CN114636816A - 一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用，所示检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：获取重组蛋白鲎C因子蛋白；将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。本发明具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，对检测设备没有特别的要求，而且携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要。

Description

一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，具体而言，涉及一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用。

背景技术

内毒素是革兰氏阴性杆菌(gram-negativebacteria，GNB)细胞膜外壁的主要组成部分，对细菌的稳定性起重要作用。细菌内毒素分子是一种双糖结构的酰胺类脂复合物，其分子量一般在2000～2300之间，因分子量小，极易从肠系膜或组织液侵入，随血液进入循环系统。内毒素几乎无处不在，是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致病介质。内毒素血症是由于血液中或病灶内细菌释放出大量细菌内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起的一种病症。当机体受到创伤(包括手术)、烧伤、感染、放疗、化疗和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜通透性增高，肠黏膜对细菌和内毒素的通透性增高，细菌和内毒素就会大量进入血液。

目前常用的内毒素检测方法包括凝胶法、浊度法和显色法等方法。其中，凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点，可以进行定性或者半定量检测，该方法结果判读简便、经济、便捷，但精密度较差，凝胶形成容易受反应物中诸多因素影响，无法精确定量检测。浊度法是利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化，通过浊度仪测定内毒素含量的方法，该方法检测范围宽、操作简便，广泛地应用于临床，但是需要配套仪器试剂。显色法是利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少，通过分光光度计或者荧光光度计测定内毒素含量的方法，但该方法所需仪器和试剂都较昂贵，操作较复杂。以上几种检测方法测量范围达到0.005～300.000EU/mL，但是受个人临时操作以及实验环境影响很大，受到仪器的制约，每次结果差别较大，影响内毒素检测的精度。

近年来显色法得到了进一步的发展，基于重组C因子开发出来的荧光检测技术进一步提高了内毒素检测的速度以及灵敏度。但目前的内毒素的检测方法很难做到快捷，方便的现场检测，对于很多需要随时进行有效监测的应用造成很大困难。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种检测灵敏度高且能够快捷、方便的对内毒素进行检测的内毒素荧光微球探针。

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：

获取重组蛋白鲎C因子蛋白；

将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；

将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；

用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。

进一步地，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有His标签的载体pET-21a与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得PET-21a-rFC1质粒；

将PET-21a-rFC1质粒导入大肠杆菌中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

进一步地，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有Fc标签的载体pINFUSE-hIgG1-Fc2与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒；

将pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒导入HEK293/CHO细胞中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

进一步地，所述重组蛋白鲎C因子蛋白的加入量为所述活化后的荧光微球上的羧基摩尔量的1～10倍。

本发明第二方面提供了一种检测内毒素的荧光微球探针，采用第一方面任一项所述的制备方法制备得到。

本发明第三方面提供了一种内毒素检测试纸，包括第二方面所述的检测内毒素的荧光微球探针。

进一步地，还包括样品垫、荧光微球结合垫、硝化纤维素膜、吸水板和底板，硝化纤维素膜设置于所述底板的中部，所述硝化纤维素膜上设置有内毒素反应检测线和内毒素质控线，所述底板的一端端头设置有所述吸水板，在所述底板的另一端端头设置有所述样品垫，所述样品垫压设在所述荧光微球结合垫上，所述硝化纤维素膜的两端分别与所述吸水板和所述荧光微球结合垫交叠连接，所述检测内毒素的荧光微球探针固定在所述荧光微球结合垫上。

进一步地，所述荧光微球结合垫包括玻璃纤维，所述玻璃纤维上喷涂有所述检测内毒素的荧光微球探针，所述玻璃纤维和所述检测内毒素的荧光微球探针采用相同的缓冲液浸泡。

进一步地，所述内毒素反应检测线上固定有偶联复合物，所述偶联复合物由内毒素与大分子共价偶联形成上；所述内毒素质控线上固定有His标签抗体或Fc标签抗体。

本发明第四方面提供了一种内毒素的检测方法，采用第三方面任一项所述的内毒素检测试纸进行检测，包括如下步骤：

将不同浓度的内毒素标准品滴加到样品垫上，经过层析后，测定内毒素反应检测线和内毒素质控线的荧光强度，根据内毒素反应检测线的荧光强度的变化，制作标准曲线；

将带有内毒素的待测样品用缓冲液稀释后，滴加到所述样品垫上，经过层析后，测定所述内毒素反应检测线和所述内毒素质控线的荧光强度，根据所述标准曲线计算出待测样品中内毒素的含量。

本发明中将重组蛋白鲎C因子蛋白偶联到荧光微球上，并用氨基化PEG和乙醇胺封闭荧光微球上未反应的基团，形成荧光微球检测探针，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提高检测结果的准确性和可信度，此外，将荧光微球检测探针通过组装后形成内毒素检测试纸，通过层析的方式检测待测样品中的内毒素，并与标准曲线对比，计算出内毒素的含量，避免了人工判读的主观性，且该内毒素检测试纸具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，对检测设备没有特别的要求，而且内毒素检测试纸携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要，例如：室外条件没有固定设备条件的环境监测，或者研发过程中随时监测核酸蛋白纯化中内毒素水平等。

附图说明

图1为本发明实施例提供的内毒素检测试纸的结构示意图；

图2为本发明实施例3中的内毒素的标准曲线图；

图3为本发明实施例3提供的不同样品中的内毒素检测回收率的结果图。

附图标记说明：

1-样品垫；2-荧光微球结合垫；3-硝化纤维素膜；4-吸水板；5-底板；31-内毒素反应检测线；32-内毒素质孔线。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

另外，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。

此外，本发明虽然对制备中的各步骤进行了如S10、S20、S30等形式的描述，但此描述方式仅为了便于理解，如S10、S20、S30等形式并不表示对各步骤先后顺序的限定。

为解决上述问题，本申请的实施例第一方面提供了一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤S10、获取重组蛋白鲎C因子蛋白；

步骤S20、将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；

步骤S30、将活化后的荧光微球和重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；

步骤S40、用氨基化PEG和乙醇胺封闭偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。

本申请的实施例提供的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，将重组蛋白鲎C因子蛋白偶联到荧光微球上，并用氨基化PEG和乙醇胺封闭荧光微球上未反应的基团，形成荧光微球检测探针，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提高检测结果的准确性和可信度，此外，本申请的实施例检测内毒素的荧光微球探针检测内毒素，具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，还可以直接通过肉眼观察，避免了人工判读的主观性。

在步骤S10中，若重组蛋白鲎C因子(recombinantFactor C，简称rFC)蛋白在原核系统中表达，则可以采用如下方法制备得到：

步骤S11、获取重组蛋白鲎C因子基因，用PCR技术对重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

步骤S12、将带有His标签的载体pET-21a与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因进行双酶切(Nde I和Xho I双酶切)后，用DNA连接酶连接，获得PET-21a-rFC1质粒；

步骤S13、将PET-21a-rFC1质粒导入大肠杆菌shuffle感受态中进行表达，使蛋白带有6x His标签，通过镍柱进行纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白，以下简称rFC1蛋白，将rFC1蛋白于-80℃保存。

若重组蛋白鲎C因子蛋白在真核系统中表达，则可以采用如下方法制备得到：

步骤S11、获取重组蛋白鲎C因子基因，用PCR技术对重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

步骤S12、将带有Fc标签的载体pINFUSE-hIgG1-Fc2与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因进行双酶切(BglⅡ和EcoRⅠ双酶切)后，用DNA连接酶连接，获得pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒；

步骤S13、将pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒导入HEK293/CHO细胞中进行表达，使蛋白带有2x Fc标签，通过proteinA柱进行纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白，以下简称rFC2蛋白，将rFC2蛋白于-80℃保存。

其中，重组蛋白鲎C因子基因可以为市场购买得到，例如：从南京金斯瑞公司购买重组蛋白鲎C因子基因。

在步骤S20中，将羧基化的荧光微球与活化剂在常温下振荡反应15～30min中进行活化，获得活化后的荧光微球，其中，活化剂为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，EDC和NSH的摩尔比大于2：5。

活化剂的加入量为羧基化的荧光微球中羧基摩尔量的10～100倍，由此，能够保证将羧基化的荧光微球充分活化。

羧基化的荧光微球是指胶乳微球上带有羧基且能发荧光，本实施例中对羧基化的荧光微球的具体种类不做进一步地限定，本领域的技术人员可以根据实际需求进行选择，在一些可选实施例中，羧基化的荧光微球为Thermos Scientific公司商业化的羧基化含铕荧光微球，该羧基化含铕荧光微球的激发光为300～360nm，发射光为600～630nm。

由于羧基化的荧光微球的粒径与透射和散射的效率及角度有关，影响荧光微球聚集产生的光密度，影响最终试验的敏感度要求，因此，本实施例中对羧基化的荧光微球的粒径不做进一步地限定，本领域的技术人员可以根据实际需求进行选择，在一些可选实施例中，羧基化的荧光微球的粒径为200nm。

在步骤S30中，将活化后的荧光微球清洗后，与硼酸盐缓冲液(pH为8.0)和重组蛋白鲎C因子蛋白混合，使活化后的荧光微球的终浓度为0.1％w/v，在常温下进行偶联反应2～3h后，获得偶联微球。

其中，重组蛋白鲎C因子蛋白的加入量为活化后的荧光微球上的羧基摩尔量的1～10倍。

硼酸盐缓冲液(pH为8.0)的浓度为25～50mmol/L。

在步骤S40中，将偶联微球与氨基化PEG和乙醇胺混合，使偶联微球的终浓度为0.1％w/v，在4℃下过夜封闭，对偶联微球上未反应的基团进行封闭，离心去除上清液后，经过清洗后，重悬为1％w/v的微球溶液，即获得检测内毒素的荧光微球探针，于4℃保存。

其中，氨基化PEG和乙醇胺的加入量为偶联微球上的羧基摩尔量的10～100倍，以对偶联微球上多余的羧基位点进行充分封闭。

本申请的实施例第二方面提供了一种检测内毒素的荧光微球探针，该检测内毒素的荧光微球探针采用第一方面的制备方法制备得到。

本申请的实施例第三方面提供了一种内毒素检测试纸，该检测试纸包括第二方面所示的检测内毒素的荧光微球探针。

结合图1所示，该内毒素检测试纸，包括样品垫1、荧光微球结合垫2、硝化纤维素膜3、吸水板4和底板5，硝化纤维素膜3设置于底板5的中部，硝化纤维素膜3上设置有内毒素反应检测线31和内毒素质控线32，在底板5的一端端头设置有吸水板4，在底板5的另一端端头设置有样品垫1，样品垫1压设在荧光微球结合垫2上，硝化纤维素膜3的两端分别与吸水板4和荧光微球结合垫2交叠连接，检测内毒素的荧光微球探针固定在荧光微球结合垫2上。

其中，内毒素接枝到大分子上，形成偶联复合物，再将偶联复合物划线固定于硝化纤维素膜3上，作为内毒素反应检测线31。

大分子是指分子量大于60kDa的物质，将内毒素接枝到大分子上，能够增大内毒素分子，对其进行较好的锚定，使内毒素稳固在硝化纤维素膜3上，避免内毒素脱落。具体地，大分子可以为小牛血清白蛋白(简称BSA)、酪蛋白casein或卵清蛋白OVA。

内毒素质控线32上固定有His标签抗体或Fc标签抗体。具体固定哪种物质，可以根据重组蛋白鲎C因子蛋白进行选择，若重组蛋白鲎C因子蛋白带有6x His标签，则内毒素质控线32上固定His标签抗体；若重组蛋白鲎C因子蛋白带有2x Fc标签，则内毒素质控线32上固定Fc标签抗体。

样品垫1和荧光微球结合垫2均包括玻璃纤维，且玻璃纤维在用于样品垫1和荧光微球结合垫2之前需要经过如下处理：

将玻璃纤维在0.1mol/LNaOH或稀盐酸溶液中浸泡过夜，去除玻璃纤维中的内毒素，然后用无热原水(如灭菌注射用水)洗净后，将玻璃纤维在35℃下烘干；

再将玻璃纤维浸泡到与检测内毒素的荧光微球探针的缓冲液一致的溶液中(例如可以为10～50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH为8.0、0.01～0.5％v/vTween-20、0.5～2％w/vBSA、0.1-5％蔗糖、0.01-2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮))，再烘干后，获得处理后的玻璃纤维。由此，将玻璃纤维经过上述处理，能够避免检测内毒素的荧光微球堵塞在玻璃纤维上。

经过处理后的玻璃纤维可以直接作为样品垫1。

将处理后的玻璃纤维固定在喷金仪上，设置喷金仪的参数后，将检测内毒素的荧光微球探针喷涂在处理后的玻璃纤维上，于35℃下烘干过夜，得到荧光微球结合垫2。本领域的技术人员可以根据实际情况设置喷金仪的参数，本申请的实施例对此不做进一步地限定。

需要说明的是，本申请实施例中的内毒素检测试纸可以根据需要在样品垫1上增加一层滤血膜。

内毒素检测试纸切割和组装后，可以装配在卡壳中，也可以直接使用，但如果直接使用，内毒素检测试纸的使用环境需要严格控制再无菌环境中，且在使用时，可以将样品垫1朝下，没入样品液中，层析15～30min后，测定内毒素反应检测线31和内毒素质控线32的荧光强度，并计算出样品液中内毒素的含量。

本申请的实施例提供的内毒素检测试纸，将重组蛋白鲎C因子蛋白偶联到荧光微球上，并用氨基化PEG和乙醇胺封闭荧光微球上未反应的基团，形成荧光微球检测探针，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提高检测结果的准确性和可信度，此外，将荧光微球检测探针通过组装后形成内毒素检测试纸，通过层析的方式检测待测样品中的内毒素，并与标准曲线对比，计算出内毒素的含量，避免了人工判读的主观性，且该内毒素检测试纸具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，对检测设备没有特别的要求，而且内毒素检测试纸携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要，例如：室外条件没有固定设备条件的环境监测，或者研发过程中随时监测核酸蛋白纯化中内毒素水平等。

本申请的实施例第四方面提供了一种内毒素的检测方法，采用第三方面的内毒素检测试纸进行检测，具体包括如下步骤：

将不同浓度的内毒素标准品滴加到样品垫1上，层析10～15min，测定内毒素反应检测线31和内毒素质控线32的荧光强度，根据内毒素反应检测线31的荧光强度的变化，制作标准曲线；

将带有内毒素的待测样品用缓冲液稀释后，滴加到样品垫1上，层析10～15min后，测定内毒素反应检测线31和内毒素质控线32的荧光强度，根据标准曲线计算出待测样品中内毒素的含量。

本申请的实施例中提供的内毒素的检测方法，将重组蛋白鲎C因子蛋白偶联到荧光微球上，并用氨基化PEG和乙醇胺封闭荧光微球上未反应的基团，形成荧光微球检测探针，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提高检测结果的准确性和可信度，此外，将荧光微球检测探针通过组装后形成内毒素检测试纸，通过层析的方式检测待测样品中的内毒素，并与标准曲线对比，计算出内毒素的含量，避免了人工判读的主观性，且该内毒素检测试纸具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，对检测设备没有特别的要求，而且内毒素检测试纸携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要，例如：室外条件没有固定设备条件的环境监测，或者研发过程中随时监测核酸蛋白纯化中内毒素水平等。

为了对本发明进行进一步详细说明，下面将结合具体实施例对本发明进行进一步说明。本发明中的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本发明中的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市场购买所得。

实施例1

本实施例提供了一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)取0.2mg粒径为200nm的羧基化含铕荧光微球(Thermos Scientific公司购买，激发光在330±30nm，发射光在615±15nm)，用25～50mmol/L MES缓冲液(pH 6.0)洗涤两次；加入一定体积的MES缓冲液，计算羧基含量，加入10～100倍于羧基摩尔量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)(摩尔比>2:5)，常温下振荡反应15～30min；

(2)离心去除上清后，用偶联buffer(与重组蛋白鲎C因子蛋白保存缓冲液相同)清洗2～3遍，加入一定量的25～50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.0)、适量的重组蛋白鲎C因子蛋白(rFC1蛋白或rFC2蛋白)溶液混合，混合液的终体积为200ul，使活化后的荧光微球的终浓度为0.1％w/v，在常温下振荡反应2～3h后，离心去除上清后，用25～50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.0)清洗2～3遍，获得偶联微球，加入适量Tris缓冲液或者硼酸盐缓冲液，使偶联微球的浓度约为0.1％w/v；

(3)取氨基化PEG与乙醇胺，加入步骤(2)中的偶联微球溶液中，使偶联微球的终浓度约为0.1％w/v，在4℃过夜封闭，对偶联微球上未反应的基团进行封闭，离心去除上清液后，用Tris缓冲液或者硼酸盐缓冲液清洗后，重悬为1％w/v的微球溶液，即获得检测内毒素的荧光微球探针，于4℃保存。

实施例2

本实施例提供了一种内毒素检测试纸的制备方法，包括如下步骤：

(1)取内毒素(简称LPS)用千倍的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化30min后，加入一定比例的小牛血清白蛋白(简称BSA)反应3h，其中，LPS和BSA的比例为0.75mg/mL:4mg/mL)；在超滤管中加入PBS缓冲液后，加入乙醇胺或者羟胺，4℃封闭过夜，或者常温下封闭30min，获得BSA-LPS偶联复合物，将BSA-LPS偶联复合物悬浮在PBS缓冲液中于-80℃保存。

(2)将玻璃纤维在0.1mol/L NaOH溶液中浸泡过夜，去除玻璃纤维中的内毒素，然后用灭菌注射用水洗净后，将玻璃纤维在35℃下烘干，再用50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH为8.0、0.05％v/v Tween-20、2w/v％蔗糖、0.5％PVP)浸泡1h，35℃烘干过夜，获得处理后的玻璃纤维，经过处理后的玻璃纤维直接作为样品垫；

(3)取步骤(2)中部分经过处理后的玻璃纤维固定在喷金仪上，设置喷金仪的参数后，将检测内毒素的荧光微球探针配制为0.01～0.05％w/v浓度的微球溶液喷涂在处理后的玻璃纤维上，于35℃下烘干过夜，得到荧光微球结合垫；

(4)取硝化纤维膜，固定在划线仪上，将步骤(1)中的BSA-LPS偶联复合物配制成0.5～10EU/mL的内毒素溶液，将内毒素溶液划线固定在硝化纤维素膜的内毒素反应检测线上，将0.25～2mg/mL的His标签抗体(用于rFC1适配)或Fc标签抗体(用于rFC2适配)划线固定在硝化纤维素膜的内毒素质控线上，于35℃烘干过夜，得到处理后的硝化纤维素膜；

(5)将步骤(4)中处理后的硝化纤维素膜设置于PVC底板的中部，在PVC底板的一端端头设置有吸水板，在PVC底板的另一端端头设置样品垫，样品垫压设在荧光微球结合垫上，硝化纤维素膜的两端分别与吸水板和荧光微球结合垫交叠连接，组装好之后用切条机切割成2.8～4mm宽的试纸条，装配在卡壳中，得到内毒素检测试纸。

实施例3

本实施例提供了一种通过内毒素检测试纸检测内毒素的方法，包括如下步骤：

(1)将内毒素冻干粉用阴性缓冲溶液溶解(即10mmol/LBB pH 8.0、0.01～2％w/vPVP、0.01～0.5％v/v Tween-20、0.1～5％w/v蔗糖、0.01～0.5％w/vBSA)，并用阴性缓冲液将内毒素冻干粉配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4EU/mL的内毒素溶液，用阴性缓冲溶液作为阴性对照，即内毒素的浓度为0；

分别取不同浓度的内毒素溶液，运用移液器滴加50～200ul的内毒素溶液到层析试纸条的样品垫上(卡壳装则滴在样品槽)，层析10～20min，然后测定T线与C线处的荧光强度(330nm激发，610nm接收)，按照信号变化计算出标准曲线，不同浓度的内毒素溶液在T线和C线处的荧光强度结果如表1所示，标准曲线如图2所示。

(2)取带有内毒素的待测样品，用步骤(1)中的阴性缓冲溶液将待测样品梯度稀释4、8、16、32、64倍，稀释后各分为两份，其中一份另行添加0.5EU/mL内毒素标准品作为对照，记为F0，另一份记为F1，每个样品平行测定3次，取平均值；

运用移液器分别取各个待测样品50～200uL，滴加50～200ul的待测样品溶液到层析试纸条的样品垫上(卡壳装则滴在样品槽)，层析10～20min，然后测定T线与C线处的荧光强度，根据图2中的标准曲线中计算得到内毒素浓度，计算结果如表2所示。

表1内毒素标准品的荧光强度

表2内毒素待测样品中内毒素的浓度

由表2中的计算结果可以得出，该带有内毒素的待测样品中约含有2.1EU/mL的内毒素，添加0.5EU/mL作为对照的组别，也可以很精确的计算出带有内毒素的待测样品中的内毒素的浓度，由此也说明了本实施例提供的内毒素检测试纸提高了检测结果的准确性和可信度，且无需使用昂贵的仪器，检测时间短，重复性好以及灵敏度高。

为了内毒素检测试纸的检测效果，同时在多种样品中添加相同量的内毒素，以检测结果值/内毒素的添加量＝回收率，可以发现不同样品回收率有较大不同，图3为不同样品中的内毒素检测回收率示意图，由图3可以看出，在灭菌注射用水中回收率为0.98，说明本实施例中的内毒素检测试纸检测内毒素的效果明显。基于内毒素的特性，血浆样品(兔血浆或人血浆)中本身会存在内毒素，而血清与灭菌注射用水中表现良好，说明本实施例中的内毒素检测试纸可以适用于水相与血清中的内毒素检测。

实施例4

本实施例提供了内毒素检测试纸各项性能指标测试

(1)灵敏度试验

测定6种不同的内毒素含量的样品，即内毒素的浓度分别为0.001EU/mL、0.005EU/mL、0.01EU/mL、0.02EU/mL、0.05EU/mL、0.1EU/mL，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，得到如表3所示的结果，从表3可见，本实施例中的内毒素检测试纸的灵敏度为0.005EU/mL。

表3

(2)高值线性测定

测定6个不同内毒素含量的样品，即内毒素的浓度分别为0.05EU/mL、0.1EU/mL、0.5EU/mL、1EU/mL、2EU/mL、4EU/mL，每个样品测3次，得到表4所示的结果，从表4可见，本实施例中的内毒素检测试纸的最高检测范围可达到4EU/mL，判定依据r²≥0.990。

表4

(3)精密度试验

使用2个不同内毒素含量的样品，测定本实施例中的内毒素检测试纸的批内精密度，使用3批次内毒素检测试纸分别测定1个样品20次，计算本实施例中的内毒素检测试纸的批间相对极差，得到表5和表6所示的结果。结果表明，本实施例中的内毒素检测试纸的批内精密度为12.41％(见表5，以误差最大值计)，批间相对极差为4.89％(见表6，以误差最大值计)。

表5

表6

(4)稳定性试验

在2～8℃贮存条件下，分别在0天、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、12个月对同一血清样品进行测定，每个样品测6次，取平均值(结果见表7)。结果表明，6个月以前的测得值相比0天差异很小，说明本发明的内毒素检测试纸在2～8℃贮存条件下可稳定6个月。

表7

由以上实施例可以看出，本发明实施例提供的内毒素检测试纸具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰性好及生产成本低的优点。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取重组蛋白鲎C因子蛋白；

将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；

将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；

用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。

2.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有His标签的载体pET-21a与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得PET-21a-rFC1质粒；

将PET-21a-rFC1质粒导入大肠杆菌中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有Fc标签的载体pINFUSE-hIgG1-Fc2与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒；

将pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒导入HEK293/CHO细胞中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

4.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白的加入量为所述活化后的荧光微球上的羧基摩尔量的1～10倍。

5.一种检测内毒素的荧光微球探针，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种内毒素检测试纸，其特征在于，包括权利要求5所述的检测内毒素的荧光微球探针。

7.根据权利要求6所述的内毒素检测试纸，其特征在于，还包括样品垫、荧光微球结合垫、硝化纤维素膜、吸水板和底板，硝化纤维素膜设置于所述底板的中部，所述硝化纤维素膜上设置有内毒素反应检测线和内毒素质控线，所述底板的一端端头设置有所述吸水板，在所述底板的另一端端头设置有所述样品垫，所述样品垫压设在所述荧光微球结合垫上，所述硝化纤维素膜的两端分别与所述吸水板和所述荧光微球结合垫交叠连接，所述检测内毒素的荧光微球探针固定在所述荧光微球结合垫上。

8.根据权利要求7所述的内毒素检测试纸，其特征在于，所述荧光微球结合垫包括玻璃纤维，所述玻璃纤维上喷涂有所述检测内毒素的荧光微球探针，所述玻璃纤维和所述检测内毒素的荧光微球探针采用相同的缓冲液浸泡。

9.根据权利要求7所述的内毒素检测试纸，其特征在于，所述内毒素反应检测线上固定有偶联复合物，所述偶联复合物由内毒素与大分子共价偶联形成上；所述内毒素质控线上固定有His标签抗体或Fc标签抗体。

10.一种内毒素的检测方法，其特征在于，采用权利要求6至9任一项所述的内毒素检测试纸进行检测，包括如下步骤：

将不同浓度的内毒素标准品滴加到样品垫上，经过层析后，测定内毒素反应检测线和内毒素质控线的荧光强度，根据内毒素反应检测线的荧光强度的变化，制作标准曲线；

将带有内毒素的待测样品用缓冲液稀释后，滴加到所述样品垫上，经过层析后，测定所述内毒素反应检测线和所述内毒素质控线的荧光强度，根据所述标准曲线计算出待测样品中内毒素的含量。

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