JPH0472571A - パイロジェンの定量法 - Google Patents

パイロジェンの定量法

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JPH0472571A
JPH0472571A JP2337562A JP33756290A JPH0472571A JP H0472571 A JPH0472571 A JP H0472571A JP 2337562 A JP2337562 A JP 2337562A JP 33756290 A JP33756290 A JP 33756290A JP H0472571 A JPH0472571 A JP H0472571A
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Tetsuya Tosa
土佐　哲也
Tadashi Sato
忠志 佐藤
Taizo Watanabe
泰三 渡辺
Satoshi Minobe
美濃部　敏
Masahiro Nawata
縄田　雅裕
Shinji Nagamatsu
信二 永松
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Tanabe Seiyaku Co Ltd
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Tanabe Seiyaku Co Ltd
Daicel Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はパイロジエンの定量法、ざるに詳しくは、定量
阻害物質等の存在により、従来、定量か困難であった検
体にも適用できる定量感度の優れた、かつ、操作性に優
れ１：パイロジェンの定量法に関する。
従来の技術および課題 パイロジエン（発熱物Ｗ）は極微量で恒温動物の体？里
を異常に上昇させる物質であり、例えば、静脈注射等の
薬剤に混入して人体に入ると、薬剤の主作用とは別に強
い発熱を惹き起こし、過変にこの作用が起こると悪寒戦
慄を伴う発熱や、時にはノヨノク死に至ると言われてい
る。パイロジェンとしては、細菌性物質、炎症性物質、
植物多糖体または血液型物質等か知ろれてお一つ、これ
らの中でＲも発熱に関与する物質は細菌性のもので、細
菌毒素と称されている３細菌毒素は、一般二、外毒素（
Ｅｘｏｔｏｘｉｎ）および内毒素（Ｅｎｄｏｔｏｘ　ｉ
ｎ）に大別され、このうち、ダラム陰性菌の細胞壁＋７
７脂質多糖体（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
：　Ｌ　Ｐ　Ｓ）を王とするいわゆる○抗原としての内
毒素か最も発熱性が強力であるとされている。
従って、パイロジエンの検出、定量は、例えば、薬剤製
造におけるパイロジエンの混入防止等かる非常に重要で
ある。
従来、パイロジエンの検出、定量方法としては、ウサギ
を用いた発熱試験やカブトガニ血球抽出物を用いたリム
ルステスト等が知られているが、感度、簡便さ、定量性
等の観点からリムルステストかよく用いられている。
しかしながら、リムルステストは定量時に共存する種々
の物質により阻害や活性化を受け、複雑な前処理を必要
としたり、検体によって：丈定量か困難な場合かある。
また、パイロ７エン以外にもリムルステストで陽性を示
す物質かあり、正確な定量を妨げる場合かある。これを
解消するために、高度に精製した試薬の使用が提案され
ているか、試薬か非常に高価になる問題かある。さらに
、溶解度の低い物質に微量含まれるパイロジェンの定量
は困難とされている。
近年、パイロジエンの１種である内毒素の検出に、酸処
理によりパイロジエンフリーとした活性炭を検体と接触
させ、この活性炭をリムルス・ライセートと反応させて
簡便、迅速にリムルステストを行なう方法が提案されて
いる（特開昭５６−１５２４２５号）。しかしながら、
この方法はパイロジエンに対する特異性、感度、定量性
の点て十分なものとはいいがたい。また、米国特許第４
４９１６６０号には、内毒素を吸着するある種のポリマ
ーが内毒素の濃縮と検出に利用できることが開示されて
いる。しかしながら、このボ１ツマ−もパイロジエンに
対する特異性、感度、定量性の、占、て十分ｔものとは
いいがたい。
本願発明：よ、定量阻害物質等の存在のために従来のリ
ムルステストでは定量が困難であった検体にも適用でき
、パイロジエンに対する特異性、定を感度、定量性の優
れたパイロジエン定ｌ法を提供することを課題とする。
本発明者らは、種々研究を重ねた結果パイロジエン吸着
能を有する吸着体と、遠心分離型濾過ユニ。
トを用いることにより、リムルステストによるパイロジ
エンの定量を簡便に、かつ、操作性よく、阻害物質や池
のリムルステスト陽性物質の存在下でも特異的に、非常
に高−度で行なえることを知り、本発明を完成するに至
った。また、特定の固体吸着体を用いることにより、活
性炭等の吸着体を用いる先行技術の問題点を解決するパ
イロジエンの定量法を実現した。
課題を解決するための手段 課題を解決する手段の一つは、濾過ユニットを用いる発
明（濾過ユニ、ト法）である。この発明は、遠心分離に
よる濾過用の、濾液カップと、その開口部に着脱可能に
取１月寸けられた検体カップとからなり、検体カップか
濾液カップと濾過膜を介して連絡している遠心分離型濾
過ユニットを用い、該検体カップ内で、パイロジェノ吸
着能を有する吸着体と検体とを接触させ、ついで、透過
促進条件下、濾過膜を通して非吸着物を濾液カップに分
離、除去した後、検体カップ内で、その中に保持された
吸着体に吸着されたパイロジェンを検出試薬と反応させ
て定！することを特徴とするパイロジエンの定量法を提
供するものである。
本願はまた、特定の吸着体を用いて検体溶液中のバイロ
ンエンと接触させ、固液分離後の吸着体に検出試薬を作
用させて定量するパイロジェンの定量法（ＰＳ定量法）
をも提供する。
濾過ユニツト法において、通常の場合、ドライビングフ
ォースとして遠心力を用いて透過を促進させる（遠心濾
過）が、例えば、圧力（加圧濾過、減圧濾過）等遠心力
以外のドライビングフォースを用いて透過を促進させて
もよい。また、疎水性膜て検体溶液を保持して吸着体と
接触させた後、アルコール等を添加して透過を促進させ
ることもてきる。
本発明における「遠心分離型濾過ユニット」および「遠
心分離による濾過層の・・・　（中略）・・、カップ」
なる表現は、これらの装置が遠心分離用に適合している
ことを示すものであって、本発明の実施にあたって、こ
れらの装置が遠心濾過以外の方式の濾過に用いられる可
能性を排除するものではない。
該濾過ユニ、トを用いなくてもパイロジエンの定量は可
能であるが、かかるユニットを用いることにより、非吸
着物の除去が簡便、迅速に、かつ、完全、正確に行え、
しかも、検体カップ内でそのまま検出試薬、例えば、リ
ムルス試薬との反応が行なえるので、ユニットを用いな
い場合に比べ、操作性および定量精度か著しく向上する
。
本発明で用いる遠心分離型濾過ユニｙ）は、濾液カップ
と、その開口部に着脱可能な手段、例えば、すり合わせ
、クランプ、ねじ込み等により取す付けられた検体カッ
プとからなり、検体カップと濾液カップが濾過膜を介し
て連絡しているものてあり、濾液カップおよび検体カッ
プはパイジンエンの定量に支障を来さない材質、例えば
、カラス、合成樹脂、金属等のものであれば、その形状
、サイズ等は特に限定するものではｔい。
遠心分離型濾過ユニ、トに用いる膜は、平常時は液を検
体カップ内に保持し、遠心分離に際して液を透過させる
性能を有する膜であり、通常の場合、限外濾過膜（ＵＦ
膜）か好適であるか、上記の性能を有する膜であれば限
外濾過膜に限定されるものではなく、例えば、疎水性の
精密濾過膜（ＭＦ膜）をも使用することかできる。限外
濾過膜は分画分子量が１万〜３００万のものを適宜選択
できる。分画分子量が余り小さいと、ｔ！過速度が遅く
なりすぎ、また、大き過ぎると液漏れが生じる。その材
質は、バイロンエンの定量に支障を来さないものであれ
ば特に限定するものではなく、例えば、セルロース、セ
ルロースアセテート、セルローストリアセテート、ポリ
エレクトロライト複合体セルロース、ポリスルホン、ビ
ニル／アクノル共重合体、ポリエーテルスルホノ等の限
外濾過膜を用いることができる。
＼ＴＦ膜としては、例えば、孔径０．０１−１０μ２の
ものを適宜選択でき、その材質は、パイロジエンの定量
に支障をきたさないものであれば特に限定するものでは
なく、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニ
リデンジフルオライド等のＭＦ膜を用いることができる
。また、これらの膜は、例えば、ポリプロピレン等の疎
水性膜と組み合わせた二重膜として用いることもできる
。
添付の第１図〜第３図に、用いる遠心分離型濾過ユニッ
トの具体例の模式的断面図を示す。
第１図に示すユニ・ノドは、濾液カップ１と、その開口
部に嵌合により着脱可能に取り付けられた検体カップ２
からなり、検体カップ２の底部には濾過膜３があり、検
体カップ内の液が遠心分離により濾過膜３を通り、濾液
カップに移行できるようになっている。検体カップ２は
Ｍ４を有している。第２図に示すユニットは、基本的に
第１図のユニットと同様であるが、濾過膜３は検体カッ
プ２の底部に傾斜して設けられている。第３図のユニッ
トも基本的に第１図のものと同様であるか、検体カップ
２の底部に一部が突出し、濾過膜３か軸方向に垂直に設
けられている。このような遠心分離型濾過ユニットは公
知であり、例えば、ウルトラフリーＣＬ（日本ミリポア
・リミテッドより販売）、ＵＬＴＲＡＣＥＮＴ　（東ソ
ー社製）、セントシカノド（クラポウ製）等として商業
的に入手できる。
濾過ユニット法においては、用いる吸着体は検体中の共
存物質との対比においてパイロジエンを選択的に吸着す
る能力を有するものであればよい。
次に説明する吸着体は好ましい吸着体の代表例であるが
、特にこれに限定されない。当業者が検討すれば、その
他にも濾過ユニット法を実施する為に好適な吸着体を見
出し得るであろう。
このような吸着体の具体例としては、例えば特開昭５７
−１８３４１２号に開示されているものがあげられる。
これは、含窒素環式化合物が水不溶性担体（基材）に直
接またはスペーサーを介して結合してなる吸着体く以下
、複素環型吸着体と称する）である。複素環型吸着体に
おいては、含窒素環式化合物か、一般式 Ｒ−Ａ−Ｘ　　　　　−＋、。
（式中、Ｒは異種原子として窒素原子を持つ複素環式基
を表し、Ａは単結合手、アルキレン基ま１こはアルケニ
レン基を表り、ＸはＡか単結合手のときは水素原子また
は官能基を表し、Ａかアルキレン基またはアルケニレン
基のときは官能基を表し、該複素環式基およびアルキレ
ン基は置換基を有していてもよい。） て示される化合物であり、水不溶性担体か水酸基、アミ
７基、カルホキシル基またはハロゲン原子を有する水不
溶性担体てあり、スペーサーが、式％式％） （各式中、口は１〜１２の整数を表す。）て示される化
合物等である。
ここて、含窒素複素環式化合物ＨＩｌの例としては、例
えば、記号Ｒかイミタノール骨格、ピラゾール骨格、ビ
リミ／ン骨格、ビリタ／ノ骨格、ピラノン骨格、プリン
骨格、アクリノン骨格、トｊアゾール骨格、オキサ／ア
ゾール骨格、テトラソール骨格、イノタソール骨格、ヘ
ン′ノドリアゾール骨格、ヘン／ピリタ７ノ骨格、ヘン
ソビリミノン骨格、ヘンゾピラジン骨格、ナフチリジン
骨格なとを有する含窒素複素環式基であり、記号Ａか単
結合手であって、記号Ｘか水素原子またはアミ７基、水
素基またはカルホキ／基等の官能基であるか、あるいは
記号Ａかメチレン基、エチレン基、プロピレン基、メチ
レン基、ヘキル７基、オクチレン基、デカメチレン基、
ドテカメチレン基のごとき炭素数１〜１２のアルキレン
基であるか、マタはビニレン基、プロペニレン基、ブテ
ニレノ基、ヘキセニレン基、オクテニレン基のコトき炭
素数２〜１２のアルケニレン基てあって、Ｘがアミノ基
、水酸基またはカルホキシル基ｔとの官能基である化合
物か挙げられる。なお、記号Ｒて示さイｚる含窒素複素
環式基および記号、八て示されるアルキレン基、二は置
換基（１ヂ１えニジ゛、カルホキシル基、オキソ基、ア
ル牛）［基、水酸基、アミン基、アルコキノ基ンを宵り
でいでもよい。上記のごとき含窒素複素環式化合物のう
ち好ましい例としては、一般式７Ｉ−１こおいで記号Ｒ
かイミタノール骨格、ビリミ／ン骨格、プリン骨格また
はアク１ノジン骨格を有する含窒素複素環式基であり、
Ａか単結合手、エチレン基、カルホ牛／ル置換エチレン
基であり、Ｘかアミ７基、カルホキシル基または水酸基
である化合物が挙げられる。
該水不溶性担体としては、前記一般式ｆｉＥで示される
含窒素複素環式化合物を直接または間隔子（スペーサー
）を介して結合しうるちのであればいずれでもよい。か
かる水不溶性担体の代表的な例としては、水酸基、アミ
７基、カルホキシル基またはハロゲン原子を有する水不
溶性担体が挙げられる。これろのうち、水酸基を有する
水不溶性担体としては、例えば、セルロース、アガロー
ス、架橋テキストランなどの多糖類あるいはヒドロキノ
アルキル化ポリス千レノ樹脂（例えば、ヒドロ牛ノアル
キル化さ４−したスチレン・／ビニルヘンセン共重合（
本）、ポリビニルアルコールｔとか好適に挙げられる。
アミノ基を有する水不溶性担体としては、例えば、アミ
ノアルキル化多糖類（例えば、アミ／エチルセルロース
、アミ／エチルセルロースのごときアミノアルキル化セ
ルロース、アミ／エチルセルロースのごときアミノアル
キル化７カロース、ｐ−アミンヘンシルセルロース、ｐ
−アミノヘノンルアカニース）、キトサン、アミノアル
キル化ポリスチレン樹脂（例えば、アミ／アル牛ル化さ
れたスチレン・ジビニルヘンゼン共重合体）、ポリアク
リルアミド、アミ／アルキル化ポリアクリルアミド（例
えば、アミノエチルポリアクリルアミド）、アミノアル
キル化多孔性ガラス（例えば、アミ／プロピル多孔性ガ
ラス）なとが挙げられる。また、カルホキ／基を有する
水不溶性担体としては、例えば、カルナキ７アルキル化
多糖類（例えば、カルホキ／へキ／ルアガロース、カル
ホキ／ペンチルアカロースのごときカルボ牛／アル牛ル
化アカロース、カルホキ／メチルセルロースのこ゛とき
カルホ牛ンアルキル化セルロース、カルホ牛／メチル架
嬌テキストランのごときカルホキジアルキル化架橋テキ
ストラン）、カルボキシアルキル化ポリアクリルアミド
（例えば、カルホキ／メチルポリアクリルアミド）、カ
ルホン酸樹脂（例えば、アクリル酸、ジビニルヘンゼン
共重合体）などが挙げられる。
さらに、ハロゲン原子を有する水不溶性担体としては、
例えば、ハロゲノアル牛ルボリステレン樹脂（例えば、
クロロメチル化されたスチレン・ジピニルヘンゼン共重
合体）などが挙げられる。
上記複素環型吸着体のうち好ましいものとしては、例え
ば、前記のごとき含窒素複素環式化合物［１］のうちヒ
スチジン、ヒスタミン、ウロカニン酸、ウラノル　オロ
チン酸、ントシン、５−メチルシトシン、２−アミ７−
４，６−シメチルピリミジン、２−アミノ−４−ヒドロ
キ／−６−メチルピリミジン、アテニンまたは６．９−
ジアミノ−２−エト牛ンアクリジンと水不溶性多糖類と
をモノエヂ牛／ド（例えば、エビクロロヒドリノ等）お
よび脂肪族／アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド
）のうち少ｔくともいずれか一方を用いる方法によりス
ペーサーとしてアルキレンンアミンを介して結合せしめ
た吸着体か挙げられる。
また、本発明においては、上記の如き複素環型吸着体以
外の吸着体を使用することもてきる。このような吸着体
としては、例えば、脂肪族窒素原子を含む化合物と基材
とか直接またはスペーサーを介して結合してなる固体吸
着体（以下、脂肪族型吸着体と称する）を挙げることか
できる。これも吸着体の一例である。
脂肪族型吸着体を構成する化合物は、含窒素複素環や芳
香族アミ７基を持たず、脂肪族窒素原子を含む。この化
合物は通常３〜５０、特に３〜３０の原子で構成される
官能鎖を持つ。鎖構成原子数（鎖長）とは最長の原子鎖
において連続する鎖のメンバーを構成する構成原子数で
ある。例えば官能鎖ＣＨ，ＣＨ（ＣＨ）ＣＨ，ＮＨ（Ｃ
Ｈ，）、ＮＨ。
の場合、鎖長は中間路（置換プロピレン）の３とジアミ
ノヘキシレンの８Ｊ：の合計１１である。炭素原子の池
に窒素原子、酸素原子（エーテル）、硫黄原子（チオエ
ーテル）も鎖構成原子として数える。
窒素原子は脂肪族炭素原子、例えばメチレン基の炭素原
子に結合していることか必要である。脂肪族窒素原子と
して、１級アミノ、２級アミノ、３級アミノ、４級アン
モニウム、イミノ等の窒素原子を用いることができるが
、１級アミノ（ＮＨり、２級アミノ（Ｎ　Ｈ）を持つも
のが特に好ましい。　脂肪族窒素原子は化合物の末端構
成原子、鎖の中間構成原子のいずれであってもよい。ま
た鎖の中間原子に直接または池の脂肪族炭素原子を介し
て結合したペンダント窒素原子であってもよい。　官能
鎖は、１級または２級アミ／脂肪族窒素原子とそれに隣
接した３個以上の炭素原子鎖を含むものがよい。先に例
示した官能鎖の場合は、２個の脂肪族窒素原子にヘキシ
レン基（およびヒドロ牛シル置換プロピレン基）が隣接
している。
官能鎖の具体的を構成は下記Ａ　−Ｄて例示５れる。
脂肪族鎖Ａ　：　−ＣＨ，ＣＨ（ＣＨ）ＣＨ，ＮＨＲＲ
ｌの例として水素原子および下記の基を事げることがて
きる（コニ・内はＲ’に対応する化合物Ｒ’ＮＨ，また
はＲ’ＯＨを表す）。
（ＣＨ，）、ＮＨ，（ｎ＝＞１２）’、アル牛レしンア
ミンＥ、Ｃ０ＣＨ（ＮＨｔＸＣＨｔ）、ｘ＋。
〔リジン〕、ＣＯＣＨ（Ｎ　Ｈｔ）ＣＣＨ、）３Ｎ　Ｈ
。
３オルニチン〕、 脂肪族鎖Ｂ　　−ＣＨ，ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ，ＮＨ（ＣＨ
，）、ＮＨＲ’ Ｒ２の例；（ＣＨ，）、、ＮＨ２（ｎ＝１〜１２）、（
ＣＨｙ）、ＮＨＣ（＝ＮＨ）＊　　（ｎ＝１〜１２）脂
肪族鎖Ｃ：　−ＣＨ，ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ，ＮＨ−ＣＯＣ
Ｈ，ＣＨ，Ｃ０ＮＨＲ３ Ｒ３の例：（ＣＨ，）、ＮＨ，（ｎ＝１〜１２）、（Ｃ
Ｈｙ）−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ｔ　　（ｎ＝１〜１２）脂肪
族鎖Ｄ　：　−ＣＨ，ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ，ＮＨ（ＣＨ，
）、ＮＨＲ’ Ｒ４の例、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、 Ｃ０ＣＨ（ＮＨ，）（ＣＩ−（、）４＼′Ｈ７、（ＣＨ
＝）、、ＮＨｔ　　（ｎ＝　Ｉ〜１２）基材は、通常多
孔質のものであり、主としてこれについて説明するか、
定量分析に必要な吸着容量を確１呆てきる基材てあれば
それに限定されることはない。多孔質基材のボア号イズ
は５Ｑｎｍから１１程度のものか好適である。基材は直
接または間接に窒素原子を持つ脂肪族鎖を固定できる構
造をもつものであり、例えば、水素基、アミ７基等の官
能基ないし他の物質と反応できる活性位置（例えば活性
水素）を備えたものが挙げられる。
具体的な基材の例としては、複素環型吸着体の水不溶性
担体と同様なものが挙げられる。好ましくは、例えば、
多糖類（アミノアルキル化多糖類、カルボキンアルキル
化多糖類等のその銹導体を含む　セルロース、架橋テキ
ストラン、キトサン等の多糖類等）、有機合成高分子（
例・ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリアミド
、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリアクリル
酸、アミノアルキル化またはハロケ／アル牛ル化された
ヂ１，１スチレン、ポリアクリルアミド等）、無機高分
子（例　／リカケル、アルミナ、アミノプロピル多孔性
カラス、各種セラミックス等）か挙げられ、また、これ
らの基材に適宜常法により脂肪族鎖との結合を作るのに
役立つ水素基、アミン基等を導入したものも挙げられる
。
脂肪族型吸着体を製造するに際し、上記多孔質基材に直
接またはスペーサーを介して脂肪族窒素原子を有する脂
肪族鎖を結合される方法としては、共有結合、イオン結
合、疎水結合、配位結合等が挙げられ、具体的には、特
開昭３７−１８３７１２号に記載の方法等を採用するこ
とができ、例えば、セルロース等の多孔性基材をエピク
ロロヒドリン等のエポ牛／化合物等で活性化した後、ア
ミ７基、水酸基、チオール基、カルホキノル基等を有す
る脂肪族鎖を結合させるか、または基材を活性化した後
、これに適当なスペーサーを導入し、次いてアミノ基、
カルホキノル基、アルデヒド基、チオール基等を有する
脂肪族鎖と反応させることこよつ実施することかてきる
。
上記の如くして得られる多孔質吸着体のうち、好ましい
ものとしては、例えば、セルロース等の多糖類を基材と
し、上記式−Ｃ８２ＣＨ（ＣＨ）Ｃ）（、ＮＨＲ’およ
び−ＣＨ，ＣＩ−（（Ｏ）（）ＣＨ。
＼）（（ＣＨ，）５ＮＨＲ”て示される脂肪族鎖を備え
、ボアの孔径か１００〜５００　ｎｍである吸着体か挙
げられる。
かくして、本発明のうち濾過ユニツト法は、まず、濾過
ユニットの検体カップ内で検体と吸着体を接触させ、遠
心分離して非吸着物を濾液カップ内に分離し、要すれば
、検体力１．ブ内の吸着体の洗浄、遠心分離を行い、洗
液を濾液カップ内に分離し、濾液カップ内容物を廃棄し
、パイロジエン以外の物質を除去し、ついで、検体カッ
プ内てパイ０／エンを吸着した吸着体をそのまま検出試
薬、例えば、リムルス試薬と反応させて、パイロジェノ
を定量することにより実施できる。
通常、リムルス反応の終了後、遠心分離して反応液を吸
着体から分離し、濾液カップに移行させて定量操作を行
うと、迅速、簡便に、かつ、精度よく定量か行える。
以下、定量操作についで、さらに詳しく説明する。
本発明においては、対象とする検体は溶液状態で使用す
る必要があり、例えば、含水溶液あるいよ水１８液の状
態、とりわ；す水溶液の状態であるのか好ましい。さら
に、本発明の方法は、用いる吸着体かリムルステストの
定量阻害物質、例えば、Ｌ−７ステイン等のアミノ酸、
ベニ／「Ｊ／Ｇ２ストレプトマイ／ン等の抗生物質、尿
素等の蛋白質変性剤、ジイノプロビルフルオロリン酸等
のセリンブロテアーセ阻害剤、グルコース等の糖類、糖
アルコール、塩化ナトリウム、リンゲルＨ等や、パイロ
ジエン以外のリムルステスト陽性物質、例えば、デキス
トラフ等の多糖類、（１−３）−βＤ−グルカン等を吸
着しないため、従来定量が困難であったこれらの物質を
含む検体についても適用できる。加えて、本発明の方法
によれば、例えば、タンパク質溶液、血漿、血清中のエ
ンドト牛／ンも定量することかできる。
吸着操作は検体カップ中で行ない、その条件は、個々の
検体に応じて適宜選択できるか、通常、検体１胛ρ当た
り、３〜２７０叩、好ましくは７〜１８０ｍｇの吸着体
を用い、４〜４０’Ｃてｐ８４〜８、好ましくは６〜７
、イオン強度０２以下てパイロジエンか特異的に、効率
よく吸着される。
この条件下、約１５分間以上吸着操作を行なうことによ
り、検体中のパイロジェノはほぼ完全に吸着体に吸着さ
れ、吸着体上で濃縮された形となる。
また−度吸着させた後、再吸着させることもでき、これ
により測定感度を上昇させることができる。
パイロジェノを吸着し１ニ吸着体は遠心分離により検体
と分離され、要すれば、さらにパイロジエンフリーの水
、緩衝液等でよく洗浄し、パイロジエン以外の物質を除
去する。
本発明においては、洗浄した吸着体をそのままリムルス
テストに付ス。
リムルステストは、一般に、合成基質法トケル化法に大
別され、また、合成基質法は用いる基質の種類により比
色法と蛍光法に区別される。本発明においては、いずれ
の方法も用いることができる。合成基質法を用いる場合
には、具体ａりには、例えば、パイロジェノを吸着した
吸着体を２５〜４０°Ｃ１通常、３７°Ｃにて１０〜１
２０分間リムルス・ライセートおよび発色団または蛍光
団を有する合成基質と反応させ、反応停止後、比色また
は蛍光測定を行ない、別途、同様にして作成した検量線
から検体中のパイロジエンａ度を算出することかできる
。
用いる合成基質は特に限定するものではなく、通常この
種の反応に用いられるもののなかから適宜選択できる。
比色による場合は、例えば、式　ＢｏｃＬｅｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−ｐＮＡ　（式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブト牛
シカルホニル基、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリンを表わす
。）で示される合成基質を用い、波長４０５．ｎ　ｍて
測定することにより定量できる。蛍光測定による場合は
、例えば、式Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−Ｘ４
ＣＡ（式中、Ｂｏｃは前記と同一意味を育り、ＭＣＡは
７−アミ／−４−メチルクマリンを表わす。）て示され
る合成基質を用い、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６
０ｎｍて１．１１定することにより定量できる。
ゲル化法を用いる場合には、具体的には、例えば、パイ
ロジエンを吸着した吸着体にリムルス・ライセートを加
え、そのまま、あるいは低温でしばらく反応させた後、
吸着体を除き、２５〜４０°Ｃ，通常、３７°Ｃにて１
０−１２０分間反応させ、ゲル化の進行を、濁度を経時
的に測定することにより測定し、同様にして作成した検
量線から検体中のパイロジエン濃度を算出することがで
きる。
以上、検出試薬としてリムルス試薬を用いる場合につい
て説明したが、検体の種類に応じ、適宜使用可能な他の
検出試薬に代替して定量操作を行なうことを妨げない。
本発明はパイロジエン吸着能を有する吸着対を用いてパ
イロジエンの濃縮、定量阻害物質または検出反応陽性物
質からの分離を行なうので、検出試薬としてリムルス試
薬はどの性能をノ、要としない場合かあるっ なお、本発明において；１用する吸着体は、例えば、特
開昭５７　１８３７１２号に記載され１こ方法に従って
製造することかできる。
次にＰＳＳ定量法ついて説明する。
ＰＳ定量法は、脂肪族窒素原子を含む化合物と基材とか
直接またはスペーサーを介して結合してなる固体吸着体
（脂肪族型吸着体）を検体溶液と接触させ、固液分離後
、固体吸着体にパイ０／エン検出試薬を作用させて定量
することを特徴とするパイロジェンの定量法である。
脂肪族型吸着体については、既に濾過ユニット法の中で
説明した。脂肪族型吸着体はパイロジエンを選択的に吸
着する能力をもち、それゆえに検体溶液との接触後、固
液分離（洗浄工程を含む）することにより、パイロジエ
ンは検体溶液中に存在する他の物質（定量阻害物質等）
から分離される。
パイロジエン吸着後の固体吸着体にはパイロジエン検出
試薬を作用させて定量する。この場合、例えば比濁時間
法リムルステストを用いると、固体吸着体は短時間のう
ち（約１０秒以内）に沈降により上清みか形成され、測
定用試験管の光束を遮らない程度になるので、固体吸着
体を検液から分離せずにケル化時間を測定することかで
きる。このように適切な選択吸着性と沈降性とを備えた
吸着体を用いて、ノパイＣ／エンを検体溶液中に存在す
る定量阻害物質等から分離して、パイロジェンに対する
特異性、感度、定量性を備えた定量法か実現する。ゲル
化に基つ＜　Ｉｆ（Ｉｆ定としては転倒法も知られてい
るか、定量性のよい比濁法を用いるのか好ましい。
勿論、ＰＳ定量法において、先に説明した濾過ユニット
を用いることもできる。濾過ユニットを使えば、ＰＳ定
量法においても固液分離（洗浄工程を含む）の操作性か
よい特徴が発揮される。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか、
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 検量線の検討 パイロジェンフＩ／−の水２＋ｎ＋２に所定量の工／ト
ドキノンＥＣ−５（ＦＤＡレファレンスエントド牛ンン
）を添加、混合し、ＥＣ−５水溶液（ＥＣ５ン農度　０
，０．０５．０．１０まに（ま０．２０ＥＵ／ｍρ、Ｅ
Ｕはエントドキノン・ユニｙトをＨす）を調製した。
この溶液２ｍＱを、予め、後記参考例１て調製した吸着
体の水懸濁液’−０，３ｇ＜湿重量）／岐−１００ｕＣ
を入れた第１図に示すような遠心分離型限外濾過ユニッ
トの検体カップに入れ、ラウンドミキサーを用い、２０
〜２５℃にて５０ｒｐｍで６０分間撹拌した。ついで、
２，３００Ｇにて１５分間遠心分離し、濾液カップを外
して内容物を廃棄した。濾液カップを戻し、２５ｍＭＮ
ａ（Ｊｌ溶液０．５ｎρを検体カップに添加し、再度１
０分間遠心分離した。同様に、濾液カップの内容物を廃
棄し、再度濾液カップを取り付け、検体カップにパイロ
ジエンフリーの水２ｍ（！を添加し、２５分間遠心分離
し、濾液カップの内容物を廃棄した。
ついで、４℃にて、検体カップにリムルス・アメ士サイ
ト・ライセード溶液］リムルス・／／グルテスト・ワコ
ー（和光純薬社製）１バイアル（０２ｍｉ！用、感度　
Ｆ　Ｄ　ＡレファレンスエントドキノンＥＣ−２が濃度
０．１ｎｇ／ｍ夕でケル化する）を０　、０４　Ｍ塩化
マグネ／ラムを含む０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）１．．５ｍ＆に溶解して調製］　　１００μＱを
添加し、ミキサーで穏やかに混合した。これに、予め７
０°Ｃに加温した、基質溶液であるＱ、５ｍＭ　　Ｂｏ
ｃ−ＬｅｕＧ　ｌ　ｙ−Ａ　ｒ　ｇ−ＭＣＡ水溶液２０
０μＣを添加し、穏やかに混合した後、３７°Ｃで２５
〜３０分間反応させた。反応後、１２．５％酢酸水溶液
２．３ｍＣを加えて反応を停止させ、濾液カップを取り
付けて、２，３００Ｇで３０分間遠心分離した。
濾液カップに移行した反応液の蛍光を、励起波長３８０
ｎｍおよび蛍光波長４６０ｎｍで測定した。ホ［ｊ定結
果を第１表に示す。
また、縦線を蛍光測定における相対強度（Ｒ１）、横軸
をエントド牛／ンｌａ庁とするグラフにフＣ″ノドする
と、１テ１寸の第４図に示すごとく、良好を直線性を示
す検量線か得られた。
第１表 実施例２ 検量線の検討 パイロジエンフリーの水２１！（に所定量のＬＰＳ（Ｅ
、ｃｏｌｉ　　０１２８：Ｂ１２由来のＬＰＳ）をｉＵ
ｎ、混合シ、ＬＰＳＪＩｉＱ、Ｓ、１０，１５または２
０　ｐｇ／ｘＱのＪｌｉのＬＰＳ水溶液とした。これら
の各溶液のＬＰＳを前記実施例１と同様にｆｆ１ｌｌ定
した。その結果、第５図に示すごとく、良好−直線性を
示す検量線か得られた。
実施例３ フェニルアラニン中のエントトキ／ンの測定エントトキ
ンンヲ含マζい２％Ｌ−フェニル了ラニう水’ｉＷＭｌ
に、エントド牛ンンＥＣ−５を○　ｌＥＵ／ｍ（添加し
、前記実施例１て得ちれた検量線を用い、実施例１と同
様にエンドトキ／）の定量を２回繰り返した。なお、非
吸着物の遠氾分離後の吸着体の洗浄：よ、０．０２〜Ｉ
　　ＮａＣ（１２ｍＣと水２ｍＣで行った。
その結果、定量値の平均は０．１１４　Ｅ　Ｕ／ｍｃ（
回収＄１１４％）であった。
一方、ゲル化感度が０．０３　Ｅ　Ｕ／ｍＱのリムルス
試薬（試薬Ａ）と０．１４ＥＵ／ｍσのリムルス試薬（
試薬Ｂ）を用い、マイナスコントロールをエンドトキシ
ノを含まない益留水、プラスコノトロールに、試薬Ａに
ついては、Ｅ　Ｃ−５’ｔｌＡＶカ０、０３３　Ｅ　Ｕ
／ｍ（のＥＣ−５水溶液、試薬ＢにツイテはＥＣ−５濃
度かＯ，Ｉ　６７　Ｅ　Ｕ／ｍｃのＥＣ−５水溶液を用
い、ケル化法によ０＠記のＥＣ５ａ有２％Ｌ−フェニル
アラコノ溶液の工／トドキノン測定したところ、試薬Ａ
およびＢとも、マイナスコントロールに対してはマイナ
スの、また、プラスコントロールに対してはプラスの結
果を与えたか、フェニルアラコノ溶液のエントトキ／）
を検出てきなかった。
実施例４ アミ／酸Ｍ液中のエンドトキンンのｌ１ｌｌＩ　定エン
ドトキ／ンを含まないアミノ酸輸液（田辺製薬株式会社
製、アミゼット１０）に、エントトキ／ンＥＣ−５を０
．２　Ｅ　Ｕ／ｍｆ！１ｆｆｉ加し、エントトキンンを
含まない水で４倍に希釈し、実施例３と同様にエンドト
キンンを定量したところ、定量値の平均は０．０６６Ｅ
Ｕ／ｍρ（回収率１３２％）であった。
一方、実施例３と同様に、試薬ＡおよびＢ、マイナスコ
ントロールおよびプラスコントロールを用い、試薬Ａに
ついてはエントド牛ンン添加アミノ酸輸液を６倍希釈し
て、また、試薬Ｂについて；ま希釈せずに１刻定し１こ
ところ、７ミ／輸液、二ついて：ユ、その工／ドトキ／
ノを検出出来ｔう・っｒニっ実施例５ ベニ／す／Ｇ中の工／［−トキ／）の５則定エンドトキ
／ノを念まないベニノリ７Ｇカリウム塩水１容ｌ夜５０
０００ビ／ｍＱにエノトト千ツノＥＣ−５をＱ、５ＥＵ
／ｍジ？呑加し、ニノトトキ、・ノを含まない水で１０
（＠ｊ二希釈し、実施例、３と同様にエントトキ／ンを
定量したところ、定量値の平均は０．０６２ＥＵ／ｍＣ
（回収Ｘ＋　２４％）であっｔニ。
一方、実施例３と同様に、試薬ＡおよびＢ、マイナスコ
ントロールおよびプラスコントロールを用い、試薬Ａに
ついてはエンドトキンン添加ベニ／リンＧカリウム塩溶
液を１５倍に希ｆＬで、また、試薬Ｂについては３（＠
希釈して測定したところ、試薬ＡてはペニノリンＧカリ
ウム塩溶液中のエンドトキ／ンを検出てきたか、試薬Ｂ
ては検出てきなかった。
実施例６ 検量線の検討 パイロジェンフリーの水１００μＣに所定量のエントド
キノンＥＣ，５を添加、ＩＬ、ＥＣ５水溶液（ＥＣ−５
濃Ｖ：Ｏｌｏ　２、ｏ　４．０８またはｌ　、　６　Ｅ
　Ｕ／、ｉＣ）を調整した。
この溶液１００μρを、予め後記参考例１て調整した吸
着体の１０％懸濁液（ｐ）１６．０、μ＝０．０２）９
００μρと混合した後、ＭＦ膜（ボリビニリテ７ノフル
オライド）と疎水性膜（ポリプロピレン）との二重膜を
濾過膜として用いた第１図に示すような遠心分離型濾過
ユニツトの検体カップに入れ、ラウンドミキサーを用い
、室温にて５Ｏｒｐｍで１５分間撹拌した。ついで、１
７００Ｇにて５分間遠心分離し、濾液カップを外して、
内容物を廃棄した。濾液カップを戻し、エントドキノン
フリーの０．０２ＭＮａＣｆ！溶液１１Ｑを検体カップ
に添加してラウンドミキサーで２０秒間撹拌した後、１
７００Ｇにて５分間遠心分離した。濾液カップの内容物
を廃棄し、ついで、４℃にて、検体カップにリムルス・
アメホサイト・ライセード試薬ｒＱｃｔ−ｒｏｏｏ　（
第−化学薬品製）　　　リムルス・アメホサイト・ライ
セード（ｌバイアル）をエントドキノンフリーの０１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（０、ＯＩ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＬ、ｐ
Ｈ８，０）１．４＋（！に溶解したものと、ＢｏｃＬｅ
　ｕ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ−Ａ　ｒ　ｇ−ｐＮＡをエントドキ
ノンフリーの蒸留水６５好に溶解したものを、ｌ　２の
割合に混合して使用３３００μａを加え、ミキサーで１
５秒間撹拌した後、３７℃で３０分間反応させた。反応
後、２５％酢酸水溶液２３ｚＱを加えて反応を停止させ
、濾液カップを取り付けて、１７００Ｇにて５分間遠心
分離した後、濾液カップに移行した反応液の、４０５ｎ
ｍでの吸光度を測定した。
測定結果を下記第２表に示す。
第２表 結果を第３表に示す。
第３表 また、縦軸を吸光度、横軸をエントド牛シン濃度とする
グラフにプロットすると、第６図に示すごとく、良好な
直線性を示す検量線が得られた。
実施例７〜１１ 種々の物質中のエントドキノンの測定 エントドキノンを含まない塩化ナトリウム、グルツース
、ノステイン塩酸塩、ヘニ７リンＧカリウム塩、β−１
，３−Ｄ−グルカン水溶液中に、エントドキノン（Ｅ　
Ｃ−５）を添加し、前記実施例６て得られた検量線を用
いて、実施例６と同様にエントドキノンの定量を行った
。
実施例１２ ヒト血清アルブミン（Ｈ５Ａ）中のエントドキノンの測
定 ５％Ｈ５Ａ溶液に、エントドキノン（ＥＣ−５）を０ま
たは０．５ＥＵ／ｚ（！添加し、前記実施例６で得られ
た検量線を用いて、ｐＨ５，，５、μ＝０．１の吸着体
懸濁液を用いる以外は実施例６と同様に処理しエントド
牛／ノの定量を行った。
結果を下記第４表にボす。
第４表 エントド牛ノ／７ト加量　’　　　ｉＭ　定値（ＥＵ／
ｌＣ）　　　　　ｌ　　（ＥＵ／’、Ｃ）０　　　　　
　　　’　　　０．１１ ０５　　　　　　　　０．６０ バｌり定 第５表 エントド牛／ン濃度 吸光度 ○　３６４ つ 実施例１３ 検量線の検討 エントド牛／ン（ＥＣ−５）溶液濃度・・・Ｏｌｏ　０
５．０１．０２．０．４　（ＥＵ／ズＣ）酵素反応時間
・・・４０分間 他は、実施例６と同様に処理することによって、下記第
５表に示す結果を得た。
また、縦軸を吸光度、横軸をエンＦ　トキ／ン１度とす
るグラフにプロットすると、第７図に示スごとく、良好
な直線性を示す検量線か得られた。
実施例１４〜１６ 種々の物質中のエンドトキンンの測定 エンドトキ／ノを含まないフェニルアラニン水溶液、メ
チオニン水溶液、アミノ酸輸液（田辺製薬株式会社製、
アミゼノ）１０）中に、エンドトキンン（ＥＣ−５）を
添加し、前記実施例７て得られた検量線を用いて、実施
例７と同様にエンドトキンンの定量を行っ１こ。
結果を下記第６表にデす。
第６表 ′Ｘ〒ハｏ１　　　検体ｌ容液　　　　：　エノドトキ
ノノ迂Ｉト　　シ　定　値（Ｅ　Ｕ　／’　＝、　ｉ：
　） （ＥＬ：／７１（り 実施例１７ 検量線の検討（比濁法） パイロジェノフリーの水２ｙＱに所定量のエントド牛／
ノＥＣ−５を添加、混合上ＥＣ−５水溶液（ＥＣ−５濃
度　０．０５．０１．１、または１０　Ｅ　Ｕ／＋ｙ（
りを調製した。
この溶液２００μ（と、予め後記参考例Ｉて調製した吸
着体の１０％懸濁液（ｐ　Ｈ６，０、μ＝０．０２）９
００μＱ　ｆ：　Ｍ　Ｆ膜（ポリビニリデンジフルオラ
イド）と疎水性膜（ポリプロピレン）との二重膜を用い
た遠心分離型傷過ユニツトの検体カップに入れ、ラウン
ドミキサーを用い、室温にて５Ｏｒｐｍで１５分間撹拌
した。ついで、１７００Ｇにて５分間遠、Ｌ・分離し、
濾液カッ′を外して内容物を廃棄した。ついで、４°Ｃ
にて、検（本カノフ゛にリムルス・アメナ寸イト・ライ
セード試藁−リムルスＥＳ−テスト７コー（相光純薬社
うｌ）　　ｌバイアルをエントド半／／フリーの０．１
〜１トリス塩酸緩衝１夜（ｐＨ７，３）５ｉσ、こ１容
解したものＥ　２００μＣどパイロノエンフＩノーの京
留水１００μＱを加え、１５秒間撹拌した後、４°Ｃに
て１５分間静置したつついて１７００Ｇ：二で５分間遠
心分離して得られた濾液をパイロジェオフリーの蓋付試
験管に移し、トキノンメーター（比濁時間測定法）にて
ゲル化時間を測定した。
一方、所定濃度のＥＣ−５溶液（００５，０，１，１ま
たはＩＯＥじ／ｌρ）を調製し、吸着体によるパイロジ
エン吸着操作を行う○とｔく、該溶ｉ＆２００μＱとリ
ムルス・アメ士サイト・ライセード試薬２００μＣとを
上記と同様に処理して得られた濾液をトキ７ノメーター
によりゲル化時間を測定した（従来法）。
測定結果を第７表二示す。本願方法によると従来法で測
定した値と；；は同じ値を得ることかできた。
また、本願方法の１１１１定結果についで、縦軸をケル
化時間、横軸をエントトキ／ンｔａ度とするグラフにプ
ロットすると、添１寸の第８図に示す如く、良好な直線
性を示すグラフが得ろれだ。
第７表 実施例１８ パイロジエンフリー水（ＰＦＷ）にＥ、Ｃｏ１１○Ｉｌ
ｌ　：　Ｂ　４由来のパイロジエン（ＤＩＦＣＯ製）を
添加し、各種原液濃２ｃ。（ｐｇ／ｘｃ）のパイロジェ
ン水溶液を調製し１為パイロジ工ン濃度は、上記バイロ
ンエンを用いてトキ／ツメーター（比濁時間測定法）で
作成した検量線により算出した。
パイロジエンフリー（Ｐ　Ｆ）の蓋は試験管に参考例４
の脂肪族型吸着体Ａ−１型３００コ９★ｅｔを計り込み
、パイロジエン水溶液３２Ｃを加え、直ちにラウンドミ
キサー（２５ｒｐｍ、２０〜２５°Ｃ）で１５分間撹拌
した。吸着処理終了後、ＰＦのＭＦフィルターユニット
にて濾過し、フィルター上の吸着体をＰＦ藁さじてＰＦ
試験管に採取し、ＰＦＷて３０％懸濁液とした。
トキシノメーター用の試験管の底に懸濁液１００μＱを
加え、４°Ｃで静置させ、同じく４°Ｃで溶解したＬＡ
Ｌ試験液（Ｅ　Ｓ　ｔｅｓｔ　ＷＡ　Ｋ○）１００μｇ
を加えた。この状態で１０分間リムルス試薬を作用させ
た後、３７°Ｃの恒温槽て試験管を１０秒間加温後トキ
シノメーターを用いてゲル化時間Ｔ、（分）を測定し、
これに基づいて求めたパイロジエン量を原液１ｊｌＱあ
たりの値Ｃ（ｐｇ／ｘのとして、Ｃ０、Ｔ１、Ｃ／Ｃｏ
と共に第８表に示す。
はぼ一定のＣ／Ｃｏが得られ、Ｃの対数とＴ、の対数と
は直線関係を示す。従って、検体溶Ｃ夜を用いて、同様
す方法でケル化時間を測定すれば、この検量線に基つい
てバイロンエンａ度を求めることかできる。
第８表 ［複素環型吸着体の製造〕 寮考例１ （１）セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマ、ア社製の商
品名）３５０９　（湿重量）を５００．ｘＱの蒸留水に
懸濁し、該懸濁液に２Ｎ水酸化ナトｌ）ラム２００ｚＣ
およびエヒリロロヒトリン５０ｘ（ｌヲ１１０え、４０
’Ｃにて２時間撹拌する。反応終了後、混合物を濾過し
、残渣を蒸留水で洗浄することｊ二よりエビクロロヒト
ワン活性化セファロースＣＬ４Ｂを得る。本品を予め６
０’Ｃｆこ加温した０６％へキサメチレン／アミン水溶
液１．４ρに懸濁し、６０’Ｃにて２時間撹拌する。反
応終了後、混合物を濾過し、残漬を蒸留水でａ、浄する
ことにより３−（６−アミ／へ牛ノルアミノ）−２−ヒ
ドロキン−プロビル化セファロースＣＬ−４８３７０９
（Ｊ重ｊ！ｉ）を得る。Ｓ亥セファロースのアミノへキ
ンル基の含量を滴定により求めたところ、３７６μｍｏ
Ｉｅ／９　（１重りであった。
（２）３−　（６−アミツペキンルアミ／）−２−ヒド
ロキ／−プロピル化セファロースＣＬ−４８３７０９（
湿重量）を４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液７００＝２に−
濁し、該懸濁液に６５°Ｃにてエビクロロヒトリンフ０
０ｚＣを加え、撹拌する。反応終了後、混合物に水を加
え３０’Ｃ以下に冷却して、濾過し、残渣を苗留水て洗
浄することによりエビクロロヒドリン活性化３−（６−
アミノへキンルアミノ）−２−ヒドロキ／−フロビル化
セファロースＣＬ、−４Ｂを得る。氷晶を予め９０’Ｃ
に力ロ温した２０％ヒスチ／ン塩酸塩・水和物の水溶液
（水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ１２に調製したちの
）２１Ｃに懸濁し、８０〜９０°Ｃて３０分間撹拌する
。反応終了後、該混合物を濾過し、残渣を蒸留水で充分
洗浄する。該残渣を巷留水ＩＣに懸濁し、１２００ｃて
２０分オートクレーフした後、該混合物を濾過する。残
渣を０．２Ｎ塩酸水溶液、０２へ゛水酸化ナトｌ／ラム
水溶液、５Ｎ塩化ナトリウム水溶液および蒸留水で充分
洗浄する。かくして、アガロースを担体とし、ヒスチジ
ンをリカノドとし、ヘキサメチレンジアミンをスペーサ
ー中心とする水不溶性吸着体３９０ｇ（湿重量）が得ら
れる。該吸着体のヒスチジン含量は２０　、４　ｇｍｏ
ｌｅ’ｇ（ｉＮｆｉｌｔ）吸着体であった。
参考例２ を考例ｉにおいてでファロースＣＬ−４Ｂの代わりにセ
ルロファインＧＣＬ　　２０００−ｍ（チ。
ソ（株）製の商品名）３３０ｙを用いる他は参考例１と
同様に処理する。かくしてセルロースを担体とし、ヒス
チ／ンをｌ／カントとし、へ牛すメチレンンアミンをス
ペーサー中心とする水不溶性吸着体３４０９　（湿重量
）か得られる。上記吸着体のヒスチジン含量は、１５８
　ａｍｏｌｅ／ｙ　（湿重量）吸着体であった。
参考例３ 参考例１　（１）と同様にして調製した３−（６−アミ
／へ牛／ルアミノ）−２−ヒドロキ／−フロビル化セフ
ァロースＣＬ−４８１８９ＧＪ！重量）を０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）４５．６ｒｔｔＱに懸濁し、
該懸５ｅ、に２５％グルタルアルテヒド水溶液１９．２
ｊｌ（！を加え、室温で２時間撹拌する。反応終了後、
混合物を濾過し、残渣を０１Ｘｌｌ１７酸緩ｔ、α（ｐ
Ｈ７，０）で十分、も争する二と、二より、グルタルア
ルテヒト活性（に３−（６アミノヘキ、ルアミノ）−２
−ヒト：キ／−フ上ビル化セファロースＣＬ−４Ｂを得
る。氷晶を１５ｍＭヒスタンミンー〇、ＩＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７０）３０ｘＣに懸濁し、該’！；、ｉｆｉ＋
釦こノ／ウム十ロヒトリド０３９を加え室温で１時１ａ
拌する。反応終了後、混合物を濾治し、残虐をＩＭ塩化
ナトＩＪウム水溶液および蒸留水て十分洗浄する。かく
してアカロースを担体とし、ヒスタノミンをリガンドと
し、ヘキサメチレンジアミンをスペーサー中心とする水
不溶性吸着体２０７９（湿重りが得られる。該吸着体の
とスタンミノ含量は４１μｍｏｌｅ／９（湿重量）吸着
体であった。
「脂肪族型吸着体の製造り 参考例４ Ａ−１型 水洗後吸引濾過（２分）により脱水したビーズ状の多孔
質セルロースゲル担体（ａ）５０９ｗｅｔを、０６ＮＷ
性ソーダｌｌｏフｃに分散し、エビク＝ルヒトリン］６
１１°を加え、６０’Ｃて、３０分反応させる。ｆ濾過
水洗したエヂ牛ノ活性化中間体（ｂ）にリカノド１容Ｃ
夜を添加し７０°Ｃ１１８寺間反応する。１ノカント溶
液は、６５９゜へ牛すメチレノノア：ン４ＲＱを水１０
０ｆｆ（に溶解した。濾過、水洗し、塩酸でｐ）（ｌ○
　４に：Ａ整し、水洗、脱水して、ｗｅｔＡｌｆｆｌ吸
ｔｔｉｌｉ（ｃ）約ろ５９を１４る。
第９表参照。
第９表 ９ｗｅｔ／９　ｄｒ） １７．０、Ｉ　、　８２　ｚＱ／　ｙ　ｗｅｔ１５８、
エボ牛／含ＩＦ　（＝ｍｏｌ／？　ｄｒｙ）　１７４（
ｃ）　　　　１８．２．１．４３ａ＋（！／９ｗｅｔ、
ヘキサメチレン／アミ７＠ｌ　（μｍｏｌ／ｇｄｒｙ）
（ｂ） （ａ） この分離剤は、おもな官能鎖としてＣＨ，ＣＨ（ＣＨ）
Ｃ）（、ＮＨ（ＣＨ，）、ＮＨ，（鎖長１１）を持つ。
同様な製法で、反応条件を変化させて、へ牛すメチレン
ジアミン含量５０〜６００の分離剤を得ることができる
。反応条件を変化させて得た分離剤は、おもな官能鎖と
してＣＨ，ＣＨ−（ＯＨ）ＣＨ７ＮＨ（ＣＨ２）、ＮＨ
ＣＨ，ＣＨ（ＣＨ）ＣＨ２（鎖長］４）とＣＨ，ＣＨ（
ＯＨ）ＣＨ，ＮＨ（ＣＨ，）、ＮＨ，（鎖長１１ンとを
併せ持つものもあると考えられる。
Ａ−２型。
Ａ−１型とリジンの縮合反応で得られる。
官能鎖ＣＨ，ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ，ＮＨ（ＣＨ，）６ＮＨ
ＣＯＣＨ（ＮＨｔＸＣＨｔ）４ＮＨｔＢ−１型 多孔質セルロースゲルを基材とＬ１エピクロルヒドリン
とアンモニアを付加させて得られる。
官能鎖ＣＨ，ＣＨ（ＣＨ）ＣＨ２ＮＨ，、ＣＨ，−ＣＨ
（ＯＨ）ＣＨ，ＮＨＣＨＩＣＨ（ＣＨ）ＣＨ，を持つ。
粒径５０〜２００ｕス程度のビーズ状、最大ボアの大き
さは約１００〜５００ｎｍ程度。
Ｂ−２型 Ｂ−１型とリジンの縮合反応で得られる。
官能鎖ＣＨ，ＣＨ（Ｏ）（）ＣＨ，ＮＨＣＯＣＨ−（Ｎ
　Ｈり（ＣＨ２）−ＮＨ！ 発明の効果 本発明の方法によれば、リムルステストにおける定量感
度を著しく上昇でき、従来測定か困難とされた阻害物質
を含有する検体でも定■できる。
また、バイロジ二ン以外のｌ／ムルステスト陽性物質か
存在しても分離、定量かでき、しかも、簡単に精度よく
行なえ、その上、リムルス試薬に替わ。
る安価な試薬を用いることも可能となり、本発明の方法
は、例えば、薬剤の製造工程におけるチエ。
り等に適用するのに好適なパイロジエンの定量法となる
。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第３図は、本発明の定量法に用いる遠心分離型
濾過ユニｌトの具体例の模式的断面図、第４図〜第８図
は本発明の定量法に用いる検量線の具体例である。 第１図〜第３図中、Ｉｉ：ｉｒ傷液液カップ２ｊま検体
力ノフ、３は濾過膜を意味する。 第１ 図 第２図 特許出願人　田辺製薬株式会社はか１名代　理　人　弁
理士　青　山　　葆　はか１名第３図 第４図 ｙ　＝４９１．４ｘ＋２２ Ｙ＝Ｒ Ｘ・　エントド矢シソ、襄度 Ｒ＝　　０．９９０ 第 図 エンドトキンンｌ農度（ＥＵ／ｚＣ） 自由［年 次項 相関係数 ０．９９７８４４５１６１ 第５図 １５．３ｘ　＋　１６．５ ｙ＝ Ｘ　＝ エンドＬ〜ワン５１度 第 図 エンドトキ／ン濃度（ＥＵ／ＩＩＩｃ）自由度 次項 相関（糸数 ０．９９６３７８３８６１ 第８図 手続補正帯 平成　３年　５月　２日

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）遠心分離による濾過用の、濾液カップと、その開
    口部に着脱可能に取り付けられた検体カップとからなり
    、検体カップが濾液カップと濾過膜を介して連絡してい
    る遠心分離型濾過ユニツトを用い、該検体カップ内で、
    パイロジェン吸着能を有する吸着体と検体とを接触させ
    、ついで、透過促進条件下、濾過膜を通して非吸着物を
    濾液カップに分離、除去した後、検体カップ内で、その
    中に保持された吸着体に吸着されたパイロジェンを検出
    試薬と反応させて定量することを特徴とするパイロジェ
    ンの定量法。
  2. （２）合成基質の存在下、リムルス・ライセートとの反
    応終了後、遠心分離により、濾過膜を通して反応液と吸
    着体を分離し、濾波カップ内に移行した反応液を定量操
    作に付す前記第（１）項のパイロジェンの定量法。
  3. （３）パイロジェン検出試薬を用いるパイロジェンの定
    量法において、脂肪族窒素原子を含む化合物と基材とが
    直接またはスペーサーを介して結合してなる固体吸着体
    を検体溶液と接触させ、固液分離後、固体吸着体にパイ
    ロジェン検出試薬を作用させて定量することを特徴とす
    るパイロジェンの定量法。
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