JPH0375565A - エンドトキシンの簡便な定量方法及びその方法に使用する試薬 - Google Patents
エンドトキシンの簡便な定量方法及びその方法に使用する試薬Info
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- JPH0375565A JPH0375565A JP21146289A JP21146289A JPH0375565A JP H0375565 A JPH0375565 A JP H0375565A JP 21146289 A JP21146289 A JP 21146289A JP 21146289 A JP21146289 A JP 21146289A JP H0375565 A JPH0375565 A JP H0375565A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、カブトガニから得られるアメボサイト・ライ
セートから調製したファクターＣを用いたエンドトキシ
ンの簡便な測定法及びその試薬に関する。
セートから調製したファクターＣを用いたエンドトキシ
ンの簡便な測定法及びその試薬に関する。
カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ 匹り吐聾ｕ＋ ｎ吐狸艮
ｕｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、 Ｔ、 ＥｉＬｉＣａｒ
ｃｉｎｏｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕｎｄ−ｉｃａｒｄ
ａ）の血リンパ液により取得されるアメポサイト・ライ
セードのダラム陰性菌表層物質「エンドトキシン」 （
リポポリサッカライド）による凝固現象は、「リムルス
テスト」の一般名でエンドトキシン特異的検出法として
医学、薬学の領域で広く利用されている。アメボサイト
・ライセートの凝固を起こす物質としてエンドトキシン
以外にトリプシン様プロテアーゼ（トリプシン、トロン
ビン等）及びβ−グルカン類（β−結合を有するグルコ
ースポリマー及びその誘導体）が知られている。アメボ
サイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固現象は
エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固
酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコ
アギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起
こることが明らかにされている。
ｕｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、 Ｔ、 ＥｉＬｉＣａｒ
ｃｉｎｏｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕｎｄ−ｉｃａｒｄ
ａ）の血リンパ液により取得されるアメポサイト・ライ
セードのダラム陰性菌表層物質「エンドトキシン」 （
リポポリサッカライド）による凝固現象は、「リムルス
テスト」の一般名でエンドトキシン特異的検出法として
医学、薬学の領域で広く利用されている。アメボサイト
・ライセートの凝固を起こす物質としてエンドトキシン
以外にトリプシン様プロテアーゼ（トリプシン、トロン
ビン等）及びβ−グルカン類（β−結合を有するグルコ
ースポリマー及びその誘導体）が知られている。アメボ
サイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固現象は
エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固
酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコ
アギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起
こることが明らかにされている。
近年、エンドトキシン（細菌内毒素）の臨床病理面の研
究がさかんになり、従来から定着している感染巣の明ら
かな疾患に由来する外因性エンドトキシン血症及びエン
ドトキシンショックの病態把握等を目的として、主とし
て外科領域に於てリムラステストが利用されてきた。一
方、内科領域に於ては、肝障害に及ぼす腸管内ダラム陰
性細菌内毒素の影響や肝の細菌内毒素解毒排泄機能等の
網内系処理機能の低下と言った内因性の内毒素血症が問
題と戒っており、血液凝固線溶系、キニン系、循環系、
及び免疫反応系に於て臨床的に内毒素を検出することが
必須となってきている。このような臨床診断を目的とし
て、上記細菌内毒素の測定法を適用する場合、検体試料
として患者体液特に血液、腹水、膵液、脳を髄液担汁等
を用いる。
究がさかんになり、従来から定着している感染巣の明ら
かな疾患に由来する外因性エンドトキシン血症及びエン
ドトキシンショックの病態把握等を目的として、主とし
て外科領域に於てリムラステストが利用されてきた。一
方、内科領域に於ては、肝障害に及ぼす腸管内ダラム陰
性細菌内毒素の影響や肝の細菌内毒素解毒排泄機能等の
網内系処理機能の低下と言った内因性の内毒素血症が問
題と戒っており、血液凝固線溶系、キニン系、循環系、
及び免疫反応系に於て臨床的に内毒素を検出することが
必須となってきている。このような臨床診断を目的とし
て、上記細菌内毒素の測定法を適用する場合、検体試料
として患者体液特に血液、腹水、膵液、脳を髄液担汁等
を用いる。
しかし、これら体液は、体液本来の着色を有しており、
疾病に起因する色素（例えば黄だん系濃黄色）を含むこ
とがあり、これら色素の妨害により吸光光度法による検
出定量がしばしば困難となる。
疾病に起因する色素（例えば黄だん系濃黄色）を含むこ
とがあり、これら色素の妨害により吸光光度法による検
出定量がしばしば困難となる。
本発明者らは上記のごとく前記細菌内毒素の検出測定法
の適用が困難であった臨床診断用途にも適用可能な検出
法を検討した結果、前記難点を解決し本発明に到達した
。
の適用が困難であった臨床診断用途にも適用可能な検出
法を検討した結果、前記難点を解決し本発明に到達した
。
本発明は、極めて簡単な操作で正確にエンドトキシンを
測定することができ、しかも定量的測定ができる方法及
びその方法に使用する定量的測定試薬を提供する。
測定することができ、しかも定量的測定ができる方法及
びその方法に使用する定量的測定試薬を提供する。
本発明は上記の事情に鑑み検討の結果得られたものであ
る。
る。
すなわち、本発明は次の構成よりなる。
１、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該アメボサイト・ライセート又は
それを含む液体よりエンドトキシンをトリガーとする酵
素前駆体ファクターＣを含む画分を調製し、該ファクタ
ーＣ画分及び 一般式： Ｒ＋−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２（
式中、Ｒ８は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸残
基又はＬ−アミ）酸から戒るペプチド残基を表す。ＮＨ
，はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。）
で表される基質とエンドトキシン含有物質とを反応せし
め、この反応により生じるアンモニアをアンモニア検出
用電極手段により測定することを特徴とするエンドトキ
シンの測定法。
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該アメボサイト・ライセート又は
それを含む液体よりエンドトキシンをトリガーとする酵
素前駆体ファクターＣを含む画分を調製し、該ファクタ
ーＣ画分及び 一般式： Ｒ＋−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２（
式中、Ｒ８は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸残
基又はＬ−アミ）酸から戒るペプチド残基を表す。ＮＨ
，はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。）
で表される基質とエンドトキシン含有物質とを反応せし
め、この反応により生じるアンモニアをアンモニア検出
用電極手段により測定することを特徴とするエンドトキ
シンの測定法。
２、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該カブトガニのアメボサイト・ラ
イセート又はそれを含む液体より分離したエンドトキシ
ンをトリガーとする酵素前駆体ファクターＣ１及び 一般式： Ｒ＋−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２（
式中、Ｒ８は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸残
基又はＬ−アミノ酸から戒るペプチド残基を表す。ＮＨ
，はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。）
とからなるエンドトキシンの測定用試薬。
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該カブトガニのアメボサイト・ラ
イセート又はそれを含む液体より分離したエンドトキシ
ンをトリガーとする酵素前駆体ファクターＣ１及び 一般式： Ｒ＋−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２（
式中、Ｒ８は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸残
基又はＬ−アミノ酸から戒るペプチド残基を表す。ＮＨ
，はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。）
とからなるエンドトキシンの測定用試薬。
本発明をさらに具体的に説明すると次の通りである。
カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ匹り吐並並、ｎ吐Ｕ民■ｔ
ｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、 工、 ム１狙、 Ｃａｒｃ
ｉｎｏｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕｎ−ｄｉｃａｒｄａ
）からアメボサイト・ライセートを調製し、スルホプロ
ピル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラフィー
にアメボサイト・ライセートを付することにより、ファ
クターＣを精製分離する。
ｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、 工、 ム１狙、 Ｃａｒｃ
ｉｎｏｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕｎ−ｄｉｃａｒｄａ
）からアメボサイト・ライセートを調製し、スルホプロ
ピル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラフィー
にアメボサイト・ライセートを付することにより、ファ
クターＣを精製分離する。
このファクターＣに検体並びに式（１）で示される基質
を加え、３７°Ｃ，６０分間保温する。さらにアンモニ
ア電極を挿入し、１０分間平衡化した後に電極を読み取
る。
を加え、３７°Ｃ，６０分間保温する。さらにアンモニ
ア電極を挿入し、１０分間平衡化した後に電極を読み取
る。
式（１） Ｒ，−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−Ｎｉｌ。
（式中、Ｒ，はＮ末端に保護基を有するＬ−アミ）酸残
基又はＬ−アミノ酸から成るペプチド残基を表す。ＮＨ
ｔはＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。） アンモニア測定のためには、従来知られている任意のア
ンモニア測定法を使用することができる。
基又はＬ−アミノ酸から成るペプチド残基を表す。ＮＨ
ｔはＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している。） アンモニア測定のためには、従来知られている任意のア
ンモニア測定法を使用することができる。
しかしながらより、正確にアンモニアを測定するために
はアンモニア測定用電極を使用することが好ましい。こ
の電極としては、例えば市販のアンモニア測定用電極を
使用することもでき、又は複合型ｐＨ電極をアンモニア
選択透過膜で覆って使用することもできる。
はアンモニア測定用電極を使用することが好ましい。こ
の電極としては、例えば市販のアンモニア測定用電極を
使用することもでき、又は複合型ｐＨ電極をアンモニア
選択透過膜で覆って使用することもできる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但
し、本発明はこれらに限定されるものでない。
し、本発明はこれらに限定されるものでない。
（ｉ）エンドトキシンをトリガーとする酵素前駆体ファ
クターＣの調製法 カブトガニ血球１０ｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）ｂｕｆｆｅｒで抽出したアメボサイト・ライ
セート６０ｍ１を上記緩衝液で平衡化した５Ｐ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｇ（１０Ｘ３０Ｃ１１）にかけ
、上記緩衝液５００ｒｎｌで洗浄することより、素通り
画分として非エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因
子を得た（特願昭６３−２９２４９４号）、さらに０．
２Ｍ ＮａＣ１を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ
８，０）ｂｕｆｆｅｒ ５００ｍで溶出後、０．５Ｍ
ＮａＣ１を含む２０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，
０）ｂｕｆｆｅｒ ５００ｒｄで溶出した画分に目的と
するファクターＣを得た。
クターＣの調製法 カブトガニ血球１０ｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）ｂｕｆｆｅｒで抽出したアメボサイト・ライ
セート６０ｍ１を上記緩衝液で平衡化した５Ｐ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｇ（１０Ｘ３０Ｃ１１）にかけ
、上記緩衝液５００ｒｎｌで洗浄することより、素通り
画分として非エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因
子を得た（特願昭６３−２９２４９４号）、さらに０．
２Ｍ ＮａＣ１を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ
８，０）ｂｕｆｆｅｒ ５００ｍで溶出後、０．５Ｍ
ＮａＣ１を含む２０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，
０）ｂｕｆｆｅｒ ５００ｒｄで溶出した画分に目的と
するファクターＣを得た。
ファクターＣを溶出したクロマトグラフィーの画分と各
画分に含まれるファクターＣの量を第１図に示す。
画分に含まれるファクターＣの量を第１図に示す。
このファクターＣ画分８０ｄを５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１５により脱塩し、凍結乾燥後８０ｍＭ ＭｇＣｈ ２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）ｂｕｆｆｅｒ
１０ｒｄで溶解したものを以下のエンドトキシンの定量
に用いた。
１５により脱塩し、凍結乾燥後８０ｍＭ ＭｇＣｈ ２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）ｂｕｆｆｅｒ
１０ｒｄで溶解したものを以下のエンドトキシンの定量
に用いた。
（ｉｉ）エンドトキシン感受性因子の活性（ファクター
Ｃ活性）の測定 クロマトグラフィーの各画分のエンドトキシン感受性因
子（ファクターＣ）の活性の測定は次の方法により行っ
た。この方法により、各画分にファクターＣが含有され
ている割合を測定した。
Ｃ活性）の測定 クロマトグラフィーの各画分のエンドトキシン感受性因
子（ファクターＣ）の活性の測定は次の方法により行っ
た。この方法により、各画分にファクターＣが含有され
ている割合を測定した。
各画分１００ｕｆｆｉとエンドトキシン（リポポリサッ
カライド、 Ｌ Ｐ Ｓ）（１００ｎｇ／Ｉｄ）１０
０μｌ並びに２０ｍＭのＭｇＣ１、を含む３２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０）ｂｕｆｆｅｒ １００μ
Ｌ １−の次式で示される基質 １００μｌを混合し３７℃で１５分間保持した後、１０
％酢酸２−を加えて反応を停止し、蛍光強度を励起波長
３４６ｎｏ＋、測定波長４４２ｎｍで測定することによ
り遊離される＾ＭＣ（４−メチルアミノクマリン）Ｉを
測定した。
カライド、 Ｌ Ｐ Ｓ）（１００ｎｇ／Ｉｄ）１０
０μｌ並びに２０ｍＭのＭｇＣ１、を含む３２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０）ｂｕｆｆｅｒ １００μ
Ｌ １−の次式で示される基質 １００μｌを混合し３７℃で１５分間保持した後、１０
％酢酸２−を加えて反応を停止し、蛍光強度を励起波長
３４６ｎｏ＋、測定波長４４２ｎｍで測定することによ
り遊離される＾ＭＣ（４−メチルアミノクマリン）Ｉを
測定した。
（ｉｉｉ ）エンドトキシンの定量法
ファクターＣ１００ｕｆ、 １０ｐｇ／ｄから１１０
６ｐ／＋＋ｆｆｉの濃度のエンドトキシン（日本薬局方
標準品）を含む人血清２００μｌ（但し、人血清は６０
’Ｃ，４０分加熱処理したものを使用した。）及び１＋
Ｍの前記式（２）の基質１００μｌを混合し３７°Ｃ，
６０分間保温する。さらに１Ｍベンズアミジン２成を加
え反応を停止する。
６ｐ／＋＋ｆｆｉの濃度のエンドトキシン（日本薬局方
標準品）を含む人血清２００μｌ（但し、人血清は６０
’Ｃ，４０分加熱処理したものを使用した。）及び１＋
Ｍの前記式（２）の基質１００μｌを混合し３７°Ｃ，
６０分間保温する。さらに１Ｍベンズアミジン２成を加
え反応を停止する。
この反応停止液にアンモニア電極を挿入し、１０分間平
衡化した後に電位を読み取った。
衡化した後に電位を読み取った。
エンドトキシン濃度は１０ｐｇ／−から１０’ｐｇ／ｄ
ノ範囲においてエンドトキシンの濃度の対数とアンモニ
ア電極の電位との間に直線関係が認められた。
ノ範囲においてエンドトキシンの濃度の対数とアンモニ
ア電極の電位との間に直線関係が認められた。
この関係を第２図に示す。
本発明は、β−グルカン類に対しては反応せず、エン−
トドキシンに対する特異性の高い定量試薬として利用で
きる。さらに、エンドトキシンはグラム陰性菌の菌体成
分であるので、エンドトキシンの定量による敗血症の診
断薬としても利用できる。
トドキシンに対する特異性の高い定量試薬として利用で
きる。さらに、エンドトキシンはグラム陰性菌の菌体成
分であるので、エンドトキシンの定量による敗血症の診
断薬としても利用できる。
第１図はエンドトキシン感受性因子（ファクターＣ＞
のクロマトグラフィーによる溶出を示す図、第２図はエ
ンドトキシン定量におけるエンドトキシン濃度とアンモ
ニア電極の電位との間の直線関係を示す図である。
のクロマトグラフィーによる溶出を示す図、第２図はエ
ンドトキシン定量におけるエンドトキシン濃度とアンモ
ニア電極の電位との間の直線関係を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該アメボサイト・ライセート又は
それを含む液体よりエンドトキシンをトリガーとする酵
素前駆体ファクターＣを含む画分を調製し、該ファクタ
ーＣ画分及び 一般式：Ｒ＿１−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２（
式中、Ｒ＿１は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸
残基又はＬ−アミノ酸から成るペプチド残基を表す。Ｎ
Ｈ＿２はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している
。）で表される基質とエンドトキシン含有物質とを反応
せしめ、この反応により生じるアンモニアをアンモニア
検出用電極手段により測定することを特徴とするエンド
トキシンの測定法。 ２、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とするクロマト
グラフィーで処理し、該カブトガニのアメボサイト・ラ
イセート又はそれを含む液体より分離したエンドトキシ
ンをトリガーとする酵素前駆体ファクターＣ、及び 一般式：Ｒ＿１−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２（
式中、Ｒ＿１は、Ｎ末端に保護基を有するＬ−アミノ酸
残基又はＬ−アミノ酸から成るペプチド残基を表す。Ｎ
Ｈ＿２はＡｒｇのカルボキシル基とアミド結合している
。）とからなるエンドトキシンの測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21146289A JPH0375565A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | エンドトキシンの簡便な定量方法及びその方法に使用する試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21146289A JPH0375565A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | エンドトキシンの簡便な定量方法及びその方法に使用する試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0375565A true JPH0375565A (ja) | 1991-03-29 |
Family
ID=16606342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21146289A Pending JPH0375565A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | エンドトキシンの簡便な定量方法及びその方法に使用する試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0375565A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG107124A1 (en) * | 1994-08-19 | 2004-11-29 | Univ Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes |
| JP2007501020A (ja) * | 2003-03-17 | 2007-01-25 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 微生物夾雑物の検出のための方法および組成物 |
-
1989
- 1989-08-18 JP JP21146289A patent/JPH0375565A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG107124A1 (en) * | 1994-08-19 | 2004-11-29 | Univ Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes |
| JP2007501020A (ja) * | 2003-03-17 | 2007-01-25 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 微生物夾雑物の検出のための方法および組成物 |
| US10119969B2 (en) | 2003-03-17 | 2018-11-06 | Charles River Laboratories, Inc. | Compositions for the detection of microbial contaminants |
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