CN111443011A - 确定基底表面硅烷密度的方法以及制备芯片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种确定基底表面硅烷密度的方法,包括:(1)使所述基底表面的所述硅烷与荧光分子连接;(2)对经过步骤(1)处理的所述基底表面进行钝化处理;和(3)基于所述荧光分子的信号,确定所述基底表面的所硅烷密度。利用该方法能够有效地确定基底表面的硅烷密度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体而言,本发明涉及确定芯片表面硅烷密度的方法和制备芯片的方法。
背景介绍
在生物技术领域中,利用硅烷修饰玻璃基底的表面,经常应用于传感芯片、微流控芯片,特别基因芯片和测序芯片。
通常而言,硅烷通过水解能够形成活性硅羟基,进而能够与玻璃基底表面的活性羟基反应,从而硅烷可以与玻璃基底会形成Si-O-Si共价键而连接在玻璃基底上。该反应能够将硅烷连接在玻璃基底上,显然,硅烷密度将决定后续可以结合的核酸分子的密度。然而,目前的工艺很难控制玻璃基底表面的硅烷密度,究其原因之一在于,硅烷分子与玻璃基底表面链接数目无法得到简单、快捷和有效的确定。
目前常用的检测芯片表面硅烷密度,通常采用高端仪器或复杂操作流程来检测,研发和生产成本较高。
因此,目前确定芯片表面硅烷密度的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种确定基底表面硅烷密度的方法,根据本发明的实施例,该方法包括:(1)使基底表面的硅烷与荧光分子连接;(2)对经过前述处理的所述基底表面进行钝化处理;(3)基于所述荧光分子的信号,确定所述基底表面的所硅烷密度。
由此,利用该方法能够有效地通过荧光分子的信号,确定硅烷在基底表面的密度,该方法能够简单、便捷地对基底表面所结合的硅烷数目进行量化,进一步可以有效地控制基底处理工艺,从而能够有效地控制可以和硅烷连接的目标分子数目,例如核酸分子的数目。
在本发明第二方面,本发明提出了一种制备芯片的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:(a)对所述芯片的基底进行表面活化处理,以便在所述基底的表面形成活性羟基基团;(b)使所述活性羟基基团与硅烷基团连接;(c)使所述硅烷基团与目标分子相连;(d)对经过步骤(c)处理的所述芯片基底进行钝化处理。利用该方法,能够有效地在芯片基底的表面形成期望的硅烷密度和目标分子的密度。
由此,根据本发明的实施例,基于目前对芯片表面硅烷密度的检测方法存在的不足,本发明提供了一种检测芯片表面硅烷密度的方法,该方法操作简单、可以对芯片表面硅烷密度进行定量检测。另外,根据本发明的实施例,根据硅烷芯片在不同溶液中的稳定性不同,本发明提供了一种制备芯片的方法可以针对不同平台和需求提供不同硅烷密度的芯片。
附图说明
图1显示了根据本发明一个实施例,芯片表面的环氧硅烷密度变化曲线示意图;
图2显示了根据本发明一个实施例,芯片表面的氨基硅烷密度变化曲线示意图;
图3显示了根据本发明一个实施例,芯片表面硅烷的基本结构示意图;
图4显示了根据本发明一个实施例,NHS芯片的结构示意图。
具体实施方式
下面参考具体实施例和附图,对本发明进行说明。需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种确定基底表面硅烷密度的方法,根据本发明的实施例,该方法包括:
在第(1)步中,使基底表面的硅烷与荧光分子连接。
可以应用于本发明方法的基底材料并不受特别限制,根据本发明的实施例,所述基底由玻璃、硅片、塑料、凝胶和尼龙膜的至少之一形成。其中,优选采用玻璃作为基底的材料,由此,可以方便地通过对玻璃进行活化处理后,在经过活化的玻璃表面形成活性羟基基团,进一步通过硅烷基团与该活性羟基基团形成共价键,从而在基底的表面连接硅烷基团。
根据本发明的实施例,硅烷与荧光分子的连接并不受特别限制,其中,优选通过共价键连接。根据本发明的实施例,所述荧光分子适于与所述硅烷通过氨基或亚氨基形成共价键合。根据本发明的实施例,所述硅烷携带环氧基团、NHS基团、醛基、氨基、亚氨基和羧基的至少之一,所述荧光分子携带氨基、亚氨基和NHS基团的至少之一。本领域技术人员能够理解的是,检测的荧光数目的多少与参与反应的硅烷数目相对应,通过荧光数目和分布可对芯片表面硅烷的密度进行定量分析。由此,可以进一步有效地形成稳定的共价连接,以便用于后期通过检测荧光分子的信号,确定基底表面所形成的硅烷的密度。
根据本发明的实施例,所述基底为芯片的至少一部分。根据本发明的实施例,所述芯片是通过溶液或者化学气相沉积法形成的。在本文中所使用的术语“芯片”的含义是表面固定可以参与化学反应的物质(例如硅烷)的固相支持物。在本文中所使用的术语“硅烷”是硅与氢的化合物,是一系列化合物的总称,在本发明中硅烷包含环氧硅烷、羧基硅烷和氨基硅烷。
在本发明的一个实施例中,芯片表面的硅烷为环氧基硅烷或羧基硅烷。
根据本发明的具体实施例,环氧硅烷是3-缩水甘油醚氧基丙基和羟基丙基三甲氧基硅烷在带有活性羟基表面的玻璃片表面形成环氧硅烷。所称羧基硅烷指的是含有羧基的硅烷,羧基作为活性基团参与反应,如与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)反应形成NHS芯片,羧基转化为酰基。
在本发明的一个实施例中,与芯片表面的环氧基硅烷或羧基硅烷反应的荧光分子是与玻璃表面环氧基或者酰基/羧基产生化学链接的荧光分子,如氨基荧光分子。所称氨基荧光分子指的是荧光分子与含有氨基的基团链接,如氨基cy3分子(NH2-Cy3、NH2-核酸-Cy3)、氨基atto647(NH2-atto647、NH2-核酸-atto647)分子、Cy3-PEG-NH2,等,荧光基团与氨基的链接方式可以用生化反应常用的化学键进行链接,氨基作为与活性基团与芯片表面的环氧基硅烷或羧基硅烷反应。
在本发明的一个实施例中,芯片表面的硅烷为氨基硅烷。氨基硅烷为硅烷带有氨基或亚氨基,可以理解,氨基硅烷是一类化合物的总称,参考图3,当芯片表面为氨基硅烷时,R1含有NH2或NH,在具体实施例中,利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷制备氨基硅烷芯片。
在本发明的一个实施例中,与芯片表面的氨基硅烷反应的荧光分子是与玻璃表面氨基产生化学链接的荧光分子,如NHS荧光分子,或COOH荧光分子,其中所称NHS荧光分子指的是荧光分子与含有NHS的基团链接,如NHS-核酸-cy3分子。
根据本发明的实施例,氨基芯片可为溶液法制备的芯片和/或化学气相沉积法制备的芯片,不同制备方法制备的芯片,在进行过后续钝化处理时,芯片表面的硅烷密度变化趋势不同,即两者在钝化溶液中的稳定性不同,根据芯片硅烷密度需求,两种芯片选择不同的钝化处理条件,如pH值、时间等。从实验结果看,在相同的钝化处理条件下,溶液法制备的芯片稳定性低于化学气相沉积法制备的芯片。
在第(2)步中,对经过前述处理的所述基底表面进行钝化处理。
在该步骤中,可以通过钝化处理,去除芯片表面不稳定的活性基团和/或降低、稳定芯片表面参与反应的活性基团密度,以及去除因非特异性吸附等方式非特异性地结合到芯片表面的物质如荧光分子或其它分子。根据本发明的实施例,活性基团包括是芯片表面的硅烷。
根据本发明的实施例,所述钝化处理是通过使所述基底与所述碱性溶液接触进行的,所述碱性溶液的pH值为8~11。
根据本发明的实施例,所述碱性溶液包括选自磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液的至少之一。
根据本发明的实施例,所述磷酸盐缓冲液含有磷酸氢钾和磷酸二氢钾,所述碳酸盐缓冲液含有碳酸钠和碳酸氢钠。
根据本发明的实施例,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下进行8~24小时。
根据本发明的实施例,所述钝化处理进行12~24小时。
根据本发明的实施例,将荧光分子与硅烷链接后,可以用水和/或连接反应所用的溶液(不包含荧光分子)对芯片进行清洗处理后检测荧光。通过进行钝化处理,可以有效地避免荧光密度太大而不能准确定量荧光分子数目,也能够避免非特异吸附的荧光分子所引起的检测结果不准确。通过钝化处理,能够有效去除非特异吸附造成的密度检测不准确的问题,同时可以排除硅烷本身不稳定造成的荧光定量和实际使用时密度不一致的问题。
根据本发明的实施例,钝化溶液为碱性缓冲液,所述碱性缓冲液的pH为8~11。经过对比测试发现,当缓冲液的pH低于8时,进行钝化处理所需要的时间较长,操作不方便,同时当缓冲液的pH值大于11时,进行钝化处理时,芯片表面的硅烷分子可能会不稳定,不易控制反应条件使其达到所需密度。
根据本发明的实施例,碱性溶液可优选为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液具体为磷酸氢钾和磷酸二氢钾形成的缓冲液,其pH值可以通过HEPES缓冲溶液进行调节。碳酸盐缓冲液具体为碳酸钠和碳酸氢钠形成的缓冲液,盐浓度为50mM~2000mM,其pH值可以通过PB或HEPES缓冲溶液进行调节。在采用不同pH值的缓冲液进行钝化处理时,荧光数目会随着钝化处理的时间变化而变化,处理的时间越长荧光数目越少,不同的pH处理,荧光数目的变化快慢有差异。但在前8小时内,荧光数目变化趋势基本相同。芯片表面的硅烷数目变化趋势与荧光信号变化趋势相同。
根据本发明的实施例,表面为环氧基硅烷或羧基硅烷的芯片和氨基荧光分子反应结束后,进行钝化处理,钝化处理采用的温度为20℃-42℃。钝化处理的时间为8h-24h,发明人发现,钝化处理小于8小时以内,不同pH处理的芯片荧光数目变化趋势基本相同,可推测,钝化处理时间在8小时以内,钝化处理对荧光的影响主要是去除固定不稳的硅烷,和/或非特异性吸附荧光分子。具体的钝化时间依据荧光显微镜检测上限和/或所需芯片表面硅烷密度而定。
在本发明的一个实施例中,表面为氨基硅烷的芯片在和NHS荧光分子反应结束后,进行钝化处理,钝化处理选择的PH为8~11,钝化处理采用的温度为20℃-42℃,钝化处理的时间为12h-24h,基于环氧基硅烷芯片和羧基硅烷芯片钝化处理条件及氨基芯片说明书提供的表面氨基硅烷密度的信息,钝化处理时间最少选择12小时进行处理,这与目前检测平台检测的芯片密度的上限有关,当荧光检测平台对荧光的分辨能力提高,钝化处理的时间可最少选为8小时。
根据本发明实施例,不同硅烷种类的表面修饰和不同的修饰方法,可以使用特定的反应条件(包括pH值,体积,温度,反应时间等),以得到合适的表面修饰密度,以便进一步有效地测定表面修饰的密度。如果钝化条件太弱,有可能导致荧光点过于密集,超出检测平台检测上限,如果钝化条件太强,可能导致残留的荧光点数过少。
在第(3)步中,基于所述荧光分子的信号,确定所述基底表面的所硅烷密度。
本领域技术人员可以通过现有技术中已知的手段进行荧光分子的信号检测,例如用荧光显微镜下拍摄芯片表面多个位点,检测特定波长,用ImageJ等图像处理软件分析图片并计算荧光点数,通过计算单位面积内的平均荧光点数对玻璃片表面上环氧硅烷的密度进行定量分析。当然本领域技术人员可以通过采用其他书手段在此不再赘述。
在确定荧光分子的信号例如单位面积内的平均荧光点数,可以将其转换为硅烷分子的密度,例如通过标准曲线,或者预先通过标准品确定的关系式,进行转换,在此不再赘述。
由此,利用该方法能够有效地通过荧光分子的信号,确定硅烷在基底表面的密度,该方法能够简单、便捷地对基底表面所结合的硅烷数目进行量化,进一步可以有效地控制基底处理工艺,从而能够有效地控制可以和硅烷连接的目标分子数目,例如核酸分子的数目。
在本发明第二方面,本发明提出了一种制备芯片的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:(a)对所述芯片的基底进行表面活化处理,以便在所述基底的表面形成活性羟基基团;(b)使所述活性羟基基团与硅烷基团连接;(c)使所述硅烷基团与目标分子相连;和(d)对经过步骤(c)处理的所述芯片基底进行钝化处理。利用该方法,能够有效地在芯片基底的表面形成期望的硅烷密度和目标分子的密度。
根据本发明的实施例,将目标分子与硅烷链接后,进行钝化处理,可以有效地避免目标分子密度太大,也能够避免非特异吸附的目标分子所引起的检测结果不准确。通过钝化处理,能够有效去除非特异吸附造成的密度检测不准确的问题,同时可以排除硅烷本身不稳定造成的固定的目标分子和实际使用时密度不一致的问题。采用此方法可以获得目标分子密度稳定的芯片。
根据本发明的实施例,上述方法还可以具有下列附加技术特征的至少之一:
根据本发明的实施例,所述钝化处理是通过使所述基底与所述碱性溶液接触进行的,所述碱性溶液的pH值为8~11。
根据本发明的实施例,所述碱性溶液包括选自磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液的至少之一。
根据本发明的实施例,所述磷酸盐缓冲液含有磷酸氢钾和磷酸二氢钾,所述碳酸盐缓冲液含有碳酸钠和碳酸氢钠。
根据本发明的实施例,所述钝化处理是是在20~42摄氏度的温度下进行8~24小时。
根据本发明的实施例,所述钝化处理进行12~24小时。
根据本发明的实施例,所述目标分子为核酸分子,例如DNA分子、RNA分子或者cDNA分子。所述核酸分子可选择性地携带荧光分子。
根据本发明的实施例,所述目标分子适于与所述硅烷通过氨基或亚氨基形成共价键。
根据本发明的实施例,所述硅烷携带环氧基团、NHS基团、醛基、氨基、亚氨基和羧基的至少之一,所述目标分子携带氨基、亚氨基和NHS基团的至少之一。
根据本发明的实施例,所述硅烷携带环氧基硅烷或羧基硅烷,所述目标分子携带氨基,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下进行8~24小时。
根据本发明的实施例,所述硅烷携带氨基,所述目标分子携带NHS基团,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下钝化处理进行12~24小时。
根据本发明的实施例,钝化溶液为碱性缓冲液,所述碱性缓冲液的pH为8~11。经过对比测试发现,当缓冲液的pH低于8时,进行钝化处理所需要的时间较长,操作不方便,同时当缓冲液的pH值大于11时,进行钝化处理时,芯片表面的硅烷分子可能会不稳定,不易控制反应条件使其达到所需密度。
根据本发明的实施例,碱性溶液可优选为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液具体为磷酸氢钾和磷酸二氢钾形成的缓冲液,其pH值可以通过HEPES缓冲溶液进行调节。碳酸盐缓冲液具体为碳酸钠和碳酸氢钠形成的缓冲液,盐浓度为50mM~2000mM,其pH值可以通过PB或HEPES缓冲溶液进行调节。在采用不同pH值的缓冲液进行钝化处理时,目标分子的密度和数目会随着钝化处理的时间变化而变化,处理的时间越长固定的目标分子越少,不同的pH处理,目标分子的变化快慢有差异。但在前8小时内,目标分子的密度变化趋势基本相同。芯片表面的硅烷数目变化趋势与目标分子变化趋势相同。
根据本发明的实施例,表面为环氧基硅烷或羧基硅烷的芯片和携带氨基的目标分子反应结束后,进行钝化处理,钝化处理采用的温度为20℃-42℃。钝化处理的时间为8h-24h,发明人发现,钝化处理小于8小时以内,不同pH处理的芯片荧光数目变化趋势基本相同,可推测,钝化处理时间在8小时以内,钝化处理对荧光的影响主要是去除固定不稳的硅烷,和/或非特异性吸附荧光分子。具体的钝化时间依据荧光显微镜检测上限和/或所需芯片表面硅烷密度而定。
在本发明的一个实施例中,表面为氨基硅烷的芯片在和携带NHS的目标分子反应结束后,进行钝化处理,钝化处理选择的PH为8~11,钝化处理采用的温度为20℃-42℃,钝化处理的时间为12h-24h,基于环氧基硅烷芯片和羧基硅烷芯片钝化处理条件及氨基芯片说明书提供的表面氨基硅烷密度的信息,钝化处理时间最少选择12小时进行处理,这与目前检测平台检测的芯片密度的上限有关,当荧光检测平台对荧光的分辨能力提高,钝化处理的时间可最少选为8小时。
根据本发明实施例,不同硅烷种类的表面修饰和不同的修饰方法,可以使用特定的反应条件(包括pH值,体积,温度,反应时间等),以得到合适的表面修饰密度,以便进一步有效地测定表面修饰的密度。如果钝化条件太弱,有可能导致荧光点过于密集,超出检测平台检测上限,如果钝化条件太强,可能导致目标分子固定的过少。
利用此方法能够有效地控制可以和硅烷连接的目标分子数目,例如核酸分子的数目。
由此,根据本发明的实施例,基于目前对芯片表面硅烷密度的检测方法存在的不足,本发明提供了一种检测芯片表面硅烷密度的方法,该方法操作简单、可以对芯片表面硅烷密度进行定量检测。另外,根据本发明的实施例,根据硅烷芯片在不同溶液中的稳定性不同,本发明提供了一种制备芯片的方法能够有效地调控芯片表面的硅烷密度,利用此方法可以针对不同平台和需求提供不同硅烷密度和目标分子密度的芯片。
实施例1环氧硅烷芯片
在本实施例中,以固体介质为玻璃片为例对芯片表面的环氧硅烷密度调节方法和检测方法进行说明。实施例中所用玻璃片均为低荧光背景的厚度为0.2毫米左右的光学玻璃,例如康宁EXG系列或者肖特DM263系列。
芯片表面的环氧硅烷密度的检测方法步骤和流程如下:
1.制备环氧硅烷芯片
使用乙醇或异丙醇,水交替清洗玻璃表面,并同时进行超声处理,超声时间2~30分钟,超声水浴温度20~42摄氏度,使用0.1M~2M的NaOH溶液活化玻璃表面,处理时间1~20分钟,使玻璃表面产生活性羟基基团。
配制1:100体积比的3-缩水甘油醚氧基丙基和羟基丙基三甲氧基硅烷混合水溶液,调整PH=5.5,将玻璃片浸泡在该溶液中,室温下反应8小时,反应结束后用乙醇或异丙醇,水交替清洗三次,再放置于真空烘箱中,100摄氏度干燥12小时。
2.链接荧光分子
将荧光分子与玻璃表面的环氧硅烷链接。荧光分子的一端带有氨基,例如氨基cy3分子(Abcam,ab146462)、氨基atto647分子(Integrated DNA Technologies,Inc.,5ATTO647NN),将带有氨基的荧光分子溶解在pH7~10的PBS缓冲液中,与环氧硅烷芯片在20~60摄氏度的条件下反应1~16小时。反应结束后用稀释10~100倍的PBS缓冲液,pH8左右,冲洗芯片表面3次以上。
3.钝化处理
配制盐浓度为50mM~2000mM,pH8~12的碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液,pH可以使用PBS或者HEPES缓冲溶液进行调节,或者配置盐浓度为50mM~2000mM,pH8~12的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液溶液所配制溶液的pH至8~12,PH可以使用HEPES缓冲溶液进行调节。
将5张单面表面积为80平方厘米的玻璃片置于芯片支架上,再将支架放入1L的碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液溶液或磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液溶液中,在20~42摄氏度的条件下反应1~24小时。分别在1小时、4小时、8、小时、16小时、24小时取出一张芯片,并用去离子水反复清洗3次以上。
然后用未经化学处理过的玻璃片,盖住钝化后的芯片表面,以防止芯片表面迅速干燥和荧光基团迅速氧化而失去发光效应,在处理好的芯片表面干燥之前,在2个小时内检测荧光。
4.荧光检测
用荧光显微镜下拍摄芯片表面多个位点,检测波长532纳米,用ImageJ等图像处理软件分析图片并计算荧光点数,通过计算单位面积内的平均荧光点数对玻璃片表面上环氧硅烷的密度进行定量分析。检测的结果如表1、表2所示。
当使用pH=8的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液进行钝化处理时,结果如表1所示;当使用pH=10的碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液进行钝化处理时,结果如表2所示。其中1024*1024pixel代表一张照片视野的大小,所采用成像系统的像素pixel等于0.106um,点数即为视野中荧光亮点的数目,此处取100个视野的平均值。
表1
表2
通过表1和表2可以看出,在环氧硅烷玻璃表面,通过氨基与环氧基团反应的化学链接方式,可以得到链接分子不少于4.3个分子每平方微米的密度,在pH=8的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液处理后,芯片表面不同程度的硅烷水解之后,可以得到不同密度的环氧硅烷修饰玻璃表面,针对特定应用对密度的需求,选取不同的处理时间。例如,对于单分子荧光测序平台,为了适应测序对于通量和成像准确性的需求,我们选取钝化24小时,对应1.66个/平方微米的密度可以最终达到理想的通量和较高数据准确性。
根据表1和表2中的检测结果,得到如图1所示的芯片表面的环氧硅烷密度变化曲线。在pH=8的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液中进行钝化时,从1小时到24小时的过程中,表面硅烷修饰密度从4.42个/平方微米下降到1.66个/平方微米。在pH=10的碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液中进行钝化时,从1小时到24小时的过程中,表面硅烷修饰密度从4.34个/平方微米下降到0.73个/平方微米。从图1的变化曲线可以看出,对于玻璃片表面修饰的环氧硅烷,在钝化的0~8小时期间,密度下降较慢,在8小时之后密度下降加速,特别是在高pH的情况下,密度下降更为明显,荧光下降明显的原因可能是大量硅烷分子因为硅氧键水解而从表面脱离。
在pH=8的条件下,荧光变化较慢,玻璃表面的环氧硅烷具有较高的稳定性。利用环氧硅烷在不同PH的稳定性差异及变化趋势,可以选择不同的处理条件(PH值、处理时间)使芯片表面的环氧硅烷的密度达到所需求的密度。
实施例2.NHS(N-羟基丁二酰亚胺)芯片
本实施例中的NHS芯片是从Schott或者PolyAn购买的NHS芯片,NHS芯片本质属于羧基硅烷芯片,如图4所示,黑色圆圈中的基团硅烷基团,芯片表面的硅烷密度检测方法步骤和流程如下:
1.钝化处理
配制盐浓度为50mM~2000mM pH 6~11的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液,PH可用HEPES缓冲溶液调节至6~11,加入0.1uM~2uM的氨基atto647分子(NH2-50 dT-atto647,其中50dT:50个胸腺嘧啶双脱氧核苷酸),搅拌至充分溶解。配制好的溶液应4摄氏度避光保存,并且在24小时之内使用。
将2张单面表面积为80cm2的NHS芯片置于芯片支架上,再将支架放入1L的配置好的溶液中,在20~42摄氏度的条件下钝化反应6~20小时后取出芯片,并用去离子水反复清洗3次以上。之后用稀释100倍的pH 8~11磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液冲洗芯片表面3次以上,然后用未经化学处理过的玻璃片,盖住芯片表面,以防止芯片表面寻迅速干燥和荧光基团迅速氧化而失去发光效应,在芯片表面干燥之前,在2个小时内检测荧光。
2.荧光检测
用荧光显微镜下拍摄芯片表面多个位点,检测波长640纳米,用ImageJ等图像处理软件分析图片并计算荧光点数,通过计算单位面积内的平均荧光点数对表面硅烷修饰的密度进行定量分析。
使用pH=6的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液进行钝化处理时,两张芯片在25摄氏度条件下分别钝化8小时和16小时,荧光点数的测量结果为密度过高,无法数清楚具体点数。
使用pH=9的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲液进行钝化处理时,两张芯片在37摄氏度条件下分别钝化8小时和16小时,荧光点数的密度为3.79个/平方微米和2.64个/平方微米。
实施例3氨基硅烷芯片
本实施例中使用得氨基硅烷芯片有两种,一种是通过溶液法自制的硅烷芯片,一种是购买Schott(肖特)的用过化学气相沉积(CVD)镀膜修饰的氨基硅烷芯片。此实施例中所用玻璃片均为低荧光背景的厚度为0.2毫米左右的光学玻璃,例如康宁EXG系列或者肖特DM263系列。
芯片表面的氨基硅烷密度的检测方法步骤和流程如下:
1.芯片制备
使用乙醇或异丙醇,水交替清洗玻璃片表面,并同时进行超声处理,超声时间2~30分钟,超声水浴温度20~42摄氏度,使用0.1M~2M的NaOH溶液活化玻璃表面,处理时间1~20分钟,使玻璃表面产生活性羟基基团。
配制1:200的3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合乙醇溶液,其中加入1:1000比例的冰醋酸,充分搅匀,将清洗和活化好的玻璃片浸泡在该溶液中,室温下反应4小时,反应结束后,用乙醇、水交替清洗三次,再放置于真空烘箱中,100摄氏度干燥12小时。
2.链接荧光分子
将荧光分子与玻璃表面的氨基硅烷链接。荧光分子的一端带有NHS(N-羟基丁二酰亚胺),例如NHS-核酸-cy3分子(Abcam,ab146452)或其它与玻璃表面氨基产生化学链接的荧光分子,将浓度为20~2000uM的NHS-50dT-cy3分子(50dT:50个胸腺嘧啶双脱氧核苷酸),溶解在pH7~10的PBS缓冲液中,与氨基硅烷修饰的芯片在20~60摄氏度的条件下反应0.5~8小时。之后用稀释10~100倍的pH7~10的PBS缓冲液冲洗芯片表面3次以上。
3.钝化处理
配制盐浓度为50~500mM的碳酸氢钠和碳酸钠溶液,并使用MES缓冲溶液调节所配制溶液的pH至9,将3张单面表面积为80cm2的玻璃片置于芯片支架上,再将支架放入1L的缓冲液中,在37摄氏度的条件下钝化处理12~24小时。分别在12小时、16小时、20小时、24小时取出一张芯片,并用去离子水反复清洗3次以上。然后用未经化学处理过的玻璃片,盖住钝化后的芯片表面,以防止芯片表面迅速干燥和荧光基团迅速氧化而失去发光效应,在处理好的芯片表面干燥之前,在2个小时内检测荧光。
4.荧光检测
用荧光显微镜下拍摄芯片表面多个位点,检测波长532纳米,用ImageJ等图像处理软件分析图片并计算荧光点数,通过计算单位面积内的平均点数对玻璃片表面硅烷的密度进行定量分析,通过不同钝化时间后荧光点数的变化检测硅烷的密度的变化。
同时使用从Schott(肖特)购买的用化学气相沉积(CVD)镀膜修饰的芯片,用本实施例步骤2-3进行处理,并进行拍照和荧光点数的分析。两种类型的氨基硅烷芯片表面硅烷密度计算结果如表3所示。
表3
通过表3可以看出,在溶液法制备的氨基硅烷修芯片表面,通过氨基与NHS的化学链接方式,在pH=9的碳酸盐溶液钝化处理12小时~24小时的情况下,可以得到4.16个/平方微米到1.03个/平方微米的荧光密度,芯片表面修饰的氨基硅烷参与反应的活性基团的密度与荧光密度相对应。例如,选取钝化20小时,1.7个/平方微米左右的密度,用于单分子荧光测序平台,可以达到理想的图像清晰度和有效通量。同样,根据表3所示的肖特CVD氨基硅烷芯片表面密度,在pH=9的碳酸盐溶液钝化处理12小时~24小时的情况下,可以得到3.84个/平方微米到1.6个/平方微米的荧光密度,芯片表面修饰的氨基硅烷参与反应的活性基团的密度与荧光密度相对应。可以选取钝化24小时,用于单分子荧光测序平台的测序芯片。在使用氨基硅烷修饰的表面时,可根据不用的应用需求选取适当的钝化处理条件,使芯片表面的活性基团达到合适的密度。
根据表3中的检测结果,得到如图2所示的芯片表面的氨基硅烷密度变化曲线。在pH=9的碳酸氢钠和碳酸钠溶液中进行钝化处理时,从12小时到24小时的过程中,对于溶液法制备的氨基硅烷芯片,其表面硅烷密度从4.16个/平方微米下降到1.04个/平方微米,对于化学气相沉积法(CVD)制备的氨基硅烷芯片,其表面氨基硅烷密度从3.84个/平方微米下降到1.61个/平方微米。可以看出,溶液法制备的氨基硅烷芯片表面,其初始的官能团密度要高于化学气相沉积法修饰的氨基硅烷芯片表面,利用此检测方法可以对芯片表面的化学修饰物的密度进行定量分析和比较。
在钝化处理的过程中,特别是16小时到20小时,溶液法制备的氨基硅烷芯片表面的密度下降速度明显快于化学气相沉积法制备的氨基硅烷芯片表面,在钝化处理24小时之后,化学气相沉积法制备的氨基硅烷芯片表面留存下来的硅烷分子更多,和钝化处理12小时相比,留存下来的硅烷分子比例为42%,而溶液法制备的氨基硅烷芯片表面的硅烷留存比例为25%。在上述的钝化条件下,化学气相沉积法制备的氨基硅烷芯片表面表现出了更高的化学稳定性。由上可知,不同方法制备的同类芯片,选择相同的钝化条件进行处理,芯片表面的修饰物表现出不同的稳定性,通过此方法,可以有效检测出不同方法制备的同类芯片表面修饰物利用不同条件处理后的密度变化,依据此实验结果,在面对同中芯片时可以有征对性的选择不同的处理条件以适合特定应用需求。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种确定基底表面硅烷密度的方法,其特征在于,包括:
(1)使所述基底表面的所述硅烷与荧光分子连接;
(2)对经过步骤(1)处理的所述基底表面进行钝化处理;和
(3)基于所述荧光分子的信号,确定所述基底表面的所述硅烷密度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基底由玻璃、硅片、塑料、凝胶和尼龙膜的至少之一形成。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基底为芯片的至少一部分;
任选地,所述芯片是通过溶液或者化学气相沉积法形成的。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述钝化处理是通过使所述基底与所述碱性溶液接触进行的,所述碱性溶液的pH值为8~11;
任选地,所述碱性溶液包括选自磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液的至少之一;
任选地,所述磷酸盐缓冲液含有磷酸氢钾和磷酸二氢钾,所述碳酸盐缓冲液含有碳酸钠和碳酸氢钠。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述荧光分子适于与所述硅烷通过氨基或亚氨基形成共价键;
任选地,所述硅烷携带环氧基团、NHS基团、醛基、氨基、亚氨基和羧基的至少之一,所述荧光分子携带氨基、亚氨基和NHS基团的至少之一;
任选地,所述硅烷携带环氧基硅烷或羧基硅烷,所述荧光分子携带氨基,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下进行8~24小时;
任选地,所述硅烷携带氨基,所述荧光分子携带NHS基团,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下进行12~24小时。
6.一种制备芯片的方法,其特征在于,包括:
(a)对所述芯片的基底进行表面活化处理,以便在所述基底的表面形成活性羟基基团;
(b)使所述活性羟基基团与硅烷基团连接;
(c)使所述硅烷基团与目标分子相连;和
(d)对经过步骤(c)处理的所述芯片基底进行钝化处理。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述钝化处理是通过使所述基底与所述碱性溶液接触进行的,所述碱性溶液的pH值为8~11;
任选地,所述碱性溶液包括选自磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液的至少之一;
任选地,所述磷酸盐缓冲液含有磷酸氢钾和磷酸二氢钾,所述碳酸盐缓冲液含有碳酸钠和碳酸氢钠。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述目标分子为核酸分子。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法,其特征在于,所述目标分子适于与所述硅烷通过氨基或亚氨基形成共价键。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述硅烷携带环氧基团、NHS基团、醛基、氨基、亚氨基和羧基的至少之一,所述目标分子携带氨基、亚氨基和NHS基团的至少之一;
任选地,所述硅烷携带环氧基硅烷或羧基硅烷,所述目标分子携带氨基,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下进行8~24小时;
任选地,所述硅烷携带氨基,所述目标分子携带NHS基团,所述钝化处理是在20~42摄氏度的温度下钝化处理进行12~24小时。
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