CH647869A5

CH647869A5 - METHOD FOR DETERMINING A FREE CHEMICAL.

Info

Publication number: CH647869A5
Application number: CH5723/79A
Authority: CH
Inventors: Robert J Buehler; Theresa H Chan; Franklin Lim; Richard D Moss
Original assignee: Damon Corp
Priority date: 1978-06-20
Filing date: 1979-06-19
Publication date: 1985-02-15
Also published as: NO792030L; GB2023816A; GB2023816B; DE2924881A1; FR2432171B1; DK256279A; SE445680B; IT7968303A0; NO154409C; NO154409B; IT1119920B; FR2432171A1; CA1120397A; SE7905101L

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines an Protein nicht gebundenen chemischen Stoffes, wie z.B. Hormone, in einer proteinhaltigen Probe, wie z.B. Serum. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung solcher Stoffe, welche mit Protein reversible Bindungen in Proben, welche den freien Stoff, das bindende Protein und eine Konzentration einer Komplexverbindung des Proteins und des Stoffes enthalten, eingehen können. The present invention relates to a method for the determination of a chemical not bound to protein, e.g. Hormones, in a protein-containing sample, e.g. Serum. In particular, the invention relates to a method for determining those substances which can form reversible bonds with protein in samples which contain the free substance, the binding protein and a concentration of a complex compound of the protein and the substance.

Die Methode der kompetitiven Bindung zum Messen der Konzentration verschiedener, biologisch aktiver Substanzen für diagnostische Zwecke ist bestens bekannt. Diese Technik umfasst ein Reaktionssystem, in welchem ein Antikörper, welcher sich zu dem zu bestimmenden chemischen Stoff (welcher im folgenden durch den Ausdruck «Spezies» bezeichnet wird) spezifisch verhält, zusammen mit der Testprobe und einer aliquoten Menge eines von der Probe unterscheidbaren Analogons inkubiert wird. Das Analogon und die natürliche Spezies konkurrieren zum Besetzen von Bindestellen am Antikörper. Nach dem Abtrennen des Antikörpers vom Rest des Reaktionssystems kann der Antikörper oder die überstehende Flüssigkeit auf das Analogon hin geprüft werden. Die Menge an mit dem Antikörper vereinigtem Analogon ist der Konzentration der zu bestimmenden Spezies in der Probe umgekehrt proportional. The method of competitive binding for measuring the concentration of various biologically active substances for diagnostic purposes is well known. This technique comprises a reaction system in which an antibody, which is specific to the chemical to be determined (hereinafter referred to as "species"), is incubated together with the test sample and an aliquot of an analog that can be distinguished from the sample becomes. The analogue and the natural species compete to occupy binding sites on the antibody. After separating the antibody from the rest of the reaction system, the antibody or the supernatant can be checked for the analog. The amount of analog combined with the antibody is inversely proportional to the concentration of the species to be determined in the sample.

Zwei zur Durchführung solcher kompetitiver Bestimmungen üblichen Methoden sind als «Flüssigphase-Radioimmunotest» und «Festphase-Radioimmunotest» bekannt. In jedem dieser Systeme muss die an den Antikörper gebundene, Two methods customary for carrying out such competitive determinations are known as "liquid phase radioimmunoassay" and "solid phase radioimmunoassay". In each of these systems, the antibody bound,

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immunogene Substanz von der nicht gebundenen, îmmunoge-nen Substanz abgetrennt werden, um das Messen der Menge an markiertem Analogon auf dem Antikörper zu ermöglichen. Aus dieser Messung wird dann die Menge an immunogener Substanz in der Probe berechnet. immunogenic substance is separated from the unbound, immunogenic substance in order to enable the measurement of the amount of labeled analog on the antibody. The amount of immunogenic substance in the sample is then calculated from this measurement.

Bei den Radioimmunotestsystemen in flüssiger Phase werden der Antikörper, das marki'erte Analogon und die zu bestimmende immunogene Substanz in Lösung inkubiert. Dabei ist eine Anzahl von Bindestellen am Antikörper zugänglich und die Reaktionsdauer kurz. Zur Abtrennung der mit dem Antikörper eine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz von der keine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz wird die Komplexverbindung der immunogenen Substanz und des Antikörpers ausgefällt, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert. In the radioimmunoassay systems in liquid phase, the antibody, the labeled analogue and the immunogenic substance to be determined are incubated in solution. A number of binding sites on the antibody are accessible and the reaction time is short. In order to separate the immunogenic substance that has been bound to the complex from the antibody from the immunogenic substance that has not been bound to the complex, the complex compound of the immunogenic substance and the antibody is precipitated, centrifuged and the supernatant liquid decanted.

Die Radioimmunotestsysteme in fester Phase vermeiden die Ausfällungsstufe. Der Antikörper ist an ein Glasstück oder an der Innenoberfläche eines Rohres gebunden. Durch Zentrifugieren des Glasstückes oder Dekantieren der überzogenen Rohre wird die mit dem Antikörper eine Komplexbindung eingegangene immunogene Substanz von der keine Komplexbindung eingegangenen immunogenen Substanz getrennt. Die Reaktionsdauer hierfür ist allerdings relativ lang, weil eine Anzahl der zugänglichen aktiven Stellen am Antikörper durch das Glasstück oder das Rohr blockiert ist. The radioimmunoassay systems in solid phase avoid the precipitation stage. The antibody is bound to a piece of glass or to the inside surface of a tube. By centrifuging the piece of glass or decanting the coated tubes, the immunogenic substance that has been bound to the complex with the antibody is separated from the immunogenic substance that has not been bound to the complex. However, the reaction time for this is relatively long because a number of the accessible active sites on the antibody are blocked by the glass piece or the tube.

Hormone, wie z.B. jene, die aus der Schilddrüse, den Hoden, den Ovarien, den Nebennieren und anderen tierischen Drüsen ausgeschieden werden, werden häufig durch das Zirkulationssystem in Verbindung mit hormonbindenden Proteinen oder Globulinen geführt. Häufig ist es von diagnostischer Bedeutung, dass man die Anwesenheit und die Konzentration eines freien Hormons im Gegensatz zu proteingebundenem Hormon oder Totalhormon bestimmen kann. So existiert beispielsweise Thyroxin (T») in der Blutbahn in einem dynamischen Gleichgewicht in Form einer Spezies, welche an Transportprotein gebunden ist (Thyroxin-binden-des Globulin, Albumin oder Prealbumin), und einer kleinen Fraktion (0,1 °'o oder weniger) als ungebundene Substanz (freies oder ungebundenes Ti). Freies T-i gilt als' die aktive Spezies des Thyroidhormonsystems. Leider hat sich die Methode zur Bestimmung des freien T» als langwierig, kompliziert und kostspielig erwiesen und sie bringt Fehlwerte mit sich wegen der Schwierigkeit im Standardisieren der Materialien und im Messen kleiner Mengen an nicht gebundenem Hormon in Gegenwart von überwiegenden Mengen an Hormon, welches mit dem Protein relativ locker gebunden ist. Mit der erwähnten Methode durch kompetitive Bindung ist es nicht möglich, Konzentrationen an freier Spezies zu bestimmen. Hormones such as those that are excreted from the thyroid, testes, ovaries, adrenal glands, and other animal glands are often routed through the circulatory system in conjunction with hormone-binding proteins or globulins. Often it is of diagnostic importance that the presence and concentration of a free hormone can be determined in contrast to protein-bound hormone or total hormone. For example, thyroxine (T ») exists in the bloodstream in a dynamic equilibrium in the form of a species that is bound to transport protein (thyroxine-binding globulin, albumin or prealbumin) and a small fraction (0.1 ° or) less) than unbound substance (free or unbound Ti). Free T-i is considered 'the active species of the thyroid hormone system. Unfortunately, the method for determining the free T »has proven to be lengthy, complicated and costly, and it entails errors due to the difficulty in standardizing the materials and measuring small amounts of unbound hormone in the presence of predominant amounts of the hormone that is involved the protein is bound relatively loosely. It is not possible to determine free species concentrations using the competitive binding method mentioned.

Unter den Methoden zum Messen von freiem Tt und anderen Hormonen, welche in vivo als Proteinkomplexverbindungen vorliegen, bietet jene durch Verwendung einer Dialysiermembrane ein hohes Ausmass an Genauigkeit. Ein Dialysesack, welcher bekannte Mengen an zu prüfendem Serum und markiertem Hormon enthält, wird in einer Pufferlösung suspendiert. Das markierte Hormon verteilt sich auf den freien und gebundenen Zustand in den gleichen Mengenverhältnissen wie das Serumhormon. Die zugesetzte Menge an markiertem Hormon muss äusserst gering sein, um das System nicht ernstlich zu beeinträchtigen, während der Zählwert hoch sein muss, um die Wahrnehmung von kleinen Mengen zu gewährleisten. Im Falle von radiaktiven Markierungen bedingt dies die Verwendung von markiertem Hormon von sehr hoher spezifischer Aktivität. Nach einer geeigneten Zeitspanne - ungefähr 24 Stunden - diffundieren das markierte und das natürliche, an Protein nicht gebundene Hormon durch den semipermeablen Dialysesack, während das an Protein (Molekulargewicht von mehr als 20 000) gebundene Hormon im Dialysesack verbleibt. Um die Menge an im Serum vorhandenem freiem Hormon zu bestimmen, prüft man eine aliquote Menge der Pufferlösung auf das markierte Hormon. Aus dem Ergebnis kann die Fraktion von markiertem Hormon, welche in die Pufferlösung eingedrungen ist, berechnet und die Fraktion vom Totalhormon, welche in freiem Zustand vorliegt, daraus gefolgert werden. Um diese Fraktion in Masseneinheiten (z.B. ng/dl) freien Hormons überzuführen, muss auch mit der Probe ein Gesamthormontest durchgeführt werden. Among the methods for measuring free Tt and other hormones, which are present as protein complex compounds in vivo, the one by using a dialysis membrane offers a high degree of accuracy. A dialysis bag containing known amounts of serum to be tested and labeled hormone is suspended in a buffer solution. The marked hormone is distributed in the free and bound state in the same proportions as the serum hormone. The amount of labeled hormone added must be extremely small so as not to seriously affect the system, while the count must be high to ensure the perception of small amounts. In the case of radioactive labels, this requires the use of labeled hormone of very high specific activity. After a suitable period of time - approximately 24 hours - the labeled and natural hormone not bound to protein diffuse through the semipermeable dialysis bag, while the hormone bound to protein (molecular weight of more than 20,000) remains in the dialysis bag. To determine the amount of free hormone present in the serum, test an aliquot of the buffer solution for the labeled hormone. From the result, the fraction of labeled hormone which has penetrated into the buffer solution can be calculated and the fraction of total hormone which is in the free state can be inferred therefrom. In order to convert this fraction into mass units (e.g. ng / dl) of free hormone, a total hormone test must also be carried out on the sample.

Wenngleich dieses System bei der Bestimmung von freiem Tt und anderen freien Hormonen brauchbare Resultate liefern kann, eignet es sich für den Routinegebrauch aber nicht. Es müssen nämlich zwei Teste durchgeführt werden, und die Genauigkeit des Endwertes kann durch jeden dieser Teste beeinträchtigt werden. Hinzukommt, dass man für jeden Test eher grosse Mengen Radioaktivität benötigt. Verunreinigungen im markierten Hormon können mitspielen und besondere Probleme verursachen. Ferner benötigt man eine lange Inkubationsdauer. Schliesslich kann man nur Serum verwenden und dieses muss noch ganz frisch sein. Hinzukommt, dass das Sammeln und das Standardisieren sämtlicher für den Test erforderlichen Materialien keine Routineangelegenheit ist. Daher ist die Anwendung dieser Methode wegen der hohen Kosten, des hohen Arbeitsaufwandes und des erforderlichen geschulten Personals sehr beschränkt. While this system can provide useful results in determining free Tt and other free hormones, it is not suitable for routine use. This is because two tests must be carried out, and the accuracy of the final value can be affected by each of these tests. In addition, each test requires large amounts of radioactivity. Impurities in the marked hormone can play along and cause special problems. A long incubation period is also required. After all, you can only use serum and this must still be completely fresh. In addition, collecting and standardizing all the materials required for the test is not a routine matter. Therefore, the application of this method is very limited due to the high costs, the high workload and the required trained personnel.

Eine andere Testmethode für freies Hormon beruht auf der Reaktionskinetik und erfordert zwei getrennte Teste. Bei jedem wird eine kinetische Kurve aufgezeichnet über die Geschwindigkeit, mit welcher ein Antikörper das Hormon, z.B. T-i, von der entgegen gerichteten Anziehung des primären Bindemittels, z.B. des Thyroxin-bindenden Globulins, wegnimmt. Another test method for free hormone is based on reaction kinetics and requires two separate tests. Each has a kinetic curve plotted against the rate at which an antibody breaks down the hormone, e.g. T-i, from the opposite attraction of the primary binder, e.g. of thyroxine-binding globulin.

Bei diesem Testsystem verursachen verschiedene pathologische Bedingungen Ungenauigkeiten. Sind mehr proteinbindende Stellen als üblich vorhanden, so wird die effektive Anziehung des Globulins auf das Hormon grösser und die Geschwindigkeit der Bindung an den Antikörper nimmt ab. Im Falle einer Thyroxinbestimmung würde die Probe deshalb scheinbar wenig T» enthalten, obschon tatsächlich ein höherer Wert an Tt, jedoch alles in gebundener Form, vorhanden wäre. Various pathological conditions cause inaccuracies in this test system. If there are more protein-binding sites than usual, the effective attraction of the globulin to the hormone increases and the rate of binding to the antibody decreases. In the case of a thyroxine determination, the sample would therefore appear to contain little T », although there would indeed be a higher value of Tt, but everything in bound form.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren, ein Reagenz und einen Testsatz, die die direkte Bestimmung nicht gebundener Hormone und anderer solcher Stoffe erlauben. Der Test lässt sich in Gegenwart von Serumprotein und gebundenem Hormon durchführen. The present invention now relates to a method, a reagent and a test kit which allow the direct determination of unbound hormones and other such substances. The test can be carried out in the presence of serum protein and bound hormone.

Gemäss vorliegender Erfindung werden z.B. semipermeable Mikrokapseln, welche einen zum Hormon oder einen anderen zu bestimmenden Stoff sich komplementär verhaltenden Antikörper enthalten, mit sowohl einem von dem zu bestimmenden Stoff unterscheidbaren Analogon als auch mit der Testprobe inkubiert. Das Analogon kann vor der Inkubation in solchen Mengen in die Mikrokapseln eingeführt werden, dass der Antikörper an den den zu bestimmenden Stoff bindenden Stellen gesättigt ist. Die Mikrokapselwandungen bestehen aus Membranen, welche die Testprobe vom Antikörper trennen; sie besitzen eine ausreichende Porosität, um den Durchgang des freien Stoffes und dessen Analogons zu gewährleisten, sind aber nicht genügend porös, um den Durchgang des Antikörpers oder des proteingebundenen Hormons zu erlauben. Wird eine Testprobe einem aliquoten Teil der Mikrokapseln hinzugegeben, so diffundiert der ungebundene Stoff durch die Membran und konkurriert mit seinem Analogon um die Besetzung der vom Antikörper gebotenen Bindestellen. Die Verteilung des Analogons zwischen dem Antikörper und dem Rest des Reaktionssystems gilt According to the present invention, e.g. semipermeable microcapsules, which contain an antibody that is complementary to the hormone or another substance to be determined, are incubated with both an analog that can be distinguished from the substance to be determined and with the test sample. Before the incubation, the analogue can be introduced into the microcapsules in such amounts that the antibody is saturated at the sites binding to the substance to be determined. The microcapsule walls consist of membranes that separate the test sample from the antibody; they have sufficient porosity to ensure the passage of the free substance and its analogs, but are not sufficiently porous to allow passage of the antibody or the protein-bound hormone. If a test sample is added to an aliquot of the microcapsules, the unbound substance diffuses through the membrane and competes with its analogue for the occupation of the binding sites provided by the antibody. The distribution of the analog between the antibody and the rest of the reaction system applies

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daher als Wertmessung für die Menge an ursprünglich in der Probe vorhandenem zu bestimmendem Stoff. Dieses Verfahren vereinigt die Genauigkeit eines üblichen Radioimmunotests in flüssiger Phase und die Einfachheit und die bequeme Arbeitsweise eines Systems in fester Phase. therefore as a value measurement for the amount of substance to be determined originally present in the sample. This method combines the accuracy of a conventional liquid phase radioimmunoassay and the simplicity and convenience of a solid phase system.

Darauf wird der Antikörper zusammen mit dem an ihn gebundenen zu bestimmenden Stoff (und gebundenem Analogon) von dem freien Stoff abgetrennt. Der Antikörper oder der Rest des Reaktionssystems wird hierauf in bezug auf das Analogon geprüft. Die Trennung kann dadurch bewirkt werden, dass man eine osmotische Veränderung vornimmt; dadurch fallen die Kapseln zusammen, und ungebundene Stoffe entweichen aus den Kapseln. Dies kann beispielsweise so geschehen, dass man dem System Serumalbumin oder Polyäthylenimin zugibt, wodurch ein Ausfliessen der intra-kapsulären Flüssigkeit bewirkt wird. Andererseits lässt sich der freie Stoff einfach aus den Mikrokapseln auswaschen. Die Resultate lassen sich durch Vergleich des bereits bestimmten Analogongehaltes mit einem Standard, z.B. einer Kurve der Konzentration an freiem Hormon als Funktion der Radioaktivitätsmenge, der Fluoreszenzintensität oder anderer Markierungseigenschaften, welche als Angabe der Anwesenheit des Analogons verwendet werden, interpretieren. The antibody is then separated from the free substance together with the substance to be determined bound to it (and bound analogue). The antibody or the rest of the reaction system is then tested for the analog. The separation can be brought about by making an osmotic change; this causes the capsules to collapse and unbound substances escape from the capsules. This can be done, for example, by adding serum albumin or polyethyleneimine to the system, which causes the intra-capsular fluid to flow out. On the other hand, the free substance can easily be washed out of the microcapsules. The results can be compared by comparing the already determined analogue content with a standard, e.g. interpret a curve of free hormone concentration as a function of the amount of radioactivity, fluorescence intensity or other labeling properties used as an indication of the presence of the analog.

Der Test kann zur Bestimmung der Gegenwart und/oder der Konzentration an freiem Thyroxin, Trijodthyronin, neonatalem Thyroxin, Testosteron, Cortisol, anderen Steroidhormonen und anderen Substanzen, welche sich an Protein reversibel binden, verwendet werden. Dieser Test kann auch dazu verwendet werden, um Stoffe nachzuweisen, welche sich nicht in signifikantem Ausmasse an Protein binden, wie z.B. Arzneimittel, beispielsweise Digoxin. Im wesentlichen lässt sich ein beliebiges solches Material mit dem Test bestimmen, vorausgesetzt, dass ein sich komplementär verhaltender Antikörper und ein von besagtem Material unterscheidbares Analogon zugänglich sind oder erzeugt werden können. Dieser Test kann routinemässig unter Verwendung eines Testsatzes durchgeführt werden, welcher das Analogon, Antikörperstandards enthaltende Mikrokapseln und vorbestimmte Konzentrationen des zu bestimmenden Stoffes enthaltende, zum Vergleich dienende Blindproben und ein Reagenz zur Entfernung von nicht gebundenem Stoff und Analogon aus den Kapseln nach beendeter Inkubation aufweist. Für die Qualitätskontrolle kann die Lösung in den Mikrokapseln gefärbt sein. Eine gefärbte, überstehende Flüssigkeit - nach dem Absetzen oder Sedimentieren der Kapseln durch Zentrifugie-ren - würde in diesem Fall ein Aufbrechen der Mikrokapseln und ein allfälliges Austreten von Antikörper anzeigen. Im Gegensatz zu den üblichen Testmethoden sichert der neue Test die klinische Korrelation mit dem diagnostizierten Zustand über einen breiten Bereich der Konzentration an Protein, Hormonen und störenden Substanzen. The test can be used to determine the presence and / or concentration of free thyroxine, triiodothyronine, neonatal thyroxine, testosterone, cortisol, other steroid hormones and other substances that bind reversibly to protein. This test can also be used to detect substances that do not bind to protein to a significant extent, e.g. Medicines, for example digoxin. Essentially, any such material can be determined using the test, provided that a complementarily behaving antibody and an analog that is distinguishable from said material are accessible or can be generated. This test can be performed routinely using a test kit that contains the analog, microcapsules containing antibody standards, and blank comparative samples containing predetermined concentrations of the substance to be determined and a reagent for removing unbound substance and analog from the capsules after the incubation has ended. The solution may be colored in the microcapsules for quality control. A colored, supernatant liquid - after centrifugation of the capsules after sedimentation or sedimentation - in this case would indicate that the microcapsules have been broken open and that any antibodies have escaped. In contrast to the usual test methods, the new test ensures clinical correlation with the diagnosed condition over a wide range of concentrations of protein, hormones and interfering substances.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer raschen, einfachen und reproduzierbaren Methode zur Bestimmung der Anwesenheit und Konzentration eines an Protein nicht gebundenen Stoffes in einer flüssigen Probe. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Zurver-fügungstellen eines für diese Bestimmungen geeigneten Reagenz und eines Testsatzes, welcher für eine rasche und bequeme Durchführung solcher Bestimmungen geeignet ist. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Methode zur Bestimmung von freiem Ti in Proben von menschlichem Blut, welche proteingebundenes Tt enthalten. The aim of the present invention is to provide a rapid, simple and reproducible method for determining the presence and concentration of a substance not bound to protein in a liquid sample. Another object of the present invention is to provide a reagent suitable for these determinations and a test kit which is suitable for the rapid and convenient carrying out of such determinations. Another object of the present invention is to provide a method for determining free Ti in human blood samples containing protein-bound Tt.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines wertvollen Verfahrens zur Bestimmung einer immunogenen Substanz, welches die Vorteile der radioimmunologischen Bestimmung in flüssiger und in fester Phase vereinigt. Schliesslich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein durchaus zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung des Digoxingehalts in Serum. Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung. Another object of the present invention is to provide a valuable method for the determination of an immunogenic substance, which combines the advantages of radioimmunological determination in liquid and in solid phase. Finally, the present invention relates to a very reliable method for determining the digoxin content in serum. These and other objects and features of the invention will appear from the following description.

In den Zeichnungen zeigen: The drawings show:

Fig. 1 eine nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Eichkurve, in der auf der y-Achse in linearem Massstab die Zählwerte pro Minute ( x 103) und auf der x-Achse in logarithmischem Massstab die Konzentration an freiem T» in ng/dl aufgetragen sind (Messwerte siehe Tabelle 1); 1 shows a calibration curve produced by the method according to the invention, in which the count values per minute (x 103) are plotted on the y-axis on a linear scale and the concentration of free T »in ng / dl is plotted on the x-axis on a logarithmic scale (Measured values see table 1);

Fig. 2 eine zweite Eichkurve für die erfindungsgemässe Bestimmung von freiem Ti, in der auf der y-Achse in linearem Massstab die Zählwerte pro Minute und auf der x-Achse in logarithmischem Massstab die Konzentration an freiem Tj in ng/dl aufgetragen ist (Messwerte siehe Tabelle 2); 2 shows a second calibration curve for the determination of free Ti according to the invention, in which the count values per minute are plotted on the y-axis on a linear scale and the concentration of free Tj in ng / dl is plotted on the x-axis (measured values see table 2);

Fig. 3 eine graphische Darstellung, in der die Zählwerte pro Minute von mit 125J markiertem und an Tt-Antikörper gebundenem Ti, das in semipermeablen Mikrokapseln, welche in Standardlösungen von freiem Tt eingetaucht sind, enthalten ist, gegen die Zeit aufgetragen sind. Da das mit 125J markierte Ti an den Bindestellen des Ti-Antikörpers durch Serum Ti ersetzt wird, nehmen die Zählwerte von markiertem Tt, das an den Antikörper gebunden bleibt, ab. Es sei darauf hingewiesen, dass die Ersetzungsgeschwindigkeit für bis zu 2stündige Inkubation bei 37 °C weitgehend linear ist; Fig. 3 is a graph plotting the counts per minute of Ti labeled with 125J and bound to Tt antibody and contained in semipermeable microcapsules immersed in standard free Tt solutions. Since the Ti labeled with 125J is replaced by serum Ti at the binding sites of the Ti antibody, the count values of labeled Tt that remains bound to the antibody decrease. It should be noted that the rate of replacement for up to 2 hours of incubation at 37 ° C is largely linear;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Korrelation zwischen den Ergebnissen der Bestimmung durch die Dialysemethode und jenen nach dem erfindungsgemässen Mikrokapsel-verfahren ; 4 shows a graphical representation of the correlation between the results of the determination by the dialysis method and those according to the microcapsule method according to the invention;

Fig. 5 eine graphische Darstellung des normalen Bereiches der Konzentration an freiem T<t, ermittelt nach dem Mikrokapselverfahren ; 5 shows a graphical representation of the normal range of the concentration of free T <t, determined by the microcapsule method;

Fig. 6 eine graphische Darstellung der Korrelation zwischen der kinetischen radioimmunologischen Bestimmung und dem erfindungsgemässen Mikrokapselverfahren; 6 shows a graphical representation of the correlation between the kinetic radioimmunological determination and the microcapsule method according to the invention;

Fig. 7 eine Digoxin-Eichkurve, in der die Zählwerte pro Minute von an Antikörper gebundenem Digoxin in linearem Massstab gegen die Digoxinkonzentration (in ng/ml) in logarithmischem Massstab auf halblogarithmischem Papier mit 2 Dekaden aufgetragen ist (Messwerte siehe Tabelle 5); 7 shows a digoxin calibration curve in which the counts per minute of digoxin bound to antibodies are plotted on a linear scale against the digoxin concentration (in ng / ml) on a logarithmic scale on semi-logarithmic paper with 2 decades (measured values see table 5);

Fig. 8 eine Kurve, in der der Prozentsatz an gebundenem Digoxin (relativ) gegen die Digoxinkonzentration aufgetragen ist, wobei % gebundenes Digoxin (relativ) = Mittelwert der Zählwerte pro Minute von gebundenem Digoxin/Mittelwert der Zählwerte von gebundenem Digoxin von 0 ng/dl Digo-xin-Standardlösung x 100 (Messwerte siehe Tabelle 8); und Figure 8 is a graph plotting the percentage of bound digoxin (relative) versus digoxin concentration, where% bound digoxin (relative) = mean of digested count per minute of bound digoxin / mean of bound digoxin count of 0ng / dl Digo-xin standard solution x 100 (for measured values see table 8); and

Fig. 9 eine schematische Darstellung, die die Retention-von Antikörper und den freien Durchtritt von immunogener Substanz in erfindungsgemäss hergestellten Mikrokapseln zeigt. 9 is a schematic representation showing the retention of antibody and the free passage of immunogenic substance in microcapsules produced according to the invention.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Probe, welche den zu bestimmenden Stoff enthält, mit dem zu diesem Stoff komplementären Antikörper und einem von dem Stoff unterscheidbaren Analogon inkubiert, und die Probe und der Antikörper sind dabei durch eine oder mehrere semipermeable Membranen, welche den Durchlass hochmolekularer Proteine ausschliessen, getrennt. According to the method according to the invention, the sample which contains the substance to be determined is incubated with the antibody complementary to this substance and an analog which can be distinguished from the substance, and the sample and the antibody are thereby through one or more semipermeable membranes which allow the passage of high molecular weight Exclude proteins, separated.

Antikörper zum gewählten Stoff können nach bekannten Methoden erzeugt werden, beispielsweise durch Verabreichung eines Hormons, gegebenenfalls mit einem Hilfsstoff, an Versuchstiere. Die so erzeugten Antikörper können dann extrahiert und gereinigt werden. Viele solche Antikörper sind im Handel erhältlich. Manche unterscheidbare Analoga der Stoffe, welche mit dem vorliegenden Verfahren bestimmt werden können, sind gleichfalls im Handel erhältlich oder lassen sich nach bekannten Techniken herstellen. Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnung «unterscheidbares Analogon» bezieht sich auf ein Molekül, welches anti5 Antibodies to the selected substance can be generated by known methods, for example by administering a hormone, optionally with an adjuvant, to experimental animals. The antibodies generated in this way can then be extracted and purified. Many such antibodies are commercially available. Some distinguishable analogues of the substances which can be determined by the present method are also commercially available or can be prepared by known techniques. The term "distinguishable analogue" used in the present description refers to a molecule which is anti5

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körperbindende Eigenschaften aufweist, welche ähnlich oder vorzugsweise die gleichen sind wie jene des zu bestimmenden Stoffes. Merkmal eines solchen Stoffes ist eine Eigenschaft, welche die Messung seiner Konzentration leicht zulässt. Bevorzugte Analoga umfassen eine Probe des zu bestimmen- 5 den Stoffes, welche mit einem radioaktiven Atom markiert ist. So kann man beispielsweise Thyroidhormone leicht mit l25J markieren, worauf man die Gammastrahlung quantitativ messen kann. Man kann aber auch andere Arten von Analoga verwenden, unter der Voraussetzung, dass deren Molekular- 10 gewichte und Dimensionen deutlich unterhalb jener der natürlichen Proteine und der verwendeten Antikörper liegen. Somit kann man Analoga herstellen, indem man eine Probe des zu bestimmenden Stoffes mit einem Enzym von relativ niedrigem Molekulargewicht, mit einem fluoreszierenden 15 Molekül oder einer anderen Komponente markiert, welche eine quantitative Messung der Konzentration des Analogons durch physikalische oder chemische Methoden ermöglichen. has body-binding properties which are similar or preferably the same as those of the substance to be determined. A characteristic of such a substance is a property that allows easy measurement of its concentration. Preferred analogs comprise a sample of the substance to be determined, which is labeled with a radioactive atom. For example, you can easily label thyroid hormones with l25J, after which you can measure the gamma radiation quantitatively. However, other types of analogs can also be used, provided that their molecular weights and dimensions are significantly below those of the natural proteins and the antibodies used. Analogs can thus be prepared by labeling a sample of the substance to be determined with an enzyme of relatively low molecular weight, with a fluorescent molecule or with another component which enables a quantitative measurement of the concentration of the analogue by physical or chemical methods.

Zur Durchführung des Testes muss der Antikörper durch eine oder mehrere Membranen von der Probe getrennt sein, 20 wobei diese Membranen eine ausreichende Porosität, um»den Durchlass von Antikörpern oder an Protein gebundenen Stoffen (welche durchwegs ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 Daltons haben) auszuschliessen, aber eine ausreichende Porosität, um dem zu bestimmenden Stoff und seinem 25 Analogon freien Durchlass zu gewähren, aufweisen müssen. To carry out the test, the antibody must be separated from the sample by one or more membranes, 20 these membranes having sufficient porosity to allow the passage of antibodies or protein-bound substances (all of which have a molecular weight of more than 20,000 Daltons) must be excluded, but must have sufficient porosity to allow free passage of the substance to be determined and its analogue.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Membranen in Form von semipermeablen Mikrokapseln ausgebildet, welche den Antikörper und das Analogon enthalten. 30 According to a preferred embodiment of the present invention, the membranes are designed in the form of semipermeable microcapsules which contain the antibody and the analog. 30th

Die verwendeten semipermeablen Mikrokapseln sollen eine Permeabilität haben, welche den oben beschriebenen Dialysemembranen ähnlich ist. Die semipermeablen Mikro-kapselwandung ist aber mehrere hundert Male dünner als die üblichen Dialysemembranen, und ihre verfügbare Fläche pro 35 Gewichtseinheit ist um Zehnerpotenzen grösser. Freies Tt oder andere freie Hormone dringen ohne weiteres in die Mikrokapseln ein und verdrängen im Verhältnis zu ihrer Konzentration markiertes Tt vom Tt-Antikörper. Auf diese Weise stellt sich ein Gleichgewicht zwischen freiem Ti und 40 markiertem Tt während der Inkubationsperiode in den Kapseln ein. The semipermeable microcapsules used are said to have a permeability which is similar to the dialysis membranes described above. However, the semi-permeable microcapsule wall is several hundred times thinner than the usual dialysis membranes, and its available area per unit of weight is 35 orders of magnitude larger. Free Tt or other free hormones easily penetrate the microcapsules and displace labeled Tt from the Tt antibody in relation to their concentration. In this way, a balance is established between free Ti and 40 labeled Tt during the incubation period in the capsules.

Geeignete Methoden zur Einkapselung von biologischen Materialien in Membranen, welche die vorerwähnten Durchlässigkeitseigenschaften aufweisen, finden sich in den ameri- 45 kanischen Patentanmeldungen Nr. 606 166 (20. August 1975), 931 177 (4. August 1978), 30 847 (17. April 1979) und 24 600 (28. März 1979). Die zur Zeit bevorzugte Methode zur Herstellung solcher Mikrokapseln führt durch Polykondensation an der Grenzfläche zu semipermeablen Polyamidmembranen. 50 Miteinander nicht mischbare Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelsysteme können zu diesem Zweck ausgesucht werden, wie z.B. Wasser und ein auf Cyclohexan basierendes Lösungsmittel, und ein Monomer eines komplementären Paares, welches ein Copolymer bildet, kann in dem Wasser, zusammen mit 55 dem einzukapselnden Material, gelöst werden. Das wässrige Lösungsmittel, welches das einzukapselnde Material enthält, kann hierauf im anderen Lösungsmittel emulgiert werden, um eine Vielzahl einzelner Tröpfchen zu bilden. Dann kann das zweite komplementäre Monomer der kontinuierlichen Phase 60 der Emulsion hinzugegeben werden, um die Polymerisation rund um die Tröpfchen an der Phasengrenze in Gang zu setzen. Die Membranenpermeabilität und die Gleichmässigkeit der Polymerausscheidungen können durch Verändern der Affinität der kontinuierlichen Phase der Emulsion für das 65 eingekapselte Monomer während des Polymerisationsverlaufes und durch Einstellen der Konzentration des reagierenden Monomers und der Dauer der Polymerisation gesteuert werden. Suitable methods for encapsulating biological materials in membranes which have the aforementioned permeability properties can be found in the American patent applications No. 606 166 (August 20, 1975), 931 177 (August 4, 1978), 30 847 (17. April 1979) and 24,600 (March 28, 1979). The currently preferred method for producing such microcapsules leads to semi-permeable polyamide membranes by polycondensation at the interface. 50 Immiscible solvents or solvent systems can be selected for this purpose, e.g. Water and a cyclohexane-based solvent, and a monomer of a complementary pair that forms a copolymer can be dissolved in the water along with the material to be encapsulated. The aqueous solvent containing the material to be encapsulated can then be emulsified in the other solvent to form a multitude of individual droplets. The second complementary monomer can then be added to the continuous phase 60 of the emulsion to initiate polymerization around the droplets at the phase boundary. The membrane permeability and the uniformity of the polymer precipitates can be controlled by changing the affinity of the continuous phase of the emulsion for the encapsulated monomer during the course of the polymerization and by adjusting the concentration of the reacting monomer and the duration of the polymerization.

Gemäss einer Variante ist die anfängliche kontinuierliche Phase ein Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelsystem, welches eine relativ hohe Affinität für das eingekapselte Monomer aufweist, so dass in einer ersten Stufe der Polymerisation rund um die Tröpfchen ein relativ dickes Polymernetzwerk gebildet wird. Hierauf kann diese kontinuierliche Phase so beeinflusst werden, dass die Affinität für das erste Monomer abnimmt, beispielsweise durch Verdünnen der kontinuierlichen Phase mit einem zweiten Lösungsmittel oder durch Ersetzen der kontinuierlichen Phase mit frischem Lösungsmittel. Nach der Zugabe des zweiten Monomers kann eine weitere Polymerisation vorzugsweise innerhalb des anfänglich gebildeten Polymernetzwerkes stattfinden, wodurch makroporöse defekte Stellen ausgeflickt werden und einheitliche Kapselmembranen gebildet werden, welche die Diffusion von gelöstem Material mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht erlauben. According to a variant, the initial continuous phase is a solvent or a solvent system which has a relatively high affinity for the encapsulated monomer, so that a relatively thick polymer network is formed around the droplets in a first stage of the polymerization. This continuous phase can then be influenced so that the affinity for the first monomer decreases, for example by diluting the continuous phase with a second solvent or by replacing the continuous phase with fresh solvent. After the addition of the second monomer, further polymerization can preferably take place within the initially formed polymer network, whereby macroporous defective areas are patched out and uniform capsule membranes are formed, which allow the diffusion of dissolved material with a relatively low molecular weight.

Gemäss einer weiteren Variante wird zu Beginn eine kontinuierliche Phase mit niedriger Affinität für das eingekapselte Monomer gewählt, so dass dünne, relativ dichte Membranen bei der ersten Polymerisationsstufe gebildet werden. Hierauf kann die Affinität der kontinuierlichen Phase für das eingekapselte Monomer erhöht werden, um weitere Monomermengen durch die Membran hindurchzuführen und eine zweite äussere Schicht von unlöslichem Polymer niederzuschlagen. According to a further variant, a continuous phase with low affinity for the encapsulated monomer is initially selected, so that thin, relatively dense membranes are formed in the first polymerization stage. The affinity of the continuous phase for the encapsulated monomer can then be increased in order to pass further amounts of monomer through the membrane and to deposit a second outer layer of insoluble polymer.

Wenn die diskontinuierliche wässrige Tröpfchenphase so gepuffert wird, dass eine verträgliche Umgebung für die labilen biologischen Materialien, wie z.B. Antikörper, geschaffen ist, kann die Einkapselung unter weitgehender Beibehaltung der biologischen Aktivität des labilen Materials durchgeführt werden. Die Wirksamkeit des eingekapselten Materials kann auch bewahrt werden, indem man das zweite Monomer portionenweise der kontinuierlichen Phase während der Polymerisationsdauer derart zugibt, dass seine Konzentration zu jeder Zeit relativ niedrig ist und der Antikörper nicht hohen Konzentrationen von potentiell schädlichen Substanzen ausgesetzt wird. If the discontinuous aqueous droplet phase is buffered so that an acceptable environment for the labile biological materials, e.g. Antibody is created, the encapsulation can be carried out while largely maintaining the biological activity of the labile material. The effectiveness of the encapsulated material can also be maintained by adding the second monomer in portions to the continuous phase during the polymerization period such that its concentration is relatively low at all times and the antibody is not exposed to high concentrations of potentially harmful substances.

Gemäss einem bevorzugten Reaktionssystem werden ein Diamin, ein hochmolekulares Füllmaterial und den Antikörper enthaltende wässrige Tröpfchen in einer kontinuierlichen Phase von Cyclohexan gebildet, deren Affinität für das in der Tropfenphase gelöste Monomer durch Zugabe von Chloroform als Verdünnungsmittel modifiziert ist. Die Zugabe eines Disäurehalogenids zum System führt zur Bildung von semipermeablen Polyamidmikrokapseln. Auf diese Weise gelangt man zu Membranen, deren oberer Durchlässigkeitswert im Bereiche von 2000 bis 30 000 Dalton Molekulargewicht liegt. Man kann somit solche Kapseln leicht herstellen, welche die Diffusion verschiedener Hormone ermöglichen. According to a preferred reaction system, a diamine, a high molecular weight filler material and aqueous droplets containing the antibody are formed in a continuous phase of cyclohexane, the affinity for which is modified for the monomer dissolved in the drop phase by adding chloroform as a diluent. The addition of a diacid halide to the system leads to the formation of semi-permeable polyamide microcapsules. In this way, membranes are obtained whose upper permeability value is in the range from 2000 to 30,000 Dalton molecular weight. It is therefore easy to manufacture capsules that allow the diffusion of different hormones.

Zur Durchführung des Testes kann die Testprobe mit Mikrokapseln der beschriebenen Art vermischt und vorzugsweise bei ungefähr 37 inkubiert werden. Vor der Inkubation können die Kapseln in einer Lösung des Analogons von ausreichender Konzentration, um den Antikörper mit einer messbaren Konzentration an Analogon zu belasten, suspendiert werden. Der Versuch kann auch so durchgeführt werden, To carry out the test, the test sample can be mixed with microcapsules of the type described and preferably incubated at approximately 37. Before incubation, the capsules can be suspended in a solution of the analogue of sufficient concentration to contaminate the antibody with a measurable concentration of the analogue. The experiment can also be carried out

dass man das Analogon während oder nach der Inkubation mit Serum dem Reaktionssystem hinzugibt. Weder das Protein in der Probe noch Komplexe von Protein und Stoff können durch die Mikrokapselwandung hindurchgehen. that the analogue is added to the reaction system during or after incubation with serum. Neither the protein in the sample nor complexes of protein and substance can pass through the microcapsule wall.

Hierauf wird der Antikörper vom Rest des Reaktionssystems (vorzugsweise unter Ausschluss der Mikrokapselmem-bran) getrennt und entweder der Antikörper oder der Rest des Systems auf das Analogon hin geprüft. Gemäss einer bevorzugten Trennungsmethode wird ein hydrophiles Material von hohem Molekulargewicht, wie z.B. eine Lösung von Polyäthy-lenimin oder Serumalbumin, dem ausserhalb der Kapseln The antibody is then separated from the rest of the reaction system (preferably excluding the microcapsule membrane) and either the antibody or the rest of the system is tested for the analogue. According to a preferred separation method, a high molecular weight hydrophilic material, e.g. a solution of polyethylene imine or serum albumin, the outside of the capsules

647 869 647 869

6 6

vorhandenen Bereich zugegeben. Dadurch wird eine Osmola-litätszunahme bewirkt, wodurch ein Aufbrechen der Mikrokapseln und eine Wanderung des innerhalb der Kapseln vorhandenen nicht gebundenen Hormons und dessen Analogons in die überstehende Flüssigkeit erfolgt. Daraus ergibt sich ein kompaktes Kügelchen von eingekapseltem Antikörper, welches - nach einer eventuellen Zentrifugation - durch Absaugen oder Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit isoliert werden kann. Man kann aber die Trennung auch durch Auswaschen des freien Stoffes und des Analogons aus den Kapseln durchführen. existing area added. This causes an increase in osmolality, which causes the microcapsules to be broken open and the unbound hormone present in the capsules and its analogs to migrate into the supernatant liquid. This results in a compact bead of encapsulated antibody, which - after a possible centrifugation - can be isolated by aspirating or decanting the supernatant liquid. However, the separation can also be carried out by washing out the free substance and the analogue from the capsules.

Die folgenden Tabellen 1 und 2 und die entsprechenden Fig. 1 und 2 der beiliegenden Zeichnung veranschaulichen die Ergebnisse der Teste gemäss vorliegender Erfindung, bei welchen man die Gegenwart von freiem Tt unter Verwendung von freiem Tt-Antikörper, 125J-markiertem Thyroxin als Analogon und Lösungen von bekannter Konzentration an freiem Tt feststellen kann. Die Ergebnisse von Parallelversuchen auf unbekannten Proben mit dem neuen Verfahren lassen sich anhand der Eichkurven interpretieren. The following Tables 1 and 2 and the corresponding Figures 1 and 2 of the accompanying drawings illustrate the results of the tests according to the present invention, in which the presence of free Tt using free Tt antibody, 125J-labeled thyroxine as an analog and solutions of known concentration of free Tt. The results of parallel tests on unknown samples with the new method can be interpreted using the calibration curves.

Tabelle 1 Eichkurve für den Test auf freies Tt Table 1 Calibration curve for the test for free Tt

Freies Tt Free Tt

CPM* CPM *

durchschnittl. CPM average CPM

0,5 ng/dl 0.5 ng / dl

57097 57472 57097 57472

57285 57285

1,3 ng/dl 1.3 ng / dl

54256 54717 54256 54717

54839 54839

3,0 ng/dl 3.0ng / dl

50960 50946 50960 50946

50953 50953

5,0 ng/dl 5.0 ng / dl

48487 48117 48487 48117

48302 48302

7,7 ng/dl 7.7 ng / dl

45982 46067 45982 46067

46025 46025

Gesamtzählwert Total count

zugesetztes Tt (125J) added Tt (125J)

86403 86403

2stündige Inkubation bei 37 °C. Incubation for 2 hours at 37 ° C.

* Zählwert pro Minute * Count value per minute

Tabelle 2 Table 2

Eichkurve für den Test auf freies Tt Calibration curve for the test for free Tt

Freies Tt Free Tt

CPM* CPM *

durchschnittl. C PM average C PM

0,1 ng/dl 0.1 ng / dl

61219 60398 61183 61219 60398 61183

60933 60933

0,5 ng/dl 0.5 ng / dl

58020 55618 56389 58020 55618 56389

56675 56675

1,0 ng/dl 1.0 ng / dl

52096 52671 53705 52096 52671 53705

52824 52824

2,0 ng/dl 2.0ng / dl

48483 50126 49971 48483 50126 49971

49536 49536

4,0 ng/dl 4.0ng / dl

44853 45108 44235 44853 45108 44235

44732 44732

6,0 ng/dl 6.0 ng / dl

42008 41344 41015 42008 41344 41015

41456 41456

Gesamtzählwert Total count

zugesetztes Tt (l25J) added Tt (l25J)

86903 86903

2stündige Inkubation bei 37 °C * Zählwert pro Minute 2 hour incubation at 37 ° C * count per minute

Die Erfindung sei durch das folgende, nicht einschränkende Beispiel erläutert. The invention is illustrated by the following, non-limiting example.

Herstellung von Mikrokapseln Manufacture of microcapsules

Eine Hexandiamincarbonatlösung mit einem pH-Wert von 8,5 ± 0,1 wird dadurch hergestellt, dass man 17,7 ml 1,6-Hexandiamin mit 32 ml Wasser vermischt und dann in diese Lösung während ungefähr 1 Stunde oder bis zur Erreichung des pH-Wertes Kohlendioxydgas einbläst. Eine Terephthaloylchloridlösung (TC1) wird dadurch hergestellt, dass man 20 g TC1 in 200 ml einer Mischung von 4 Teilen Cyclohexan und 1 Teil Chloroform als organisches Lösungsmittel hinzugibt. TC1 wird durch kräftiges Rühren gelöst und die Lösung hierauf während 10 Minuten bei 2600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa ausgeschiedener Niederschlag wird entfernt. A hexanediamine carbonate solution with a pH of 8.5 ± 0.1 is prepared by mixing 17.7 ml of 1,6-hexanediamine with 32 ml of water and then in this solution for approximately 1 hour or until the pH is reached - Blowing in value carbon dioxide gas. A terephthaloyl chloride solution (TC1) is prepared by adding 20 g of TC1 in 200 ml of a mixture of 4 parts of cyclohexane and 1 part of chloroform as an organic solvent. TC1 is dissolved by vigorous stirring and the solution is then centrifuged at 2600 revolutions per minute for 10 minutes. Any precipitate that has separated out is removed.

750 ml Cyclohexan werden mit 125 ml SPAN-85 (Emulgiermittel, Fettsäureester von Sorbitan) in einem 2-Liter-Mischgerät, welches mit einem magnetischen Rührstab ausgerüstet ist, vermischt. Unter Rühren wird eine Lösung aus 1 ml Antiserum in bezug auf Thyroxin (4% in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung der Firma R.F. Laboratories, Houston, Texas, oder Radioassay Systems Laboratories, Carson, California), 25 ml Polyvinylpyrrolidon, 4% Rinderserumalbumin und 30 ml Hexandiamincarbonatlösung dem Cyclohexan hinzugegeben. Nachdem Tröpfchen der gewünschten Grösse erzeugt worden sind, versetzt man mit 70 ml TCl-Lösung. Nach weiteren 30 Sekunden gibt man weitere 37,5 ml TC1 hinzu. Nach weiteren 60 Sekunden werden 25 ml Chloroform hinzugegeben. In Abständen von jeweils 30 Sekunden werden dreimal jeweils 25 ml Chloroform hinzugegeben. 750 ml of cyclohexane are mixed with 125 ml of SPAN-85 (emulsifier, fatty acid ester of sorbitan) in a 2 liter mixer which is equipped with a magnetic stir bar. While stirring, a solution of 1 ml of antiserum with respect to thyroxine (4% in phosphate buffered saline from RF Laboratories, Houston, Texas, or Radioassay Systems Laboratories, Carson, California), 25 ml of polyvinylpyrrolidone, 4% bovine serum albumin and 30 ml Hexane diamine carbonate solution added to the cyclohexane. After droplets of the desired size have been generated, 70 ml of TCl solution are added. After another 30 seconds, 37.5 ml of TC1 are added. After a further 60 seconds, 25 ml of chloroform are added. 25 ml of chloroform are added three times at intervals of 30 seconds.

Die Mikrokapseln werden durch Zentrifugieren des Zwei-phasenreaktionssystems, Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit dekantiert und Mischen der Kapseln mit Tween-20 (Polyoxyäthylenderivat von Fettsäurepartialestern von Sorbitolanhydrid - Emulgiermittel mit Natriumbicarbo-nat gepuffert) und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewonnen. Die Kapseln halten das Polyvinylpyrrolidon und das Rinderserumalbuminfüllmaterial sowie den Thyroxinan-tikörper zurück. The microcapsules are decanted by centrifuging the two-phase reaction system, decanting the supernatant liquid and mixing the capsules with Tween-20 (polyoxyethylene derivative of partial fatty acid esters of sorbitol anhydride - emulsifier buffered with sodium bicarbonate) and saline solution buffered with phosphate. The capsules hold back the polyvinylpyrrolidone and the bovine serum albumin filling material as well as the thyroxine antibody.

Sättigung des Antikörpers mit Analogon Saturation of the antibody with analog

Nach der vorerwähnten Methode erhaltene Mikrokapseln werden mit mit ,2SJ markiertem Thyroxin in folgender Weise beladen. Microcapsules obtained by the aforementioned method are loaded with thyroxine labeled with 2SJ in the following manner.

1. In jeweils 100 Standardrohre werden 0,5 ml Mikrokap-selsuspension und 1,0 ,uCi von Tt (l25J) (hoch spezifische Aktivität von 5000 bis 6000 [iCi pro |ig) zugegeben. Dann wird während mindestens 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. 1. 0.5 ml of microcapsule suspension and 1.0 .mu.Ci of Tt (125J) (highly specific activity from 5000 to 6000 [iCi per | ig) are added to each 100 standard tubes. Then incubate at 37 ° C for at least 30 minutes.

2. Die Mikrokapseln werden mit dem doppelten Volumen einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (0,l5molar an NaCl, pH = 7,5, 0,015molarer Phosphatpuffer). ■ 2. The microcapsules are filled with twice the volume of a saline solution buffered with phosphate (0.15 molar NaCl, pH = 7.5, 0.015 molar phosphate buffer). ■

3. Es wird während 15 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert. 3. Centrifuge at 2000 g for 15 minutes and decant the supernatant.

4. Die Stufen 2 und 3 werden zweimal wiederholt. 4. Levels 2 and 3 are repeated twice.

5. Die Mikrokapselsuspension wird mit der l,6fachen Volumenmenge der oben beschriebenen, mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung verdünnt. Das Gesamtvolumen liegt bei 80 ml. 0,8 ml der Mikrokapselsuspension werden pro Test verwendet. Auf diese Weise lassen sich 100 Tests mit den Kapseln durchführen. 5. The microcapsule suspension is diluted with 1.6 times the volume of the phosphate-buffered saline described above. The total volume is 80 ml. 0.8 ml of the microcapsule suspension are used per test. In this way, 100 tests can be carried out with the capsules.

Testverfahren Test procedure

1) 25 Mikroliter-Testproben und 5 Proben von freiem Tt mit bekannter Konzentration werden in getrennte Rohre eingebracht. Gemäss der aus Tabelle 1 erhaltenen Eichkurve wurden Konzentrationen von 0,5, 1,3,3,0, 5,0 und 7,7 ng% freiem Tt verwendet, doch kann man beliebige Reihen von 1) 25 microliter test samples and 5 samples of free Tt with known concentration are placed in separate tubes. Concentrations of 0.5, 1.3, 3.0, 5.0 and 7.7 ng% free Tt were used according to the calibration curve obtained from Table 1, but any series of

5 5

10 10th

15 15

20 20th

, 25 , 25

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

freien T4-Konzentrationen nach den bestens bekannten Experimentiertechniken anwenden. Als zusätzlicher Sicherheitstest kann man ein Kontrollrohr einsetzen, welches 25 Mikroliter Kochsalzlösung enthält. Use free T4 concentrations according to the best known experimental techniques. As an additional safety test, you can use a control tube that contains 25 microliters of saline.

2) Es werden 800 Mikroliter mit T4(125J) vorgesättigte Mikrokapseln (als solche erhältlich) in jedes Rohr pipettiert. 2) Pipette 800 microliters of T4 (125J) pre-saturated microcapsules (available as such) into each tube.

3) Der Inhalt eines jeden Rohres wird durchgewirbelt und während 120 Minuten bei 37 °C gebrütet. 3) The contents of each tube are whirled through and incubated at 37 ° C for 120 minutes.

4) Nach der Inkubation wird 1,0 ml 2,0%iges Polyäthylen-imin (Molekulargewicht 40 000 bis 50 000) in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung jedem einzelnen Rohr hinzugegeben. 4) After the incubation, 1.0 ml of 2.0% polyethylene imine (molecular weight 40,000 to 50,000) in a phosphate-buffered saline solution is added to each individual tube.

5) Es wird während weiteren 20 Minuten ausgebrütet. 5) It is incubated for another 20 minutes.

6) Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert. 6) The supernatant liquid is decanted.

7) Jedes Rohr wird während 1 Minute in einem Gamma-zählrohr untersucht. 7) Each tube is examined in a gamma counter tube for 1 minute.

Berechnung der Resultate Calculation of the results

1) Bei jedem Test bezüglich der Bestimmung einer unbekannten Konzentration an freiem Tt in einer oder mehreren Proben sollte man Standardversuche durchführen, um die Eichkurve zu erhalten. 1) For each test to determine an unknown concentration of free Tt in one or more samples, standard tests should be carried out to obtain the calibration curve.

2) Nach Beendigung des Testes wird eine Eichkurve, wie sie beispielsweise in den Fig. 2 oder 3 gezeigt wird, gemacht, wobei Werte zur Anwendung gelangen, welche man aus den Standardversuchen erhalten hatte, welche gleichzeitig mit unbekannten Proben getestet wurden. 2) After completion of the test, a calibration curve, as shown for example in FIG. 2 or 3, is made, using values obtained from the standard tests which were tested simultaneously with unknown samples.

3) Die Zählwerte pro Minute (nachstehend ais «cpm» bezeichnet) für jeden Wert können in der linearen Skala von halblogarithmischem Papier mit 2 Dekaden gegen die Konzentration von freiem Tt in ng% auf der logarithmischen Skala aufgetragen werden. 3) The counts per minute (hereinafter referred to as "cpm") for each value can be plotted on the linear scale of half-log paper with 2 decades against the concentration of free Tt in ng% on the logarithmic scale.

Eine weitere Variante zum Auftragen von cpm gegen die Konzentration an freiem Ti besteht darin, dass man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) gegen die Konzentration an freiem Tt aufträgt. Another variant for plotting cpm against the concentration of free Ti is to plot the percentage of bound material (relative) against the concentration of free Tt.

Dies kann geschehen, indem man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) für jeden Standard, Vergleichsversuch bzw. unbekanntes Material errechnet und diese Werte auf einem halblogarithmischen Papier mit 2 Dekaden in ähnlicher Weise aufträgt, wie dies zuvor für cpm beschrieben worden ist. Der Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) wird wie folgt berechnet: Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) = cpm gebunden/mittleres cpm/gebunden eines Standardmaterials mit niedrigster Konzentration an freiem Tt. This can be done by calculating the percentage of bound material (relative) for each standard, comparative test or unknown material and plotting these values on semi-logarithmic paper with 2 decades in a manner similar to that previously described for cpm. The percentage of bound material (relative) is calculated as follows: Percentage of bound material (relative) = cpm bound / mean cpm / bound of a standard material with the lowest concentration of free Tt.

Die Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Konzentration an freiem Tt in ng% von ungefähr 200 Testproben, wobei jede Probe nach der erfindungsgemässen Methode und nach der Dialysenmethode analysiert wurde. Wie daraus hervorgeht, besteht ein hohes Ausmass an Korrelation zwischen den beiden Testmethoden. FIG. 4 is a graphical representation of the concentration of free Tt in ng% of approximately 200 test samples, each sample being analyzed by the method according to the invention and by the dialysis method. As can be seen from this, there is a high degree of correlation between the two test methods.

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Häufigkeit einer bestimmten Konzentration an freiem Tt gegen die Konzentration an freiem Tt aufgrund von etwa 200 Testproben, welche nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden. FIG. 5 is a graphical representation of the frequency of a certain concentration of free Tt versus the concentration of free Tt based on about 200 test samples which were carried out according to the method described above.

Die Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Konzentration an freiem Tt in ng% bei ungefähr 100 Testproben, wobei jeder Test nach der erfindungsgemässen Methode und nach der kinetischen Radiotesttechnik erfolgte. Wie daraus ersichtlich ist, besteht ein hohes Ausmass an Korrelation zwischen den beiden Testmethoden. FIG. 6 is a graphical representation of the concentration of free Tt in ng% for approximately 100 test samples, each test being carried out according to the method according to the invention and according to the kinetic radio test technique. As can be seen from this, there is a high degree of correlation between the two test methods.

Die Tabelle 3 zeigt die Konsistenz der bei Auswertung der Innerblock-Information erhaltenen Ergebnisse. Table 3 shows the consistency of the results obtained when evaluating the inner block information.

647 869 647 869

Tabelle 3 Innerblockvarianz (Werte in ng/dl) Table 3 Inner block variance (values in ng / dl)

Wert A (1,2) Value A (1,2)

Wert B (2,0) Value B (2.0)

Wert C (5,3) Value C (5.3)

1,5 1.5

2,3 2.3

3,6 3.6

1,3 1.3

2,1 2.1

4,2 4.2

1,1 1.1

'2,2 '2.2

4,2 4.2

1,1 1.1

2,1 2.1

3,3 3.3

1,2 1.2

2,1 2.1

3,3 3.3

1,3 • 1.3 •

2,0 2.0

3,9 3.9

1,3 1.3

1,7 1.7

4,1 4.1

1,4 1.4

2,1 2.1

3,7 3.7

1,2 1.2

2,5 2.5

3,5 3.5

1,3 1.3

1,8 1.8

3,5 3.5

1,3 1.3

2,2 2.2

4,4 4.4

1,3 1.3

2,1 2.1

3,9 3.9

1,6 1.6

2,3 2.3

4,6 4.6

1,2 1.2

2,5 2.5

4,6 4.6

1,3 1.3

2,3 2.3

4,4 4.4

1,2 1.2

2,1 2.1

4,2 4.2

1,2 1.2

2,1 2.1

3,4 3.4

1,3 1.3

2,3 2.3

3,8 3.8

1,5 1.5

2,1 2.1

4,2 4.2

1,4 • 1.4 •

2,2 2.2

4,6 4.6

1,4 1.4

2,1 2.1

3,7 3.7

1,4 1.4

2,1 2.1

4,0 4.0

1,4 1.4

2,1 2.1

4,0 4.0

1,4 1.4

2,3 2.3

4,3 4.3

1,4 1.4

2,3 2.3

4,0 4.0

1,6 1.6

2,4 2.4

4,0 4.0

1,3 1.3

2,0 2.0

4,2 4.2

1,2 1.2

2,1 2.1

4,2 4.2

2,4 2.4

4,5 4.5

Variationskoeffizient Coefficient of variation

Anzahl x+ S.D. Number x + S.D.

C.V. C.V.

A A

28 28

1,34±0,13 1.34 ± 0.13

9,6% 9.6%

B B

29 29

2,20 ±0,17 2.20 ± 0.17

7,7% 7.7%

C C.

29 29

4,10 + 0,38 4.10 + 0.38

9,3% 9.3%

S.D. = Standardabweichung C.V. = Variationskoeffizient S.D. = Standard deviation C.V. = Coefficient of variation

Tabelle 4 zeigt die Konsistenz der bei Auswertung der Zwischenblock-Information erhaltenen Ergebnisse. Table 4 shows the consistency of the results obtained when evaluating the inter-block information.

Tabelle 4 Table 4

Zwischenblockvarianz: (Werte in ng/dl) Inter-block variance: (values in ng / dl)

Test test

Wert A (1,2) Value A (1,2)

Wert B (2,0) Value B (2.0)

Wert C (5,3) Value C (5.3)

1 1

1,3 1.3

2,4 2.4

4,6 4.6

1,2 1.2

1,8 1.8

4,4 4.4

2 2nd

1,4 1.4

1,5 1.5

4,6 4.6

1,5 1.5

2,6 2.6

4,7 4.7

1,2 1.2

2,0 2.0

4,0 4.0

1,3 1.3

2,0 2.0

3,7 3.7

1,4 1.4

2,5 2.5

3,8 3.8

1,2 1.2

1,9 1.9

4,0 4.0

3 3rd

1,3 1.3

2,2 2.2

3,9 3.9

4 4th

1,4 1.4

2,0 2.0

3,2 3.2

1,2 1.2

2,1 2.1

4,0 4.0

7 7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

647 869 647 869

8 8th

Test test

Wert A (1,2) Value A (1,2)

Wert B (2,0) Value B (2.0)

Wert C (5,3) Value C (5.3)

5 5

1,5 1.5

1,8 1.8

4,2 4.2

6 6

1,3 1.3

2,0 2.0

4,2 4.2

1,2 1.2

2,0 2.0

4,5 4.5

7 7

1,3 1.3

2,1 2.1

3,5 3.5

1,35 1.35

2,5 2.5

3,7 3.7

1,1 1.1

1,7 1.7

4,0 4.0

1,2 1.2

2,0 2.0

3,5 3.5

1,4 1.4

4,2 4.2

1,4 1.4

4,0 4.0

Variationskoeffizient Coefficient of variation

Anzahl x + S.D. Number x + S.D.

C.V. C.V.

A A

20 20th

1,32 + 0,11 1.32 + 0.11

8,41% 8.41%

B B

18 18th

2,10 + 0,27 2.10 + 0.27

13% 13%

C C.

20 ' 20 '

4,00 + 0,4 4.00 + 0.4

10% 10%

Digoxintext Digoxin text

Ein Verfahren zum Einkapseln eines für Digoxin spezifischen Antikörpers findet sich nachstehend. Die verwendeten Reagenzien und deren Lieferanten finden sich nachstehend: A procedure for encapsulating an antibody specific for digoxin can be found below. The reagents used and their suppliers can be found below:

Natriumbicarbonat Sodium bicarbonate

Cyclohexan Cyclohexane

Chloroform chloroform

Natriumchlorid monobasisches Monobasic sodium chloride

N atri umphosphat dibasisches Natriumphosphat N atrium phosphate, dibasic sodium phosphate

1,6-Hexandiamin 1,6-hexanediamine

«Span-85» "Span-85"

«Tween-20» "Tween-20"

Antidigoxin-Kaninchen- Antidigoxin rabbit

Anti-Antiserum Anti-antiserum

Rinderserumalbumin Bovine serum albumin

Comassie Brilliant Blue R Comassie Brilliant Blue R

Polyvinylpyrrolidon-40 Polyvinylpyrrolidone-40

Terephthaloylchlorid sämtliche Substanzen der Firma Fisher Chemical Terephthaloyl chloride all substances from the company Fisher Chemical

Ruger Chemical, New Jersey Arnel Products, Brooklyn, New York Ruger Chemical, New Jersey Arnel Products, Brooklyn, New York

Sigma Chemical Aldrich Chemical Eastman Kodak Sigma Chemical Aldrich Chemical Eastman Kodak

20 20th

25 25th

30 30th

Die Mengen der einzelnen Ingredienzen waren die folgenden: The amounts of each ingredient were as follows:

1,6-Hexandiamincarbonat 30 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 40 ml 1,6-hexanediamine carbonate 30 ml with phosphate buffered saline 40 ml

Polyvinylpyrrolidon-40/Comassie Blue 25 ml Polyvinylpyrrolidone-40 / Comassie Blue 25 ml

Antidigoxin-Kaninchen-Antiserum 5 ml Antidigoxin rabbit antiserum 5 ml

Cyclohexan, ACS 750 ml Cyclohexane, ACS 750 ml

«Span-85» 125 ml "Span-85" 125 ml

Terephthaloylchloridlösung 107,5 ml Terephthaloyl chloride solution 107.5 ml

Chloroform 100 ml Chloroform 100 ml

«Tween-20»-Waschlösung Q.S. 200 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung Q.S. 8 Liter "Tween-20" washing solution Q.S. 200 ml phosphate buffered saline Q.S. 8 liters

Vorgehen: Vor Gebrauch wurden sämtliche Glaswaren mit destilliertem Wasser gespült. Procedure: Before use, all glassware was rinsed with distilled water.

1. Ein 2-Liter-Glasmischgefäss wurde mit einem magnetischen Rührwerk versehen und in den Abzug gestellt. 1. A 2 liter glass mixing vessel was provided with a magnetic stirrer and placed in the fume cupboard.

2. Neben den Abzug wird ein Mikroskop hingestellt. 2. A microscope is placed next to the trigger.

3. In einem geeichten 250-ml-Glaszylinder werden sorgfältig 125 ml «Span-85» abgemessen. 3. 125 ml «Span-85» are carefully measured in a calibrated 250 ml glass cylinder.

4. Das abgemessene «Span-85» wird unter dem Abzug in die Glasmischvorrichtung gegeben. 4. The measured «Span-85» is placed under the hood in the glass mixer.

5. Es werden 750 ml Cyclohexan in einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder abgemessen und dann diese Menge 5. 750 ml of cyclohexane are measured in a calibrated 1000 ml glass cylinder and then this amount

5 unter dem Abzug in die aus Glas bestehende Mischvorrichtung gegossen. 5 poured under the hood into the glass mixing device.

6. Die Mischvorrichtung wird mit einem Deckel verschlossen. 6. The mixing device is closed with a lid.

7. Der magnetische Rührer wird in Gang gesetzt. 7. The magnetic stirrer is started.

10 8. Abmessen: 30 ml Hexandiamincarbonat; 40 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung; 25 ml 15%iges PVP/ Commasie Blue/4%iges Rinderserumalbumin; 5 ml Antikörper. Die 40 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird in einem mit Masseinteilungen versehenen 50-ml-Zylinder 10 8. Measure: 30 ml hexanediamine carbonate; 40 ml saline buffered with phosphate; 25 ml 15% PVP / Commasie Blue / 4% bovine serum albumin; 5 ml of antibody. The 40 ml saline solution buffered with phosphate is placed in a graduated 50 ml cylinder

15 mit den 5 ml Antikörper vermischt. 15 mixed with the 5 ml antibody.

9. Es wird ein mit einem Ring versehener 5-cm-Rührstab in ein 400-ml-Becherglas eingebracht und auf dem magnetischen Rührwerk angeordnet. 9. A 5 cm stirrer with a ring is placed in a 400 ml beaker and placed on the magnetic stirrer.

10. Das Becherglas wird mit 30 ml Hexandiamin versetzt und der magnetische Rührer in Gang gesetzt. 10. 30 ml of hexanediamine are added to the beaker and the magnetic stirrer is started.

11. Dem im Becher vorhandenen Hexandiamin werden nacheinander die folgenden Substanzen beigegeben: 25 ml 15%iges PVP/Comassie Blue/4%iges Rinderserumalbumin; 35 ml mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung/Antikörperlösung. Dann wird das Gemisch während 2 Minuten und die Lösung während 3 Minuten gerührt. 11. The following substances are successively added to the hexanediamine present in the beaker: 25 ml of 15% PVP / Comassie Blue / 4% bovine serum albumin; 35 ml saline / antibody solution buffered with phosphate. Then the mixture is stirred for 2 minutes and the solution for 3 minutes.

12. Während des Vermischens der Lösung werden eine 70-ml-Portion und eine 37,5-ml-Portion von Terephthaloylchlorid in verschiedenen mit geeichten 100 ml Glaszylindern abgemessen. Diese wurden mit Uhrgläsern bedeckt und in den Abzug gestellt. In verschiedenen geeichten 25-ml-Glaszy-lindern wurden viermal jeweils 25-ml-Portionen von Chloroform abgemessen. Diese Glaszylinder werden mit Uhrgläsern bedeckt und in den Abzug gestellt. 12. While mixing the solution, measure a 70 ml portion and a 37.5 ml portion of terephthaloyl chloride in different with calibrated 100 ml glass cylinders. These were covered with watch glasses and placed in the fume cupboard. Four different 25 ml portions of chloroform were measured in different calibrated 25 ml glass cylinders. These glass cylinders are covered with watch glasses and placed in the fume cupboard.

13. Durch einen Seitenarm des Kolbens wird der Inhalt des 400-ml-Becherglases in die Glasmischvorrichtung unter dem Abzug zugegeben. 13. Through a side arm of the flask, the contents of the 400 ml beaker are added to the glass mixer under the fume cupboard.

14. Mit einer 1-ml-Wegwerfglaspipette wird so rasch als möglich eine Probe der Lösung aus der Mischvorrichtung entnommen und auf einem Objektträger auf das Mikroskop gelegt. Dabei wird geprüft, ob die Tröpfchen eine zulässige Grösse besitzen, nämlich 10 bis 80 um Durchmesser. 14. With a 1 ml disposable glass pipette, a sample of the solution is taken from the mixing device as quickly as possible and placed on a microscope slide. It is checked whether the droplets have a permissible size, namely 10 to 80 µm in diameter.

15. Wenn die Tröpfchen eine annehmbare Grösse aufweisen, wird diese Zeit mit 0 (T = 0) bezeichnet. Durch den Sei- 15. If the droplets are of an acceptable size, this time is designated 0 (T = 0). Because of the

45 tenarm der Mischvorrichtung werden die abgemessenen 70 ml Terephthaloylchlorid hinzugegeben. Bei T = 30, d.h. nach einem Ablauf von genau 30 Sekunden, wird die zweite 37,5-ml-Portion von Terephthaloylchlorid durch den Seitenarm in die Mischvorrichtung eingebracht. Dann wird während genau 60 Sekunden gemischt. The measured 70 ml of terephthaloyl chloride are added to the mixing device. At T = 30, i.e. after exactly 30 seconds have elapsed, the second 37.5 ml portion of terephthaloyl chloride is introduced through the side arm into the mixing device. Then mix for exactly 60 seconds.

16. Nach 60 Sekunden (T = 90) werden die ersten 25 ml Chloroform hinzugegeben. Dann wird während 30 Minuten gemischt. Bei T = 120 wird die zweite abgemessene 25-ml-Por-tion Chloroform hinzugegeben und während 30 Sekunden 16. After 60 seconds (T = 90), the first 25 ml of chloroform are added. Then mix for 30 minutes. At T = 120, the second measured 25 ml portion of chloroform is added and for 30 seconds

55 vermischt (T= 150). Es wird dann die dritte abgemessene 25-ml-Portion Chloroform hinzugegeben und das Ganze während 30 Sekunden gerührt (T = 180). Es wird schliesslich die vierte abgemessene 25-ml-Portion Chloroform hinzugegeben und das Ganze genau während 30 Sekunden gemischt (T = 210 Sekunden). Dann wird die Mischvorrichtung verschlossen. 55 mixed (T = 150). The third measured 25 ml portion of chloroform is then added and the whole is stirred for 30 seconds (T = 180). Finally, the fourth measured 25 ml portion of chloroform is added and the whole is mixed exactly for 30 seconds (T = 210 seconds). Then the mixing device is closed.

17. Der Inhalt der Mischvorrichtung wird in zwei 1-Liter-Plastikflaschen, welche zum Zentrifugieren verwendet werden, gegossen. Die Flaschen werden zuvor dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Dann werden sie während 3 Minuten bei 500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. 17. The contents of the mixer are poured into two 1 liter plastic bottles used for centrifugation. The bottles are rinsed three times with distilled water beforehand. Then they are centrifuged at 500 revolutions per minute for 3 minutes.

18. Die überstehende Flüssigkeit wird vorsichtig abdekantiert. 18. The supernatant liquid is carefully decanted off.

40 40

50 50

60 60

65 65

9 9

647 869 647 869

19. Zu jeder Flasche werden ungefähr 50 ml der «Tween-20»-Lösung, d.h. ungefähr das gleiche Tween-20-Volumen wie bei den Kapseln, hinzugegeben. Dann wird mit dem Rührstab während ungefähr 5 Minuten gründlich gemischt. 19. Approximately 50 ml of the "Tween-20" solution, i.e. approximately the same Tween-20 volume as the capsules. Then mix thoroughly with the stir bar for about 5 minutes.

20. Jede Flasche wird hierauf mit ungefähr 10 bis 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung versetzt und der Inhalt gründlich gerührt. 20. Add approximately 10 to 15 ml of phosphate-buffered saline to each bottle and stir the contents thoroughly.

21. Die Stufe 20 wird 4- bis 5mal wiederholt. 21. Level 20 is repeated 4 to 5 times.

22. Dann werden weitere 400 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzugegeben und das Ganze gemischt. 22. Then another 400 ml of phosphate-buffered saline are added and the whole is mixed.

23. Die Flaschen werden gewogen und während 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesogen. Dann werden jeder Flasche ungefähr 800 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Dann wird gründlich gerührt und verschlossen. 23. The bottles are weighed and centrifuged at 3000 revolutions per minute for 20 minutes. The supernatant liquid is drawn off. Then approximately 800 ml of phosphate buffered saline is added to each bottle. Then it is stirred thoroughly and sealed.

24. Die Stufe 23 wird zehnmal wiederholt. Nach dem letzten Absaugen werden in jede Flasche 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingetragen und der Inhalt von beiden Flaschen dann vereinigt. Das Ganze wird gründlich geschüttelt. Dann wird es in einen geeichten 500-ml:Glaszylinder gegossen und der Zylinderinhalt durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 500 ml gebracht. 24. Level 23 is repeated ten times. After the last aspiration, 100 ml of phosphate-buffered saline are introduced into each bottle and the contents of both bottles are then combined. The whole thing is shaken thoroughly. Then it is poured into a calibrated 500 ml: glass cylinder and the contents of the cylinder are brought up to 500 ml by adding phosphate-buffered saline.

25. Dieses Material wird bei 4 °C in einem 1-Liter-Reagenzkolben aus Glas gelagert. 25. This material is stored at 4 ° C in a 1 liter glass test tube.

Die «Tween-20»-Waschiösung, welche am Tage vor deren Gebrauch hergestellt werden kann, lässt sich wie folgt herstellen: The «Tween-20» washing solution, which can be prepared the day before it is used, can be prepared as follows:

1. Es werden 6,06 g Natriumbicarbonat auf einer Dreibalkenwaage ausgewogen. 1. 6.06 g of sodium bicarbonate are weighed out on a three-beam balance.

2. Es werden vorsichtig 6,06 g Natriumbicarbonat in einem 250-ml-Kolben, welcher mit einem Rührstab versehen ist, eingetragen. 2. 6.06 g of sodium bicarbonate are carefully introduced into a 250 ml flask equipped with a stir bar.

3. Es werden ungefähr 200 ml gereinigtes Wasser hinzugegeben und solange mit dem magnetischen Rührer gerührt, bis das Natriumbicarbonat gelöst ist. 3. Add approximately 200 ml of purified water and stir with the magnetic stirrer until the sodium bicarbonate is dissolved.

4. Der Rührstab wird entnommen und der Kolbeninhalt mit gereinigtem Wasser versetzt, bis der Kolbeninhalt 250 ml beträgt. 4. The stirring rod is removed and the contents of the flask are mixed with purified water until the contents of the flask are 250 ml.

5. Dann wird vorsichtig in einem 500-ml-Erlenmeyerkol-ben, welcher mit einem Rührstab ausgerüstet ist, gegossen. 5. Then pour carefully into a 500 ml Erlenmeyer flask equipped with a stir bar.

6. Es werden vorsichtig 250 ml «Tween-20» in einen geeichten 250-ml-Zylinder eingegeben. 6. 250 ml «Tween-20» are carefully added to a calibrated 250 ml cylinder.

7. Dann erfolgt die Zugabe zum Erlenmeyerkolben, welcher Natriumbicarbonatlösung enthält. 7. Then add to the Erlenmeyer flask, which contains sodium bicarbonate solution.

8. Mit Hilfe des magnetischen Rührwerks wird solange gemischt, bis eine vollständige Mischung nach ungefähr 1 Stunde erhalten worden ist. 8. Mix using the magnetic stirrer until complete mixing is obtained after approximately 1 hour.

9. Hierauf wird in einem dicht versiegelten 1-Liter-Kolben aus Polyäthylen, welcher zugeschraubt ist, bei ungefähr 25 °C gelagert. 9. It is then stored in a tightly sealed 1 liter flask made of polyethylene, which is screwed on, at approximately 25 ° C.

Die Terephthaloylchloridlösung, welche am Tag der Verwendung hergestellt werden sollte, wird ohne Tiefkühlung wie folgt erhalten: The terephthaloyl chloride solution, which should be prepared on the day of use, is obtained without freezing as follows:

1. Das Gewicht von Terephthaloylchlorid (TCL) wird auf der das TCL enthaltenden Flasche notiert. Das Gewicht von TCL in g wird mit 10 multipliziert, um das Volumen der dem TCL zuzugebenden Cyclohexan-Chloroform-Lösung in Millilitern zu berechnen. 1. The weight of terephthaloyl chloride (TCL) is noted on the bottle containing the TCL. The weight of TCL in g is multiplied by 10 to calculate the volume in milliliters of the cyclohexane-chloroform solution to be added to the TCL.

Berechnung: gxTCLx 10 = ml Totalvolumen Cyclo- Calculation: gxTCLx 10 = ml total volume cyclo-

hexan-Chloroform-Lösung. hexane-chloroform solution.

Es ist darauf zu achten, dass das Total volumen ausreicht für die folgende Arbeitsweise. It is important to ensure that the total volume is sufficient for the following procedure.

2. Die Cyclohexan-Chloroform-Lösung beträgt 4 Teile Cyclohexan und 1 Teil Chloroform. Das Totalvolumen der Cyclohexan-Chloroform-Lösung (obige Stufe 1) wird durch 5 dividiert, um das Volumen von Chloroform zu berechnen. 2. The cyclohexane-chloroform solution is 4 parts of cyclohexane and 1 part of chloroform. The total volume of the cyclohexane-chloroform solution (step 1 above) is divided by 5 to calculate the volume of chloroform.

Das Chloroformvolumen wird mit 4 multipliziert, um das Cyclohexanvolumen zu bestimmen. The chloroform volume is multiplied by 4 to determine the cyclohexane volume.

Berechnung: a) ml Totalvolumen — 5 = ml Chloroform. Cyclohexan/Chloroform b) ml Chloroform x 4= ml Cyclohexan. Calculation: a) ml total volume - 5 = ml chloroform. Cyclohexane / chloroform b) ml chloroform x 4 = ml cyclohexane.

3. Die berechneten Volumina an Cyclohexan und Chloroform werden vorsichtig in geeichten Zylindern abgemessen. Dann werden diese Mengen in einem Erlenmeyerkolben vereinigt. Es wird gelinde gerührt, um eine Mischung zu erhalten. Dann wird mit einem Uhrglas abgedeckt. Das Ganze wird in den Abzug gestellt. 3. The calculated volumes of cyclohexane and chloroform are carefully measured in calibrated cylinders. Then these quantities are combined in an Erlenmeyer flask. Stir gently to obtain a mixture. Then it is covered with a watch glass. The whole thing is deducted.

4. Ein magnetisches Rührwerk wird in den Abzug gestellt. 4. A magnetic stirrer is placed in the fume cupboard.

5. Die das Terephthaloylchlorid enthaltende Flasche wird mit dem magnetischen Rührwerk in Verbindung gebracht. Die Flasche wird geöffnet und möglichst rasch mit dem magnetischen Rührstab und der Cyclohexan-Chloroform-Lösung versehen. Dann wird die Flasche wieder mit dem Stopfen verschlossen. » 5. The bottle containing the terephthaloyl chloride is connected to the magnetic stirrer. The bottle is opened and the magnetic stir bar and the cyclohexane-chloroform solution are added as quickly as possible. Then the bottle is closed again with the stopper. »

6. Es wird solarige mit dem magnetischen Rührer gerührt, bis sämtliches Terephthaloylchlorid in Lösung gegangen ist. Dabei mag es nötig sein, die Flasche zu kippen, um am oberen Ende der Flasche vorhandenes Terephthaloylchlorid aufzulösen. 6. It is stirred solar with the magnetic stirrer until all terephthaloyl chloride has gone into solution. It may be necessary to tilt the bottle to dissolve the terephthaloyl chloride present at the top of the bottle.

7. Dann werden möglichst schnell so viel 200-mI-Zentrifu-gierflaschen aus Glas als nötig in der gleichen Menge der Terephthaloylchloridlösung gefüllt und verschlossen. Das Ganze wird dann während 10 Minuten bei Zimmertemperatur und mit 2600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. 7. Then as many 200 ml glass centrifuge bottles as necessary are filled and sealed in the same amount of the terephthaloyl chloride solution as quickly as possible. The whole is then centrifuged for 10 minutes at room temperature and at 2600 revolutions per minute.

8. Die überstehende Flüssigkeit wird in bernsteinfarbenen 500-ml-Flaschen gegossen und gründlich versiegelt. 8. The supernatant liquid is poured into amber 500 ml bottles and sealed thoroughly.

9. Die Lagerung in fest versiegeltem Zustande erfolgt bei ungefähr 25 °C. 9. Storage in a tightly sealed state takes place at approximately 25 ° C.

Die Herstellung der Mischung von 15% Polyvinylpyrroli-don-40 und Comassie Blue mit 4% Rinderserumalbumin geschieht in folgender Weise, wobei man dies am Tag der Verwendung vornimmt. Das Gemisch ist nicht in den Gefrierschrank zu stellen. The mixture of 15% Polyvinylpyrroli-don-40 and Comassie Blue with 4% bovine serum albumin is prepared in the following manner, taking place on the day of use. The mixture should not be placed in the freezer.

1. Es werden auf einer Dreibalkenwaage 7,5 g Polyvinyl-pyrrolidon-40, 2 g Rinderserumalbumin und 0,1 g (100 mg) «Comassie Blue» abgewogen. 1. 7.5 g of polyvinyl-pyrrolidone-40, 2 g of bovine serum albumin and 0.1 g (100 mg) of "Comassie Blue" are weighed out on a three-bar balance.

2. Das Polyvinylpyrrolidon-40 wird in ein mit einem Rührstab versehenes 50-ml-Becherglas eingetragen. 2. The polyvinylpyrrolidone-40 is introduced into a 50 ml beaker provided with a stirring rod.

3. Es werden ungefähr 20 ml Rinderserumalbumin hinzugegeben und das Becherglas mit einer Glasplatte bedeckt. 3. Add approximately 20 ml of bovine serum albumin and cover the beaker with a glass plate.

4. Dann wird solange mit dem magnetischen Rührwerk gerührt, bis alles gelöst ist. 4. Then stir with the magnetic stirrer until everything is dissolved.

5. 0,1 g «Comassie Blue» und 2 g Rinderserumalbumin werden getrennt in ein anderes 50-ml-Becherglas eingetragen. 5. 0.1 g "Comassie Blue" and 2 g bovine serum albumin are added separately to another 50 ml beaker.

6. Es werden ungefähr 20 ml Rinderserumalbumin hinzugegeben und der Becher mit einer Glasplatte bedeckt. 6. Add approximately 20 ml bovine serum albumin and cover the beaker with a glass plate.

7. Es wird gerührt und unter Verwendung einer Heizplatte und eines magnetischen Rührwerks Nr. 10 schwach erhitzt, wobei die Heizplatte auf Stufe 2 eingestellt ist. Es wird solange gerührt, bis alles nach ungefähr 10 Minuten gelöst ist. 7. Stir and heat gently using a hot plate and # 10 magnetic stirrer with the hot plate set to level 2. Stir until everything is dissolved after about 10 minutes.

8. Der gesamte Inhalt der die Polyvinylpyrrolidon-40-Lösung und die Comassie-Blue-Lösung enthaltenden Bechergläser werden vorsichtig einem 50-ml-Glaskolben, welcher mit einem Rührstab versehen ist, zugegeben. 8. The entire contents of the beakers containing the polyvinylpyrrolidone 40 solution and the Comassie Blue solution are carefully added to a 50 ml glass flask equipped with a stir bar.

9. Die vereinigten Lösungen werden während 10 Minuten mit dem magnetischen Rührwerk vermischt, worauf der Rührstab entfernt wird. 9. The combined solutions are mixed with the magnetic stirrer for 10 minutes, after which the stir bar is removed.

10. Es wird dann mit Rinderserumalbumin auf ein Volumen von 50 ml gefüllt. 10. It is then filled with bovine serum albumin to a volume of 50 ml.

11. Der pH-Wert wird auf 7,5 ± 0,5 mit Hilfe von 1 n-Natriumhydroxyd eingestellt. Orig.-pH End- 11. The pH is adjusted to 7.5 ± 0.5 using 1N sodium hydroxide. Orig.-pH end

pH Menge an verwendetem ln-NaOH . pH amount of In-NaOH used.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

647 869 647 869

10 10th

12. Die Lösung wird durch eine «Nalgen»-Membran-Wegwerffiltereinheit (0,45 u) filtriert. 12. The solution is filtered through a «Nalgen» membrane disposable filter unit (0.45 u).

13. Das Ganze wird bei ungefähr 25 °C in einer 60-ml-Polyäthylenflasche mit Verschlusskappe versiegelt und gelagert. 13. The whole is sealed and stored at about 25 ° C in a 60 ml polyethylene bottle with a cap.

Die mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird wie folgt hergestellt, wobei diese Lösung tags zuvor hergestellt werden kann: The saline solution buffered with phosphate is prepared as follows, whereby this solution can be prepared the day before:

1. In einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder werden vorsichtig 1000 ml einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung eingefüllt. 1. 1000 ml of a saline solution buffered with phosphate are carefully poured into a calibrated 1000 ml glass cylinder.

2. Es wird in einen aus Polyäthylenballon mit 20 Liter Fassungsvermögen gegossen. 2. It is poured into a 20 liter polyethylene balloon.

3. Dann werden in einem geeichten 1000-ml-Glaszylinder 9000 ml entionisiertes Wasser eingemessen und diese Flüssigkeit dem Ballon, welcher die mit Phosphat gepufferte Kochsalzvorratslösung enthält, versetzt. 3. Then 9000 ml of deionized water are measured in a calibrated 1000 ml glass cylinder and this liquid is added to the balloon, which contains the saline solution buffered with phosphate.

4. Unter Verwendung eines magnetischen Rührstabes wird gerührt. 4. Stir using a magnetic stir bar.

5. Der pH-Wert wird bestimmt. Nötigenfalls wird er auf einen solchen von 7,5 + 0,05 eingestellt. Schluss-pH— 5. The pH is determined. If necessary, it is set to 7.5 + 0.05. Final pH

Wert= . Value =.

6. Die mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wird in einem dicht versiegelten 20-Liter-Polyäthylenballon bei ungefähr 25 °C solange gelagert, bis sie verwendet wird. 6. The phosphate buffered saline is stored in a tightly sealed 20 liter polyethylene balloon at approximately 25 ° C until used.

Das 1,6-Hexandiamincarbonat wird wie folgt hergestellt, wobei dies tags zuvor geschehen kann: The 1,6-hexanediamine carbonate is produced as follows, which can be done the day before:

1. Die das 1,6-Hexandiamin enthaltende Flasche wird in ein 3-Liter-Becherglas gestellt. Dann wird dem Becher genügend Brunnenwasser zugegeben, um das Niveau des Hexan-diamins in der Flasche zu erreichen. 1. The bottle containing the 1,6-hexanediamine is placed in a 3 liter beaker. Sufficient well water is then added to the beaker to reach the level of the hexane diamine in the bottle.

2. Der Verschluss der Hexandiaminflasche wird gelockert. 2. The closure of the hexanediamine bottle is loosened.

3. Das Becherglas wird an den magnetischen Rührer angeschlossen und auf einer Heizplatte auf Stufe 2 solange erwärmt, bis das Hexandiamin vollständig geschmolzen ist. 3. The beaker is connected to the magnetic stirrer and heated on a hot plate at level 2 until the hexanediamine has completely melted.

4. In einen geeichten 25-ml-Glaszylinder werden genau 17,7 ml Hexandiamin abgemessen. Dann wird vorsichtig in eine bernsteinfarbene 100-ml-Flasche gegossen. 4. Exactly 17.7 ml of hexanediamine are measured in a calibrated 25 ml glass cylinder. Then it is carefully poured into an amber-colored 100 ml bottle.

5. Es werden genau 32 ml gereinigtes Wasser in einen geeichten 50-ml-Glaszylinder hinzugegeben. Dann wird dieses Wasser dem Hexandiamin in der bernsteinfarbenen Flasche zugegeben. 5. Exactly 32 ml of purified water are added to a calibrated 50 ml glass cylinder. Then this water is added to the hexanediamine in the amber bottle.

6. Durch die Lösung wird CO2 während ungefähr 1 Stunde so lange durchgeblasen, bis der pH = 8,5 ± 0,1 erreicht ist. End-pH-Wert = . 6. CO2 is bubbled through the solution for about 1 hour until the pH = 8.5 ± 0.1 is reached. Final pH =.

7. Die bernsteinfarbene Flasche wird versiegelt und bei ungefähr 25 °C gelagert. 7. The amber bottle is sealed and stored at approximately 25 ° C.

Die Mikrokapsel und das Prinzip des Arbeitsganges ist in Fig. 9 schematisch dargestellt. Wie aus der Fig. 9 ersichtlich ist, wird der Antikörper 9, welcher in bezug auf Digoxin spezifisch ist, innerhalb der Wandung 10 der Mikrokapsel 12 eingefangen. Die Wandungen 10 der Mikrokapsel 12 besitzen jedoch Öffnungen 14, welche genügend klein sind, um den freien Durchlass von Digoxin zu erlauben. Somit können das aus der Probe stammende Digoxin 16 und das markierte Digoxin 18 ohne weiteres durch die Wandungen der Mikrokapseln hindurchtreten und können miteinander um die Bindungsstellen am Antikörper 9 «konkurrieren». Nicht gebundenes Digoxin 16 bzw. 18 lässt sich nach vollständiger Bebrütung aus der Mikrokapsel herauswaschen. The microcapsule and the principle of the operation is shown schematically in FIG. 9. As can be seen from FIG. 9, the antibody 9, which is specific with respect to digoxin, is captured within the wall 10 of the microcapsule 12. However, the walls 10 of the microcapsule 12 have openings 14 which are small enough to allow free passage of digoxin. The digoxin 16 originating from the sample and the labeled digoxin 18 can thus easily pass through the walls of the microcapsules and can “compete” with one another for the binding sites on the antibody 9. Unbound digoxin 16 or 18 can be washed out of the microcapsule after complete incubation.

Wie oben ausgeführt worden ist, ist ein Teil des Digoxins markiert, und dieses markierte Digoxin «konkurriert» mit dem nicht markierten Digoxin, welches aus der Probe stammt, um die Stellen am Antikörper, welche für Digoxin spezifisch sind. Das bevorzugte markierte Digoxin ist (125J)--Digoxin, welches man bei der Firma New Endland Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, käuflich erwerben kann. As noted above, part of the digoxin is labeled and this labeled digoxin "competes" with the unlabeled digoxin derived from the sample for the antibody-specific sites for digoxin. The preferred labeled digoxin is (125J) - digoxin, which can be purchased from New Endland Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts.

Testverfahren Test procedure

1. Eine Probe oder mehrere Proben des zu testenden Serums werden nach bekannten Verfahren erhalten. In diesem Beispiel werden Blindproben verwendet. 1. A sample or multiple samples of the serum to be tested are obtained by known methods. Blank samples are used in this example.

5 2. 0,1 ml (100 Lil) einer jeden Serumprobe standardisierter Beschaffenheit, jeder Vergleichsprobe oder jeder unbekannten Probe von einem Patienten wird mit der Pipette in entsprechend bezeichnete Röhrchen, welche 0,5 ml Digoxin-Antikörper-Mikrokapselsuspension, hergestellt nach den obi- 5 2. 0.1 ml (100 lil) of each serum sample of standardized nature, each comparison sample or each unknown sample from a patient is pipetted into correspondingly labeled tubes which contain 0.5 ml digoxin-antibody-microcapsule suspension, prepared according to the above -

10 gen Angaben, enthalten, mit der Pipette zugegeben. 10 gene information included, added with the pipette.

3. 0,5 ml (500 jil) mit 12äJ markiertes Digoxin in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung werden in jedes Röhrchen mit der Pipette hinzugegeben. Es wird während mindestens 3 bis 4 Sekunden aufgewirbelt. 3. Add 0.5 ml (500 ml) of digoxin labeled with 12 µJ in a phosphate buffered saline solution to each tube with the pipette. It is whirled up for at least 3 to 4 seconds.

15 4. Sämtliche Reaktionsröhrchen werden in einem Wasserbade (37 °C) während mindestens 15 Minute inkubiert. Man kann auch sämtliche Reaktionsröhrchen bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C während mindestens 30 Minuten inkubieren. 15 4. All reaction tubes are incubated in a water bath (37 ° C) for at least 15 minutes. You can also incubate all reaction tubes at a temperature of 20 to 25 ° C for at least 30 minutes.

5. Jedes Röhrchen wird mit 0,5 ml (500 jj.1) Waschlösung 5. Each tube is filled with 0.5 ml (500 ml) washing solution

20 versetzt und der Röhrcheninhalt während mindestens 3 bis 4 20 and the tube contents for at least 3 to 4

Sekunden aufgewirbelt. Whirled up for seconds.

6. Sämtliche Reaktionsröhrchen werden während 5 Minuten bei Zimmertemperatur (20 bis 25 °C) inkubiert. 6. All reaction tubes are incubated for 5 minutes at room temperature (20 to 25 ° C).

7. Sämtliche Röhrchen werden bei mindestens 1600 g 7. All tubes are at least 1600 g

25 während 10 Minuten bei einer Temperatur von 20 bis 25 °C zentrifugiert, worauf man die überstehende Flüssigkeit in einen geeigneten Abfallbehälter dekantiert. Der letzte Tropfen wurde auf einem Löschblatt aufgenommen. Centrifuged for 25 minutes at a temperature of 20 to 25 ° C, after which the supernatant liquid was decanted into a suitable waste container. The last drop was recorded on a blotter.

8. Sämtliche Röhrchen werden in einem Gammazählwerk, 8. All tubes are in a gamma counter,

30 eingestellt für 125J, während jeweils 1 Minute gezählt. 30 set for 125J, counted for 1 minute each.

9. Die Standardkurve bekannter Mengen Digoxin gegen cpm wird gezeichnet, worauf man aus dieser Kurve die unbekannten Digoxinmengen abliest. 9. The standard curve of known amounts of digoxin against cpm is drawn, whereupon the unknown amounts of digoxin are read from this curve.

35 Verwendete Reagenzien 35 Reagents used

Der Digoxin-Antikörper wird in semipermeablen Nylonmikrokapseln eingekapselt, welche in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung der oben erwähnten Art suspendiert sind. Zur Qualitätskontrolle enthalten die Antikörpermi- The digoxin antibody is encapsulated in semipermeable nylon microcapsules which are suspended in a phosphate buffered saline of the type mentioned above. For quality control purposes, the antibody

40 krokapseln einen blauen Farbstoff, nämlich Comassie Blue R250. Nachdem sich die Mikrokapseln abgesetzt oder durch Zentrifugieren niedergeschlagen haben, zeigt die überstehende blaue Flüssigkeit an, dass die Mikrokapseln geborsten und der Antikörper eingedrungen ist. 40 krokapseln a blue dye, namely Comassie Blue R250. After the microcapsules have settled or deposited by centrifugation, the supernatant blue liquid indicates that the microcapsules have broken and the antibody has penetrated.

45 45

Mit 125J markiertes Digoxin Digoxin marked with 125J

Jedes ml Lösung enthält 10 ug l25J-Digoxin von weniger als 4,2 n Ci. Each ml of solution contains 10 µg of l25J digoxin of less than 4.2 n Ci.

30 Pufferlösung 30 buffer solution

0,015molare Phosphatpufferlösung, pH = 7,5, enthaltend 0,15 Mol pro Liter Natriumchlorid, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid. 0.015 molar phosphate buffer solution, pH = 7.5, containing 0.15 mol per liter of sodium chloride, 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% sodium azide.

53 Waschlösung 53 washing solution

Polyäthylenglykol 6000,20%ige Lösung in 0,5molarem Barbitalpuffer, pH = 6,9, enthaltend 0,15 Mol/Liter Natriumchlorid. Polyethylene glycol 6000.20% solution in 0.5 molar barbital buffer, pH = 6.9, containing 0.15 mol / liter sodium chloride.

60 Berechnung der Resultate 60 Calculation of results

Die Resultate dieses Experimentes finden sich in der Tabelle 5 und werden graphisch in den Fig. 7 und 8 dargestellt. The results of this experiment can be found in Table 5 and are shown graphically in FIGS. 7 and 8.

In Fig. 7 wird CPM auf einer linearen Skala auf halbloga- In Fig. 7, CPM is on a linear scale on half-log

65 rithmischem Papier mit 2 Dekaden gegen die Konzentration von Digoxin in ng/ml auf der Logarithmenskala aufgetragen. Eine Alternative zum Auftragen von CPM gegen die Digoxinkonzentration besteht darin, dass man den Prozentsatz an 65 rithmic paper with 2 decades plotted against the concentration of digoxin in ng / ml on the log scale. An alternative to applying CPM against the digoxin concentration is to look at the percentage

11 11

647 869 647 869

gebundenem Digoxin (relativ) gegen die Digoxinkonzentration gemäss Fig. 8 aufträgt. Dies kann dadurch geschehen, dass man den Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) für jedes Standardmaterial, Vergleichsmaterial oder unbekanntes Material errechnet und diese Werte auf halblogarith-mischem Papier mit 2 Dekaden in ähnlicher Weise aufträgt, wie dies zuvor für CPM beschrieben worden ist. Der Prozentsatz an gebundenem Material (relativ) wird wie folgt berechnet: % gebunden (relativ) = (durchschnittliches CPM gebunden von 0 ng/ml Digoxinstandarad) x 100. bound digoxin (relative) against the digoxin concentration according to FIG. 8. This can be done by calculating the percentage of bound material (relative) for each standard material, comparative material or unknown material and plotting these values on semi-logarithmic paper with 2 decades in a manner similar to that previously described for CPM. The percentage of bound material (relative) is calculated as follows:% bound (relative) = (average CPM bound from 0 ng / ml digoxin standard) x 100.

Tabelle 5 Table 5

Standard ng/ml Standard ng / ml

CPM gebunden CPM bound

Digoxin Digoxin

1 1

2 2nd

0 0

16,888 16.888

17,136 17.136

0,5 0.5

14,464 14.464

14,473 14,473

1,0 1.0

12,279 12,279

12,192 12.192

2,0 2.0

9,690 9.690

9,717 9.717

4,0 4.0

7,344 7,344

7,445 ■ 7.445 ■

Blindversuch Blind test

1 1

10,360 10,360

10,486 10,486

2 2nd

8,226 8,226

8,380 8,380

CPM Total = CPM Total =

26 780 26 780

Durchschnitt average

Relativ % gebunden Relatively% bound

Digoxinwert Digoxin value

(CPM gebunden/ (CPM bound /

ng/ml ng / ml

CPM gebunden)' CPM bound) '

•x 100 X 100

17012 17012

100,0 100.0

14 469 14 469

85,0 85.0

12 236 12 236

72,0 72.0

9 704 9 704

57,0 57.0

7 395 7 395

43,0 43.0

10 423 10 423

61,3 61.3

1,7 1.7

8 303 8 303

48,8 48.8

3,1 3.1

* gebunden = CPM gebunden bzw. 0 ng/ml Digoxin * bound = CPM bound or 0 ng / ml digoxin

Das Testsystem dieses Verfahrens hat sich als sehr präzis erwiesen. Die Innerblockvarianz beträgt weniger als 7% und die Zwischenblockvarianz weniger als 9%. The test system for this method has proven to be very precise. The inner block variance is less than 7% and the intermediate block variance is less than 9%.

Innerblockvarianz Inner block variance

Die Varianzkoeffizienten, nachstehend mit C V bezeichnet, bei zwei Kontrollproben, jeweils 25mal innerhalb eines Experimentes getestet, ergaben die folgenden Werte: The coefficients of variance, hereinafter referred to as C V, in two control samples, each tested 25 times in one experiment, gave the following values:

mittleres Digoxin ng/ml medium digoxin ng / ml

CV CV

Kontrollversuch 1 Control attempt 1

1,54 1.54

4,9% 4.9%

Kontrollversuch 2 Control attempt 2

2,95 2.95

6,2% 6.2%

Zwischenblockvarianz Inter-block variance

Die Varianzkoeffizienten für die beiden Kontrollversuche, jeweils 3mal in 18 getrennten Versuchen getestet, waren die folgenden: The coefficients of variance for the two control experiments, each tested 3 times in 18 separate experiments, were as follows:

mittleres Digoxin ng/ml medium digoxin ng / ml

CV CV

Kontrollversuch 1 Control attempt 1

1,50 1.50

7,3% 7.3%

Kontrollversuch 2 Control attempt 2

3,04 3.04

8,8% 8.8%

Die folgende Tabelle 6 zeigt die ausserordentlichen Werte dieses Testes für Digoxin und den Ausschluss anderer potentiell dazwischentretenden Substanzen. The following table 6 shows the extraordinary values of this test for digoxin and the exclusion of other potentially interfering substances.

Tabelle 6 Table 6

Spezifität: Specificity:

Prozentuale Kreuzreaktionsfähigkeit verschiedener biochemischer Verbindungen mit in Mikrokapseln eingeschlossenen Antidigoxin-Antiseren. Percent cross-reactivity of various biochemical compounds with antidigoxin antisera enclosed in microcapsules.

Verbindung % Kreuzreaktivität Compound% cross reactivity

Digoxin 100,00 Digoxin 100.00

Digitoxin 0,80 Digitoxin 0.80

Progesteron 0,16 Progesterone 0.16

Cortisol 0,10 Cortisol 0.10

Testosteron 0,08 Testosterone 0.08

Dehydroandrosteronsulfat 0,08 Dehydroandrosterone sulfate 0.08

Cholesterin 0,06 Cholesterol 0.06

Quabain 0,02 Quabain 0.02

Quantitative Gewinnung Quantitative extraction

Es hat sich herausgestellt, dass das vorliegende Verfahren durchaus quantitativ erfolgt, indem nicht weniger als eine 96%ige Rückgewinnung der hinzugesetzten Digoxinproben erzielt wird. It has been found that the present method is carried out quantitatively in that no less than 96% recovery of the added digoxin samples is achieved.

Tabelle 7 Rückgewinnungswerte Table 7 Recovery values

Anfänglicher zugesetztes More initially added

Total gemessenes Totally measured

% Rückge % Returns

Digoxin- Digoxin

Digoxin Digoxin

Digoxin winnung Digoxin recovery

Wert value

ng/ml ng/ml ng / ml ng / ml

0,64 0.64

0,5 0.5

1,14 1.14

1,13 1.13

99 99

0,64 0.64

1,0 1.0

1,64 1.64

1,72 1.72

105 105

0,64 0.64

2,0 2.0

2,64 2.64

2,70 2.70

102 102

0,64 0.64

4,0 4.0

4,64 4.64

4,45 4.45

96 96

Es ist besonders wichtig das hohe Ausmass der Korrelation der Resultate beim vorliegenden Verfahren mit Digoxin-bestimmungen, wie sie mit anderen Testmethoden festgehalten wurden, festzuhalten. It is particularly important to note the high degree of correlation of the results in the present method with digoxin determinations, as they were recorded with other test methods.

Die Tabelle 8 zeigt Vergleichstestresultate, welche man den nach dem vorliegenden Verfahren und nach anderen Testmethoden erzielt. Table 8 shows comparative test results which can be achieved by the present method and by other test methods.

Die Systeme A und C entsprechen flüssigen Testsystemen mit die Ausfällung bewirkenden Reagenzien, während das System B eine Trennung in fester Phase benützt. Es geht daraus hervor, dass ein 0,97- bis 0,98-Korrelationskoeffizient besteht. Systems A and C correspond to liquid test systems with the reagents causing the precipitation, while system B uses a separation in the solid phase. It follows that there is a 0.97 to 0.98 correlation coefficient.

Tabelle 8 Table 8

Übereinstimmung für die verfschiedenen Testmethoden Agreement for the passed test methods

Die Korrelationskoeffizienten für 135 Proben nach dem System A, dem System B, dem System C und dem vorliegenden System waren die folgenden: The correlation coefficients for 135 samples according to System A, System B, System C and the present system were as follows:

n r* No*

y y

System A System A

135 135

0,98 0.98

1,12x -0,1 1.12x -0.1

System B System B

135 135

0,97 0.97

0,90 x -0,02 0.90 x -0.02

System C System C

135 135

0,97 0.97

0,96 x + 0 0.96 x + 0

vorliegendes System present system

135 135

0,97 0.97

0,95 x +0,14 0.95 x + 0.14

*r= Korrelationskoeffizient * r = correlation coefficient

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

.35 .35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

647 869 647 869

12 12

Aus dem soeben Gesagten geht eindeutig hervor, dass die in der vorliegenden Beschreibung geoffenbarte Testtechnik für die Bestimmung der Anwesenheit und der Konzentration beliebiger freier Spezies Verwendung finden kann unter der Voraussetzung, dass ein komplentärer Antikörper, welcher sich mit der Spezies und einem von dieser Spezies unterscheidbaren Analogon spezifisch binden lässt, zugänglich sind. Hinzu kommt, dass das Molekulargewicht der Spezies und seines Analogons genügend niedrig sein muss, dass man From what has just been said it is clear that the test technique disclosed in the present description can be used for determining the presence and concentration of any free species, provided that a complementary antibody which is distinguishable from the species and from one of these species Analogue can be specifically bound, accessible. In addition, the molecular weight of the species and its analogue must be sufficiently low that one

Mikrokapselmembranen einsetzen kann, welche eine selektive Diffusion dieser Substanzen erlaubt, andererseits aber den Durchlass von hochmolekularen Materialien, wie z.B. natürlichen Proteinen, verhindert. Glücklicherweise besitzen Steroidhormone, Thyroidhormone, manche Arzneimittel und andere Klassen von Substanzen klinischer Wichtigkeit Molekulardimensionen, welche wesentlich kleiner sind als jene der natürlichen Proteine. Microcapsule membranes can be used, which allows a selective diffusion of these substances, but on the other hand the passage of high molecular weight materials, such as natural proteins, prevented. Fortunately, steroid hormones, thyroid hormones, some drugs, and other classes of substances of clinical importance have molecular dimensions that are significantly smaller than those of natural proteins.

G G

5 Blatt Zeichnungen 5 sheets of drawings

Claims

647 869

2nd

PATENT CLAIMS

1. A method for determining a chemical substance not bound to protein in a protein-containing sample, characterized in that the sample is incubated with an antibody which behaves complementarily with respect to this substance and an analog which can be distinguished from this substance, the sample and the antibody are separated from one another by at least one membrane which has a sufficient porosity to allow the said substance and the different analog to pass through, but on the other hand is not sufficiently porous to allow the passage of the antibody or protein-bound substance present in the sample, that the unbound substance present in the sample passes through the membrane and competes with the analog that can be distinguished for the occupation of the binding sites provided by the antibody, that the antibody is then separated from the unbound substance and the unbound analog and the amounton an analog which is distinguishable from the substance and which is bound or free of antibodies to said antibody, this amount indicating the amount of the substance which is not bound to protein in the sample.

2. The method according to claim 1, characterized in that said antibody and the substance-distinguishable analog are within microcapsules which form said membranes, that the separation process is effected by the unbound substance and said analog removed from said microcapsules and separating said microcapsules from the rest of the reaction system, and that the amount of analogue bound to said antibody is determined.

3. The method according to claim 1, characterized in that the distinguishable analog has said substance, marked with a radioactive atom.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the substance is L-thyroxine.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said substance is L-3,5,3'-tri-iodothyro-nine.

6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said substance is cortisol, testosterone or neonatal thyroxine.

7. The method according to claim 2, characterized in that the separation process is brought about by bringing about an osmolality change in the reaction system which causes the microcapsules to break open.

8. The method according to claim 2, characterized in that said separation process is effected in that the unbound substance and unbound analog are washed out of the microcapsules.

9. The method according to claim 2, characterized in that said substance is digoxin.

10. Test set for performing the method according to claim 1, characterized in that it contains the following components:

a distinguishable analogue of said substance;

a multiplicity of microcapsules which contain an antibody which is complementary to the said substance, said microcapsules having membranes with sufficient permeability to allow passage of said substance and an analog which can be distinguished therefrom, but are insufficiently permeable, said antibody or to allow natural proteins to pass through, these microcapsules being designed to adsorb unbound substance from said sample;

a reactant capable of removing unbound substance and its unbound, distinguishable analog from said microcapsules; and a standard agent which contains a predetermined amount of said substance and is to be used for comparison with a sample.

11. Test kit according to claim 10, characterized in that said substance is thyroxine, said distinguishable analog is thyroxine and said standard agent is aliquots of a material containing known amounts of free thyroxine, which when tested in the Allow a calibration curve to be recorded in comparison with the sample.

12. Test kit according to claim 11, characterized in that the reactant contains serum albumin or polyethylene imine.

13. Test kit according to claim 10, characterized in that said microcapsules contain antibodies to digoxin and said distinguishable analog is' -5J-labeled digoxin.

14. Reagent for carrying out the method according to claim 1, characterized in that the reagent on the one hand has a plurality of microcapsules which contain an antibody which is complementary to the substance to be analyzed analytically, and on the other hand has an analog which can be distinguished from this substance, and in addition that said microcapsules form membranes of sufficient permeability to allow the passage of the analytical substance and its distinguishable analogues, but on the other hand are insufficiently permeable to allow said antibody and natural proteins to pass through.

15. A reagent according to claim 14, characterized in that said antibody is complementary to thyroxine and said analogy which can be distinguished from it is radioactively labeled thyroxine.