CN108398561A - 利用光学微腔生物传感器对化合物进行特异性检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物特异性检测技术领域,具体为利用微腔生物传感器对目标小分子化合物进行特异性检测的方法。本发明首先利用硅烷偶联剂与碱性环境处理后二氧化硅材质的微腔表面羟基会发生吸附和反应的原理,将活性氨基或环氧基固定在微腔表面;氨基或环氧基和蛋白质以及DNA等生物分子发生偶联,底物利用氨基或环氧基固定在微腔表面,作为特异性检测的探针;对微腔表面进行钝化,将微腔表面未占据的氨基或环氧基结合位点封闭;通入目标分子进行特异性检测,当目标分子和底物结合时,改变了光学微腔模式的有效折射率,导致模式发生红移,从而实现灵敏度高检测。本发明方法成本低廉,操作简单,节省耗材。
Description
技术领域
本发明属于化合物特异性检测技术领域,具体涉及利用光学微腔生物传感器对目标小分子化合物进行特异性检测的方法。
背景技术
随着现代科学技术的发展,特别是生命科学、临床医学等新兴科学的发展,生物大分子分析、药物分析、生物活性物质分析等大量新课题不断涌现,对于分析结果的要求也越来越高,不再局限与简简单单的有什么,而是要在较短的时间内在检测物低使用量的前提下提供物质更多更全面的信息。生物传感器就是在此基础上发展的一种新型测试分析装置,它可以固定生物成分或生物活性物质作为敏感元件,能够感受特定的靶分子并且按照一定规律将这种感知转换为可识别信号。以不同种被测目标与分子识别的相互作用方式可以将生物传感器分为多个种类,其中以待分析物与识别元件特异性结合能力为基础的生物传感器已经成为当下的研究热点。
光学微腔传感器作为一种新型的生物传感器,具高灵敏度、低探测极限、 检测速度快等优点,已经广泛的应用于生物样品的检测,如细胞、 DNA、病毒以及蛋白质。光学微腔,它们拥有独特的结构,可以形成微流通道,由于采用微流技术,在操控 pL~μL 量级的流体方面有独特的优势。并且当被测目标和分子识别原件特异性结合时,改变了微腔模式的有效折射率,谐振光波的中心频率发生移动,从而可以观测到被测目标和分子识别原件特异性结合信号。
因此,本发明提出了一套完整的光学微腔生物传感器的表面修饰和特异性检测方法,该工艺可以利用不同种类的生物蛋白分子或化合物小分子作为探针,对大量的分子进行特异性的检测,并且可以利用微腔灵敏度高的优势,对低浓度的小分子进行特异性的探测,并且成本低廉,操作简单,节省耗材。
发明内容
本发明目的在于提出一种灵敏度高、成本低廉、操作简单的利用光学微腔生物传感器对目标化合物进行特异性检测的方法。
本发明提出的利用光学微腔生物传感器对目标化合物进行特异性检测的方法,是先对光学微腔生物传感器的微腔进行表面化学修饰,然后进行特异性检测;当检测探针和目标化合物发生特异性反应,使分布在微腔表面的模式有效折射率发生稳定性的变化,导致模式的中心波长发生红移;而如果没有发生特异性反应时,模式不存在稳定性的变化。从而实现灵敏度高检测。本发明方法的具体步骤如下:
(1)对光学微腔生物传感器的微腔通入碱性溶液,在微腔表面形成羟基吸附;
(2)将偶联剂的酒精溶液通入微腔内,静置反应1.5-2小时;所述偶联剂为氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS);
(3)将酒精,去离子水依次通入微腔内,去除未反应的偶联剂残留溶液;
(4)将样品置于烘箱内烘干;
(5)取出经烘干处理后的微泡样品,通入作为检测探针的底物的溶液,孵化1.5-2小时;
(6)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(7)通入高浓度与检测探针和目标小分子化合物都无反应的溶液,封闭残存的结合位点;
(8)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(9)通入用于特异性检测的目标小分子化合物;
(10)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液,观察脱附现象。
本发明中,使用设备有:光纤熔接机,恒温烘箱,真空压缩机械泵,可调谐激光器,超声清洗机等。
本发明步骤(1)中,所述微腔的材料一般为二氧化硅玻璃。所述碱性溶液为常见溶液,如NaOH溶液,氨水溶液等。
本发明步骤(2)中,所述偶联剂酒精溶液的体积浓度为0.5-2%,即偶联剂氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)与酒精的体积比为0.5-2%。
本发明步骤(4)中,所述烘箱的温度为100-120℃,烘干为1.5-2小时。
本发明步骤(5)中,所述作为检测探针的底物可以为一些常见的一些蛋白质分子,化合物小分子,如一些抗原抗体分子、DNA分子。
本发明步骤(7)中,所述通入微摩尔每毫升(uM/ml)高浓度用于封闭剩余结合位点的小分子溶液,需要有充分时间,在微腔表面完全封闭残存的羟基或环氧基结合位点,具体时间为1-2小时。用于封闭的溶液为与底物和分析物都无反应的小分子溶液,如在HIV抗体探测中使用牛血清蛋白(BSA)溶液或山羊血清蛋白溶液。
本发明首先利用硅烷偶联剂与碱性环境处理后二氧化硅材质的微腔表面羟基会发生吸附和反应的原理,将活性氨基或环氧基固定在微腔表面。活性的氨基或环氧基可以和蛋白质以及DNA等生物分子发生偶联,底物通过氨基或环氧基固定在微腔的表面,作为特异性检测的探针。利用高浓度与探针和目标都无相互反应的分子对微腔表面进行钝化,将微腔表面未占据的氨基或环氧基结合位点封闭。经过表面处理后,通入目标分子进行特异性检测,当目标分子和底物结合时,改变了光学微腔模式的有效折射率,从而导致模式发生红移。本发明提出了一套完整光学微腔生物传感器的表面修饰和特异性检测方法,该工艺可以利用不同种类的生物蛋白作为探针,对大量的生物分子进行特异性的检测,并且可以利用光学微腔灵敏度高的优势,对低浓度的小分子进行特异性的探测,并且成本低廉,操作简单,节省耗材。本发明可无标记的检测不同的小分子化合物,避免了使用标记物带来的实验中反应过程的复杂性,同时利用了微腔灵敏度高的特性,在极低的浓度下实现对小分子化合物的探测。
附图说明
图1是封装型微泡腔结构示意图.。
图2是以链霉亲和素(SA)为底物时,进行特异性检测微腔表面修饰的流程示意图。
图3是封装型微泡腔检测小分子化合物生物素(Biotin)模式移动信号。
图4是封装型微泡腔检测小分子化合物mag模式移动信号。
图5是封装型微泡腔检测小分子化合物med模式移动信号。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明:
实施例:利用光学微腔生物传感器的表面修饰进行特异性检测,在封装的微泡腔内采用硅烷偶联剂APTMS固定底物链霉亲和素(SA)(作为探针),筛选与链霉亲和素(SA)有特异性反应的分子biotin,封装的微泡腔结构如图1,具体步骤为:
(1)光学微腔生物传感器的微腔通入碱性溶液(NaOH溶液),在微腔表面形成羟基吸附;
(2)将作为偶联剂的浓度为1%氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)与酒精的混合溶液通入微腔内,静置孵化1h;
(3)将酒精,去离子水依次通入微腔内,去除未反应的氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)残留溶液;
(4)将样品置于烘箱内120℃,烘干2小时;
(5)取出经烘干处理后的微泡样品,使用波长为850nm附近的可调谐激光器,搭建耦合系统,将微泡腔内通入底物小分子链霉亲和素(SA),孵化2小时;
(6)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(7)通入高浓度牛血清蛋白(BSA)溶液,封闭残存的结合位点;
(8)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(9)通入用于特异性检测的生物小分子(biotin);
(10)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液,观察脱附现象;
(11)处理模式移动数据,发现观察到明显的结合信号以及较小的脱附信号,与已知的链霉亲和素(SA)与小分子化合物生物素(Biotin)具有较强结合能力相符,其导致模式的移动信号如图3所示。
实施例2:利用光学微腔生物传感器的表面修饰进行特异性检测,在封装的微泡腔内采用硅烷偶联剂APTMS固定底物链霉亲和素(SA)(作为探针),检测小分子化合物mag,具体步骤为:
(1)光学微腔生物传感器的微腔通入碱性溶液(NaOH溶液),在微腔表面形成羟基吸附;
(2)将作为偶联剂的浓度为1%氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)与酒精的混合溶液通入微腔内,静置孵化2h;
(3)将酒精,去离子水依次通入微腔内,去除未反应的氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)残留溶液;
(4)将样品置于烘箱内120℃,烘2小时;
(5)取出经烘干处理后的微泡样品,使用波长为850nm附近的可调谐激光器,搭建耦合系统,将微泡腔内通入底物小分子链霉亲和素(SA),孵化2小时;
(6)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(7)通入高浓度牛血清蛋白(BSA)溶液,封闭残存的结合位点;
(8)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(9)通入用于特异性检测的生物小分子mag;
(10)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液,观察脱附现象;
(11)处理模式移动数据,观察到与检测小分子化合物生物素(Biotin)时呈现的结合信号以及较小的脱附信号一致,从而证明小分子化合物mag与链霉亲和素(SA)同样有特异性结合能力,其导致模式的移动信号如图4所示。
实施例3:利用光学微腔生物传感器的表面修饰进行特异性检测,在封装的微泡腔内采用硅烷偶联剂APTMS固定底物链霉亲和素(SA)为探针,检测小分子化合物Reb,具体步骤为:
(1)光学微腔生物传感器的微腔通入碱性溶液(NaOH溶液)在微腔表面形成羟基吸附;
(2)将作为偶联剂的浓度为1%氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)与酒精的混合溶液通入微腔内,静置孵化2h;
(3)将酒精,去离子水依次通入微腔内,去除未反应的氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)残留溶液;
(4)将样品置于烘箱内120℃,烘干2小时;
(5)取出经烘干处理后的微泡样品,使用波长为850nm附近的可调谐激光器,搭建耦合系统,将微泡腔内通入底物小分子链霉亲和素(SA),孵化2小时;
(6)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(7)通入高浓度牛血清蛋白(BSA)溶液,封闭残存的结合位点;
(8)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液;
(9)通入用于特异性检测的生物小分子Reb;
(10)通入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液,冲去残留溶液,观察脱附现象;
(11)处理模式移动数据,未观察到明显的结合信号,从而证明小分子化合物Reb与链霉亲和素(SA)无特异性结合能力,其导致模式的移动信号如图5所示。
Claims (7)
1.一种利用光学微腔生物传感器对目标化合物进行特异性检测的方法,其特征在于,先对光学微腔生物传感器的微腔进行表面化学修饰,然后进行特异性检测;当检测探针和目标化合物发生特异性反应,使分布在微腔表面的模式有效折射率发生稳定性的变化,导致模式的中心波长发生红移,实现灵敏度高检测,具体步骤如下:
(1)对光学微腔生物传感器的微腔通入碱性溶液,在微腔表面形成羟基吸附;
(2)将偶联剂的酒精溶液通入微腔内,静置反应1.5-2小时;所述偶联剂为氨丙基三甲氧基硅烷或3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷;
(3)将酒精、去离子水依次通入微腔内,去除未反应的偶联剂残留溶液;
(4)将样品置于烘箱内,烘干;
(5)取出经烘干处理后的微泡样品,通入作为检测探针的底物的溶液,孵化1.5-2小时;
(6)通入磷酸盐缓冲液溶液,冲去残留溶液;
(7)通入高浓度与检测探针和目标小分子化合物都无反应的溶液,封闭残存的结合位点;
(8)通入磷酸盐缓冲液溶液,冲去残留溶液;
(9)通入用于特异性检测的目标小分子化合物;
(10)通入磷酸盐缓冲液溶液,冲去残留溶液,观察脱附现象。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述碱性溶液为NaOH溶液,或氨水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述偶联剂酒精溶液的体积浓度为0.5-2%。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中所述烘箱的温度为100-120℃,烘干为1.5-2小时。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中所述作为检测探针的底物为抗原抗体分子、DNA分子。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(7)中,所述通入高浓度与检测探针和目标小分子化合物都无反应的溶液,封闭残存的结合位点,时间1-2小时。
7.根据权利要求1、5或6所述的方法,其特征在于,步骤(7)中,在HIV抗体探测中,通入的溶液为牛血清蛋白溶液或山羊血清蛋白溶液。
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