DE69118959T2 - Verfahren zum Nachweis des Pyrogen-Gehaltes - Google Patents
Verfahren zum Nachweis des Pyrogen-GehaltesInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines pyrogengehalts. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Bestimmung eines Pyrogengehalts, welches eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und ausgezeichnete Betriebseigenschaften hat und welches sogar auf eine Probe anwendbar ist, bei der bisher eine Bestimmung wegen der Anwesenheit von die Bestimmung störenden Substanzen und ähnlichem schwierig gewesen ist.
- Pyrogene sind pyrogene Substanzen, welche die Körpertemperatur eines homöothermen Lebewesens um einen sehr kleinen Betrag erhöhen. Wenn ein Pyrogen in den menschlichen Körper eingebracht wird, beispielsweise durch die intravenöse Injektion einer mit ihm verunreinigten Medizin, verursacht das Pyrogen neben der Hauptwirkung der Medizin ein starkes Fieber. Man sagt, daß diese Wirkung des Pyrogens, wenn sie ernst wird, ein starkes Fieber verursacht, welches von Frösteln und Schaudern begleitet wird und gelegentlich zum Tod durch Schock führt. Viele Substanzen, wie bakterielle Substanzen, Entzündungen verursachende Substanzen, pflanzliche Polysaccharide, Blutgruppensubstanzen und ähnliche, sind als Pyrogene bekannt geworden. Unter diesen haben die bakteriellen Substanzen den wichtigsten Einfluß auf das Fieber und werden als bakterielle Toxine bezeichnet. Ganz allgemein werden bakterielle Toxine in Ektotoxine und Endotoxine eingeteilt. Insbesondere wird gesagt, daß ein als ein sogenanntes O-Antigen wirkendes Endotoxin, dessen Hauptkomponente ein Zellwandlipopolysaccharid (LPS) eines gramnegativen Bakteriums ist, die stärkste fiebererregende Wirkung hat.
- Entsprechend ist es sehr wichtig, einen Pyrogengehalt nachzuweisen oder zu bestimmen, beispielsweise um während der Herstellung einer Medizin die Verunreinigung mit einem Pyrogen zu verhindem.
- Als Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Pyrogengehalts sind beispielsweise ein Fiebertest unter Verwendung eines Kaninchens oder der Limulus-Test bekannt geworden, welcher einen Blutzellenextrakt von Limulus Polyphemus anwendet. Insbesondere der Limulus-Test ist oft im Hinblick auf seine Empfindlichkeit, Einfachheit, quantitativen Eigenschaften und auf ähnliches angewandt worden.
- Jedoch ist der Limulus-Test in Gefahr, durch verschiedenartige im Bestimmungssystem vorhandene Substanzen gestört oder aktiviert zu werden, und deshalb ist eine komplizierte Vorbehandlung erforderlich oder wird es manchmal in der Abhängigkeit von einer Probe schwierig, einen Pyrogengehalt zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es einige Substanzen, welche keine Pyrogene sind und welche im Limulus-Test positiv sind, und diese stören die genaue Bestimmung eines Pyrogengehalts. Um dieses Problem zu lösen, ist die Verwendung von hochreinen Reagenzien vorgeschlagen worden. Jedoch sind solche Reagenzien sehr teuer. Darüber hinaus wird es als schwierig angesehen, einen sehr geringen Gehalt eines Pyrogens zu bestimmen, welcher in einer Substanz mit einer geringen Löslichkeit enthalten ist.
- Vor kurzem ist, um ein Endotoxin nachzuweisen, welches eines der Pyrogene ist, ein Verfahren vorgeschlagen worden, das beinhaltet, eine pyrogenfreie Aktivkohle, welche durch eine Säurebehandlung erhalten worden ist, in Kontakt mit einer Probe zu bringen und die Aktivkohle mit Limulus- Lysat reagieren zu lassen, um den Limulus-Test leicht und schnell durchzuführen (japanische Offenlegungsschrift Nr. 152425/1981). Jedoch ist dieses Verfahren hinsichtlich seiner Spezifität, Empfindlichkeit und seiner quantitativen Eigenschaften für Pyrogene noch unbefriedigend. Darüber hinaus offenbart das US-Patent Nr. 4 491 660, daß ein bestimmtes Polymer, welches ein Endoxin absorbieren kann, zum Konzentrieren und Nachweisen des Endoxins benutzt werden kann. Jedoch ist dieses Polymer im Hinblick auf seine Spezifität, seine Sensitivität, seine quantitativen Eigenschaften und ähnliches noch unbefriedigend.
- EP-A-0 350 004 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts, bei welchem eine Probe in Kontakt mit einem Adsorptionsmittel gebracht wird, welches aus einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Verbindung zusammengesetzt ist, die an einen wasserunlöslichen Träger direkt oder über einen Spacer gebunden ist. Nach dem Eluieren des an dem Adsorptionsmittel adsorbierten Pyrogens, oder auch ohne daß eluiert wird, wird die Menge des adsorbierten Pyrogens mittels eines Limulus-Verfahrens bestimmt.
- JP-A-62-176560 offenbart ein Filter eines zentrifugalabscheiders, welcher aus einem zylindrischen Probenbecher mit einem Filter am Boden und einem Filtratbecher besteht, der mit dem Boden des Probenbechers verbunden ist.
- Die Erfinder haben gründliche Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur Bestimmung eines Pyrogengehalts zu entwickeln, welches eine ausgezeichnete Spezifität, Empfindlichkeit und quantitative Eigenschaften für Pyrogene hat. Als Ergebnis ist gefunden worden, daß, indem ein Adsorptionsmittel, welches eine Adsorptionsfähigkeit für Pyrogen hat, und eine Filtriereinheit vom zentrifugaltyp verwendet wird, die Bestimmung des Pyrogengehalts mittels des Limulus-Tests kann leicht und einfach mit hoher Spezifität und hoher Empfindlichkeit selbst in der Gegenwart von verschiedenartigen störenden Substanzen oder anderen beim Limulus-Test positiv reagierenden Substanzen durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Pyrogengehalts unter Verwendung von bestimmten festen Adsorptionsmitteln verwirklicht worden, welches Probleme lösen kann, die bei bekannten Verfahren auftreten, welche Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle und ähnliche, anwenden.
- Die Hauptaufgabe der Erfindung ist nämlich, ein Verfahren zum Bestimmen eines Pyrogengehalts mit einer ausgezeichneten Spezifität, Empfindlichkeit und quantitativen Eigenschaften für Pyrogene bereitzustellen, welches auch auf eine Probe anwendbar ist, bei der die Bestimmung mittels des üblichen Limulus-Tests bisher wegen der Anwesenheit von bei der Bestimmung störenden Substanzen und ähnlichem schwierig war.
- Diese Aufgabe sowie andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten auf dem betreffenden Gebiet aus der folgenden Beschreibung offenbar, bei der auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen wird.
- Figuren 1 bis 3 zeigen jeweils schernatische Querschnitte von Beispielen der Filtriereinheit vom Zentrifugaltyp, welche bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
- Figuren 4 bis 10 erläutern jeweils Beispiele der Eichkurve, welche bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen des Pyrogengehalts einer flüssigen Probe bereitgestellt, welches eine Filtriereinheit benützt, die einen Filtratbecher und einen Probenbecher beinhaltet, welcher abnehmbar an der Öffnung des Filtratbechers befestigt ist, wobei der Probenbecher mit dem Filtratbecher über eine Filtriermembran in Verbindung steht, und wobei die genannte Methode die Schritte einschließt: Die flüssige Probe in den Probenbecher mit einem festen Adsorptionsmittel in Berührung bringen, welches in der Lage ist, selektiv Pyrogen zu adsorbieren,
- das nicht adsorbierte Material durch die Filtriermembran unter Bedingungen filtrieren, bei denen die Permeation durch die Membran beschleunigt wird, um das nicht adsorbierte Material in den Filtratbecher zu überführen und
- das an dem Adsorptionsmittel adsorbierte Material, welches in dem Probenbecher zurückgehalten worden ist, mit einem Nachweisreagens zur Reaktion bringen, um seinen Pyrogengehalt zu bestimmen. Im folgenden wird dieses Verfahren als das Verfahren mit der Filtriereinheit bezeichnet.
- Bei dem Verfahren mit der Filtriereinheit wird normalerweise die Permeation durch die Anwendung einer Zentrifugalkraft als Triebkraft (Zentrifugalfiltration) beschleunigt. Weiterhin kann die Permeation durch Anwendung einer anderen Kraft als einer Zentrifugalkraft, wie eines Drucks (beispielsweise Druckfiltration, Filtration unter vermindertem Druck usw.) oder von etwas ähnlichem, als Triebkraft beschleunigt werden. Darüber hinaus kann, wenn eine Probenlösung mit einer hydrophoben Membran zurückgehalten wird und mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt gebracht wird, die Permeation auch durch die Zugabe von Alkohol oder etwas ähnlichem beschleunigt werden. So bedeutet der hierbei benutzte Ausdruck "unter Bedingungen zur Beschleunigung der Permeation durch die Membran" diese Betriebsverfahren.
- Ausdrücke wie "eine Filtriereinheit vom Zentrifugaltyp" oder eine "Filtriereinheit vom Zentrifugaltyp für die Filtration beinhaltet einen Filtratbecher und einen Probenbecher, welcher entfembar an dem Öffnungsteil des Filtratbechers befestigt ist", welche hier benutzt werden, bedeuten nur, daß die Vorrichtung für das Zentrifugieren geeignet ist. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf das Zentrifugieren begrenzt. Eine andere Filtration als die Zentrifugalfiltration kann bei der vorliegenden Erfindung auch angewandt werden.
- Sogar dann, wenn die Filtriereinheit nicht verwendet wird, kann die Bestimmung des Pyrogengehalts durchgeführt werden. Jedoch können, wenn die Filtriereinheit benutzt wird, nicht adsorbierte Materialien leicht, schnell, vollständig und genau entfernt werden, und außerdem kann die Reaktion mit einem Nachweisreagens beispielsweise dem Limulus-Reagens in situ in dem Probenbecher durchgeführt werden. Entsprechend werden die Betriebseigenschaften und die Genauigkeit der Bestimmung im Vergleich zu der Bestimmung ohne Verwendung der Einheit beachtlich verbessert.
- Die Filtriereinheit vom zentrifugaltyp, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet einen Filtratbecher und einen Probenbecher, welcher entfernbar an dem Öffnungsteil des Filtratbechers mittels geeigneter Mittel, wie beispielsweise Verbundstücken, Schrauben, Klammern und ähnlichem befestigt ist. Der Probenbecher ist mit dem Filtratbecher über eine Filtriermembran verbunden. Die Form und die Größe des Filtratbechers und des Probenbechers sind nicht speziell eingeschränkt, sofern sie aus Materialien bestehen, welche bei der Bestimmung eines Pyrogengehalts nicht stören, wie beispielsweise Glas, synthetische Harze, Metall und ähnliches.
- Die Membran, welche für die Filtriereinheit vom Zentrifugiertyp verwendet wird, funktioniert so, daß sie eine Lösung in dem Probenbecher unter normalen Bedingungen zurückhält und die Lösung beim Zentrifugieren durch sie hindurchtritt. Normalerweise wird eine Ultrafiltriermembran (UF- Membran) bevorzugt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine Ultrafiltriermembran begrenzt, und jede Membran, welche wie oben beschrieben funktioniert, kann verwendet werden. Beispielsweise kann eine hydrophobe Mikrofiltriermembran (MF-Membran) benutzt werden. Als Ultrafiltriermembran kann beispielsweise eine mit einem Trenngrenzenmolekulargewicht von 10 000 bis 3 000 000 als geeignet ausgewählt werden. Wenn das Trenngrenzenmolekulargewicht zu klein ist, wird die Filtrationsgeschwindigkeit zu langsam. Andererseits wird, wenn das Trenngrenzenmolekulargewicht zu groß ist, ein Lecken verursacht. Das Material der Membran ist nicht speziell eingeschränkt, sofern es bei der Bestimmung eines Pyrogengehalts nicht stört. Beispielsweise können Ultrafiltriermembranen verwendet werden, welche aus Cellulose, Cellulosesacetat, Cellulosetriacetat, mit einem Polyelektrolyten konjugierter Cellulose, Polysulfon, Vinyl/Acryl-Copolymer, Polyethersulfon oder aus etwas ähnlichem hergestellt sind.
- Als MF-Membran kann beispielsweise eine als geeignet ausgewählt werden, welche Porenöffnungen von 0,01 bis 10 µm hat, und das Material hiervon ist nicht speziell begrenzt, wenn es nicht bei der Bestimmung eines Pyrogengehalts stört. Beispielsweise können MF-Membranen, welche aus Polytetrafluorethylen, Polyvinylidendifluorid oder ähnlichem hergestellt sind, benutzt werden. Darüber hinaus können diese Membranen auch als Doppelmembran in Kombination mit einer hydrophoben Membran verwendet werden, welche beispielsweise aus Polypropylen oder etwa ähnlichem hergestellt ist.
- Die Figuren 1 bis 3 sind jeweils schematische Querschnitte durch Beispiele der Filtriereinheit vom Zentrifugaltyp, welche bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
- Die in der Figur 1 gezeigte Einheit enthält einen Filtratbecher 1 und einen Probenbecher 2, welcher entfernbar an dem Öffnungsteil des Filtratbechers mittels Ineinandergreifens befestigt ist und am Boden des Probenbechers 2 ist eine Filtriermembran 3 so angebracht, daß die Lösung einer Probe durch die Filtriermembran 3 mittels Zentrifugierens in den Filtratbecher transportiert wird. Der Probenbecher 2 hat einen Deckel 4. Die in der Figur 2 gezeigte Einheit ist, außer daß die Filtriermembran 3 am Boden des Probenbechers geneigt ist, grundsätzlich dieselbe wie die in der Figur 1 gezeigte. Die Einheit der Figur 3 ist auch, außer daß ein Teil des Bodens des Probenbechers 2 extrudiert ist und die Filtriermembran 3 senkrecht zu der Axialrichtung angebracht ist, grundsätzlich dieselbe wie die in der Figur 1 gezeigte. Diese Filtriereinheiten vom Zentrifugiertyp sind bekannt und sind beispielsweise im Handel unter den Handelsnamen ULTRAFREE-CL (verkauft von Japan Millipore Limited), ULTRACENT (hergestellt von Toso Kabushiki Kaisha, Japan), CENTRICUT (hergestellt von Kurabo, Japan) und ähnlichen erhältlich.
- Bei dem Verfahren mit der Futriereinheit muß das Adsorptionsmittel, welches verwendet werden soll, von der Art sein, daß es in der Lage ist, ein Pyrogen im Vergleich zu gleichzeitig in einer Probe vorhandenen Materialien ein Pyrogen selektiv zu adsorbieren. Die im folgenden erläuterten Adsorptionsmittel sind typische Beispiele der bevorzugten Adsorptionsmittel. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt und ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht andere Adsorbiermittel auffinden, welche für das Verfahren mit der Filtriereinheit geeignet sind.
- Beispiele von diesen Adsorptionsmitteln schließen solche ein, welche in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 183412/1982 offenbart sind. Solch ein Adsorptionsmittel ist zusammengesetzt aus einer Stickstoff enthaltenden cyclischen Verbindung, welche an einen wasserunlöslichen Träger (Basismaterial) direkt oder mittels eines Spacers gebunden ist (im folgenden als das Adsorptionsmittel vom heterocyclischen Typ bezeichnet).
- Beispiele des Adsorptionsmittels vom heterocyclischen Typ schließen solche ein, in denen die Stickstoff enthaltende heterocvclische Verbindung durch die allgemeine Formel: dargestellt wird, worin R eine heterocyclische Gruppe mit Stickstoff als Heteroatom ist, A eine Einfachbindung, eine Alkylengruppe oder eine Alkenylengruppe ist, X ein Wasserstoffatom oder eine funktionelle Gruppe, wenn A eine Einfachbindung ist, oder eine funktionelle Gruppe ist, wenn A eine Alkylengruppe oder eine Alkenylengruppe ist, und die heterocyclische Gruppe und die Alkylengruppe können mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein,
- der wasserunlösliche Träger ein solcher ist, welcher Hydroxy, Amino, Carboxyl oder ein Halogenatom aufweist, und der Spacer eine Verbindung der Formel:
- NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;,
- NH&sub2;(CH&sub2;)nCOOH,
- NH&sub2;(CH&sub2;)nOH oder
- HOOC(CH&sub2;)nCOOH
- ist, worin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 12 ist. Beispiele der Stickstoff enthaltenden heterocyclischen Verbindung der Formel [I] schließen solche ein, in denen R eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, beispielsweise mit einem Imidazolkern, einem Pyrazolkern, einem Pyrimidinkern, einem Pyridazinkern, einem Pyrazinkern, einem Purinkern, einem Acridinkern, einem Triazolkern, einem Oxadiazolkern, einem Tetrazolkern, einem Indazolkern, einem Benzotriazolkern, einem Benzopyridazolkern, einem Benzopyrimidinkern, einem Benzohydrazinkern, einem Naphthylidinkern oder etwas ähnlichem ist, A eine Einfachbindung ist und X ein Wasserstoffatom oder eine funktionelle Gruppe, wie Amino, Hydroxy, Carboxyl oder eine ähnliche ist, oder A eine Alkylengruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Methylen, Ethylen, Propylen, Butylen, Hexylen, Octylen, Decamethylen oder Dodecamethylen oder eine Alkenylengruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Vinylen, Propenylen, Butenylen, Hexenylen oder Octenylen ist, und X eine funktionelle Gruppe, wie Amino, Hydroxy, Carboxyl oder eine ähnliche ist. Die stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe von R und die Alkylengruppe von A können gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten (beispielsweise Carboxyl, Oxo, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Hydroxy, Amino, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy usw.) substituiert sein. Bevorzugte Beispiele der stickstoffhaltigen heterocyclischen Verbindungen sind solche, der Formel [I], worin R eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe mit einem Imidazolkern, einem Pyrimidinkern, einem Purinkern oder einem Acridinkern, A eine Einfachbindung, Ethylen oder mit Carboxyl substituiertes Ethylen ist, und X Amino, carboxyl oder Hydroxy ist.
- Bei der vorliegenden Erfindung kann irgendein wasserunlöslicher Träger verwendet werden, welcher an die stickstoffhaltige heterocyclische Verbindung der allgemeinen Formel [I] direkt oder über einen Spacer gebunden ist. Beispielhafte Vertreter eines wasserunlöslichen Trägers schließen solche ein, welche Hydroxy, Amino, Carboxyl oder ein Halogenatom haben. Bevorzugte Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einem Hydroxy sind Polysaccharide, wie Cellulose, Agarose, vernetztes Dextran und ähnliche, hydroxylierte Polystyrolharze (beisielsweise ein hydroxyalkyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer usw.), Polyvinylalkohol und ähnliche ein. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit Amino sind aminoalkylierte Polysaccharide (beispielsweise aminoalkylierte Cellulose, wie Aminoethylcellulose oder Aminohexylcellulose, aminoalkylierte Agarose, wie Aminohexylagarose, p-Aminobenzylcellulose, p-Aminobenzylagarose usw.), Chitosan, aminoalkylierte Polystoyrolharze (beispielsweise aminoalkyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer usw.), Polyacrylamide, aminoalkyliertes Polyacrylamid (beispielsweise Aminoethylpolyacrylamid usw.), aminoalkyliertes poröses Glas (beispielsweise poröses Aminopropylglas usw.) und ähnliche. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit Carboxyl sind carboxylierte Polysaccharide (beispielsweise carboxyalkylierte Agarose, wie Carboxyhexylagarose oder Carboxypentylagarose, carboxyalkylierte Cellulose, wie Carboxymethylcellulose, carboxyliertes vernetztes Dextran, wie vernetztes Carboxymethyldextran usw.), carboxyalkyliertes Polyacrylamid (beispielsweise Carboxvmethylpolyacrylamid usw.), Carbonsäureharze (beispielsweise Acrylsäure-Divinylbenzol-Copolymer usw.) und ähnliche. Beispiele des wasserunlöslichen Trägers mit einem Halogenatom sind Halogenalkylpolystyrolharze (beispielsweise chlormethyliertes Styrol- Divinylbenzol-Copolymer usw.) und ähnliche.
- Bevorzugte Beispiele des oben erwähnten Adsorptionsmittels vom heterocyclischen Typ, welches bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, sind solche, welche erhalten werden, indem die stickstoffhaltige hydrocyclische Verbindung [I], wie Histidin, Histamin, Urocansäure, Uracil, Orotsäure, Cytosin, 5-Methylcytosin, 2-Amino-4,6- dimethylpyrimidin, 2-Amino-4-hydroxy-6-methylpyrimidin, Adenin oder 6,9- Diamino-2-ethoxyacridin über Alkylendiamin als Spacer an das wasserunlösliche Polysaccharid unter Verwendung mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Monoepoxid (beispielsweise Epichlorhydrin usw.) und einem aliphatischen Dialdehyd (beispielsweise Glutaraldehyd usw.) gebunden wird.
- Darüber hinaus kann bei der vorliegenden Erfindung auch ein Adsorptionsmittel, welches keines der oben beschriebenen Adsorptionsmittel vom heterocyclischen Typ ist, eingesetzt werden. Beispiele eines solchen Adsorptionsmittels schließen ein festes Adsorptionsmittel ein, welches aus einer aliphatischen stickstoffhaltigen Verbindung besteht, die an das Grundmaterial direkt oder über einen Spacer gebunden ist (im folgenden als ein Adsorptionsmittel aliphatischen Typs bezeichnet). Dies ist auch ein Beispiel der Adsorptionsmittel.
- Die Verbindung, welche das Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ bildet, hat keinen stickstoffhaltigen Heterocyclus und keine aromatische Aminogruppe, aber enthält ein aliphatisches Stickstoffatom. Normalerweise hat diese Verbindung eine funktionelle Kette, welche aus 3 bis 50 Atomen und insbesondere aus 3 bis 30 Atomen besteht. Die Anzahl der kettenbildenden Atome (Kettenlänge) ist die Anzahl von den Atomen, welche in der längsten Kette ein Glied einer kontinuierlichen Kette bilden. Beispielsweise ist im Fall der funktionellen Kette von CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub6;NH&sub2; die Kettenlänge die Summe aus der Zwischenkette (substituiertes Propylen) (3) und des Diaminohexylens (8), d.h. 11. Stickstoffatome, Sauerstoffatome (Äther) und Schwefelatome (Thioäther) werden als kettenbildende Atome zusätzlich zu den Kohlenstoffatomen gezählt.
- Das Stickstoffatom sollte an ein aliphatisches Kohlenstoffatom, beispielsweise an das Kohlenstoffatom von Methylen, gebunden sein. Als das aliphatische Stickstoffatom kann beispielsweise das Stickstoffatom von primärem Amino, sekundärem Amino, tertiärem Amino, quaternärem Ammonium, Imino oder etwas ähnlichem eingesetzt werden. Insbesondere die des primären Aminos(NH&sub2;) und des sekundären Aminos(NH) werden bevorzugt. Das aliphatische Stickstoffatom kann irgendeines der endständigen Atome einer Verbindung oder eines der intermediär stehenden Atome in einer Kette sein. Darüber hinaus kann es ein angehängtes Stickstoffatom sein, welches an ein intermediäres Atom direkt oder über andere aliphatische Kohlenstoffatome gebunden ist. Als funktionelle Kette sind solche bevorzugt, welche ein aliphatisches Stickstoffatom aus primärem oder sekundärem Amino und eine dem Stickstoffatom benachbarte Kette mit 3 oder mehr Kohlenstoffatomen enthalten. Im Fall der funktionellen Kette, welche oben beispielhaft angeführt worden ist, ist eine Hexylengruppe (und eine hydroxysubstituierte Propylengruppe) zwei aliphatischen Stickstoffatomen benachbart.
- Beispiele der funktionellen Gruppe werden im folgenden unter den Bezeichnungen A bis D gezeigt.
- Aliphatische Kette A: -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NHR¹
- Beispiele von R¹ schließen das Wasserstoffatom und die folgenden Gruppen (die Verbindung in den Klammern ist, entsprechend der Gruppe R¹, R¹NH&sub2; oder R¹OH).
- (CH&sub2;)nNH&sub2; (n = 1 bis 12) [Alkylendiamin], COCH(NH&sub2;)(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2; [Lysin], COCH(NH&sub2;)(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2; (Ornithin] ein.
- Aliphatische Kette B: -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub5;NHR²
- Beispiele von R²: (CH&sub2;)nNH&sub2; (n = 1 bis 12), (CH&sub2;)nNHC(=NH)&sub2; (n = 1 bis 12)
- Aliphatische Kette C: -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NHCOCH&sub2;CH&sub2;NHR³
- Beispiele von R³: (CH&sub2;)nNH&sub2; (n = 1 bis 12), (CH&sub2;)nNHC(=NH)&sub2; (n = 1 bis 12).
- Aliphatische Kette D: -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)nNHR
- Beispiele von R&sup4;: C(=NH)NH&sub2;, COCH(NH&sub2;) (CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;, (CH&sub2;)nNH&sub2; (n = 1 bis 12)
- Das Grundmaterial ist normalerweise ein poröses Material und im folgenden ist die Erläuterung hauptsächlich auf ein poröses Grundmaterial gerichtet. Jedoch ist das Grundmaterial hierauf nicht speziell eingeschränkt und jedes Basismaterial ist einsetzbar, welches eine für die quantitative Analyse erforderliche Adsorptionskapazität hat.
- Das poröse Grundmaterial mit einer Porengröße von 50 nm bis 1 µm wird bevorzugt. Das Grundmaterial hat eine Struktur, an welcher die aliphatische Kette mit dem Stickstoffatom, direkt oder indirekt festgemacht werden kann und Beispiele hiervon schließen ein Material rnit einer aktiven Stelle (beispielsweise aktiven Wasserstoff), welche mit einer funktionellen Gruppe, wie Hydroxy, Amino oder einer ähnlichen, reagieren kann, und andere Substanzen ein.
- Beispiele des Grundmaterials sind solche, welche dem wasserunlöslichen Träger für das Adsorptionsmittel vom heterocyclischen Typ ähnlich sind. Bevorzugte Beispiele schließen Polysaccharide (einschließlich Derivate hiervon, wie aminoalkylierte Polysaccharide, carboxyalkylierte Polysaccharide usw., Polysaccharide wie Cellulose, vernetztes Dextran, Chitosan usw.), synthetische organische Polymere (beispielsweise Polyacrylnitril, Polysulfon, Polyamid, Polyvinylalkohol, Polystyrol, Polyacrylsäure, aminoalkyliertes oder halogenalkyliertes Polystyrol, Polyacrylamid usw.) und anorganische Polymere (beispielsweise Silicagel, Aluminiumoxid, poröses Aminopropylglas, verschiedenartige Keramikerzeugnisse usw.) ein. Darüber hinaus kann ein Material auch als Grundmaterial verwendet werden, welches erhalten worden ist, indem in geeigneter Weise Hydroxy, Amino oder etwas ähnliches, welches zum Einbinden einer aliphatischen Kette in das oben erwähnte poröse Material brauchbar ist, gemäß einem üblichen Verfahren eingeführt worden ist.
- Bei der Herstellung des Adsorptionsmittels vom aliphatischen Typ schließen Beispiele der Mittel, um die aliphatische Kette mit einem aliphatischen Stickstoffatom direkt oder über einen Spacer an das oben erwähnte poröse Grundmaterial zu binden, die covalente Bindung, die ionische Bindung, die hydrophobe Wechselwirkung, die koordinative Bindung und ähnliches ein. Beispielsweise können die in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 187312/1982 beschriebenen Mittel angewandt werden. Das Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ kann beispielsweise hergestellt werden, indem das poröse Grundmaterial wie Cellulose usw. mit der Epoxyverbindung, wie Epichlorhydrin usw., aktiviert wird und dann die aliphatische Kette, welche Amino, Hydroxy, Thiol, Carboxyl oder etwas ähnliches trägt, daran angebunden wird oder indem das Grundmaterial aktiviert wird, ein geeigneter Spacer in dieses eingeführt wird und man dann mit der aliphatischen Kette reagieren läßt, welche Amino, Carboxyl, Aldehyd, Thiol oder etwas ähnliches aufweist.
- Unter den porösen Adsorptionsmitteln, welche erhalten worden sind, wie es oben beschrieben worden ist, sind die bevorzugtesten Adsorptionsmittel beispielsweise solche, welche Polysaccharid, wie Cellulose usw., als Grundmaterial verwenden und eine aliphatische Kette aufweisen, welche durch die obigen Formeln -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NHR¹ oder -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub5;NHR¹ dargestellt wird, und eine Porenöffnung von 100 bis 500 nm haben.
- Auf diese Weise kann das Verfahren mit der Filtriereinheit durchgeführt werden, indem eine Probe in dem Probenbecher der Futriereinheit mit dem Adsorptionsmittel in Kontakt gebracht wird, indem nicht adsorbiertes Material mittels Zentrifugierens abgetrennt wird, wobei es in den Filtratbecher überführt wird, indem man wahlweise das Adsorptionsmittel in dem Probenbecher wäscht und zentrifugiert, wobei die Waschflüssigkeit in den Filtratbecher überführt wird, indem der Inhalt des Filtratbechers weggegossen wird, um Substanzen, die keine Pyrogene sind, zu entfernen, und indem man das Adsorptionsmittel, an dem die Pyrogene in dem Probenbecher adsorbiert sind, mit einem Nachweisreagens, beispielsweise dem Limulus- Reagens reagieren läßt, um den Pyrogengehalt zu bestimmen.
- Normalerweise kann die Bestimmung des Pyrogengehalts schnell, leicht und genau durchgeführt werden, indem nach dem Abschluß der Limulus- Reaktion die Reaktionslösung von dem Adsorptionsmittel mittels Zentrifugierens getrennt wird, wobei sie in den Filtratbecher überführt wird, um einen quantitativen Arbeitsgang durchzuführen.
- Im folgenden wird eine detaillierte Erläuterung des quantitativen Arbeitsgangs gegeben.
- Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte die zu prüfende Probe im gelösten Zustand vorliegen, d.h. beispielsweise als Wasser enthaltende Lösung oder als wässrige Lösung, und insbesondere ist eine wässrige Lösung bevorzugt. Darüber hinaus kann, da das bei der vorliegenden Erfindung eingesetzte Adsorptionsmittel weder bei der Bestimmung mit dem Limulus-Test störende Substanzen, wie beispielsweise Aminosäuren (beispielsweise L-Cystein usw.), Antibiotika (beispielsweise Penicillin G, Streptomycin usw.), Proteindenaturierungsmittel (beispielsweise Harnstoff usw.), Serinproteaseinhibitoren (beispielsweise Diisopropylfluorphosphorsäure usw.), Saccharide (beispielsweise Glucose usw.), Zuckeralkohole, Natriumchlorid, Ringer's Lösung und ähnliche, noch Substanzen, wie Dextran, (1-3)-β-D-Glucan und ähnliche adsorbiert, die beim Limulus-Test positiv reagieren, das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch auf eine Probe angewandt werden, welche solche Substanzen enthält, welche es bisher schwierig gemacht haben, den Pyrogengehalt zu bestimmen. Zusätzlich können gemäß der vorliegenden Erfindung Endoxine, welche in einer Proteinlösung, Blutplasma oder Blutserum enthalten sind, bestimmt werden.
- Der Adsorptionsarbeitsgang wird in dem Probenbecher durchgeführt und die Betriebsbedingungen können entsprechend einer bestimmten Probe in geeigneter Weise ausgewählt werden. Normalerweise kann das Pyrogen spezifisch und effizient adsorbiert werden, indem 3 bis 270 mg, bevorzugt 7 bis 180 mg, des Adsorptionsmittels pro 1 ml der Probe verwendet werden, und die Adsorption unter Bedingungen, wie einer Temperatur von 4 bis 40 ºC, einem pH von 4 bis 8, bevorzugt von 6 bis 7, und einer lonenstärke von nicht mehr als 0,2 durchgeführt wird. Wenn der Adsorptionsarbeitsgang unter diesen Bedingungen etwa 15 Minuten lang oder länger durchgeführt wird, ist das Pyrogen in der Probe fast vollständig an dem Adsortionsmittel adsorbiert, und das Pyrogen ist auf dem Adsorptionsmittel konzentriert. Darüber hinaus kann auch eine Readsorption nach dem Abschluß der Adsorption durchgeführt werden, wodurch die Empfindlichkeit der Bestimmung weiter erhöht werden kann.
- Das Adsorptionsmittel, an dem das Pyrogen adsorbiert ist, wird von der Probe mittels eines bekannten Verfahrens getrennt und dann mit pyrogenfreiem Wasser, einer pyrogenfreien Pufferlösung oder etwas ähnlichem gewaschen, um andere Substanzen zu entfernen, die keine Pyrogene sind.
- Bei der vorliegenden Erfindung kann das so gewaschene Adsorptionsmittel, so wie es ist, dem Limulus-Test unterworfen werden.
- Im allgemeinen wird der Limulus-Test in Verfahren, die ein synthetisches Substrat anwenden und Gelierverfahren eingeteilt und die ein synthetisches Substrat anwendenden Verfahren werden je nach der besonderen Art der Substrate in kolorimetrische und fluorometrische Verfahren unterteilt. Bei der vorliegenden Erfindung kann irgendeines von ihnen angewandt werden. Beispielsweise wird das Adsorptionsmittel, an dem das Pyrogen adsorbiert worden ist, mit Limulus-Lysat und einem synthetischen Substrat, welches einen Chromophor oder einen Fluorophor enthält, bei 25 bis 40 ºC, üblicherweise bei 37 ºC, 10 bis 120 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Nach dem Abschluß der Reaktion wird die Reaktionsmischung der Kolorimetrie oder Fluorometrie unterworfen und dann wird der Pyrogengehalt in der Probe anhand einer Eichkurve bestimmt, welche getrennt hiervon gemäß derselben Weise hergestellt wird, wie sie oben beschrieben worden ist.
- Das synthetische Substrat ist nicht speziell eingeschränkt und wird in geeigneter Weise aus solchen ausgewählt, welche üblicherweise bei dieser Art von Reaktion angewandt werden.
- Im Fall der Kolorirnetrie kann die Bestimmung durchgeführt werden, indem ein synthetisches Substrat, beispielsweise Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNa oder Boc-Leu-Gly-Arg-pNa (worin Ac Acetyl, Boc t-Butoxycarbonyl und pNa p- Nitroanilin bedeuten) verwendet wird, und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen wird. Im Fall der Fluorometrie kann die Bestimmung durchgeführt werden, indem ein synthetisches Substrat, beispielsweise Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (worin Boc in derselben Weise wie oben definiert ist und MCA 7-Amino-4-methylcumarin bedeutet) verwendet wird, und indem die Fluoreszenz bei der Erregungswellenlänge von 380 nm und der Fluoreszenzwellenlänge von 460 nm gemessen wird.
- Im Fall des Gelierverfahrens wird Limulus-Lysat zu dem Adsorptionsmittel zugefügt, an dem das Pyrogen adsorbiert worden ist, und dann wird, sofort nachdem die Reaktion begonnen hat oder nachdem man bei einer niedrigen Temperatur für eine Weile hat stehen lassen, um die Reaktion voranzubringen, das Adsorptionsmittel entfernt und die Reaktion wird weiter bei 25 bis 40 ºC, üblicherweise bei 37ºC, 10 bis 120 Minuten lang fortgesetzt. Die Trübung der Reaktionslösung aufgrund des Gelierens wird über die Zeit gemessen, und dann kann die Konzentration des Pyrogens in der Probe anhand einer Eichkurve bestimmt werden, welche davon getrennt und in derselben Weise, wie es oben beschrieben ist, hergestellt wird.
- Oben ist das Verfahren unter Verwendung des Limulus-Reagens als Nachweisreagens angegeben worden. Jedoch kann, je nach der besonderen Art der Probe, der quantitative Arbeitsgang in geeigneter Weise unter Verwendung anderer verfügbarer Nachweismittel durchgeführt werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Konzentrierung des Pyrogens und die Abtrennung des Pyrogens von die Bestimmung störenden Substanzen oder Substanzen, welche bei der Bestimmungsreaktion positiv reagieren, unter Verwendung von Adsorptionsmitteln, welche eine Adsorptionsfähigkeit für Pyrogen haben, durchgeführt. Deshalb gibt es einige Fälle, in denen kein Nachweismittel erforderlich ist, welches dieselbe Wirksamkeit wie das Limulus-Reagens hat.
- Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Adsorptionsmittel kann beispielsweise gemäß derselben Weise hergestellt werden wie der, die in der obenerwähnten japanischen Offenlegungsschrift Nr. 183712/1982 beschrieben ist.
- Zum Zwecke der Erläuterung wird eine detaillierte Erklärung des PS- Verfahrens weiter unten gegeben.
- Gemäß dem PS-Verfahren kann die Bestimmung eines Pyrogengehalts durchgeführt werden, indem eine Probenlösung in Kontakt mit einem festen Adsorptionsmittel (Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ) gebracht wird, welches aus einer stickstoffhaltigen aliphatischen Verbindung besteht, die an ein Grundmaterial direkt oder über einen Spacer gebunden ist, und indem man nach der Fest-Flüssigtrennung das feste Adsorptionsmittel mit einem Reagens zum Pyrogennachweis reagieren läßt.
- Die Erläuterung des Adsorptionsmittels vom aliphatischen Typ ist bereits im Zusammenhang mit dem Verfahren mit der Filtriereinheit gegeben worden. Das Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ ist in der Lage, ein Pyrogen selektiv zu adsorbieren, und deshalb wird das Pyrogen, indem nach dem Kontaktieren mit einer Probenlösung die Fest-Flüssigtrennung (einschließlich eines Waschschritts) durchgeführt wird, von anderen Substanzen getrennt, welche in der Probenlösung enthalten sind.
- Das feste Adsorptionsmittel läßt man mit einem Reagens zum Pyrogennachweis reagieren, um den Pyrogengehalt zu bestimmen. In diesem Fall, beispielsweise, wenn der turbidimetrische Limulus-Test angewandt wird, bildet sich innerhalb einer kurzen Zeitspanne (innerhalb ungefähr 10 Sekunden) wegen der Ausfällung des festen Adsorptionsmittels eine überstehende Flüssigkeit, so daß der Lichtstrom für die Messung in dem Probierglas nicht abgesperrt wird, und deshalb kann die Gelierzeit gemessen werden, ohne daß das feste Adsorptionsmittel von der Probenlösung getrennt wird. Auf diese Weise kann das Verfahren zur Bestimmung eines Pyrogengehalts, welches Spezifität und Empfindlichkeit ebenso wie quantitative Eigenschaften hat, verwirklicht werden, indem das Adsorptionsmittel verwendet wird, welches eine geeignete selektive Adsorptionsfähigkeit und Ausfällfähigkeit hat und das in der Probenlösung enthaltene Pyrogen von den die Bestimmung störenden Substanzen und ähnlichem abtrennt. Obwohl für die auf dem Gelieren beruhende Bestimmung auch ein Inversionsverfahren bekannt ist, wird die turbidimetrische Technik bevorzugt angewandt, da sie ausgezeichnete quantitative Eigenschaften hat.
- Selbstverständlich kann auch bei dem PS-Verfahren die Filtriereinheit, wie sie oben erläutert ist, verwendet werden. Wenn die Filtriereinheit verwendet wird, können die ausgezeichneten Betriebseigenschaften bei der Fest-Flüssigtrennung (einschließlich des Waschschritts) in dem PS- Verfahren ausgenutzt werden.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Empfindlichkeit des Limulus-Tests beachtlich verbessert werden, und der Pyrogengehalt einer Probe kann auch bestimmt werden, wenn sie störende Substanzen enthält, was bisher als schwierig angesehen worden ist. Darüber hinaus können, selbst dann, wenn beim Limulus-Test positiv reagierende Substanzen, welche keine Pyrogene sind, in der Probe enthalten sind, die Abtrennung und die Bestimmung der Pyrogene leicht und genau durchgeführt werden. Außerdem ist es moglich, ein billigeres Reagens anstelle des Limulus-Reagens zu verwenden.
- Auf diese Weise ist das Verfahren für die Bestimmmung des Pyrogengehalts gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, um die Herstellungsschritte von Arzneien und ähnlichem zu überwachen.
- Die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutern bevorzugte Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung im Detail weiter.
- Zu pyrogenfreiem Wasser (2 ml) wurde eine festgelegte Menge Endotoxin EC-5 (FDA-Vergleichs-Endotoxin) zugefügt, um eine wässrige EC-5- Lösung herzustellen (Konzentration von EC-5: 0, 0,05, 0,10 oder 0,20 EE/ml; EE ist eine Endotoxineinheit).
- Diese Lösung wurde in den Probenbecher einer Filtriereinheit vom Zentrifugiertyp, wie sie in der Figur 1 gezeigt ist, gebracht, in der eine Suspension des im weiter unten beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels in Wasser [0,3 g (Feuchtgutmasse)/ml, 100 µl] enthalten war, und die Mischung wurde mit 50 r.p.m. bei 20 bis 25 ºC 60 Minuten lang unter Verwendung eines Rundmischers gerührt. Dann wurde die Mischung mit 2 300 G 15 Minuten lang zentrifugiert und der Filtratbecher wurde entfernt, um seinen Inhalt wegzugießen. Der Filtratbecher wurde zurückgestellt und eine 25 millimolare Lösung von NaCl (0,5 ml) wurde in den Probenbecher gegeben, worauf ein weiteres 10 Minuten dauerndes Zentrifugieren folgte. In derselben Weise wurde der Inhalt des Filtratbechers weggegossen und wieder wurde der Filtratbecher an dem Probenbecher befestigt. In den Probenbecher wurde pyrogenfreies Wasser (2 ml) eingebracht und die Mischung wurde 25 Minuten lang zentrifugiert und dann wurde der Inhalt des Filtratbechers weggegos sen.
- Dann wurde in den Probenbecher Limulus-Amoebenzellenlysat [hergestellt durch die Auflösung eines Glasfläschchens (für 0,2 ml, Empfindlichkeit: FDA-Vergleichs-Endotoxin EC-2 gelierte bei einer Konzentration von 0,1 ng/ml) von Limulus-Einzeltest Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) in 0,4 molarem Trishydrochloridpuffer (pH 8,0, 1,5 ml), welches 0,4 molar an Magnesiumchlorid war] (50 µl) bei 4 ºC eingebracht, und die Mischung wurde mit einem Mischer behutsam gerührt.
- Dazu wurde eine 0,6 millimolare wässrige Boc-Leu-Gly-Arg-MCA-Lösung (200 µl) als eine Substratlösung zugefügt, welche auf 70 ºC erhitzt worden war, und die Mischung wurde behutsam gemischt, und dann ließ man sie bei 37 ºC 25 bis 30 Minuten lang reagieren. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde eine 12,5-prozentige wässrige Essigsäurelösung (2,3 ml) zugefügt, um die Reaktion zu beenden. Der Filtratbecher wurde angebracht und dann wurde die Mischung mit 2 300 G 30 Minuten lang zentrifugiert.
- Dann wurde die Fluorometrie bei einer Erregungswellenlänge von 380 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 460 nm durchgeführt.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
- Die erhaltenen Daten wurden in einem Diagramm aufgetragen, worin die Ordinate die relative Intensität (RI) bei der Fluorometrie und die Abszisse die LPS-Konzentration anzeigte, um eine Eichkurve, wie sie in der Figur 4 gezeigt ist, zu erhalten.
- Wie man aus der Figur 4 ersieht, zeigt die Eichkurve eine gute lineare Beziehung. Tabelle 1 Versuch-Nr. Endotoxinkonzentration (EE/ml)
- Zu pyrogenfreiem Wasser (2 ml) wurde eine festgelegte Menge von LPS (abgeleitet von E. coli 0128: B12) zugefügt, um eine wässrige LPS-Lösung (LPS-Konzentration: 0, 5, 10, 15 oder 20 pg/ml) herzustellen. In derselben Weise wie der, die im Beispiel 1 beschrieben ist, wurde der LPS-Gehalt in der LPS-Lösung bestimmt. Als Ergebnis wurde die in der Figur 5 gezeigte Eichkurve erhalten, welche eine gute lineare Beziehung hatte. Beispiel 3
- Zu einer 2-prozentigen wässrigen L-Phenylalanin-Lösung, welche kein Endotoxin enthielt, wurde Endotoxin EC-5 (0,1 EE/ml) zugefügt. Dann wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen Eichkurve die Bestimmung des Endotoxingehalts zweimal in derselben Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wiederholt. Nach dem Abzentrifugieren von nicht adsorbierten Substanzen wurde das Adsorptionsmittel der Reihe nach mit einer 0,02 molaren NaCl-Lösung (2 ml) und Wasser (2 ml) gewaschen.
- Der Durchschnittswert der Ergebnisse bei der Bestimmung war 0,114 EE/ml (Rückgewinnung: 114 %).
- Andererseits wurde der Endotoxingehalt in der obengenannten, EC-5 enthaltenden 2-prozentigen L-Phenylalaninlösung unter Verwendung des Limulus-Reagens mit einer Gelierempfindlichkeit von 0,03 EE/ml (Reagens A) oder eines Limulus-Reagens, welches eine solche von 0,14 EE/ml hatte, (Reagens B) bestimmt. Als negative Kontrolle wurde endotoxinfreies destilliertes Wasser verwendet. Als positive Kontrolle wurde eine wässrige EC-5- Lösung, deren EC-5-Konzentration im Fall des Reagens A bei 0,033 EE/ml lag, oder eine wässrige EC-5-Lösung verwendet, deren EC-5-Konzentration im Fall des Reagens B bei 0,167 EE/ml lag. Als ein Ergebnis ergaben die Reagenzien A und B negative Ergebnisse bezüglich der negativen Kontrolle und positive Ergebnisse mit der positiven Kontrolle. Jedoch konnte der Endotoxingehalt in der Phenylalaninlösung nicht nachgewiesen werden.
- Zu einer endotoxinfreien Aminosäureernährungslösung (Amizet 10, hergestellt von Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Japan) wurde Endotoxin EC-5 (0,2 EE/ml) zugefügt und die Mischung wurde viermal mit endotoxinfreiem Wasser verdünnt. In derselben Weise wie der, die im Beispiel 3 beschrieben ist, wurde die Endotoxinbestimmung durchgeführt. Der Durchschnittswert der Ergebnisse bei der Bestimmung war 0,066 EE/ml (Wiedergewinnung: 132 %).
- Andererseits wurde auch der Endotoxingehalt unter Verwendung des Reagens A, des Reagens B, der negativen Kontrolle und der positiven Kontrolle - außer daß die Aminosäureernährungslösung mit zugesetztem Endotoxin im Fall des Reagens A sechsmal verdünnt wurde und die Lösung im Fall des Reagens B nicht verdünnt wurde - in derselben Weise wie der, die im Beispiel 3 beschrieben ist, bestimmt. Das Ergebnis war, daß der Endotoxingehalt in der Aminosäureernährungslösung nicht bestimmt werden konnte.
- Zu einer wässrigen endotoxinfreien Kaliumpenicillin-G-Lösung (50 000 E/ml) wurde Endotoxin EC-5 (0,5 EE/ml) zugefügt und die Mischung wurde zehnmal mit endotoxinfreiem Wasser verdünnt. In derselben Weise wie der, die im Beispiel 3 beschrieben ist, wurde der Endotoxingehalt bestimmt. Als Ergebnis lag der Durchschnitt der Ergebnisse der Bestimmung bei 0,062 EE/ml (Wiedergewinnung: 124 %).
- Andererseits wurde der Endotoxingehalt unter Verwendung des Reagens A, des Reagens B, der negativen Kontrolle und der positiven Kontrolle - -außer daß die Kaliumpenicillin-G-Lösung mit zugesetztem Endotoxin 15 mal im Fall des Reagens A und dreimal im Fall des Reagens B verdünnt wurde - -in derselben Weise wie der, die im Beispiel 3 beschrieben ist, bestimmt. Das Ergebnis war, daß obwohl der Endotoxingehalt in der wässrigen Kaliumpenicillin-G-Lösung im Fall des Reagens B bestimmt werden konnte, der Endotoxingehalt im Fall des Reagens A nicht bestimmt werdenkonnt.
- Zu pyrogenfreiem Wasseer (100 µl) wurde eine festgelegte Menge von Endotoxin EC-5 zugegeben, um eine wässrige EC-5 Lösung (Konzentration von EC-5: 0, 0,2 0,4 0,8 oder 1,6 EE/ml) herzustellen.
- Diese Lösung (100 µl) wurde mit einer 10-prozentigen Suspension (pH 6,0, µ = 0,02, 900 µl) des im weiter unten beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels vermischt, und die Mischung wurde in eine Filtriereinheit vom Zentrifugiertyp gebracht, wie sie in der Figur 1 gezeigt ist, worin eine Doppelmembran, welche aus einer MF-Membran (Polyvinylidendifluorid) und einer hydrophoben Membran (Polypropylen) als Filtriermembran bestand, verwendet wurde, und mit 50 r.p.m. bei Raumtemperatur 15 Minuten lang unter Verwendung eines Rundmischers gerührt. Dann wurde 5 Minuten lang mit 1 700 G zentrifugiert und der Filtratbecher wurde entfernt, um den Inhalt wegzugießen. Der Filtratbecher wurde zurückgestellt und eine endotoxinfreie 0,02 molare NaCl-Lösung (1 ml) wurde in den Probenbecher gegeben, worauf ein 20 Sekunden dauerndes Rühren mit einem Mischer und ein weiteres 5 Minuten dauerndes Zentrifugieren mit 1 700 G folgte. Der Inhalt in dem Filtratbecher wurde weggegossen und dann wurde in den Probenbecher Limulus-Amoebenzellenlysatreagens QLC-1000 (300 µl) bei 4 ºC gegeben, welches von der Daiichi Kagaku Yakuhin K.K. hergestellt wird [zubereitet, indem eine Lösung, welche durch Auflösen von Limulus- Amoebenzellenlysat (1 Glasf läschchen) in endotoxinfreiem 0,1 molarem Trishydrochloridpuffer (0,01 molar an MgCl&sub2;, pH 8,0, 1,4 ml) erhalten worden war und eine durch Auflösen von Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNa in endotoxinfreiem destilliertem Wasser (6,5 ml) erhaltene Lösung im Mischungsverhältnis 1 : 2 gemischt wurden]. Die Mischung wurde 15 Sekunden lang mittels eines Mischers gerührt und dann ließ man sie 30 Minuten lang bei 37 ºC reagieren. Zum Abschluß der Reaktion wurde 25-prozentige wässrige Essigsäurelösung (200 µl) zugefügt, um die Reaktion zu beenden. Der Filtratbecher wurde angebracht, und die Mischung wurde 5 Minuten lang mit 1 700 G zentrifugiert und dann wurde die Extinktion bei 405 nm der in den Filtratbecher überführten Reaktionslösung gemessen.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Versuch-Nr. Endotoxinkonzentration (EE/ml) Extinktion
- Die erhaltenen Daten wurden in einem Diagramm aufgetragen, worin die Koordinate die Extinktion anzeigte und die Abszisse die Endotoxinkonzentration, um die in der Figur 6 gezeigte Eichkurve zu erhalten.
- Wie man aus der Figur 6 ersieht, zeigt die Eichkurve eine gute lineare Beziehung.
- Bestimmung von Endotoxin in verschiedenenartigen
- Außer daß Endotoxin (EC-5) zu einer wässrigen Lösung von endotoxinfreiem Natriumchlorid, Glucose, Cysteinhydrochlorid, Kaliumpenicillin G bzw. β-1,3-D-Glucan und die im Beispiel 6 erhaltene Eichkurve verwendet wurde, wurde der Endotoxingehalt in derselben Weise wie der, die im Beispiel 6 beschrieben ist, bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Versuch-Nr. Probenlösung Endotoxinmenge EE/ml) Endotoxingehalt (EE/ml) molare wässrige Natriumchloridlösung 50-prozentige wässrige Glucoselösung wässrige Cystein-Hydrochloridlösung wässrige Kaliumpenicillin G-Lösung wässrige β-1,3-D-Glucanlösung
- Zu einer 5-prozentigen MSA-Lösung wurde Endotoxin (EC-5) (0 oder 0,5 EE/ml) zugefügt und, außer daß eine Adsorptionsmittelsuspension mit einem pH von 5,5 und p = 0,1 verwendet wurde, wurde der Endotoxingehalt in derselben Weise bestimmt wie der, die im Beispiel 6 beschrieben ist.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Endotoxinmenge (EE/ml) Endotoxingehalt (EE/ml)
- Außer daß die Endotoxin (EC-5)-Konzentrationenen in der Lösung bei 0, 0,05, 0,1, 0,2 bzw. 0,4 (EE/ml) lagen und die Enzymreaktion 40 Minuten dauerte, wurde in derselben Weise wie der, die im Beispiel 6 beschrieben ist, die in der Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse erhalten. Tabelle 5 Versuch-Nr. Endotoxinkonzentration (EE/ml) Extinktion
- Die Daten wurden in einem Diagramm aufgezeichnet, worin die Ordinate die Extinktion und die Abszisse die Endotoxinkonzentration anzeigte, um die in der Figur 7 gezeigte Eichkurve zu erhalten.
- Wie man aus der Figur 7 ersieht, zeigt die Eichkurve eine gute Beziehung.
- Außer daß Endotoxin (EC-5) zu einer wässrigen Lösung von endotoxinfreiem Phenylalanin, Methionin bzw. einer Aminosäureernährungslösung zugefügt wurde und die in Beispiel 7 erhaltene, oben beschriebenen Eichkurve verwendet wurde, wurde in derselben Weise wie der, die im Beispiel 7 beschrieben ist, der Endotoxingehalt bestimmt.
- Die Ergebnisses sind in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Versuch-Nr. Probenlösung Endotoxinmenge (EE/ml) Endotoxingehalt (EE/ml) 2-prozentige wässrige Phenylalaninlösung 5-prozentige wässrige Methioninlösung Aminosäureernährungslösung
- Zu pyrogenfreiem Wasser (2 ml) wurde eine festgelegte Menge Endotoxin EC-5 zugefügt, um eine wässrige EC-5-Lösung zuzubereiten (Konzentrationen des EC-5: 0,05, 0,1, 1 bzw. 10 EE/ml).
- Diese Lösung (200 µl) und eine 10-prozentige Suspension (pH 6,0, µ = 0,02, 900 µl) des im unten beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels wurden in eine Futriereinheit vom Zentrifugiertyp gebracht, worin eine doppelte Membran als Filtriermembran verwendet wurde, welche aus einer MF-Membran (Polyvinylidindifluorid) und einer hydrophoben Membran (Polypropylen) bestand, und es wurde mit 50 r.p.m. bei Raumtemperatur 15 Minuten lang unter Verwendung eines Rundmischers gerührt. Dann wurde mit 1 700 G 5 Minuten lang zentrifugiert und der Filtratbecher wurde entfernt, um seinen Inhalt wegzugießen. Dann wurden in den Probenbecher Limulus-Amoebenzellenlysat [zubereitet durch Auflösen eines Glasfläschchens mit Limulus Einzeltest Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) in endotoxinfreiem 0,1 molarem Trishydrochloridpuffer (ph 7,3, 5 ml)] (200 µl) und pyrogenfreies destilliertes Wasser (100 µl) bei 4 ºC eingebracht. Die Mischung wurde 15 Sekunden lang mittels eines Mischers gerührt und man ließ sie dann 15 Minuten lang bei 4 ºC stehen. Dann wurde das Filtrat, welches durch 5 Minuten dauerndes Zentrifugieren mit 1 700 G erhalten worden war, in ein pyrogenfreies Probierglas mit Deckel überführt und die Gelierzeit wurde mit dem Toxinometer (turbidimetrische Technik) gemessen.
- Andererseits wurde eine wässrige EC-5-Lösung mit festgelegter Konzentration (Konzentrationen des EC-5: 0,05, 0,1, 1 bzw. 10 EE/ml) zubereitet und die Gelierzeit des Filtrats wurde gemessen, welches erhalten wurde, indem die obengenannte wässrige EC-5-Lösung (200 µl) und das Limulus- Amoebenzellenlysatreagens (200 µl), wie oben beschrieben, ohne Arbeitsgang behandelt wurde, bei dem Pyrogen mittels eines Adsorptionsmittels adsorbiert wurde (übliches Verfahren).
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 gezeigt. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde fast derselbe Wert erhalten wie der, welcher mittels des üblichen Verfahrens gemessen wurde.
- Die erhaltenen Daten wurden in einem Diagramm aufgetragen, worin die Ordinate die Gelierzeit und die Abszisse die Endotoxinkonzentration angaben, wobei die in Figur 8 gezeigte Eichkurve erhalten wurde.
- Wie man aus der Figur 8 ersieht, zeigt die Eichkurve eine gute Beziehung. Tabelle 7 Versuch-Nr. Endotoxinkonzentration (EE/ml) Gelierzeit (Min.) (Anmerkung) A*: Verfahren der vorliegenden Erfindung B**: übliches Verfahren
- Zu pyrogenfreiem Wasser (PFW) wurde ein Pyrogen (hergstellt von DIFCO, gewonnen aus E. coli 0111: B4 zugegeben, um eine wässrige Pyrogenlösung mit unterschiedlichen Pyrogenkonzentrationen C&sub0; (pg/ml) herzustellen. Die Konzentration des Pyrogens wurde berechnet aus der Eichkurve, welche unter Verwendung der oben beschriebenen Pyrogenbestimmung mit dem Toxinometer (turbidimetrische Technik) hergestellt worden war.
- Ein Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ, A-1-Typ (300 mg Feuchtgutmasse) wurde in ein pyrogenfreies (PF) Probierglas mit einem Deckel gebracht, und eine wässrige Pyrogenlösung (3 ml) wurde zugefügt und die Mischung wurde sofort 15 Minuten lang mittels eines Rundmischers (25 r.p.m., 20 bis 25 ºC) gerührt. Nach dem Abschluß der Adsorptionsbehandlung wurde die Lösung mittels einer pyrogenfreien MF-Filtriereinheit filtriert. Das Adsorptionsmittel auf dem Filter wurde in einem PF-Probierglas mit einem PF-Spatel gesammelt, und zu diesem wurde pyrogenfreies Wasser zugefügt, um eine 30-prozentige Suspension zu erhalten.
- In den unteren Teil eines Probierglases für das Toxinorneter wurde eine Suspension (100 µl) eingebracht, welche man bei 4 ºC stehen ließ. Dann wurde eine LAL-Testlösung (ES-Test Wako), die bei 4 ºC gelöst worden war (100 µl), zugefügt. Nachdem die Mischung mit dem Limulus-Reagens 10 Minuten lang reagiert hatte, wurde das Probierglas in einem Brutschrank, welcher bei 37 ºC gehalten wurde, 10 Sekunden lang erwärmt und die Gelierzeit Tg (in Minuten) wurde mit dem Toxinometer gemessen. Der Pyrogengehalt, welcher auf der Grundlage der Gelierzeit bestimmt wurde, ist in der Tabelle 8 als der Wert C (pg/ml) pro 1 ml der unverdünnten Lösung zusätzlich zu C&sub0;, Tg und C/C&sub0; gezeigt.
- Als Ergebnis wird ein fast konstanter C/C&sub0;-Wert erhalten und der Logarithmus von C zeigt eine gute lineare Beziehung zu dem Logarithmus von Tg. Dementsprechend kann, wenn die Gelierzeit einer Probelösung auf dieselbe Weise gemessen wird, der Pyrogengehalt basierend auf der obigen Eichkurve bestimmt werden. Tabelle 8
- Zu Kaninchenserurn wurde Endotoxin (EC-5) (0 oder 10 EE/ml) zugefügt. Diese Lösung wurde zehnmal mit endotoxinfreiem Acetatpuffer (pH 5,5) verdünnt. Diese Lösung (100 µl) wurde mit einer 10-prozentigen Suspension (900 µl; suspendiert im selben Puffer wie oben angegeben) des im unten beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels gemischt und die Mischung wurde in eine Filtriereinheit vom Zentrifugiertyp, wie sie im Bespiel 6 beschrieben ist, gebracht und bei 4 ºC 30 Minuten lang gerührt. Dann wurde sie 5 Minuten lang mit 1 700 G zentrifugiert und der Filtratbecher wurde entfernt, um seinen Inhalt wegzugießen. Der Filtratbecher wurde zurückgestellt und endotoxinfreie 0,02 molare NaCl-Lösung (1 ml) wurde in den Probenbecher gebracht, worauf ein 20 Sekunden dauerndes Rühren mit einem Mischer und ein weiteres 5 Minuten dauerndes Zentrifugieren mit 1 700 G folgte. Der Inhalt in dem Filtratbecher wurde weggegossen und der Probenbecher wurde 10 Minuten lang auf 70 ºC erhitzt. Dann wurde Limulus-Amoebenzellenlysatreagens (dasselbe wie in Beispiel 6, 300 µl) bei 4 ºC in den Probenbecher gegeben. Die Mischung wurde 15 Sekunden lang gerührt und dann ließ man sie bei 37ºC 30 Minuten lang reagieren. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde eine 25-prozentige wässrige Essigsäurelösung (200 µl) zugefügt, um die Reaktion zu beenden. Der Filtratbecher wurde angebracht, und die Mischung wurde 5 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde die Extinktion der in den Filtratbecher überführten Reaktionslösung bei 405 nm gemessen und der Endotoxingehalt im Kaninchenserum wurde unter Verwendung einer Eichkurve (gezeigt in der Figur 9) berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 gezeigt.
- Gleichzeitig wurde, außer daß pyrogenfreies destilliertes Wasser anstelle von Kaninchenserum verwendet wurde und die Hitzebehandlung bei 70 ºC nicht durchgeführt wurde, die Eichkurve in derselben Weise erhalten, wie es oben beschrieben ist. Tabelle 9 Endotoxinmenge (EE/ml) Endotoxingehalt (EE/ml)
- Zu menschlichem Plasma wurde Endotoxin (EC-5) (0 oder 1 EE/ml) zugefügt. Diese Lösung wurde 40 mal mit endotoxinfreiem destilliertem Wasser verdünnt. Diese Lösung (400 µl) wurde in eine Filtriereinheit vom Zentrifugiertyp gegeben, wie sie im Beispiel 6 beschrieben ist, und bei 65 ºC zwei Stunden lang erhitzt. Dann wurde zu dieser Lösung eine 15-prozentige Suspension (600 µl; suspendiert in endotoxinfreiem Acetatpuffer (pH 5,5)) des im unten beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Adsorptionsmittels zugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt. Dann wurde sie 5 Minuten lang zentrifugiert und der Filtratbecher wurde entfernt, um seinen Inhalt wegzugießen. Der Filtratbecher wurde zurückgestellt und eine endotoxinfreie 0,02 molare NaCl-Lösung (1 ml) wurde in den Probenbecher gegeben, worauf ein 20 Sekunden dauerndes Rühren und ein weiteres, 5 Minuten dauerndes Zentrifugieren folgte. Der Inhalt des Filtratbechers wurde weggegossen und dann wurde Limulus- Amoebenzellenlysatreagens (dasselbe wie im Beispiel 6, 300 µl) bei 4 ºC in den Probenbecher gegeben. Die Mischung wurde gerührt und dann ließ man sie 40 Minuten lang bei 37ºC reagieren. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in derselben Weise wie der, die im Beispiel 19 beschrieben ist, behandelt und die Extinktion der Reaktionslösung wurde bei 405 nm gemessen. Der Endotoxingehalt im menschlichen Plasma wurde unter Verwendung einer Eichkurve (gezeigt in der Figur 10) berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 gezeigt.
- Gleichzeitig wurde - außer daß pyrogenfreies destilliertes Wasser anstelle des menschlichen Plasmas verwendet wurde und die Hitzebehandlung bei 65 ºC nicht durchgeführt wurde - die Eichkurve in derselben Weise erhalten, wie es oben beschrieben ist. Tabelle 10 Endotoxinmenge (EE/ml) Endotoxingehalt (EE/ml)
- (1) Sepharose CL-4B (Handelsname eines Agarosederivats, das von Pharmacia Fine Chemicals hergestellt wird, 350 g Feuchtgutmasse) wurde in destilliertem Wasser (500 ml) suspendiert. 2 normales wässriges Natriumhydroxid (200 ml) und Epichlorhydrin (50 ml) wurden zugefügt, und die Mischung wurde bei 40 ºC 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um mit Epichlorhydrin aktivierte Sepharose CL-4B zu erhalten. Die so erhaltene mit Epichlorhydrin aktivierte Sepharose CL-4B wurde in einer 0,6-prozentigen wässrigen Lösung von Hexamethylendiamin (1,4 Liter) suspendiert, auf 60 ºC erhitzt, und die Suspension wurde bei 60 ºC 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxy-propyliertes Sepharose CL-4B (370 g Feuchtgutmasse) zu erhalten. Als der Aminohexylgehalt der erhaltenen Sepharose mittels Titration gemessen wurde, lag er bei 37,6 µMol/g (Feuchtgutmasse).
- (2) 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxy-propylierte Sepharose CL-4B (370 g Feuchtgutmasse) wurde in 4 normalem wässrigen Natriumhydroxid (700 ml) suspendiert. Epichlorhydrin (700 ml) wurde zu der Suspension bei 65 ºC zugefügt, und die Mischung wurde gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde Wasser zu der Mischung zugefügt, um auf 50 ºC oder weniger abzukühlen. Dann wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei mit Epichlorhydrin aktivierte 3-(6- aminohexylamino)-2-hydroxy-propylierte Sepharose CL-4B erhalten wurde. Diese wurde in einer 20-prozentigen wässrigen Lösung von Histidinhydrochloridhydrat (eingestellt auf einen pH von 12 mit einem wässrigen Natriumhydroxid, 2,1 Liter) suspendiert, auf 90 ºC erhitzt und die Mischung wurde bei 80 bis 90 ºC 30 Minuten lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser (1 Liter) suspendiert und bei 120 ºC 20 Minuten lang einer Behandlung im Autoklaven unterworfen und dann filtriert. Der Rückstand wurde gründlich der Reihe nach mit 0,2 normaler wässriger Salzsäure, 0,2 normalem wässrigen Nartriumhydroxid, 1,5 normalem wässrigen Natriumchlorid und destilliertem Wasser gewaschen. Auf diese Weise wurde ein wasserlösliches Adsorptionsmittel erhalten, welches Agarose als Träger, Histidin als einen Liganden und Hexamethylendiamin als ein Spacerzentrum (390 g Feuchgutmasse) enthielt. Der Histidingehalt pro 1 g (Feuchtstoffmasse) des Absorptionsmittels lag bei 20,4 µMol.
- Außer daß Cellulofine GCL-2000-m (Handelsname eines Cellulosederivats, das von Chisso Co., Ltd., Japan hergestellt wird, 350 g) anstelle von Sepharose CL-4B eingesetzt wurde, wurde in derselben Weise wie der, die im Vergleichsbeispiel 1 beschrieben ist, ein Adsorptionsmittel erhalten. Das erhaltene Adsorptionsmittel war ein wasserunlösliches Adsorptionsmittel, welches Cellulose als Träger, Histidin als einen Liganden und Hexamethylendiamin als ein Spacerzentrum (340 g, Feuchtstoffmasse) enthielt. Der Histidingehalt pro 1 g (Feuchtstoffmasse) des Adsorptionsmittels lag bei 58 pmol.
- 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxy-propylierte Sepharose CL-4B (18 g, Feuchtstoffmasse), welche in derselben Weise wie der, die im Vergleichsbeispiel 1 (1) beschrieben ist, hergestellt worden war, wurde in 0,05 molarem Phosphatpuffer (pH 7,0, 45,6 ml) suspendiert. Zu der Suspension wurde eine 25-prozentige wässrige Glutaraldehydlösung (19,2 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde gründlich mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, um mit Glutaraldehyd aktivierte 3-(6-Aminohexylamino)-2-hydroxy-propylierte Sepharose CL-4B zu erhalten. Diese wurde in 0,1 molarem an Histamin 15 millimorem Phosphatpuffer (pH 7,0, 59,6 ml) suspendiert und die Suspension wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung futriert und der Rückstand wurde mit einer 1 molaren wässrigen Lösung von Natriumchlorid (600 ml) gewaschen. Der Rückstand wurde in 0,1 molarem Phosphatpuffer (pH 7,0, 30 ml) suspendiert. Zu der Suspension wurde Natriumborhydrid (0,3 g) zugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurde die Mischung filtriert und der Rückstand wurde gründlich der Reihe nach mit einer 1 molaren wässrigen Natriumchloridlösung und destilliertem Wasser gewaschen. Auf diese Weise wurde ein wasserunlösliches Adsorptionsmittel erhalten, welches Agarose als Träger, Histamin als einen Liganden und Hexamethylendiamin als ein Spacerzentrum (20,7 g Feuchtgutmasse) enthielt. Der Histamingehalt pro 1 g (Feuchtgutmasse) des Absorptionsmittels lag bei 4,1 µMol.
- Kügelchen einen porösen Cellulosegelträgers (a) (50 g Feuchtgutmasse) wurden nach dem Waschen mit Wasser und der Dispersion in einer 0,6 normalen wässrigen Natriumhydroxidlösung (110 ml) mittels Filtration unter vermindertem Druck entwässert. Zu der Mischung wurde Epichlorhydrin (16 ml) zugefügt und man ließ 30 Minuten lang bei 60 ºC reagieren. Zu dem mit Epoxid aktivierten Zwischenprodukt (b), welches filtriert und mit Wasser gewaschen worden war, wurde eine Ligandenlösung zugefügt, und man ließ die Mischung bei 70 ºC eine Stunde lang reagieren. Die Ligandenlösung wurde hergestellt, indem 65-prozentiges Hexamethylendiamin (4 ml) in Wasser (100 ml) aufgelöst wurde. Die Reaktionslösung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen, mittels Salzsäure auf einen pH von 10,4 eingestellt, mit Wasser gewaschen und dann entwässert, wobei ungefähr 55 g eines feuchten Adsorptionsmittels (c) vom A-Typ erhalten wurde (siehe die Tabelle 11). Tabelle 11 g (Feuchtgutmasse) /g (Trockengewicht) Hexamethylendiamingehalt Trockengewicht (Elementaranalyse)
- Dieses Trennmittel (Adsorptionsmittel) hat CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub6;NH&sub2; (Kettenlänge: 11) als seine wichtigste funktionelle Kette.
- In derselben Weise kann ein Trennmittel erhalten werden, welches einen Hexamethylendiarningehalt von 50 bis 600 hat, indem die Reaktionsbedingungen geändert werden. Es wird angenommen, daß das Trennmittel, welches erhalten wird, indem die Reaktionsbedingungen geändert werden, sowohl CH&sub2;CH(OH) CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub6;NHCH&sub2;CH(OH)CH&sub2; (Kettenlänge: 14) als auch CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub6;NH&sub2; (Kettenlänge: 11) als die wichtigste funktionelle Kette haben kann.
- Dieser wird erhalten durch eine Kondensationsreaktion des Adsorptionsmittels des A-1-Typ mit Lysin.
- CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH(CH&sub2;)&sub6;NHCOCH(NH&sub2;) (CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;
- Dieser wird erhalten, indem ein poröses Cellulosegel als Grundmaterial verwendet wird und hierzu Epichlorhydrin und Ammoniak zugefügt wird. Das erhaltene Produkt hat CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH&sub2; und CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NHCH&sub2;(OH)CH&sub2; als funktionelle Ketten und liegt in der Form von Kügelchen vor, welche einen Teilchendurchmesser von ungefähr 50 bis 200 µm haben und die Größe der größten Pore liegt bei etwa 100 bis 500 nm.
- Dieser wird erhalten mittels einer Kondensationsreaktion des Adsorptionsmittels vom B-1-Typ mit Lysin.
- Funktionelle Kette: CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NHCOCH(NH&sub2;) (CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;
Claims (10)
1. Ein Verfahren zur Bestimmung des Pyrogengehalts einer flüssigen
Probe, bei der eine Filtriereinheit verwendet wird, die einen
Filtratbecher und einen Probenbecher, welcher entfembar am offenen Teil des
Futratbechers befestigt ist, wobei der genannte Probenbecher mit dem
Filtratbecher über eine Filtrationsmembram verbunden ist, und wobei das
Verfahren die Schritte einschließt:
die flüssige Probe in dem Probenbecher mit einem festen
Adsorptionsmittel in Berührung bringen, welches in der Lage ist, selektiv Pyrogen zu
adsorbieren,
das nichtadsorbierte Material durch die Filtriermembran unter
solchen Bedingungen, daß die Permeation durch die Membran beschleunigt wird,
filtrieren, um das nicht adsorbierte Material in den Filtratbecher
wegzutransportieren und
das an dem in dem Probenbecher zurückgehaltenen Adsorptionsmittel
adsorbierten Pyrgon mit einem Nachweismittel zur Reaktion bringen, um
seinen Pyrogengehalt zu bestimmen.
2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem nach dem Abschluß der
Reaktion mit Limulus-Lysat als Nachweisreagens in Gegenwart einen
synthetischen Substrats das Adsorptionsmittel von der Reaktionslösung durch die
Filtriermembran mittels Zentrifugierens getrennt wird, um die
Reaktionslösung in den Filtratbecher zu überführen und den Pyrogengehalt der
Reaktionslösung zu bestimmen.
3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Filtriermembran eine
Ultrafiltriermembran mit einem Trenngrenzenmolekulargewicht von 10 000 bis
3 000 000 oder eine Mikrofiltriermembran mit einer Porenöffnung von 0,01
bis 10 µm
ist.
4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Adsorptionsmittel
ein Adsorptionsmittel vom heterocyclischen Typ ist, welches aus einer
stickstoffhaltigen cyclischen Verbindung der Formel
R-A-X
besteht, worin R eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe ist, A eine
Einfachbindung, eine Alkylengruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder
eine Alkenylengruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen ist und X Wasserstoff,
Amino, Hydroxy oder Carboxyl, wenn A eine Einfachbindung ist oder X Amino,
Hydroxy oder Carboxyl ist, wenn A eine Alkylen- oder Alkenylengruppe ist,
wobei die genannte heterocyclische Gruppe und die Alkylengruppe wahlweise
mit einem oder mehreren Gruppen substituiert sind, welche aus Carboxyl,
Oxo, einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Amino und
einer Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, und
einem wasserunlöslichen Träger besteht, welcher Hydroxy,
Aminocarboxyl oder ein Halogenatom aufweist,
wobei die stickstoffhaltige cyclische Verbindung mit dem
wasserunlöslichen Träger direkt oder über eine Spacerverbindung verbunden ist,
welche aus:
NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)nCOOH,
NH&sub2;(CH&sub2;)nOH und
HOOC(CH&sub2;)nCOOH
ausgewählt ist, worin n eine ganze Zahlen zwischen 1 und 12 ist.
5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die stickstoffhaltige
heterocyclische Gruppe ein Imidazolkern, ein Pyrazolkern, Pyrimidinkern, ein
Pyridazinkern, ein Pyrazinkern, ein Purinkern, ein Acridinkern, ein
Triazolkern, ein Oxadiazolkern, ein Tetrazolkern, ein Indazolkern, ein
Benzotriazolkern, ein Benzopyridazinkern, ein Benzopyrimidinkern, ein
Benzopyrazinkern oder ein Naphthylizinkern ist.
6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Adsorptionsmittel ein
Adsorptionsmittel vom aliphatischen Typ ist, welches aus einer
aliphatischen Stickstoff enthaltenden Verbindung besteht, welche eine funktionelle
Kette 3 bis 50 kettenbildenden Atomen aber keine stickstoffhaltige
heterocyclische oder aromatische Aminogruppe enthält, worin das genannte
aliphatische Stickstoffatom dasjenige aus primärem Amino, sekundärem
Amino, tenärem Amino, quaternärem Ammonium oder Imino ist und an ein
aliphatisches Kohlenstoffatom gebunden ist, und
einem porösen Grundmaterial besteht, welches eine Porengröße von 50
nm bis 1 µm hat,
wobei die genannte aliphatischen Stickstoff enthaltende Verbindung
an dieses Grundmaterial direkt oder über eine Spacerverbindung gebunden
ist, welche aus
NH&sub2;(CH&sub2;)nNH&sub2;
NH&sub2;(CH&sub2;)nCOOH,
NH&sub2;(CH&sub2;)nOH und
HOOC(CH&sub2;)nCOOH
ausgewählt ist, worin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 12 ist.
7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der genannte Schritt des
Abfilterns des nicht adsorbierten Materials durch die Filtriermembran
durchgeführt wird, in dem die Filtriereinheit zentrifugiert wird.
8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Probe mit dem
Adsorptionsmittel mindestens 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 4 bis 40
ºC, einem pH von 4 bis 8 und einer lonenstärke von nicht höher als 0,2 in
Kontakt gebracht wird.
9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Reaktion bei einer
Temperatur von 25 bis 40 ºC 10 bis 120 Minuten lang durchgeführt wird.
10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das synthetische
Substrat Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNa, Boc-Leu-Gly-Arg-pNa oder Boc-Leu-Gly-Arg-
MCA ist, wobei Ac Acetyl ist, Boc t-Butoxycarbonyl ist, pNa ein p-
Nitranilin ist und MCA 7-Amino-4-methylcumarin ist.
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