DE2551576A1

DE2551576A1 - CARRIERS FOR IMMUNOCHEMICAL MEASUREMENTS

Info

Publication number: DE2551576A1
Application number: DE19752551576
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Hashimoto; Nobuhisa Ogawa
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-16
Filing date: 1975-11-17
Publication date: 1976-05-20
Also published as: DE2551576B2; NL7513302A; FR2291496B1; JPS5157818A; DK143045B; GB1487698A; DK513375A; CA1049404A; BR7507475A; NL180546B; NL180546C; FR2291496A1; DE2551576C3; JPS5247012B2; DK143045C; US4062936A

Description

MÜLLER-BORIS · GROJBXING · DJUOFi₁L · SCHÖN · HERTELMÜLLER-BORIS GROJBXING DJUOFi ₁ L SCHÖN HERTEL

DR. WOI-FQANe MÖLLER-BORS HANS W. QROENINQ, DIPL-INS. DR. PAUU DEUFEL, DIPU-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPU-CHEM. WERNER HERTEI-, DIPI PHYS.DR. WOI-FQANe MÖLLER-BORS HANS W. QROENINQ, DIPL-INS. DR. PAUU DEUFEL, DIPU-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPU-CHEM. WERNER HERTEI-, DIPI PHYS.

17. NOV. 197517 NOV. 1975

S/Gl - M 2475S / Gl - M 2475

Mochida Seiyaku Kabushiki Kaisha, Tokio / Japan Träger für immunochemische MessungenMochida Seiyaku Kabushiki Kaisha, Tokyo / Japan Carrier for immunochemical measurements

In den vergangenen Jahren wurde die Messung biologisch aktiver Komponenten in einem lebenden Körper, wie Insulin, Wachstumshormonen, Prolactin, Gastrin, Nebennierenrindenhormonen, Schilddrüsenhormonen, Angiotensin oder dergleichen, als wichtig für die Diagnose, Therapie und Verhinderung von menschlichen Krankheiten oder zur Durchführung von verschiedenen Funktionstests angesehen. Die Folge ist, dass derartige Messungen nunmehr sehr häufig durchgeführt werden.In the past few years it has been measuring biologically active components in a living body, such as insulin, growth hormones, prolactin, gastrin, adrenal cortex hormones, thyroid hormones, Angiotensin or the like, as important for diagnosis, therapy and prevention of human diseases or for Implementation of various functional tests viewed. The result is that such measurements are now carried out very frequently will.

Da jedoch alle diese biologischen Komponenten in sehr kleinen Mengen vorliegen, können sie nicht nach einer herkömmlichen chemischen Methode gemessen werden, vielmehr werden sie nach einer immunochemischen Methode gemessen, beispielsweise durch eine Radio-However, since all of these biological components are present in very small amounts, they cannot be traced to a conventional chemical Method, rather they are measured by an immunochemical method, for example by a radio

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MOSTCIIEiT 80 · SIEBERTSTR. 4 · POB 860720 · KABEL·: 5ITJEBOPAT · TEL·. (089) 471079 · TELEX 5-226 59MOSTCIIEiT 80 · SIEBERTSTR. 4 POB 860720 KABEL: 5ITJEBOPAT TEL. (089) 471079 TELEX 5-226 59

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immunoarialyse, die nachfolgend als RIA bezeichnet wird. Diese Analyse ermöglicht eine aussergewöhnlich empfindliche Messung.immunoarialysis, hereinafter referred to as RIA. These Analysis enables an exceptionally sensitive measurement.

Die RIA-Methode eignet sich jedoch nicht zum Messen von Komponenten des menschlichen Körpers im Rahmen einer Routineuntersuchung in medizinischen Labors, da sie spezielle Instrumente erfordert, die unter Einsatz von Isotopen arbeiten₇ wobei die Bedienung dieser Instrumente schwierig und nicht sehr bequem ist.However, the RIA method is not suitable for measuring components of the human body as part of a routine examination in medical laboratories, since it requires special instruments that operate using isotopes _7, these instruments being difficult and not very convenient to use.

Eine bekannte einfache Methode zur Messung von biologischen Komponenten im menschlichen Körper besteht darin, einen Träger aus Blutzellen, Polystyrollatex, Kaolinit, Bentonit, Aktivkohle, kristallinem Cholesterin oder dergleichen mit einem Antigen oder Antikörper zu sensibilisieren und dann den Träger mit dem Antikörper oder Antigen in der Probe umzusetzen, wodurch eine immunochemische Agglutinierungsreaktion oder eine Agglutinierungsinhibierungsreaktion erfolgt. Eine Methode unter Einsatz von Blutzellen als Träger ist infolge ihrer hohen Empfindlichkeit besonders vorzuziehen.One known simple method of measuring biological components in the human body is to use a carrier from blood cells, polystyrene latex, kaolinite, bentonite, activated carbon, crystalline cholesterol or the like with an antigen or to sensitize antibodies and then to react the carrier with the antibody or antigen in the sample, whereby a immunochemical agglutination reaction or an agglutination inhibition reaction he follows. One method using blood cells as a carrier is due to their high sensitivity especially preferable.

Die Blutzellen, die als Träger für die vorstehend erwähnte immunochemische Messung eingesetzt werden, werden gewöhnlich aus Blutzellen hergestellt, die von verschiedenen Tieren ohne eine chemische Behandlung erhalten werden. Man kann auch auf Blutzellen zurückgreifen, die zuerst mit einem geeigneten Fixiermittel, wie Formaldehyd, Pyruvinaldehyd, Wasserstoffperoxyd oder dergleichen und dann mit einem Bindemittel, wie Gerbsäure, Bisdiazobenzidin, 1,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol oder dergleichen, behandelt worden sind.The blood cells used as carriers for the aforementioned immunochemical Measurement used are usually made from blood cells obtained from different animals without a chemical Treatment to be received. One can also resort to blood cells, which are first treated with a suitable fixative, such as Formaldehyde, pyruvinaldehyde, hydrogen peroxide or the like and then with a binder such as tannic acid, bisdiazobenzidine, 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenzene or the like are.

Die Tiere, aus denen die Blutzellen erhalten werden, sind im allgemeinen Säugetiere, beispielsweise Rinder, Pferde, Schafe, Kaninchen, Menschen etc_v oder Vögel, beispielsweise Küken, Tauben, Truthähne oder dergleichen, man kann jedoch auch auf andere TiereThe animals from which the blood cells are obtained are generally mammals, such as cattle, horses, sheep, rabbits, etc. People _v or birds, such as chicks, pigeons, turkeys and the like, but it is also to other animals

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*"· j. —* "· J. -

zurückgreifen, beispielsweise Reptilien, wie Krokodile und Schlangen, sowie Amphibien, wie Frösche etc., ferner auf Wassertiere, wie Delphine.fall back, for example reptiles, such as crocodiles and snakes, as well as amphibians, such as frogs, etc., also on aquatic animals, like dolphins.

Die Blutzellen, die aus diesen Tieren erhalten werden, können in unbehandeltem Zustand verwendet werden, I_n. den meisten Fällen werden jedoch fixierte Blutzellen, die mit den vorstehend geschilderten Fixiermitteln behandelt worden sind, verwendet, da nichtbehandelte Blutzellen in ihrer natürlichen Form eine schlechte Festigkeit besitzen und zu einer Hämolyse während mechanischer oder chemischer Behandlungen neigen.The blood cells obtained from these animals can be used in the untreated state, I _n . in most cases, however, fixed blood cells treated with the above-mentioned fixing agents are used because untreated blood cells in their natural form have poor strength and are prone to hemolysis during mechanical or chemical treatments.

Unter dem Begriff "Blutzellen" soll die Materialkomponente in dem Blut verstanden werden, die sich hauptsächlich aus roten Blutzellen zusammensetzt, wobei sowohl nicht-behandelte Blutzellen, die keinerlei Behandlung unterzogen worden sind, als auch die erwähnten fixierten Blutzellen in Frage kommen. Die Menge der Blutzellen wird durch das scheinbare Volumen an Blutzellen wiedergegeben, das beim Zentrifugieren von Blut ermittelt wird.The term "blood cells" should be understood to mean the material component in the blood, which is mainly composed of red blood cells composed, both untreated blood cells that have not undergone any treatment and the fixed blood cells mentioned are possible. The amount of blood cells is represented by the apparent volume of blood cells, which is determined when centrifuging blood.

Diese Blutzellen müssen mit dem vorstehend erwähnten Bindemittel behandelt werden, bevor sie als Träger verwendet werden. Es ist schwer. Antigene oder Antikörper an Blutzellen zu binden, die nicht mit einem Bindemittel behandelt worden sind. Auch dann, wenn sie gebunden sind, lässt sich kein gleichmässiges Produkt erhalten, so dass es unmöglich ist, einen Träger zu gewinnen, der eine reproduzierbare Empfindlichkeit aufweist. Andererseits besitzen Blutzellen, die mit einem Bindemittel behandelt worden sind, ein verbessertes Bindevermögen auf ihren Oberflächen, wodurch die Bindung an ein Antigen oder an einen Antikörper erhöht wird, so dass ein Träger mit einer besseren immunochemischen Agglutinierungsreaktion oder Agglutinierungsinhibierungsreaktion erhalten wird. Wird beispielsweise Gerbsäure als Bindemittel bei der Durchführung von üblichen Methoden verwendet, dann wird eine Suspen-These blood cells must be treated with the above-mentioned binder before they can be used as a carrier. It is heavy. To bind antigens or antibodies to blood cells that have not been treated with a binding agent. Even if they are bound, a uniform product cannot be obtained, so that it is impossible to obtain a carrier that has one has reproducible sensitivity. On the other hand, blood cells that have been treated with a binder have a improved binding capacity on their surfaces, as a result of which the binding to an antigen or to an antibody is increased, see above that a carrier having a better immunochemical agglutination reaction or agglutination inhibition reaction can be obtained will. If, for example, tannic acid is used as a binder when performing conventional methods, then a suspension

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sion von Blutzellen in einer Pufferlösung (Blutzellenkonzentration 2 bis 8 %) mit einem gleichen Volumen einer Lösung eines Bindesmittels in der Pufferlösung vermischt, worauf beide Komponenten bei 37 bis 56⁰C während einer Zeitspanne von 30 bis Minuten reagieren gelassen werden. Die Gerbsäurelösung besitzt gewöhnlich eine Konzentration von 1/20 000 bis 1/40 000. Die Angabe 1/20 000 im Zusammenhang mit der Gerbsäurelösung bedeutet, dass 20 000 ml der Lösung durch Zugabe von 1 g des gelösten Stoffes zu dem Lösungsmittel hergestellt worden sind. Auf weitere Fälle wird nachfolgend eingegangen.Sion of blood cells in a buffer solution (blood cell concentration 2 to 8%) mixed with an equal volume of a solution of a binding agent in the buffer solution, whereupon both components are allowed ^{to react at 37 to 56 0} C for a period of 30 to minutes. The tannic acid solution usually has a concentration of 1/20,000 to 1/40,000. The indication 1/20,000 in connection with the tannic acid solution means that 20,000 ml of the solution have been prepared by adding 1 g of the solute to the solvent . Further cases are discussed below.

Werden Blutzellen mit Gerbsäure behandelt, dann werden ungefähr 0,3 bis 2,5 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden. Die Blutzellen besitzen eine Empfindlichkeit von ungefähr 100 ng/ml bei der Messung von menschlichem Serumalbumin (nachfolgend als HSA bezeichnet) mit den Blutzellen als Träger. Dieser Empfindlichkeitswert ist vergleichsweise hoch im Vergleich zu anderen Trägertypen als Blutzellen, beispielsweise kleinen Polystyrollatexteilchen. Dennoch ist dieser Wert nicht mehr als 1/10 bis 1/10 000 der Empfindlichkeit der RIA-Methode.When blood cells are treated with tannic acid, approximately 0.3 to 2.5 mg of tannic acid are bound to 1 ml of blood cells. The blood cells have a sensitivity of approximately 100 ng / ml the measurement of human serum albumin (hereinafter referred to as HSA) with the blood cells as the carrier. This sensitivity value is comparatively high compared to types of carriers other than blood cells, such as small polystyrene latex particles. However, this value is no more than 1/10 to 1/10 000 of the sensitivity of the RIA method.

Daher ist es bei der Durchführung von immunochemischen Agglutinierungsreaktionen oder Agglutinierungsinhibierungsreaktionen unmöglich, eine. Empfindlichkeit zu erzielen, die mit derjenigen einer RIA-Methode unter Einsatz eines herkömmlichen Trägers vergleichbar ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass die Messung mit einer derartig hohen Empfindlichkeit einen neuen Träger erfordert.Hence, it is useful when performing immunochemical agglutination reactions or agglutination inhibition reactions impossible to achieve a. Sensitivity to achieve that with that is comparable to an RIA method using a conventional carrier. In other words, this means that the measurement with such high sensitivity requires a new carrier.

Als stark empfindlicher und sehr spezifischer Träger für die Durchführung einer immunochemischen Messung sollte er folgende Eigenschaften besitzen: Wird der Träger mit einem Antigen oder Antikörper entsprechend der zu messenden Substanz sensibilisiert, dann kann eine geringe Menge Antigen oder Antikörper in einemAs a highly sensitive and very specific carrier for the Carrying out an immunochemical measurement, it should have the following properties: Will the carrier contain an antigen or Antibodies sensitized according to the substance to be measured, then a small amount of antigen or antibody can be in one

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lebenden Körper als biologische Komponente leicht eine immunochemische Reaktion mit dem Antikörper oder Antigen, mit welchem der Träger sensibilisiert worden ist, verursachen, so dass auf der Grundlage dieser Reaktion der sensibilisierte Träger eine vollständige Agglutinxerungsreaktion eingeht. Für den Fall, dass die immunochemische Reaktion nicht stattfindet, tritt keine spontane Agglutinxerungsreaktion ein.living body as a biological component easily an immunochemical Reaction with the antibody or antigen with which the carrier has been sensitized, causing so that on based on this reaction, the sensitized carrier undergoes a complete agglutinative reaction. In case that the immunochemical reaction does not take place, does not occur spontaneously Agglutinating reaction.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Trägers, der bei einer vereinfachten Messung von biologischen Komponenten unter Anwendung einer immunochemischen Agglutinxerungsreaktion oder einer Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität wie im Falle einer Radioimmunoanalyse ergibt.The object of the invention is to create a carrier which, in a simplified measurement of biological components, is subject to Applying an immunochemical agglutinating reaction or an agglutination inhibiting reaction has high sensitivity and specificity as in the case of radioimmunoanalysis.

Die Erfindung betrifft einen Träger für immunochemische Messungen, der dadurch gekennzeichnet ist, dass Gerbsäure an Blutzellen in einer Menge von 3 0 bis 500 mg pro 1 ml der Blutzellen gebunden ist. Bisher wurden die qualitativen und quantitativen Messungen der biologischen Komponenten eines lebenden Körpers durch Anwendung von immunochemischen Reaktionen durchgeführt. Diese Methoden sind zwar sehr einfach im Vergleich zu der Radio-. immunoanalysen-Methode (RIA-Methode), sie besitzen jedoch insofern Nachteile, als eine Antigen-Antikörper-Reaktion eine geringe Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu der RIA-Methode bedingt, da man keinen geeigneten Träger zum Tragen des Antigens und Antikörpers gefunden hat, das bzw. der mit biologischen Komponenten über eine immunochemische Reaktion reagiert.The invention relates to a carrier for immunochemical measurements, which is characterized in that tannic acid is applied to blood cells in an amount of 3 0 to 500 mg per 1 ml of the blood cells is bound. So far, the qualitative and quantitative measurements of the biological components of a living body have been made carried out by applying immunochemical reactions. Although these methods are very simple compared to the radio. immunoanalysing method (RIA method), but they have so far Disadvantages, as an antigen-antibody reaction, a low sensitivity and specificity compared to the RIA method conditional, since no suitable carrier has been found to carry the antigen and antibody, that or those with biological Components reacts via an immunochemical reaction.

Es wurde nunmehr gefunden, dass durch Vermischen der Blutzellen mit einer grossen Menge an Gerbsäure ein Träger aus Blutzellen erhalten wird, bei welchem 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind, wobei dieser Träger bei der Durchführung von immunochemischen Messungen ganz hervorragende Eigenschaften besitzt.It has now been found that by mixing the blood cells with a large amount of tannic acid, a carrier of blood cells is obtained in which 30 to 500 mg of tannic acid are bound to 1 ml of blood cells, this carrier in the implementation possesses excellent properties for immunochemical measurements.

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— D —- D -

Der erfindungsgemässe Träger wird gewöhnlich in der Weise hergestellt, dass eine Blutzellensuspension, die 2 bis 4 % Blutzellen in einer Pufferlösung enthält, mit einer Lösung von Gerbsäure in der Pufferlösung mit einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 Gerbsäure vermischt und umgesetzt wird, dass 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml der Blutzellen gebunden sind.The carrier according to the invention is usually produced in the manner that a blood cell suspension containing 2 to 4% blood cells in a buffer solution with a solution of tannic acid in the buffer solution with a concentration of 1/50 to 1/1000 tannic acid is mixed and converted that 30 to 500 mg Tannic acid are bound to 1 ml of blood cells.

Die erfindungsgemäss eingesetzten Blutzellen können allen Typen entsprechen, die als Träger für herkömmliche immunochemische Messungen eingesetzt worden sind.The blood cells used according to the invention can be of all types which have been used as carriers for conventional immunochemical measurements.

Die Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden wird, liegt vorzugsweise zwischen 30 und 500 mg pro 1 ml der Blutzellen. Ist die Menge geringer als 3 0 mg, dann kann der Träger nicht die gewünschte hohe Empfindlichkeit und Spezifität erreichen, übersteigt sie 500 mg, dann ist die Agglutinierungswarkung des Trägers zu intensiv, um nach der nachfolgend geschilderten Methode kontrolliert werden zu können, so dass daher der Träger nicht mehr zur Durchführung einer immunochemisehen Messung eingesetzt werden kann.The amount of tannic acid that is bound to the blood cells is up preferably between 30 and 500 mg per 1 ml of the blood cells. If the amount is less than 30 mg, the carrier cannot obtain the desired one achieve high sensitivity and specificity exceeds if it is 500 mg, then the agglutination of the carrier is too intense to be checked by the method described below so that the carrier can no longer be used to carry out an immunochemical measurement.

Gewöhnlich werden bei der Umsetzung zwischen Blutzellen und Gerbsäure gleiche Mengen der Blutzellensuspension, die 2 bis 4 % Blutzellen enthält, sowie einer Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 vermischt. Die Konzentration der Blutzellen in der Suspension, die Konzentration der Gerbsäure in der Gerbsäurelösung sowie das Mischungsverhältnis der Blutzellensuspension zu der Gerbsäurelösung werden derartig gewählt, dass die Menge an Gerbsäure, die an 1 ml der Blutzellen gebunden ist, zwischen 30 und 500 mg liegt. Dies bedeutet, dass entweder Blutzellen in einer Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von 1/100 bis 1/2000 suspendiert werden oder Gerbsäure selbst einer Blutzellensuspension mit einer Konzentration von 1 bis 2 % zugesetzt werden.Usually in the implementation between blood cells and tannic acid equal amounts of the blood cell suspension, which contains 2 to 4% blood cells, and a tannic acid solution with one concentration mixed from 1/50 to 1/1000. The concentration of blood cells in the suspension, the concentration of tannic acid in the Tannic acid solution and the mixing ratio of the blood cell suspension to the tannic acid solution are selected such that the Amount of tannic acid bound to 1 ml of blood cells is between 30 and 500 mg. This means either blood cells be suspended in a tannic acid solution with a concentration of 1/100 to 1/2000 or tannic acid itself in a blood cell suspension can be added at a concentration of 1 to 2%.

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Die Pufferlösung zur Suspendierung der Blutzellen sowie zur Auflösung der Gerbsäure kann jede Pufferlösung sein, wie sie in herkömmlicher Weise zur Durchführung von immunochemisehen Reaktionen eingesetzt wird. Insbesondere kann eine physiologische Salzlösung verwendet werden, vorzugsweise eine Phosphatpuffersalzlösung. The buffer solution for suspending the blood cells and for dissolving them The tannic acid can be any buffer solution conventionally used for performing immunochemical reactions is used. In particular, a physiological saline solution can be used, preferably a phosphate buffer saline solution.

Die Blutzellen können mit der Gerbsäure bei Zimmertemperatur umgesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn man auf eine Temperatur zwischen 37 und 56⁰C erhitzt, dies ist der übliche Temperaturbereich, der im allgemeinen bei der Durchführung von immunochemischen Verfahren eingehalten wird.The blood cells can be reacted with the tannic acid at room temperature. However, better results are obtained when ^{heating to a temperature between 37 and 56 °} C., this is the usual temperature range which is generally adhered to when carrying out immunochemical processes.

Der erfindungsgemässe Träger, der eine grössere Menge an Gerbsäure als übliche Träger festhält, besitzt eine wesentlich gesteigerte Agglutinierungswirkung und vermag gleichzeitig eine grössere Menge an Antigen oder Antikörper an sich zu binden als herkömmliche Träger.The carrier according to the invention which contains a larger amount of tannic acid than usual carriers, has a significantly increased agglutination effect and at the same time can to bind to a larger amount of antigen or antibody than conventional carriers.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die zur Behandlung von Blutzellen zugesetzt worden ist, und der Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden ist, geht aus der Tabelle I hervor.The relationship between the amount of tannic acid added to treat blood cells and the amount of tannic acid, which is bound to the blood cells is shown in Table I.

Table I.

Menge an Gerb- Gerbsäure, die Bindungsgrad, %Amount of tannic acid, the degree of binding,%

säure, die 1 ml an 1 ml Blutzellenacid that gives 1 ml to 1 ml of blood cells

Blutzeilen züge- gebunden ist, mg setzt wird, mgBlood cells is train-bound, mg is set, mg

1 0,94 94,0 1 0.94 94.0

10 8,82 88,2 10 8.82 88.2

100 86,2 86,2 100 86.2 86.2

600 498 83,0 600 498 83.0

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Die in der Tabelle I angegebenen Werte sind Gerbsäurewerte, die unter Verwendung von FoIin-Denis—Reagens in Äthanolextrakten aus Blutzellen, die mit Gerbsäure behandelt worden sind, gemessen worden sind. Ungefähr die gleichen Werte werden durch Messen des Restgerbsäuregehaltes in der überstehenden Flüssigkeit nach dem Binden der Gerbsäure an die Blutzellen und Abziehen von der Ausgangsmenge an Gerbsäure erhalten. Aus dieser Tabelle geht hervor, dass der grösste Teil der zugesetzten Gerbsäure an den Blutzellen gebunden ist, und zwar unabhängig von der Menge an Gerbsäure, die den Blutzellen zugesetzt wird.The values given in Table I are tannic acid values obtained using FoIin-Denis reagent in ethanol extracts Blood cells that have been treated with tannic acid have been measured. Approximately the same values are obtained by measuring the Residual tannic acid content in the supernatant liquid after the tannic acid has bound to the blood cells and deducted from the initial quantity obtained in tannic acid. This table shows that most of the tannic acid added is in the blood cells is bound, regardless of the amount of tannic acid that is added to the blood cells.

Die Agglutinierungswirkung des Trägers selbst, die Agglutinierungswirkung, die dann ermittelt wird, wenn Rinderserumalbumin " als Stabilisiermittel für ein Reaktionssystem zugesetzt wird, und die Agglutinierungswirkung eines Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert worden ist, wurden zur Durchführung eines Vergleichs der herkömmlichen Träger mit dem erfindungsgemässen Träger ermittelt. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst schwankt im allgemeinen mit dem pH-Wert, der Ionenstärke etc. der Pufferlösung, in welcher der Träger suspendiert ist. In dem vorliegenden Beispiel werden Träger, an die verschiedene Mengen Gerbsäure gebunden sind, in einer Phosphatpuffersalzlösung (pH 6,4 und Konzentration 0,067 Mol) mit einer Konzentration von 0,133 % suspendiert, wobei 0,5 ml einer jeden Suspension in ein kleines Reagensglas eingefüllt und 2 Stunden stehen gelassen werden, worauf die Agglutinierungswirkung des Trägers auf der Grundlage der Sedimentation am Boden des Reagensglases ermittelt wird.The agglutination effect of the carrier itself, the agglutination effect, which is determined when bovine serum albumin "is added as a stabilizer for a reaction system, and the agglutination effect of a carrier sensitized with an anti-HSA antibody were used to carry out a Comparison of the conventional carrier with the one according to the invention Carrier determined. The agglutination effect of a carrier itself generally varies with pH, ionic strength, etc. Buffer solution in which the carrier is suspended. In the present For example, carriers to which various amounts of tannic acid are bound are placed in a phosphate buffer salt solution (pH 6.4 and Concentration 0.067 mol) suspended at a concentration of 0.133%, 0.5 ml of each suspension being poured into a small test tube and left to stand for 2 hours, followed by the agglutination effect of the carrier is determined on the basis of the sedimentation at the bottom of the test tube.

Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst wird nach Zugabe eines Rinderserumalbumins. als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystem in der gleichen Weise wie in dem Fall gemessen, dass kein Serumalbumin vorliegt, mit der Ausnahme, dass eine Phosphatpuffersalzlösung, die 0,2 % Rinderserumalbumin enthält, zum Suspendieren des Trägers verwendet wird. Die AgglutinierungswirkungThe agglutination effect of a carrier itself is increased after addition of a bovine serum album. as a stabilizer for a reaction system measured in the same manner as in the case of no serum albumin except that a phosphate buffer saline solution containing 0.2% bovine serum albumin was used to suspend of the carrier is used. The agglutination effect

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eines Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist₇ wird in der gleichen Weise wie in Spalte 2 von Tabelle II angegeben ist, mit der Ausnahme, dass ein Träger verwendet wird, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Die Kriterien für die Sedimentation auf dem Boden eines Reagensglases werden wie folgt festgelegt:a carrier sensitized with an anti-HSA antibody ₇ is reported in the same manner as in column 2 of Table II, except that a carrier sensitized with an anti-HSA antibody is used. The criteria for sedimentation on the bottom of a test tube are defined as follows:

sehr intensive positive Reaktion intensive positive Reaktion positive Reaktion
negative Reaktionvery intense positive reaction intense positive reaction positive reaction
negative reaction

Die Ergebenisse sind in der Tabelle II zusammengefasst,The results are summarized in Table II,

Gerbsäure, die an
1 ml Blutzellen
gebunden ist, mgTannic acid that at
1 ml of blood cells
is bound, mg

Spalte 1Column 1

Agglutinierungswir- kung des Trägers selbstAgglutination effect of the carrier itself

Tabelle II Spalte 2Table II column 2

Agglutinierungswirkung des Trägers selbst mit Zusatz von Rinderserunaalbumin als Stabilisierungsmittel für das ReaktionssystemAgglutination effect of the carrier itself with the addition of bovine seruna albumin as a stabilizer for the reaction system

Spalte 3Column 3

Agglutinierungswirkung des Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert istAgglutination effect of the carrier with an anti-HSA antibody is sensitized

500
100
10.
1500
100
10.
1

-t-H--t-H-

-H--H-

Die Tabelle II zeigt, dass der erfxndungsgemässe Träger, an dem eine grosse Menge Gerbsäure gebunden ist, eine spontane Agglutinierungsreaktion bedingt, während die herkömmlichen Träger, an denen nur eine kleine Menge Gerbsäure gebunden ist, diese Wirkung nicht zeigt. Dies legt nahe, dass dann, wenn eine grosse Menge an Gerbsäure an die Blutzellen gebunden ist, eine bestimmte Verände-Table II shows that the carrier according to the invention on which a large amount of tannic acid is bound, a spontaneous agglutination reaction conditional, while the conventional carriers, to which only a small amount of tannic acid is bound, this effect does not show. This suggests that when a large amount of tannic acid is bound to the blood cells, a certain change

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rung der Oberfläche der Blutzellen erfolgt, die eine Erhöhung der Agglutinierungswirkung des Trägers selbst bedingt.tion of the surface of the blood cells takes place, which causes an increase in the agglutination effect of the carrier itself.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die an Blutzellen gebunden ist, und der Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das an den Träger gebunden ist, der wiederum mit Gerbsäure verbunden ist, wurde untersucht.The relationship between the amount of tannic acid made by blood cells is bound, and the amount of antibody or antigen bound to the carrier, which in turn is tannic acid connected has been investigated.

Die Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das an einen Träger gebunden ist, wird durch Bestimmung der Menge an Antikörper oder Antigen in der überstehenden Flüssigkeit nach der Sensibilisierung des Trägers mit Antikörper oder Antigen nach einer immunologischen Diffusionsmethode und Abziehen von der Anfangsmenge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das zum Zwecke der Sensibilisierung zugesetzt worden ist, ermittelt.The amount of antibody or antigen bound to a carrier is determined by determining the amount of antibody or antigen in the supernatant after sensitizing the carrier with antibody or antigen an immunological diffusion method and peeling off from the The initial amount of antibody or antigen added for the purpose of sensitization is determined.

In dem vorliegenden Beispiel wird ein Kaninchen-Gamrnaglobulin bzw. HSA als Antikörper und Antigen verwendet.In the present example, a rabbit gamran globulin and HSA is used as antibody and antigen, respectively.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.The results are shown in Table III.

Table ITI

Gerbsäure, die an 1 ml Gebundener Antikörper Blutzellen gebunden (Gammaglobulin), mg ist, mg (5 mg Zusatz zu 0,2 mlTannic acid bound to 1 ml of bound antibody blood cells (gamma globulin), mg is, mg (5 mg addition to 0.2 ml

Blutzellen)Blood cells)

Gebundenes Antigen (HSA), mgBound Antigen (HSA), mg

(2 mg Zusatz zu 0,2 ml(2 mg addition to 0.2 ml

Blutzellen)Blood cells)

500 100 50 10500 100 50 10

3,0 (60 %13.0 (60% 1st

2,5 (50 %)2.5 (50%)

1,9 (38 %)1.9 (38%)

Q,6 (12 %)Q, 6 (12%)

0,4 (8 %)0.4 (8%)

1,7 (85%)1.7 (85%)

1,5 (75 %)1.5 (75%)

1,3 (65 %)1.3 (65%)

0,7 (35 %)0.7 (35%)

0,3 (15 %)0.3 (15%)

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, steigt mit zunehmender gebun-As can be seen from Table III, with increasing bound

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dener Menge Gerbsäure an dem Träger die an dem Träger gebundene Gammaglobulinmenge. Ein Träger, an dem 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, bindet ungefähr 7,5 mal soviel Gammaglobulin wie ein Träger, an dem 1 mg Gerbsäure gebunden sind. Im Falle von gebundenem Antigen ist die Situation ähnlich. Daraus ist zu schliessen, dass der erfindungsgemässe Träger eine merklich gesteigerte Wirkung besitzt, Antikörper oder Antigen zu binden, und zwar im Vergleich zu herkömmlichen Trägern.the amount of tannic acid on the carrier is the amount of gamma globulin bound to the carrier. A carrier on which 500 mg of tannic acid per 1 ml Blood cells are bound, binds about 7.5 times as much gamma globulin like a carrier to which 1 mg of tannic acid is bound. In the case of bound antigen, the situation is similar. From it it can be concluded that the carrier according to the invention is a noticeable has an increased effect of binding antibodies or antigen compared to conventional carriers.

Ferner besitzt der erfindungsgemässe Träger den Vorteil, dass die hohe Agglutinierungswirkung und das ausgeprägte Vermögen, eine grosse Menge an Antigen oder Antikörper zu binden, je nach dem Anwendungszweck gesteuert werden kann. Eine derartige Steuerung lässt sich in sehr wirksamer Weise durch Anwendung der bekannten Methoden durchführen, beispielsweise bei der Sensibilisierung eines Trägers mit einem Antigen oder Antikörper, um die Menge an Antigen oder Antikörper zu steuern, ferner durch Zugabe von normalem Kaninchenalbumin, Rinderserumalbumin oder eines grenzflächenaktiven Mittels etc. als Stabilisierungsmittel für das immunochemische Reaktionssystem, durch eine Steuerung des pH-Wertes und der Ionenstärke des immunochemischen Reaktionssystems oder durch eine Kombination dieser bekannten Methode {vgl. die Tabelle II).Furthermore, the carrier according to the invention has the advantage that the high agglutination effect and the pronounced ability to bind a large amount of antigen or antibody, depending on the application can be controlled. Such a control can be made very effective by using the known Perform methods, such as sensitizing a carrier with an antigen or antibody, to the To control the amount of antigen or antibody, further by adding normal rabbit albumin, bovine serum albumin or one of them surfactants, etc. as stabilizers for the immunochemical reaction system by controlling the pH and the ionic strength of the immunochemical reaction system or by a combination of this known method {cf. the Table II).

Der erfindungsgemässe Träger kann als Träger für Antigen oder Antikörper zur. Durchführung von immunochemischen Agglutinierungs- und Agglutinierungsinhibierungsreaktionen eingesetzt werden. Wird beispielsweise HSA unter Einsatz des erfindungsgemässen Trägers gemessen, dann ist eine Messung von HSA in einer Grössenordnung von 100 pg/ml möglich. Dies bedeutet, dass die Empfindlichkeit der Messung um ungefähr das 1000-fache im Vergleich zu dem Einsatz herkömmlicher Träger verstärkt wird.The carrier according to the invention can be used as a carrier for antigen or Antibodies to. Implementation of immunochemical agglutination and agglutination inhibition reactions can be used. Is, for example, HSA using the carrier according to the invention measured, a measurement of HSA on the order of 100 pg / ml is possible. This means the sensitivity the measurement by about 1000 times compared to that Use of conventional carriers is reinforced.

Die folgenden Versuche und Beispiele erläutern die Erfindung.The following experiments and examples illustrate the invention.

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Versuch 1Attempt 1

2 ml Schafblutzeilen, die mit Formalin fixiert worden .sind, werden in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 60 ml einer Lösung von Gerbsäure mit verschiedenen Konzentrationen, gelöst in der Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Verschiedene Träger mit verschiedenen Mengen an gebundener Gerbsäure werden erhalten. Jeder der Träger wird in 60 ml der Pufferlösung suspendiert und dann mit einer Antikörperlösung vermischt, die in der Weise hergestellt wird, dass 60 mg eines Anti-HSA-Antikörpers (als Kaninchengammaglobulin) in der Pufferlösung aufgelöst werden. Die Mischung wird bei 56⁰C während einer. Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit dem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Danach wird jeder der auf diese Weise erhaltenen sensibilisierten Träger mit 50 ml Pufferlösung gewaschen und zu einer 1 %igen Suspension in einer- PHosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10 % Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,02 % normales Kaninchenserum enthält.2 ml of sheep's blood that have been fixed with formalin are suspended in 60 ml of phosphate buffer saline. The suspension is mixed with 60 ml of a solution of tannic acid with different concentrations, dissolved in the buffer solution, whereupon the mixture is ^{reacted at 56 °} C. for a period of 30 minutes. Different carriers with different amounts of bound tannic acid are obtained. Each of the carriers is suspended in 60 ml of the buffer solution and then mixed with an antibody solution prepared by dissolving 60 mg of an anti-HSA antibody (as rabbit gamma globulin) in the buffer solution. The mixture is at 56 ⁰ C during a. Time of 30 minutes reacted until the carrier is sensitized with the anti-HSA antibody. Thereafter, each of the sensitized carriers thus obtained is washed with 50 ml of buffer solution and formulated into a 1% suspension in a phosphate buffer saline solution containing 10% cane sugar, 0.1% bovine serum albumin and 0.02% rabbit normal serum.

0,1 ml einer jeden dieser sensibilsierten Trägersuspensionen werden in ein Reagensglas mit einem Innendurchmesser von ungefähr 9 mm mit einem kugelförmigen Boden eingebracht und allmählich mit 0,3 ml der Phosphatpuffersalzlösung zur Gewinnung einer 0,25 %igen Suspension vermischt, worauf sich die Zugaben von 0,1 ml HSA-Lösungen mit 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0_# 10, 20, 50 bzw. 100 ng/ml HSA anschliessen. Nach einem Schütteln werden die Mischungen während einer Zeitspanne von 2 Stunden stehen gelassen. Die Sedimentationsmuster, die sich am Boden der Reagensgläser entwickeln, werden beobachtet. Die Ergebnisse werden als negativ bzw. positiv eingestuft, je nachdem, ob ein Sedimentationsring gebildet worden ist oder nicht.0.1 ml of each of these sensitized carrier suspensions are placed in a test tube with an inner diameter of approximately 9 mm with a spherical bottom and gradually mixed with 0.3 ml of the phosphate buffer saline to obtain a 0.25% suspension, followed by the additions of Connect 0.1 ml HSA solutions with 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 _# 10, 20, 50 or 100 ng / ml HSA. After shaking, the mixtures are allowed to stand for a period of 2 hours. The sedimentation patterns that develop at the bottom of the test tubes are observed. The results are classified as negative or positive, depending on whether a sedimentation ring has been formed or not.

Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse der Empfindlichkeiten von ver-Table IV shows the results of the sensitivities of various

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schiedenen Trägern bei HSA-Messungen, und zwar dargestellt als die minimalen Mengen an HSA, die erforderlich sind, um positive Reaktionen zu bewirken.different carriers for HSA measurements, shown as the minimal amounts of HSA that are required to be positive Cause reactions.

Table IV

Konzentration der Gerbsäurelösung, die für die Behandlung der Blutzellen verwendet wirdConcentration of the tannic acid solution necessary for the treatment of blood cells is used

Gerbsäure, die an 1 ml Blutzellen gebunden ist,itigTannic acid bound to 1 ml of blood cells, itig

Empfindlichkeit bei der HSA-Messung, ng/mlSensitivity in HSA measurement, ng / ml

1/501/50 500500 *(298)* (298) 1/2501/250 100100 (103)(103) 1/9001/900 3030th (29)(29) 1/2 5001/2 500 1Q1Q (10,4)(10.4) 1/30 0001/30 000 11 (0,96)(0.96)

0,50.5

0,1 5,0 20
1000.1 5.0 20
100

*Die Werte in Klammern sind die tatsächlich gemessenen Werte.* The values in brackets are the actually measured values.

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, wird das beste Ergebnis mit dem Träger erhalten, bei welchem 100 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind. Dieser Träger besitzt eine ungefähr 1000 mal so grosse Empfindlichkeit wie ein herkömmlicher Träger, bei dem nur 1 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden ist.As can be seen from Table IV, the best result is obtained with the carrier in which 100 mg of tannic acid on 1 ml of blood cells are bound. This carrier possesses an approximately 1000 times as sensitive as a conventional carrier in which only 1 mg of tannic acid is bound to 1 ml of blood cells.

Versuch 2Attempt 2

60 ml jeweils einer der Trägersuspensionen, die nach der in Versuch 1 beschriebenen Weise hergestellt worden sind, werden mit einer Lösung von 6 mg eines Kombinationsproduktes aus 2,4-Dinitrophenol und Rinderserumalbumin (nachfolgend als DNP-BSA bezeichnet)60 ml each of one of the carrier suspensions that were used in the experiment 1 described manner are prepared with a solution of 6 mg of a combination product of 2,4-dinitrophenol and bovine serum albumin (hereinafter referred to as DNP-BSA)

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in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung vermischt. Die Lösung wird bei 56⁰C während einer Zeitspanne von 3 0 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit DNP-BSA sensibilisiert ist. Dann wird jeder der Träger mit 50 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen und zu einer 1 %igen Suspension in der Phosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10 % Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,02 % normales Kaninchenserum enthält.mixed in 60 ml of phosphate buffer saline solution. The solution is ^{reacted at 56 °} C. for a period of 30 minutes until the carrier is sensitized with DNP-BSA. Then each of the carriers is washed with 50 ml of the aforementioned buffer solution and formulated into a 1% suspension in the phosphate buffer saline solution containing 10% cane sugar, 0.1% bovine serum albumin and 0.02% rabbit normal serum.

Zuerst wird mit den sensibilisierten Trägern das maximale Verdünnungsverhältnis eines Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, untersucht.First, use the sensitized vehicle at the maximum dilution ratio an antiserum necessary for an agglutination reaction of the carriers to occur.

Ein Anti-DNP-BSA-Antiserum wird in der Weise hergestellt, dass Freund¹sches Complete Adjuvant mit DNP-BSA nach einer herkömmlichen Methode vermischt und dabei ein Kaninchen immunisiert wird. Die Absorption des Serums mit BSA liefert ein Antiserum, das eine Antikörperaktivität nur gegenüber DNP besitzt. Das Antiseruia wird mit 0,25 % einer Salzlösung verdünnt, die 1 % BSA enthält, und zwar in der Reihenfolge des 1-, 10-, 20-, 50-, 100-, 200-, 300-, 400- und 500-fachen. Dann werden 0,1 ml der verdünnten Sera in ein Reagensglas gegeben, das 0,1 ml jeweils einer der sensibilisierten Trägersuspensionen und 0,3 ml Phosphatpuffersalzlösung enthält, worauf geschüttelt wird. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das maximale Verdünnungsverhältnis des Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, bestimmt.An anti-DNP-BSA antiserum is prepared in such a way that friend ¹ mixed ULTRASONIC Complete Adjuvant with DNP-BSA by a conventional method and thereby a rabbit is immunized. The absorption of the serum with BSA provides an antiserum which has antibody activity only against DNP. The antiseruia is diluted with 0.25% saline solution containing 1% BSA, in the order of 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 and 500 fold. 0.1 ml of the diluted sera are then placed in a test tube containing 0.1 ml each of the sensitized carrier suspensions and 0.3 ml of phosphate buffer saline, followed by shaking. After standing for a period of 2 hours, the maximum dilution ratio of the antiserum required for an agglutination reaction of the carriers to occur is determined.

Dann werden einige Agglutinierungsinhibierungssysteme aus jedem der sensibilisierten Träger zusammengesetzt, worauf das Antiserum bei dem maximalen Verdünnungsverhältnis bestimmt wird, das für die Agglutinierungsreaktion erforderlich ist. Jedes der Systeme, das auf diese Weise erhalten wird, wird auf seine Empfindlichkeit zur Durchführung einer DNP-Messung untersucht.Then some agglutination inhibition systems become out of each one composed of the sensitized carrier, after which the antiserum is determined at the maximum dilution ratio, that is necessary for the agglutination reaction. Each of the systems obtained in this way will be on its own Investigated sensitivity for performing a DNP measurement.

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Für jedes der Agglutinierungsinhibierungsreaktionssysteme werden 0,1 ml des erwähnten Antiserums mit maximaler Verdünnung in einem Reagensglas mit 0,1 ml einer DNP-Lösung vermischt, die 50, 100, 200, 300, 500, 700 oder 1000 ng/ml DNP in einer Phosphatpuffersalzlösung enthält, der 0,1 ml der sensibilisierten Trägerlösung und 0,2 ml Phosphatpuffersalzlösung zugesetzt worden sind. Nach einem Schütteln und Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das Sedimentationsmuster, das sich auf dem Boden des Reagensglases entwickelt hat_f beobachtet. Falls ein Sedimentationsring gebildet wird, wird das Ergebnis als positiv eingestuft, während es als negativ bewertet wird, wenn sich kein Sedimentationsring gebildet hat.For each of the agglutination inhibition reaction systems, 0.1 ml of the aforementioned antiserum at maximum dilution in a test tube is mixed with 0.1 ml of a DNP solution containing 50, 100, 200, 300, 500, 700 or 1000 ng / ml DNP in a phosphate buffer salt solution to which 0.1 ml of the sensitized carrier solution and 0.2 ml of phosphate buffer salt solution have been added. After shaking and allowing to stand for a period of 2 hours, the sedimentation, which has developed on the bottom of the test tube is observed _f. If a sedimentation ring is formed, the result is rated as positive, while it is rated as negative if no sedimentation ring has formed.

Die Empfindlichkeiten der Träger sind in der Tabelle V zusammengefasst und werden als minimale Menge an DNP wiedergegeben, die für das Auftreten positiver Reaktionen erforderlich sind.The sensitivities of the carriers are summarized in Table V. and are reported as the minimum amount of DNP required for positive reactions to occur.

Table V

Konzentration der
Gerbsäurelösung, die
für die Behandlung
von Blutzellen ein
gesetzt wirdConcentration of
Tannic acid solution that
for the treatment
of blood cells
is set Gerbsäure, die
an 1 ml Blutzel
len gebunden
ist, mgTannic acid that
on 1 ml of blood cells
len bound
is, mg 1/501/50 500500 1/2501/250 100100 1/9001/900 3030th 1/2 5001/2 500 1010 1/30 0001/30 000 11

Maximales Verdünnungsver hältnis des Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion erforderlichiistMaximum dilution ratio of the antiserum that is necessary for the occurrence of a Agglutination reaction is required

300 300 100300 300 100

50 *50 *

Empfindlichkeit bei der DNP-Messung, ng/mlSensitivity in DNP measurement, ng / ml

100100

200200

10001000

*Es erfolgt keine Agglutinierung, selbst wenn nicht-verdünntes Serum verwendet wird.* No agglutination occurs even if it is not diluted Serum is used.

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Aus der Tabelle V geht hervor, dass herkömmliche Träger, an denen 1 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden ist, auch dann nicht agglutiniert werden können, wenn nicht-verdünntes Antiserum verwendet wird, während der erfindungsgemässe Träger, an dem 100 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, eine Agglutinierungsreaktion mit einem Antiserum zu bewirken vermag, das um das 3 00-fache verdünnt worden ist.From Table V it can be seen that conventional carriers to which 1 mg of tannic acid is bound per 1 ml of blood cells also then cannot be agglutinated if undiluted antiserum is used while the carrier of the invention is on to which 100 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells are bound, an agglutination reaction with an antiserum that has been diluted 300 times.

Die erfindungsgemässen Träger besitzen eine 5 bis 10 mal grössere Empfindlichkeit bei der Messung als die herkömmlichen Träger.The carriers according to the invention are 5 to 10 times larger Sensitivity in measurement than the conventional carrier.

Aus diesen Versuchen geht hervor, dass die Verwendung des erfindungsgemässen Trägers zur Durchführung einer immunochemisehen Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine starke Vervielfachung der Verdünnung des Antiserums im Vergleich zu einer Verwendung von herkömmlichen Trägers ermöglicht, so dass Messungen mit einer höheren Empfindlichkeit möglich sind, bei denen Antiseren mit einem derart niedrigen Antikörpergehalt verwendet werden können, welcher bisher für eine Messung unmöglich war.From these experiments it is evident that the use of the inventive Carrier for carrying out an immunochemical agglutination inhibition reaction a large multiplication of the dilution of the antiserum compared to using conventional ones Carrier allows, so that measurements with a higher sensitivity are possible in which antisera with such a low antibody content can be used, which was previously impossible for a measurement.

example 1

30 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in einer Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 900 ml eingestellt wird. Die Suspension wird mit 900 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/300-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, versetzt, worauf die Mischung bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger jeweils zweimal mit 600 ml der Pufferlösung gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt worden ist, enthält ungefähr 90 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen in gebundener Form.30 ml of sheep blood cells that have been fixed with formalin are used washed with 300 ml of phosphate buffer saline and then suspended in a buffer solution, the total volume of the solution is adjusted to 900 ml. The suspension is mixed with 900 ml of a tannic acid solution with a 1/300 concentration dissolved in the same Buffer solution, added, whereupon the mixture at 56 ° C during a period of 30 minutes is implemented. After the reaction, the carrier is washed twice with 600 ml of the buffer solution each time. The carrier used to carry out this example contains approximately 90 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells in bound form.

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Example 2

50 ml Kükenblutzellen, die mit Pyruvinaldehyd fixiert worden sind, werden 10 mal mit der physiologischen Salzlösung gewaschen und dann in 1000 ml dieses Lösungsmittels suspendiert.50 ml chick blood cells that have been fixed with pyruvinaldehyde, are washed 10 times with the physiological saline solution and then suspended in 1000 ml of this solvent.

Dieser Blutzellensuspension werden 2 000 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/350-Konzentration zugemischt, worauf die Mischung bei 25°C während einer Zeitspanne von 60 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger mit 1000 ml des Lösungsmittels gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt wird, weist in gebundener Form ungefähr 100 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen auf.This blood cell suspension is mixed with 2,000 ml of a tannic acid solution with a 1/350 concentration, whereupon the mixture is added to 25 ° C is reacted over a period of 60 minutes. After the reaction, the carrier is washed with 1000 ml of the solvent. The carrier used to carry out this example has approximately 100 mg of tannic acid per in bound form 1 ml of the blood cells.

Example 3

50 ml Kaninchenblutzellen, die nach einer Behandlung mit Wasser— stoffperoxyd fixiert sind, werden mit 500 ml einer Boratpuffersalzlösung gewaschen und dann erneut in der Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 1500 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/500-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56°C während einer Zeitspanne von 45 Minuten umgesetzt wird. Nach der Umsetzung wird das Produkt mit 1000 ml der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 50 mg Gerbsäure pro 1 „gji .Blutzellen auf.50 ml rabbit blood cells, which after treatment with water- Peroxide are fixed with 500 ml of a borate buffer salt solution washed and then resuspended in the buffer solution. The suspension is with 1500 ml of a tannic acid solution with a 1/500 concentration, dissolved in the same buffer solution, mixed, followed by mixing at 56 ° C for 45 minutes is implemented. After the reaction, the product is washed with 1000 ml of the buffer solution to obtain a carrier. The carrier of this For example, it has approximately 50 mg of tannic acid per 1 ″ gji of blood cells on.

Example 4

30 ml nicht-behandelter Rinderblutzellen werden mit 500 ml Veronalpufferlösung gewaschen, wgrauf die Blutzellen zentrifugiert werden. ■ Die Blutzellen werden in einer Gerbsäurelösung suspendiert, die durch Auflösen von 1 g Gerbsäure in 1000 ml der Pufferlösung hergestellt worden ist, worauf die Suspension bei 37⁰C während einer Zeit-30 ml of untreated bovine blood cells are washed with 500 ml of veronal buffer solution before the blood cells are centrifuged. ■ The blood cells are suspended in a tannic acid solution which has been prepared by dissolving 1 g of tannic acid in 1000 ml of the buffer solution, whereupon the suspension is kept at 37 ^° C. for a period of time.

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spanne von 3 0 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen . span of 30 minutes is implemented. After the reaction, the product is washed with the buffer solution to obtain a carrier.

Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 3 0 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen auf.The carrier of this example has approximately 30 mg per tannic acid 1 ml of blood cells.

Example 5

20 ml Rinderblutzellen, die mit Wasserstoffperoxyd fixiert worden sind, werden mit 3 00 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in der Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 600 ml eingestellt wird. ^: 20 ml of bovine blood cells which have been fixed with hydrogen peroxide are washed with 300 ml of phosphate buffer salt solution and then suspended in the buffer solution, the total volume of the solution being adjusted to 600 ml. ^:

Die Blutzellensuspension wird mit einer Lösung von Gerbsäure mit einer 1/50-Konzentration, gelöst in der Pufferlösung, vermischt. Die Mischung wird bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels enthält ungefähr 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen.The blood cell suspension is mixed with a solution of tannic acid with a 1/50 concentration dissolved in the buffer solution. The mixture is reacted at 56 ° C for 30 minutes. After the reaction, the product is mixed with the buffer solution washed to obtain a carrier. The carrier of this example contains approximately 500 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells.

Wie vorstehend erwähnt worden ist, besitzt der erfindungsgemässe Träger für immunochemische Messungen eine höhere Empfindlichkeit und eine höhere Spezifität als herkömmliche Träger, so dass er ohne weiteres eine immunochemische Reaktion auslöst, und zwar auch dann, wenn die Menge der biologischen Komponenten sehr gering ist. Ferner bedingt er, aufgrund dieser Reaktion, eine vollständige Agglutinierungsreaktion. Daher erleichtert die Verwendung des erfindungsgemässen Trägers die Messung von biologischen Komponenten, so dass er von sehr hohem medizinischen Wert ist.As mentioned above, the inventive Carriers for immunochemical measurements have a higher sensitivity and a higher specificity than conventional carriers, so that he readily triggers an immunochemical reaction, even if the amount of the biological components is very small. Furthermore, due to this reaction, it causes a complete agglutination reaction. Therefore, the use of the inventive one facilitates The measurement of biological components, so that it is of very high medicinal value.

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Claims

1 . Carrier for immunochemical measurements, characterized in that it consists of blood cells containing tannic acid in a quantity 30 to 500 mg of tannic acid is bound per 1 ml of blood cells.

2. Carrier according to claim 1, characterized in that the blood cells obtained from various animals in the untreated state have been.

3. Carrier according to claim 1, characterized in that the blood cells, obtained from different animals have been fixed with a suitable fixative.

4. Carrier according to claim 3, characterized in that the fixing means from formaldehyde, pyruvinaldehyde or hydrogen peroxide consists.

5. Process for the preparation of a carrier for immunochemical Measurements according to claim 1, characterized in that a Blood cell suspension prepared by suspending blood cells in a buffer solution with a tannic acid solution is implemented, the concentrations and the mixing ratio of the solutions being such that 3 0 to 500 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells are bound.

6. The method according to claim 5, characterized in that a blood cell suspension with a blood cell concentration of 2 to 4% in a buffer solution is mixed with a solution and reacted, the tannic acid in solution in the same buffer solution in a concentration of 1/50 to 1 / 1OQO, so that 30 to 500 mg of succinic acid are bound per 1 ml of the blood cells.

7. Process for the production of a carrier for immunochemical measurement

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sung, which is made up of blood cells with which tannic acid is associated in an amount of 30 to 50 0 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells is, characterized in that blood cells and tannic acid are reacted in a buffer solution in such a way that 30 to 500 mg of tannic acid per 1 ml of blood cells are bound.

8. The method according to claim 7, characterized in that the used buffer solution from a phosphate buffer salt solution, a physiological salt solution, a borate buffer salt solution or consists of a veronal buffer solution.

9. The method according to claim 5, characterized in that the blood cells used from natural blood cells, which are from different Animals are obtained, as well as made up of fixed blood cells obtained by fixing natural blood cells can be obtained with a fixative.

10. The method according to claim 5, characterized in that a reaction temperature between 37 and 56 ° C is maintained.

11. Reaction system for an immunochemical measurement, marked by a carrier according to claim 1, which is sensitized with an antigen or antibody.

1-2 .Reaktionssystem according to claim 11, characterized in that that he of the respective measurement by adding a stabilizing agent is adapted.

13. Reaction system according to claim 13, characterized in that that it also serves the measurement purpose. Control of its pH is adjusted.

14. Reaction system according to claim 11, characterized in that it is additionally controlled by the respective measurement purpose its ionic strength is adapted.

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15. Methods of measurement of immunochemical biological Components, characterized in that the reaction system according to claim 11 is an immunochemical agglutination or agglutination inhibition reaction is applied with a test sample containing the biological components to be measured contains.

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