kontinuierliche Phase mit niedriger Affinität für das eingekapselte Monomer gewählt, so dass dünne, relativ dichte Membranen bei der ersten Polymerisationsstufe gebildet werden. Hierauf kann die Affinität der kontinuierlichen Phase für das eingekapselte Monomer erhöht werden, um weitere Monomermengen durch die Membran hindurchzuführen und eine zweite äussere Schicht von unlöslichem Polymer niederzuschlagen.

Wenn die diskontinuierliche wässrige Tröpfchenphase so gepuffert wird, dass eine verträgliche Umgebung für die labilen biologischen Materialien, wie z.B. Antikörper, geschaffen ist, kann die Einkapselung unter weitgehender Beibehaltung der biologischen Aktivität des labilen Materials durchgeführt werden. Die Wirksamkeit des eingekapselten Materials kann auch bewahrt werden, indem man das zweite Monomer portionenweise der kontinuierlichen Phase während der Polymerisationsdauer derart zugibt, dass seine Konzentration zu jeder Zeit relativ niedrig ist und der Antikörper nicht hohen Konzentrationen von potentiell schädlichen Substanzen ausgesetzt wird.

Gemäss einem bevorzugten Reaktionssystem werden ein Diamin, ein hochmolekulares Füllmaterial und den Antikörper enthaltende wässrige Tröpfchen in einer kontinuierlichen Phase von Cyclohexan gebildet, deren Affinität für das in der Tropfenphase gelöste Monomer durch Zugabe von Chloroform als Verdünnungsmittel modifiziert ist. Die Zugabe eines Disäurehalogenids zum System führt zur Bildung von semipermeablen Polyamidmikrokapseln. Auf diese Weise gelangt man zu Membranen, deren oberer Durchlässigkeitswert im Bereiche von 2000 bis 30 000 Dalton Molekulargewicht liegt. Man kann somit solche Kapseln leicht herstellen, welche die Diffusion verschiedener Hormone ermöglichen.

Zur Durchführung des Testes kann die Testprobe mit Mikrokapseln der beschriebenen Art vermischt und vorzugsweise bei ungefähr 37 inkubiert werden. Vor der Inkubation können die Kapseln in einer Lösung des Analogons von ausreichender Konzentration, um den Antikörper mit einer messbaren Konzentration an Analogon zu belasten, suspendiert werden. Der Versuch kann auch so durchgeführt werden,

dass man das Analogon während oder nach der Inkubation mit Serum dem Reaktionssystem hinzugibt. Weder das Protein in der Probe noch Komplexe von Protein und Stoff können durch die Mikrokapselwandung hindurchgehen.

Hierauf wird der Antikörper vom Rest des Reaktionssystems (vorzugsweise unter Ausschluss der Mikrokapselmem-bran) getrennt und entweder der Antikörper oder der Rest des Systems auf das Analogon hin geprüft. Gemäss einer bevorzugten Trennungsmethode wird ein hydrophiles Material von hohem Molekulargewicht, wie z.B. eine Lösung von Polyäthy-lenimin oder Serumalbumin, dem ausserhalb der Kapseln

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vorhandenen Bereich zugegeben. Dadurch wird eine Osmola-litätszunahme bewirkt, wodurch ein Aufbrechen der Mikrokapseln und eine Wanderung des innerhalb der Kapseln vorhandenen nicht gebundenen Hormons und dessen Analogons in die überstehende Flüssigkeit erfolgt. Daraus ergibt sich ein kompaktes Kügelchen von eingekapseltem Antikörper, welches - nach einer eventuellen Zentrifugation - durch Absaugen oder Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit isoliert werden kann. Man kann aber die Trennung auch durch Auswaschen des freien Stoffes und des Analogons aus den Kapseln durchführen.

Die folgenden Tabellen 1 und 2 und die entsprechenden Fig. 1 und 2 der beiliegenden Zeichnung veranschaulichen die Ergebnisse der Teste gemäss vorliegender Erfindung, bei welchen man die Gegenwart von freiem Tt unter Verwendung von freiem Tt-Antikörper, 125J-markiertem Thyroxin als Analogon und Lösungen von bekannter Konzentration an freiem Tt feststellen kann. Die Ergebnisse von Parallelversuchen auf unbekannten Proben mit dem neuen Verfahren lassen sich anhand der Eichkurven interpretieren.

Tabelle 1 Eichkurve für den Test auf freies Tt

Freies Tt

CPM*

durchschnittl. CPM

0,5 ng/dl

57097 57472

57285

1,3 ng/dl

54256 54717

54839

3,0 ng/dl

50960 50946

50953

5,0 ng/dl

48487 48117

48302

7,7 ng/dl

45982 46067

46025

Gesamtzählwert

zugesetztes Tt (125J)

86403

2stündige Inkubation bei 37 °C.

* Zählwert pro Minute

Tabelle 2

Eichkurve für den Test auf freies Tt

Freies Tt

CPM*

durchschnittl. C PM

0,1 ng/dl

61219 60398 61183

60933

0,5 ng/dl

58020 55618 56389

56675

1,0 ng/dl

52096 52671 53705

52824

2,0 ng/dl

48483 50126 49971

49536

4,0 ng/dl

44853 45108 44235

44732

6,0 ng/dl

42008 41344 41015

41456

Gesamtzählwert

zugesetztes Tt (l25J)

86903

2stündige Inkubation bei 37 °C * Zählwert pro Minute

Die Erfindung sei durch das folgende, nicht einschränkende Beispiel erläutert.

Herstellung von Mikrokapseln

Eine Hexandiamincarbonatlösung mit einem pH-Wert von 8,5 ± 0,1 wird dadurch hergestellt, dass man 17,7 ml 1,6-Hexandiamin mit 32 ml Wasser vermischt und dann in diese Lösung während ungefähr 1 Stunde oder bis zur Erreichung des pH-Wertes Kohlendioxydgas einbläst. Eine Terephthaloylchloridlösung (TC1) wird dadurch hergestellt, dass man 20 g TC1 in 200 ml einer Mischung von 4 Teilen Cyclohexan und 1 Teil Chloroform als organisches Lösungsmittel hinzugibt. TC1 wird durch kräftiges Rühren gelöst und die Lösung hierauf während 10 Minuten bei 2600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa ausgeschiedener Niederschlag wird entfernt.

750 ml Cyclohexan werden mit 125 ml SPAN-85 (Emulgiermittel, Fettsäureester von Sorbitan) in einem 2-Liter-Mischgerät, welches mit einem magnetischen Rührstab ausgerüstet ist, vermischt. Unter Rühren wird eine Lösung aus 1 ml Antiserum in bezug auf Thyroxin (4% in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung der Firma R.F. Laboratories, Houston, Texas, oder Radioassay Systems Laboratories, Carson, California), 25 ml Polyvinylpyrrolidon, 4% Rinderserumalbumin und 30 ml Hexandiamincarbonatlösung dem Cyclohexan hinzugegeben. Nachdem Tröpfchen der gewünschten Grösse erzeugt worden sind, versetzt man mit 70 ml TCl-Lösung. Nach weiteren 30 Sekunden gibt man weitere 37,5 ml TC1 hinzu. Nach weiteren 60 Sekunden werden 25 ml Chloroform hinzugegeben. In Abständen von jeweils 30 Sekunden werden dreimal jeweils 25 ml Chloroform hinzugegeben.

Die Mikrokapseln werden durch Zentrifugieren des Zwei-phasenreaktionssystems, Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit dekantiert und Mischen der Kapseln mit Tween-20 (Polyoxyäthylenderivat von Fettsäurepartialestern von Sorbitolanhydrid - Emulgiermittel mit Natriumbicarbo-nat gepuffert) und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewonnen. Die Kapseln halten das Polyvinylpyrrolidon und das Rinderserumalbuminfüllmaterial sowie den Thyroxinan-tikörper zurück.

Sättigung des Antikörpers mit Analogon

Nach der vorerwähnten Methode erhaltene Mikrokapseln werden mit mit ,2SJ markiertem Thyroxin in folgender Weise beladen.

1. In jeweils 100 Standardrohre werden 0,5 ml Mikrokap-selsuspension und 1,0 ,uCi von Tt (l25J) (hoch spezifische Aktivität von 5000 bis 6000 [iCi pro |ig) zugegeben. Dann wird während mindestens 30 Minuten bei 37 °C inkubiert.

2. Die Mikrokapseln werden mit dem doppelten Volumen einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (0,l5molar an NaCl, pH = 7,5, 0,015molarer Phosphatpuffer). ■

3. Es wird während 15 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert.

4. Die Stufen 2 und 3 werden zweimal wiederholt.

5. Die Mikrokapselsuspension wird mit der l,6fachen Volumenmenge der oben beschriebenen, mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung verdünnt. Das Gesamtvolumen liegt bei 80 ml. 0,8 ml der Mikrokapselsuspension werden pro Test verwendet. Auf diese Weise lassen sich 100 Tests mit den Kapseln durchführen.

Testverfahren

1) 25 Mikroliter-Testproben und 5 Proben von freiem Tt mit bekannter Konzentration werden in getrennte Rohre eingebracht. Gemäss der aus Tabelle 1 erhaltenen Eichkurve wurden Konzentrationen von 0,5, 1,3,3,0, 5,0 und 7,7 ng% freiem Tt verwendet, doch kann man beliebige Reihen von

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freien T4-Konzentrationen nach den bestens bekannten Experimentiertechniken anwenden. Als zusätzlicher Sicherheitstest kann man ein Kontrollrohr einsetzen, welches 25 Mikroliter Kochsalzlösung enthält.

2) Es werden 800 Mikroliter mit T4(125J) vorgesättigte Mikrokapseln (als solche erhältlich) in jedes Rohr pipettiert.

3) Der Inhalt eines jeden Rohres wird durchgewirbelt und während 120 Minuten bei 37 °C gebrütet.

4) Nach der Inkubation wird 1,0 ml 2,0%iges Polyäthylen-imin (Molekulargewicht 40 000 bis 50 000) in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung jedem einzelnen Rohr hinzugegeben.

5) Es wird während weiteren 20 Minuten ausgebrütet.

6) Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert.

7) Jedes Rohr wird während 1 Minute in einem Gamma-zählrohr untersucht.

Berechnung der Resultate

1) Bei jedem Test bezüglich der Bestimmung einer unbekannten Konzentration an freiem Tt in einer oder mehreren Proben sollte man Standardversuche durchführen, um die Eichkurve zu erhalten.

2) Nach Beendigung des Testes wird eine Eichkurve, wie sie beispielsweise in den Fig. 2 oder 3 gezeigt wird, gemacht, wobei Werte zur Anwendung gelangen, welche man aus den Standardversuchen erhalten hatte, welche gleichzeitig mit unbekannten Proben getestet wurden.

3) Die Zählwerte pro Minute (nachstehend ais «cpm» bezeichnet) für jeden Wert können in der linearen Skala von halblogarithmischem Papier mit 2 Dekaden gegen die Konzentration von freiem Tt in ng% auf der logarithmischen Skala aufgetragen werden.

Eine weitere Variante zum Auftragen von cpm gegen die Konzentration an freiem Ti besteht darin, dass man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) gegen die Konzentration an freiem Tt aufträgt.

Dies kann geschehen, indem man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) für jeden Standard, Vergleichsversuch bzw. unbekanntes Material errechnet und diese Werte auf einem halblogarithmischen Papier mit 2 Dekaden in ähnlicher Weise aufträgt, wie dies zuvor für cpm beschrieben worden ist. Der Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) wird wie folgt berechnet: Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) = cpm gebunden/mittleres cpm/gebunden eines Standardmaterials mit niedrigster Konzentration an freiem Tt.

Die Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Konzentration an freiem Tt in ng% von ungefähr 200 Testproben, wobei jede Probe nach der erfindungsgemässen Methode und nach der Dialysenmethode analysiert wurde. Wie daraus hervorgeht, besteht ein hohes Ausmass an Korrelation zwischen den beiden Testmethoden.

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Häufigkeit einer bestimmten Konzentration an freiem Tt gegen die Konzentration an freiem Tt aufgrund von etwa 200 Testproben, welche nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden.

Die Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Konzentration an freiem Tt in ng% bei ungefähr 100 Testproben, wobei jeder Test nach der erfindungsgemässen Methode und nach der kinetischen Radiotesttechnik erfolgte. Wie daraus ersichtlich ist, besteht ein hohes Ausmass an Korrelation zwischen den beiden Testmethoden.

Die Tabelle 3 zeigt die Konsistenz der bei Auswertung der Innerblock-Information erhaltenen Ergebnisse.

647 869

Tabelle 3 Innerblockvarianz (Werte in ng/dl)

Wert A (1,2)

Wert B (2,0)

Wert C (5,3)

1,5

2,3

3,6

1,3

2,1

4,2

1,1

'2,2

4,2

1,1

2,1

3,3

1,2

2,1

3,3

1,3 •

2,0

3,9

1,3

1,7

4,1

1,4

2,1

3,7

1,2

2,5

3,5

1,3

1,8

3,5

1,3

2,2

4,4

1,3

2,1

3,9

1,6

2,3

4,6

1,2

2,5

4,6

1,3

2,3

4,4

1,2

2,1

4,2

1,2

2,1

3,4

1,3

2,3

3,8

1,5

2,1

4,2

1,4 •

2,2

4,6

1,4

2,1

3,7

1,4

2,1

4,0

1,4

2,1

4,0

1,4

2,3

4,3

1,4

2,3

4,0

1,6

2,4

4,0

1,3

2,0

4,2

1,2

2,1

4,2

2,4

4,5

Variationskoeffizient

Anzahl x+ S.D.

C.V.

A

28

1,34±0,13

9,6%

B

29

2,20 ±0,17

7,7%

C

29

4,10 + 0,38

9,3%

S.D. = Standardabweichung C.V. = Variationskoeffizient

Tabelle 4 zeigt die Konsistenz der bei Auswertung der Zwischenblock-Information erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle 4

Zwischenblockvarianz: (Werte in ng/dl)

Test

Wert A (1,2)

Wert B (2,0)

Wert C (5,3)

1

1,3

2,4

4,6

1,2

1,8

4,4

2

1,4

1,5

4,6

1,5

2,6

4,7

1,2

2,0

4,0

1,3

2,0

3,7

1,4

2,5

3,8

1,2

1,9

4,0

3

1,3

2,2

3,9

4

1,4

2,0

3,2

1,2

2,1

4,0

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 869

8

Test

Wert A (1,2)

Wert B (2,0)

Wert C (5,3)

5

1,5

1,8

4,2

6

1,3

2,0

4,2

1,2

2,0

4,5

7

1,3

2,1

3,5

1,35

2,5

3,7

1,1

1,7

4,0

1,2

2,0

3,5

1,4

4,2

1,4

4,0

Variationskoeffizient

Anzahl x + S.D.

C.V.

A

20

1,32 + 0,11

8,41%

B

18

2,10 + 0,27

13%

C

20 '

4,00 + 0,4

10%

S.D. = Standardabweichung C.V. = Variationskoeffizient

Digoxintext

Ein Verfahren zum Einkapseln eines für Digoxin spezifischen Antikörpers findet sich nachstehend. Die verwendeten Reagenzien und deren Lieferanten finden sich nachstehend:

Natriumbicarbonat

Cyclohexan

Chloroform

Natriumchlorid monobasisches

N atri umphosphat dibasisches Natriumphosphat

1,6-Hexandiamin

«Span-85»

«Tween-20»

Antidigoxin-Kaninchen-

Anti-Antiserum

Rinderserumalbumin

Comassie Brilliant Blue R

Polyvinylpyrrolidon-40

Terephthaloylchlorid sämtliche Substanzen der Firma Fisher Chemical

Ruger Chemical, New Jersey Arnel Products, Brooklyn, New York

Sigma Chemical Aldrich Chemical Eastman Kodak

20

25

30

Die Mengen der einzelnen Ingredienzen waren die folgenden:

1,6-Hexandiamincarbonat 30 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 40 ml

Polyvinylpyrrolidon-40/Comassie Blue 25 ml

Antidigoxin-Kaninchen-Antiserum 5 ml

Cyclohexan, ACS 750 ml

«Span-85» 125 ml

Terephthaloylchloridlösung 107,5 ml

Chloroform 100 ml

«Tween-20»-Waschlösung Q.S. 200 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung Q.S. 8 Liter

Vorgehen: Vor Gebrauch wurden sämtliche Glaswaren mit destilliertem Wasser gespült.

1. Ein 2-Liter-Glasmischgefäss wurde mit einem magnetischen Rührwerk versehen und in den Abzug gestellt.

2. Neben den Abzug wird ein Mikroskop hingestellt.

3. In einem geeichten 250-ml-Glaszylinder werden sorgfältig 125 ml «Span-85» abgemessen.

4. Das abgemessene «Span-85» wird unter dem Abzug in die Glasmischvorrichtung gegeben.

5. Es werden 750 ml Cyclohexan in einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder abgemessen und dann diese Menge

5 unter dem Abzug in die aus Glas bestehende Mischvorrichtung gegossen.

6. Die Mischvorrichtung wird mit einem Deckel verschlossen.

7. Der magnetische Rührer wird in Gang gesetzt.

10 8. Abmessen: 30 ml Hexandiamincarbonat; 40 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung; 25 ml 15%iges PVP/ Commasie Blue/4%iges Rinderserumalbumin; 5 ml Antikörper. Die 40 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird in einem mit Masseinteilungen versehenen 50-ml-Zylinder

15 mit den 5 ml Antikörper vermischt.

9. Es wird ein mit einem Ring versehener 5-cm-Rührstab in ein 400-ml-Becherglas eingebracht und auf dem magnetischen Rührwerk angeordnet.

10. Das Becherglas wird mit 30 ml Hexandiamin versetzt und der magnetische Rührer in Gang gesetzt.

11. Dem im Becher vorhandenen Hexandiamin werden nacheinander die folgenden Substanzen beigegeben: 25 ml 15%iges PVP/Comassie Blue/4%iges Rinderserumalbumin; 35 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung/Antikörperlösung. Dann wird das Gemisch während 2 Minuten und die Lösung während 3 Minuten gerührt.

12. Während des Vermischens der Lösung werden eine 70-ml-Portion und eine 37,5-ml-Portion von Terephthaloylchlorid in verschiedenen mit geeichten 100 ml Glaszylindern abgemessen. Diese wurden mit Uhrgläsern bedeckt und in den Abzug gestellt. In verschiedenen geeichten 25-ml-Glaszy-lindern wurden viermal jeweils 25-ml-Portionen von Chloroform abgemessen. Diese Glaszylinder werden mit Uhrgläsern bedeckt und in den Abzug gestellt.

13. Durch einen Seitenarm des Kolbens wird der Inhalt des 400-ml-Becherglases in die Glasmischvorrichtung unter dem Abzug zugegeben.

14. Mit einer 1-ml-Wegwerfglaspipette wird so rasch als möglich eine Probe der Lösung aus der Mischvorrichtung entnommen und auf einem Objektträger auf das Mikroskop gelegt. Dabei wird geprüft, ob die Tröpfchen eine zulässige Grösse besitzen, nämlich 10 bis 80 um Durchmesser.

15. Wenn die Tröpfchen eine annehmbare Grösse aufweisen, wird diese Zeit mit 0 (T = 0) bezeichnet. Durch den Sei-

45 tenarm der Mischvorrichtung werden die abgemessenen 70 ml Terephthaloylchlorid hinzugegeben. Bei T = 30, d.h. nach einem Ablauf von genau 30 Sekunden, wird die zweite 37,5-ml-Portion von Terephthaloylchlorid durch den Seitenarm in die Mischvorrichtung eingebracht. Dann wird während genau 60 Sekunden gemischt.

16. Nach 60 Sekunden (T = 90) werden die ersten 25 ml Chloroform hinzugegeben. Dann wird während 30 Minuten gemischt. Bei T = 120 wird die zweite abgemessene 25-ml-Por-tion Chloroform hinzugegeben und während 30 Sekunden

55 vermischt (T= 150). Es wird dann die dritte abgemessene 25-ml-Portion Chloroform hinzugegeben und das Ganze während 30 Sekunden gerührt (T = 180). Es wird schliesslich die vierte abgemessene 25-ml-Portion Chloroform hinzugegeben und das Ganze genau während 30 Sekunden gemischt (T = 210 Sekunden). Dann wird die Mischvorrichtung verschlossen.

17. Der Inhalt der Mischvorrichtung wird in zwei 1-Liter-Plastikflaschen, welche zum Zentrifugieren verwendet werden, gegossen. Die Flaschen werden zuvor dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Dann werden sie während 3 Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.

18. Die überstehende Flüssigkeit wird vorsichtig abdekantiert.

40

50

60

65

9

647 869

19. Zu jeder Flasche werden ungefähr 50 ml der «Tween-20»-Lösung, d.h. ungefähr das gleiche Tween-20-Volumen wie bei den Kapseln, hinzugegeben. Dann wird mit dem Rührstab während ungefähr 5 Minuten gründlich gemischt.

20. Jede Flasche wird hierauf mit ungefähr 10 bis 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung versetzt und der Inhalt gründlich gerührt.

21. Die Stufe 20 wird 4- bis 5mal wiederholt.

22. Dann werden weitere 400 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzugegeben und das Ganze gemischt.

23. Die Flaschen werden gewogen und während 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesogen. Dann werden jeder Flasche ungefähr 800 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Dann wird gründlich gerührt und verschlossen.

24. Die Stufe 23 wird zehnmal wiederholt. Nach dem letzten Absaugen werden in jede Flasche 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingetragen und der Inhalt von beiden Flaschen dann vereinigt. Das Ganze wird gründlich geschüttelt. Dann wird es in einen geeichten 500-ml:Glaszylinder gegossen und der Zylinderinhalt durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 500 ml gebracht.

25. Dieses Material wird bei 4 °C in einem 1-Liter-Reagenzkolben aus Glas gelagert.

Die «Tween-20»-Waschiösung, welche am Tage vor deren Gebrauch hergestellt werden kann, lässt sich wie folgt herstellen:

1. Es werden 6,06 g Natriumbicarbonat auf einer Dreibalkenwaage ausgewogen.

2. Es werden vorsichtig 6,06 g Natriumbicarbonat in einem 250-ml-Kolben, welcher mit einem Rührstab versehen ist, eingetragen.

3. Es werden ungefähr 200 ml gereinigtes Wasser hinzugegeben und solange mit dem magnetischen Rührer gerührt, bis das Natriumbicarbonat gelöst ist.

4. Der Rührstab wird entnommen und der Kolbeninhalt mit gereinigtem Wasser versetzt, bis der Kolbeninhalt 250 ml beträgt.

5. Dann wird vorsichtig in einem 500-ml-Erlenmeyerkol-ben, welcher mit einem Rührstab ausgerüstet ist, gegossen.

6. Es werden vorsichtig 250 ml «Tween-20» in einen geeichten 250-ml-Zylinder eingegeben.

7. Dann erfolgt die Zugabe zum Erlenmeyerkolben, welcher Natriumbicarbonatlösung enthält.

8. Mit Hilfe des magnetischen Rührwerks wird solange gemischt, bis eine vollständige Mischung nach ungefähr 1 Stunde erhalten worden ist.

9. Hierauf wird in einem dicht versiegelten 1-Liter-Kolben aus Polyäthylen, welcher zugeschraubt ist, bei ungefähr 25 °C gelagert.

Die Terephthaloylchloridlösung, welche am Tag der Verwendung hergestellt werden sollte, wird ohne Tiefkühlung wie folgt erhalten:

1. Das Gewicht von Terephthaloylchlorid (TCL) wird auf der das TCL enthaltenden Flasche notiert. Das Gewicht von TCL in g wird mit 10 multipliziert, um das Volumen der dem TCL zuzugebenden Cyclohexan-Chloroform-Lösung in Millilitern zu berechnen.

Berechnung: gxTCLx 10 = ml Totalvolumen Cyclo-

hexan-Chloroform-Lösung.

Es ist darauf zu achten, dass das Total volumen ausreicht für die folgende Arbeitsweise.

2. Die Cyclohexan-Chloroform-Lösung beträgt 4 Teile Cyclohexan und 1 Teil Chloroform. Das Totalvolumen der Cyclohexan-Chloroform-Lösung (obige Stufe 1) wird durch 5 dividiert, um das Volumen von Chloroform zu berechnen.

Das Chloroformvolumen wird mit 4 multipliziert, um das Cyclohexanvolumen zu bestimmen.

Berechnung: a) ml Totalvolumen — 5 = ml Chloroform. Cyclohexan/Chloroform b) ml Chloroform x 4= ml Cyclohexan.

3. Die berechneten Volumina an Cyclohexan und Chloroform werden vorsichtig in geeichten Zylindern abgemessen. Dann werden diese Mengen in einem Erlenmeyerkolben vereinigt. Es wird gelinde gerührt, um eine Mischung zu erhalten. Dann wird mit einem Uhrglas abgedeckt. Das Ganze wird in den Abzug gestellt.

4. Ein magnetisches Rührwerk wird in den Abzug gestellt.

5. Die das Terephthaloylchlorid enthaltende Flasche wird mit dem magnetischen Rührwerk in Verbindung gebracht. Die Flasche wird geöffnet und möglichst rasch mit dem magnetischen Rührstab und der Cyclohexan-Chloroform-Lösung versehen. Dann wird die Flasche wieder mit dem Stopfen verschlossen. »

6. Es wird solarige mit dem magnetischen Rührer gerührt, bis sämtliches Terephthaloylchlorid in Lösung gegangen ist. Dabei mag es nötig sein, die Flasche zu kippen, um am oberen Ende der Flasche vorhandenes Terephthaloylchlorid aufzulösen.

7. Dann werden möglichst schnell so viel 200-mI-Zentrifu-gierflaschen aus Glas als nötig in der gleichen Menge der Terephthaloylchloridlösung gefüllt und verschlossen. Das Ganze wird dann während 10 Minuten bei Zimmertemperatur und mit 2600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.

8. Die überstehende Flüssigkeit wird in bernsteinfarbenen 500-ml-Flaschen gegossen und gründlich versiegelt.

9. Die Lagerung in fest versiegeltem Zustande erfolgt bei ungefähr 25 °C.

Die Herstellung der Mischung von 15% Polyvinylpyrroli-don-40 und Comassie Blue mit 4% Rinderserumalbumin geschieht in folgender Weise, wobei man dies am Tag der Verwendung vornimmt. Das Gemisch ist nicht in den Gefrierschrank zu stellen.

1. Es werden auf einer Dreibalkenwaage 7,5 g Polyvinyl-pyrrolidon-40, 2 g Rinderserumalbumin und 0,1 g (100 mg) «Comassie Blue» abgewogen.

2. Das Polyvinylpyrrolidon-40 wird in ein mit einem Rührstab versehenes 50-ml-Becherglas eingetragen.

3. Es werden ungefähr 20 ml Rinderserumalbumin hinzugegeben und das Becherglas mit einer Glasplatte bedeckt.

4. Dann wird solange mit dem magnetischen Rührwerk gerührt, bis alles gelöst ist.

5. 0,1 g «Comassie Blue» und 2 g Rinderserumalbumin werden getrennt in ein anderes 50-ml-Becherglas eingetragen.

6. Es werden ungefähr 20 ml Rinderserumalbumin hinzugegeben und der Becher mit einer Glasplatte bedeckt.

7. Es wird gerührt und unter Verwendung einer Heizplatte und eines magnetischen Rührwerks Nr. 10 schwach erhitzt, wobei die Heizplatte auf Stufe 2 eingestellt ist. Es wird solange gerührt, bis alles nach ungefähr 10 Minuten gelöst ist.

8. Der gesamte Inhalt der die Polyvinylpyrrolidon-40-Lösung und die Comassie-Blue-Lösung enthaltenden Bechergläser werden vorsichtig einem 50-ml-Glaskolben, welcher mit einem Rührstab versehen ist, zugegeben.

9. Die vereinigten Lösungen werden während 10 Minuten mit dem magnetischen Rührwerk vermischt, worauf der Rührstab entfernt wird.

10. Es wird dann mit Rinderserumalbumin auf ein Volumen von 50 ml gefüllt.

11. Der pH-Wert wird auf 7,5 ± 0,5 mit Hilfe von 1 n-Natriumhydroxyd eingestellt. Orig.-pH End-

pH Menge an verwendetem ln-NaOH .

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

647 869

10

12. Die Lösung wird durch eine «Nalgen»-Membran-Wegwerffiltereinheit (0,45 u) filtriert.

13. Das Ganze wird bei ungefähr 25 °C in einer 60-ml-Polyäthylenflasche mit Verschlusskappe versiegelt und gelagert.

Die mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird wie folgt hergestellt, wobei diese Lösung tags zuvor hergestellt werden kann:

1. In einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder werden vorsichtig 1000 ml einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung eingefüllt.

2. Es wird in einen aus Polyäthylenballon mit 20 Liter Fassungsvermögen gegossen.

3. Dann werden in einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder 9000 ml entionisiertes Wasser eingemessen und diese Flüssigkeit dem Ballon, welcher die mit Phosphat gepufferte Kochsalzvorratslösung enthält, versetzt.

4. Unter Verwendung eines magnetischen Rührstabes wird gerührt.

5. Der pH-Wert wird bestimmt. Nötigenfalls wird er auf einen solchen von 7,5 + 0,05 eingestellt. Schluss-pH—

Wert= .

6. Die mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird in einem dicht versiegelten 20-Liter-Polyäthylenballon bei ungefähr 25 °C solange gelagert, bis sie verwendet wird.

Das 1,6-Hexandiamincarbonat wird wie folgt hergestellt, wobei dies tags zuvor geschehen kann:

1. Die das 1,6-Hexandiamin enthaltende Flasche wird in ein 3-Liter-Becherglas gestellt. Dann wird dem Becher genügend Brunnenwasser zugegeben, um das Niveau des Hexan-diamins in der Flasche zu erreichen.

2. Der Verschluss der Hexandiaminflasche wird gelockert.

3. Das Becherglas wird an den magnetischen Rührer angeschlossen und auf einer Heizplatte auf Stufe 2 solange erwärmt, bis das Hexandiamin vollständig geschmolzen ist.

4. In einen geeichten 25-ml-Glaszylinder werden genau 17,7 ml Hexandiamin abgemessen. Dann wird vorsichtig in eine bernsteinfarbene 100-ml-Flasche gegossen.

5. Es werden genau 32 ml gereinigtes Wasser in einen geeichten 50-ml-Glaszylinder hinzugegeben. Dann wird dieses Wasser dem Hexandiamin in der bernsteinfarbenen Flasche zugegeben.

6. Durch die Lösung wird CO2 während ungefähr 1 Stunde so lange durchgeblasen, bis der pH = 8,5 ± 0,1 erreicht ist. End-pH-Wert = .

7. Die bernsteinfarbene Flasche wird versiegelt und bei ungefähr 25 °C gelagert.

Die Mikrokapsel und das Prinzip des Arbeitsganges ist in Fig. 9 schematisch dargestellt. Wie aus der Fig. 9 ersichtlich ist, wird der Antikörper 9, welcher in bezug auf Digoxin spezifisch ist, innerhalb der Wandung 10 der Mikrokapsel 12 eingefangen. Die Wandungen 10 der Mikrokapsel 12 besitzen jedoch Öffnungen 14, welche genügend klein sind, um den freien Durchlass von Digoxin zu erlauben. Somit können das aus der Probe stammende Digoxin 16 und das markierte Digoxin 18 ohne weiteres durch die Wandungen der Mikrokapseln hindurchtreten und können miteinander um die Bindungsstellen am Antikörper 9 «konkurrieren». Nicht gebundenes Digoxin 16 bzw. 18 lässt sich nach vollständiger Bebrütung aus der Mikrokapsel herauswaschen.

Wie oben ausgeführt worden ist, ist ein Teil des Digoxins markiert, und dieses markierte Digoxin «konkurriert» mit dem nicht markierten Digoxin, welches aus der Probe stammt, um die Stellen am Antikörper, welche für Digoxin spezifisch sind. Das bevorzugte markierte Digoxin ist (125J)--Digoxin, welches man bei der Firma New Endland Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, käuflich erwerben kann.

Testverfahren

1. Eine Probe oder mehrere Proben des zu testenden Serums werden nach bekannten Verfahren erhalten. In diesem Beispiel werden Blindproben verwendet.

5 2. 0,1 ml (100 Lil) einer jeden Serumprobe standardisierter Beschaffenheit, jeder Vergleichsprobe oder jeder unbekannten Probe von einem Patienten wird mit der Pipette in entsprechend bezeichnete Röhrchen, welche 0,5 ml Digoxin-Antikörper-Mikrokapselsuspension, hergestellt nach den obi-

10 gen Angaben, enthalten, mit der Pipette zugegeben.

3. 0,5 ml (500 jil) mit 12äJ markiertes Digoxin in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung werden in jedes Röhrchen mit der Pipette hinzugegeben. Es wird während mindestens 3 bis 4 Sekunden aufgewirbelt.

15 4. Sämtliche Reaktionsröhrchen werden in einem Wasserbade (37 °C) während mindestens 15 Minute inkubiert. Man kann auch sämtliche Reaktionsröhrchen bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C während mindestens 30 Minuten inkubieren.

5. Jedes Röhrchen wird mit 0,5 ml (500 jj.1) Waschlösung

20 versetzt und der Röhrcheninhalt während mindestens 3 bis 4

Sekunden aufgewirbelt.

6. Sämtliche Reaktionsröhrchen werden während 5 Minuten bei Zimmertemperatur (20 bis 25 °C) inkubiert.

7. Sämtliche Röhrchen werden bei mindestens 1600 g

25 während 10 Minuten bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C zentrifugiert, worauf man die überstehende Flüssigkeit in einen geeigneten Abfallbehälter dekantiert. Der letzte Tropfen wurde auf einem Löschblatt aufgenommen.

8. Sämtliche Röhrchen werden in einem Gammazählwerk,

30 eingestellt für 125J, während jeweils 1 Minute gezählt.

9. Die Standardkurve bekannter Mengen Digoxin gegen cpm wird gezeichnet, worauf man aus dieser Kurve die unbekannten Digoxinmengen abliest.

35 Verwendete Reagenzien

Der Digoxin-Antikörper wird in semipermeablen Nylonmikrokapseln eingekapselt, welche in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung der oben erwähnten Art suspendiert sind. Zur Qualitätskontrolle enthalten die Antikörpermi-

40 krokapseln einen blauen Farbstoff, nämlich Comassie Blue R250. Nachdem sich die Mikrokapseln abgesetzt oder durch Zentrifugieren niedergeschlagen haben, zeigt die überstehende blaue Flüssigkeit an, dass die Mikrokapseln geborsten und der Antikörper eingedrungen ist.

45

Mit 125J markiertes Digoxin

Jedes ml Lösung enthält 10 ug l25J-Digoxin von weniger als 4,2 n Ci.

30 Pufferlösung

0,015molare Phosphatpufferlösung, pH = 7,5, enthaltend 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid.

53 Waschlösung

Polyäthylenglykol 6000,20%ige Lösung in 0,5molarem Barbitalpuffer, pH = 6,9, enthaltend 0,15 Mol/Liter Natriumchlorid.

60 Berechnung der Resultate

Die Resultate dieses Experimentes finden sich in der Tabelle 5 und werden graphisch in den Fig. 7 und 8 dargestellt.

In Fig. 7 wird CPM auf einer linearen Skala auf halbloga-

65 rithmischem Papier mit 2 Dekaden gegen die Konzentration von Digoxin in ng/ml auf der Logarithmenskala aufgetragen. Eine Alternative zum Auftragen von CPM gegen die Digoxinkonzentration besteht darin, dass man den Prozentsatz an

11

647 869

gebundenem Digoxin (relativ) gegen die Digoxinkonzentration gemäss Fig. 8 aufträgt. Dies kann dadurch geschehen, dass man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) für jedes Standardmaterial, Vergleichsmaterial oder unbekanntes Material errechnet und diese Werte auf halblogarith-mischem Papier mit 2 Dekaden in ähnlicher Weise aufträgt, wie dies zuvor für CPM beschrieben worden ist. Der Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) wird wie folgt berechnet: % gebunden (relativ) = (durchschnittliches CPM gebunden von 0 ng/ml Digoxinstandarad) x 100.

Tabelle 5

Standard ng/ml

CPM gebunden

Digoxin

1

2

0

16,888

17,136

0,5

14,464

14,473

1,0

12,279

12,192

2,0

9,690

9,717

4,0

7,344

7,445 ■

Blindversuch

1

10,360

10,486

2

8,226

8,380

CPM Total =

26 780

Durchschnitt

Relativ % gebunden

Digoxinwert

(CPM gebunden/

ng/ml

CPM gebunden)'

•x 100

17012

100,0

14 469

85,0

12 236

72,0

9 704

57,0

7 395

43,0

10 423

61,3

1,7

8 303

48,8

3,1

* gebunden = CPM gebunden bzw. 0 ng/ml Digoxin

Das Testsystem dieses Verfahrens hat sich als sehr präzis erwiesen. Die Innerblockvarianz beträgt weniger als 7% und die Zwischenblockvarianz weniger als 9%.

Innerblockvarianz

Die Varianzkoeffizienten, nachstehend mit C V bezeichnet, bei zwei Kontrollproben, jeweils 25mal innerhalb eines Experimentes getestet, ergaben die folgenden Werte:

mittleres Digoxin ng/ml

CV

Kontrollversuch 1

1,54

4,9%

Kontrollversuch 2

2,95

6,2%

Zwischenblockvarianz

Die Varianzkoeffizienten für die beiden Kontrollversuche, jeweils 3mal in 18 getrennten Versuchen getestet, waren die folgenden:

mittleres Digoxin ng/ml

CV

Kontrollversuch 1

1,50

7,3%

Kontrollversuch 2

3,04

8,8%

Die folgende Tabelle 6 zeigt die ausserordentlichen Werte dieses Testes für Digoxin und den Ausschluss anderer potentiell dazwischentretenden Substanzen.

Tabelle 6

Spezifität:

Prozentuale Kreuzreaktionsfähigkeit verschiedener biochemischer Verbindungen mit in Mikrokapseln eingeschlossenen Antidigoxin-Antiseren.

Verbindung % Kreuzreaktivität

Digoxin 100,00

Digitoxin 0,80

Progesteron 0,16

Cortisol 0,10

Testosteron 0,08

Dehydroandrosteronsulfat 0,08

Cholesterin 0,06

Quabain 0,02

Quantitative Gewinnung

Es hat sich herausgestellt, dass das vorliegende Verfahren durchaus quantitativ erfolgt, indem nicht weniger als eine 96%ige Rückgewinnung der hinzugesetzten Digoxinproben erzielt wird.

Tabelle 7 Rückgewinnungswerte

Anfänglicher zugesetztes

Total gemessenes

% Rückge

Digoxin-

Digoxin

Digoxin

Digoxin winnung

Wert

ng/ml ng/ml

0,64

0,5

1,14

1,13

99

0,64

1,0

1,64

1,72

105

0,64

2,0

2,64

2,70

102

0,64

4,0

4,64

4,45

96

Es ist besonders wichtig das hohe Ausmass der Korrelation der Resultate beim vorliegenden Verfahren mit Digoxin-bestimmungen, wie sie mit anderen Testmethoden festgehalten wurden, festzuhalten.

Die Tabelle 8 zeigt Vergleichstestresultate, welche man den nach dem vorliegenden Verfahren und nach anderen Testmethoden erzielt.

Die Systeme A und C entsprechen flüssigen Testsystemen mit die Ausfällung bewirkenden Reagenzien, während das System B eine Trennung in fester Phase benützt. Es geht daraus hervor, dass ein 0,97- bis 0,98-Korrelationskoeffizient besteht.

Tabelle 8

Übereinstimmung für die verfschiedenen Testmethoden

Die Korrelationskoeffizienten für 135 Proben nach dem System A, dem System B, dem System C und dem vorliegenden System waren die folgenden:

n r*

y

System A

135

0,98

1,12x -0,1

System B

135

0,97

0,90 x -0,02

System C

135

0,97

0,96 x + 0

vorliegendes System

135

0,97

0,95 x +0,14

*r= Korrelationskoeffizient

5

10

15

20

25

30

.35

40

45

50

55

60

65

647 869

12

Aus dem soeben Gesagten geht eindeutig hervor, dass die in der vorliegenden Beschreibung geoffenbarte Testtechnik für die Bestimmung der Anwesenheit und der Konzentration beliebiger freier Spezies Verwendung finden kann unter der Voraussetzung, dass ein komplentärer Antikörper, welcher sich mit der Spezies und einem von dieser Spezies unterscheidbaren Analogon spezifisch binden lässt, zugänglich sind. Hinzu kommt, dass das Molekulargewicht der Spezies und seines Analogons genügend niedrig sein muss, dass man

Mikrokapselmembranen einsetzen kann, welche eine selektive Diffusion dieser Substanzen erlaubt, andererseits aber den Durchlass von hochmolekularen Materialien, wie z.B. natürlichen Proteinen, verhindert. Glücklicherweise besitzen Steroidhormone, Thyroidhormone, manche Arzneimittel und andere Klassen von Substanzen klinischer Wichtigkeit Molekulardimensionen, welche wesentlich kleiner sind als jene der natürlichen Proteine.

G

5 Blatt Zeichnungen

Claims (15)

1. 647 869

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Bestimmung eines an Protein nicht gebundenen chemischen Stoffes in einer proteinhaltigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einem sich in bezug auf diesen Stoff komplementär verhaltenden Antikörper und einem von diesem Stoff unterscheidbaren Analogon inkubiert, wobei die Probe und der Antikörper durch mindestens eine Membran voneinander getrennt sind, welche eine ausreichende Porosität aufweist, um den besagten Stoff und das sich davon unterscheidende Analogon durchzulassen, andererseits aber nicht genügend porös ist, um den Durchlass des in der Probe vorhandenen Antikörpers oder an Protein gebundenen Stoffes zu erlauben, dass man den in der Probe vorhandenen ungebundenen Stoff durch die Membran hindurchgehen und mit dem von ihm unterscheidbaren Analogon um die Besetzung der vom Antikörper gebotenen Bindestellen konkurrieren lässt, dass man hierauf den Antikörper von dem nicht gebundenen Stoff und dem nicht gebundenen Analogon abtrennt und die Menge an von dem Stoff unterscheidbarem Analogon, welches an besagten Antikörper gebunden oder antikörperfrei ist, bestimmt, wobei diese Menge die Menge des Stoffes, welche in der Probe an Protein nicht gebunden ist, anzeigt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Antikörper und das von dem Stoff unterscheidbare Analogon sich innerhalb von Mikrokapseln, welche die besagten Membranen bilden, befinden, dass der Trennvorgang dadurch bewirkt wird, dass man den ungebundenen Stoff und das besagte Analogon aus den besagten Mikrokapseln entfernt und die besagten Mikrokapseln aus dem Rest des Reaktionssystems abtrennt, und dass die Menge an Analogon, welches an den besagten Antikörper gebunden ist, bestimmt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das sich unterscheidbare Analogon den besagten Stoff, markiert mit einem radioaktiven Atom, aufweist.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoff L-Thyroxin ist.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Stoff L-3,5,3'-Tri-jodthyro-nin ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Stoff Cortisol, Testosteron oder neonatales Thyroxin ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Trennvorgang dadurch bewirkt wird, dass man eine Osmolalitätsveränderung im Reaktionssystem, welche die Mikrokapseln aufbrechen lässt, bewirkt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Trennvorgang dadurch bewirkt wird, dass man den nicht gebundenen Stoff und nicht gebundenes Analogon aus den Mikrokapseln herauswäscht.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Stoff Digoxin ist.
10. 10. Testsatz zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er folgende Bestandteile enthält:

    ein unterscheidbares Analogon des besagten Stoffes ;

    eine Vielzahl von Mikrokapseln, welche einen sich zum besagten Stoff komplementär verhaltenden Antikörper enthalten, wobei die besagten Mikrokapseln Membranen mit genügender Durchlässigkeit aufweisen, um den Durchgang des besagten Stoffes und eines von diesem unterscheidbaren Analogons zu gestatten, jedoch ungenügend durchlässig sind, den besagten Antikörper oder natürliche Proteine durchzulassen, wobei diese Mikrokapseln dazu bestimmt sind, nicht gebundenen Stoff aus der besagten Probe zu adsorbieren;

    ein Reaktionsmittel, welches nicht gebundenen Stoff und dessen nicht gebundenes, unterscheidbares Analogon aus den besagten Mikrokapseln zu entfernen vermag; und ein Standardmittel, welches eine zuvor bestimmte Menge des besagten Stoffes enthält und zum Vergleich mit einer Probe dienen soll.
11. 11. Testsatz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Stoff Thyroxin ist, das besagte von diesem unterscheidbare Analogon radioaktiv markiertes Thyroxin ist und das besagte Standardmittel aliquote Teile eines Materials ist, welches bekannte Mengen an freiem Thyroxin enthält, welche bei der Prüfung im Vergleich mit der Probe eine Eichkurve aufzuzeichnen erlauben.
12. 12. Testsatz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmittel Serumalbumin oder Polyäthylen-imin enthält.
13. 13. Testsatz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Mikrokapseln Antikörper zu Digoxin enthalten und das besagte davon unterscheidbare Analogon '-5J-markiertes Digoxin ist.
14. 14. Reagenz zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz einerseits eine Vielzahl von Mikrokapseln, welche einen sich komplementär zum analytisch zu erfassenden Stoff verhaltenden Antikörper enthalten, und andererseits ein von diesem Stoff unterscheidbares Analogen aufweist, und dass ausserdem die besagten Mikrokapseln Membranen von ausreichender Permeabilität bilden, um den Durchgang des analytisch zu erfassenden Stoffes und dessen unterscheidbaren Analogons zu erlauben, andererseits aber ungenügend durchlässig sind, um den besagten Antikörper und die natürlichen Proteine durchzulassen.
15. 15. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sich der besagte Antikörper zu Thyroxin komplementär verhält und das besagte von ihm unterscheidbare Analogon radioaktiv markiertes Thyroxin ist.