CN104195029A - 用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片及其制备方法。是以纳米二氧化硅为基底，修饰十八烷基三氯硅烷，覆盖掩膜板，紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷，得到图案化纳米二氧化硅超亲水微井，在超亲水微井区域修饰功能化硅烷试剂，功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰上功能化基团，功能化基团可与配基结合，形成具有生物特异亲和性的功能化微井芯片。这种功能化微井芯片具备定点限域富集的优点，使点样简单方便、点样点规整均一，提高了检测的准确性，同时这种功能化微井芯片光学性质良好、化学性质稳定，以共价键牢牢键合相应配基修饰的核酸捕获链，提高了核酸固化量，可实现对核酸生物分子的痕量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料、功能材料和检测分析技术领域，特别涉及一种用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片及其制备方法。
背景技术
生物芯片技术是上世纪80年代末才发展起来的一项新技术，它将生命的化学过程转化为一种可控制的静态形式。它将大量的生物大分子探针、基因片段、寡聚核苷酸等按特定方式排列在特殊载体的固定位置上，在特定条件下与待检样品进行作用，通过精密的扫描仪器进行记录、检测、分析。检测型生物芯片中发展最快应用最广的是核酸芯片技术，其利用核酸分子可以变性、杂交的特性，通过核酸芯片上固定的探针或样品核酸与游离的样品核酸或探针杂交来推断未知的靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。
生物芯片的基础是基片，基片是生化反应的载体。核酸芯片从选择的基片方面可以分为两类：一类是在光滑的基片表面直接进行化学修饰；另一类是在光滑的基片上构筑微纳结构后再进行化学修饰。在光滑的基片表面直接修饰其方法简单、成本较低、便于制备，但是存在的缺陷是点样点不规整、核酸固定量小、信号强度低。另一类是在光滑的基片上构筑微纳结构后再修饰，其微纳结构增大了比表面积，使核酸固化量增大，但是其点样点同样不规则、不整齐、不集中，给信号扫描、检测、分析带来不便。所以，这种单一构筑微纳结构并不能对核酸分子实现定点限域可控的检测，另外如何降低检测限、提高灵敏度仍是核酸芯片技术一直面临的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片。
本发明的再一目的在于提供一种成本低廉、制备简单快捷、光学性质良好、化学性质稳定、表面均一、点样点规整、背景值低，具备定点限域富集作用的用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法。
一种用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片，是用功能化硅烷试剂(2)修饰纳米二氧化硅超亲水微井(1)，其特征在于：功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰上了功能化基团(Functional groups，简称F)如环氧基、氨基、巯基等，以便于配基结合，形成具有生物特异亲和性的功能化微井芯片如环氧基功能化微井芯片、氨基功能化微井芯片、巯基功能化芯片等；作为纳米二氧化硅功能化微井芯片的载体可以选择光学性质良好的玻璃片、石英片中的一种；功能化微井芯片的厚度即纳米二氧化硅基底的厚度为10μm～25μm。
所述的用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，制备步骤如下：
(1)清洗基片，氮气吹净，烘箱烘干，然后将基片以恒定的速度于稳定燃烧的蜡烛火焰上方反复平移数次，在基片表面物理沉积得到均匀分布的、具有一定厚度的炭纳米颗粒；将沉积好炭纳米颗粒的基片放入含硅化合物的气相沉积容器中，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，高温煅烧去除炭核，从而得到均匀具有微米厚度的空心纳米二氧化硅基底；
(2)将步骤(1)得到的纳米二氧化硅基底等离子体处理后，采用单分子膜自组装法，在其表面修饰十八烷基三氯硅烷(OTS)；
(3)将步骤(2)得到的由十八烷基三氯硅烷(OTS)修饰的纳米二氧化硅基底用圆形图案光掩模板覆盖，采用光刻技术紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷(OTS)，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(4)将步骤(3)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井放入功能化硅烷化试剂的乙醇溶液中反应，功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰功能化基团，然后用乙醇反复洗涤，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片。
本发明的功能化微井芯片利用纳米二氧化硅超亲水微井定点限域可控及对目标分子具有良好浓缩富集效果的优点，可以对核酸生物分子(DNA、RNA)实现痕量检测，从而降低了检测限，提高了灵敏度，降低了检测成本。
实验结果表明，本发明的以纳米二氧化硅超亲水微井为基底的功能化微井芯片对核酸固化链具有良好的共价键合作用，对目标核酸链和荧光标记链具有很好的富集效果，放大了检测信号，可以对核酸生物分子实现痕量检测，提高了检测的准确性。
所述的功能化微井芯片的厚度即二氧化硅层厚度是由炭纳米层厚度和含硅化合物沉积时间所控制的：炭纳米层厚度可根据基片在蜡烛火焰上方移动速度、次数来调控，最佳选择是基片以2cm/s的速度在蜡烛火焰上方平移7次～15次；含硅化合物沉积时间为24h～48h。
所述的高温煅烧所选择的温度优选550℃～600℃，处理时间为1h～3h；去除炭核后二氧化硅基底的厚度即芯片的厚度是10μm～25μm，此时纳米二氧化硅基底具有超亲水性，用静态接触角测量仪表征，SCA≈0°。
所述的采用单分子膜自组装法修饰十八烷基三氯硅烷(OTS)所需反应时间为0.5h～3h，修饰后的纳米二氧化硅基底具有超疏水性。
所述的圆形图案光掩膜板材料选自成本低廉的黑纸或可循环使用的金属片中的一种，圆形光掩膜板的直径为500μm，所得以二氧化硅为基底的微井芯片的孔径大小为500μm。
所述的紫外光降解的时间为0.5h～2h，紫外光降解未被掩膜板覆盖区域的十八烷基三氯硅烷，该区域又恢复超亲水性，被掩膜板覆盖的保护区域仍然保持超疏水性。
所选择的功能化试剂(2)选自(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)中的一种，所修饰的功能化基团(F)是环氧基、氨基，可与配基以共价键牢牢键合，形成具有生物特异亲和性的功能化微井芯片环氧基功能化微井芯片、氨基功能化微井芯片。
所述的功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰功能化基团反应时间至少6h～8h。
本发明的用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片具有原料易得、设备和工艺简单、成本低廉、制备简捷、制备过程无公害、环境友好、化学性质稳定、表面均一、可定点限域、点样点规整、光学性质良好、背景值低、富集效果好、多功能化等优点。便于实现产业化生产，在临床诊断实现高通量、多元化检测。
附图说明
图1.本发明用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的示意图。
图2a.本发明实施例1制备的纳米二氧化硅基底的正面扫描电子显微镜图片。
图2b.本发明实施例1制备的厚度约为20μm的纳米二氧化硅基底的侧面扫描电子显微镜图片。
图3.环氧基功能化微井芯片与氨基修饰的核酸固化链的反应机理图。
图4.本发明实施例1制备的环氧基功能化微井芯片在实验组检测目标DNA链的荧光强度值并与空白组1、2的荧光强度值进行对照。
具体实施方式
实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
(1)将2×1平方厘米的玻璃片在热的Piranha溶液(98％浓硫酸/30％双氧水，V/V＝7:3)中浸泡1h。冷却后，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10分钟。最后用氮气吹净、干燥箱烘干；点燃蜡烛(新蜡烛要避免用蜡头，太短的蜡烛也不要用蜡尾)，待火焰稳定后，用镊子夹取干净玻璃片以恒定的速度(2cm/s)于稳定燃烧的火焰上方反复平移15次，玻璃表面将物理沉积一层均匀分布的厚度约为19微米的炭纳米颗粒。取两个5毫升的小烧杯，其中一个加入2毫升四乙氧基硅烷另一个加入2毫升氨水，然后将沉积好炭纳米颗粒的玻璃片和两个小烧杯分别放入干燥器中，密封后将干燥器置于30℃烘箱，36h后取出玻璃片，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，以550℃高温煅烧2h去除炭核，从而得到均匀的厚度约为20微米的空心纳米二氧化硅层。
(2)将步骤(1)得到的覆盖纳米二氧化硅层的玻璃片置于低温等离子体处理仪中，设置功率参数100W，处理时间180s。然后置于1％体积浓度的十八烷基三氯硅烷(OTS)的无水甲苯溶液中，在室温、避光、氮气环境下浸泡1h。取出后依次用甲苯、乙醇、去离子水清洗，用氮气吹干后置于120℃的干燥箱中，10min后取出，得到十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底(SiO2/OTS-SAM)。用静态接触角测量仪表征，测量结果表明，十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底具备超疏水性，SCA＝166.2±1.3°。
(3)将步骤(2)得到的十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底紫外光照45min。用静态接触角测量仪表征，纳米二氧化硅基底因产生羟基又恢复了超亲水性，SCA≈0°。
(4)按照步骤(3)的方法，将步骤(2)得到的超疏水十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底表面上覆盖圆形光掩膜板，紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷单分子膜，45min后，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(5)将步骤(4)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井浸入2％(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)的乙醇(95％)溶液中反应6h，然后用乙醇反复清洗除去微井周围的(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷，只有纳米二氧化硅超亲水微井区能通过共价键将功能化试剂(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)牢牢修饰在基底上，取出，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到的用于核酸生物分子痕量检测的环氧基功能化微井芯片；
(6)在步骤(5)得到的环氧基微井芯片中滴加2μL氨基修饰的DNA(本方案均指单链DNA)溶液(1μM；碳酸钠缓冲液pH＝10，灭菌)，置于湿盒中在密闭、室温条件下孵育过夜，液滴富集在芯片微井区域；
(7)将步骤(6)得到的芯片用5％的牛血清蛋白(BSA)封堵，再用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝9，灭菌)清洗，晾干；
(8)在步骤(7)得到的芯片中滴加2μL目标DNA溶液(0.1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴挥发富集，提高杂交效率；
(9)将步骤(8)得芯片用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后在芯片中加入2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集；
(10)将步骤(9)得芯片用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组1将步骤(7)得到的芯片直接滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组2将步骤(7)得到的芯片滴加2μL磷酸盐缓冲液，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
实施例2
(1)将2×1平方厘米的玻璃片在热的Piranha溶液(98％浓硫酸/30％双氧水，V/V＝7:3)中浸泡1h。冷却后，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10分钟。最后用氮气吹净、干燥箱烘干；点燃蜡烛(新蜡烛要避免用蜡头，太短的蜡烛也不要用蜡尾)，待火焰稳定后，用镊子夹取干净玻璃片以恒定的速度(2cm/s)于稳定燃烧的火焰上方反复平移7次，玻璃表面将物理沉积一层均匀分布的厚度约为10微米的炭纳米颗粒。取两个5毫升的小烧杯，其中一个加入2毫升四乙氧基硅烷另一个加入2毫升氨水，然后将沉积好炭纳米颗粒的玻璃片和两个小烧杯分别放入干燥器中，密封后将干燥器置于30℃烘箱，36h后取出玻璃片，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，以550℃高温煅烧2h去除炭核，从而得到均匀的厚度约为11微米的空心纳米二氧化硅层。
(2)将步骤(1)得到的覆盖纳米二氧化硅层的玻璃片置于低温等离子体处理仪中，设置功率参数100W，处理时间180s。然后置于1％体积浓度的十八烷基三氯硅烷(OTS)的无水甲苯溶液中，在室温、避光、氮气环境下浸泡1.5h。取出后依次用甲苯、乙醇、去离子水清洗，用氮气吹干后置于120℃的干燥箱中，10min后取出，得到十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底(SiO2/OTS-SAM)。用静态接触角测量仪表征，十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底具备超疏水性。
(3)将步骤(2)得到的十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底紫外光照35min。用静态接触角测量仪表征，纳米二氧化硅基底因产生羟基又恢复了超亲水性，SCA≈0°。
(4)按照步骤(3)的方法，将步骤(2)得到的超疏水十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底表面上覆盖圆形光掩膜板，紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷单分子膜，35min后，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(5)将步骤(4)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井浸入2％(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)的乙醇(95％)溶液中反应6h，然后用乙醇反复清洗除去微井周围的(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷，只有纳米二氧化硅超亲水微井区能通过共价键将功能化试剂(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)牢牢修饰在基底上，取出，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到的用于核酸生物分子痕量检测的环氧基功能化微井芯片；
(6)在步骤(5)得到的环氧基微井芯片中滴加2μL氨基修饰的DNA(本专利均指单链DNA)溶液(1μM；碳酸钠缓冲液pH＝10，灭菌)，置于湿盒中在密闭、室温条件下孵育过夜，液滴富集在芯片微井区域；
(7)将步骤(6)得到的芯片用5％的牛血清蛋白(BSA)封堵，再用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝9，灭菌)清洗，晾干；
(8)在步骤(7)得到的芯片中滴加2μL目标DNA溶液(0.1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集，提高杂交效率；
(9)将步骤(8)得芯片用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后在芯片中加入2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集；
(10)将步骤(9)得芯片用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组1将步骤(7)得到的芯片直接滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组2将步骤(7)得到的芯片滴加2μL磷酸盐缓冲液，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
实施例3
(1)将2×1平方厘米的石英片在热的Piranha溶液(98％浓硫酸/30％双氧水，V/V＝7:3)中浸泡1h。冷却后，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10分钟。最后用氮气吹净、干燥箱烘干；点燃蜡烛(新蜡烛要避免用蜡头，太短的蜡烛也不要用蜡尾)，待火焰稳定后，用镊子夹取干净石英片以恒定的速度(2cm/s)于稳定燃烧的火焰上方反复平移9次，石英表面将物理沉积一层均匀分布的厚度约为12微米的炭纳米颗粒。取两个5毫升的小烧杯，其中一个加入2毫升四乙氧基硅烷另一个加入2毫升氨水，然后将沉积好炭纳米颗粒的石英片和两个小烧杯分别放入干燥器中，密封后将干燥器置于30℃烘箱，48h后取出玻璃片，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，以600℃高温煅烧3h去除炭核，从而得到均匀的厚度约为13微米的空心纳米二氧化硅层。
(2)将步骤(1)得到的覆盖纳米二氧化硅层的石英片置于低温等离子体处理仪中，设置功率参数100W，处理时间180s。然后置于1％体积浓度的十八烷基三氯硅烷(OTS)的无水甲苯溶液中，在室温、避光、氮气环境下浸泡2h。取出后依次用甲苯、乙醇、去离子水清洗，用氮气吹干后置于120℃的干燥箱中，10min后取出，得到十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底(SiO2/OTS-SAM)。用静态接触角测量仪表征，十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底具备超疏水性。
(3)将步骤(2)得到的十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底紫外光照50min。用静态接触角测量仪表征，纳米二氧化硅基底因产生羟基又恢复了超亲水性，SCA≈0°。
(4)按照步骤(3)的方法，将步骤(2)得到的超疏水十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底表面上覆盖圆形光掩膜板，紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷单分子膜，50min后，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(5)将步骤(4)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井浸入2％氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的无水乙醇溶液中反应8h，然后用乙醇反复清洗除去微井周围的氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，只有纳米二氧化硅超亲水微井区能通过共价键将功能化试剂(氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)牢牢修饰在基底上，取出，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到的用于核酸生物分子痕量检测的氨基功能化微井芯片；
(6)将步骤(5)得到的氨基功能化微井芯片浸入5％戊二醛的乙醇溶液3h，取出，用乙醇反复清洗，氮气吹干，得到醛基功能化微井芯片；
(7)在步骤(6)得到醛基功能化微井芯片中(滴加2μL氨基修饰的DNA(本方案均指单链DNA)溶液(1μM；碳酸钠缓冲液pH＝10，灭菌)，置于湿盒中在密闭、室温条件下孵育过夜，液滴富集在芯片微井区域；
(8)将步骤(7)得到的芯片用5％的牛血清蛋白(BSA)封堵，再用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝9，灭菌)清洗，晾干；
(9)在步骤(8)得到的芯片中滴加2μL目标DNA溶液(0.1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集，提高杂交效率；
(10)将步骤(9)得芯片用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后在芯片中加入2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集；
(11)将步骤(10)得芯片用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组1将步骤(8)得到的芯片直接滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组2将步骤(8)得到的芯片滴加2μL磷酸盐缓冲液，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
实施例4
(1)将2×1平方厘米的石英片在热的Piranha溶液(98％浓硫酸/30％双氧水，V/V＝7:3)中浸泡1h。冷却后，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10分钟。最后用氮气吹净、干燥箱烘干；点燃蜡烛(新蜡烛要避免用蜡头，太短的蜡烛也不要用蜡尾)，待火焰稳定后，用镊子夹取干净石英片以恒定的速度(2cm/s)于稳定燃烧的火焰上方反复平移11次，石英表面将物理沉积一层均匀分布的厚度约为16微米的炭纳米颗粒。取两个5毫升的小烧杯，其中一个加入2毫升四乙氧基硅烷另一个加入2毫升氨水，然后将沉积好炭纳米颗粒的石英片和两个小烧杯分别放入干燥器中，密封后将干燥器置于30℃烘箱，36h后取出玻璃片，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，以600℃高温煅烧3h去除炭核，从而得到均匀的厚度约为17微米的空心纳米二氧化硅层。
(2)将步骤(1)得到的覆盖纳米二氧化硅层的石英片置于低温等离子体处理仪中，设置功率参数100W，处理时间180s。然后置于1％体积浓度的十八烷基三氯硅烷(OTS)的无水甲苯溶液中，在室温、避光、氮气环境下浸泡3h。取出后依次用甲苯、乙醇、去离子水清洗，用氮气吹干后置于120℃的干燥箱中，10min后取出，得到十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底(SiO2/OTS-SAM)。用静态接触角测量仪表征，十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底具备超疏水性。
(3)将步骤(2)得到的十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底紫外光照2h。用静态接触角测量仪表征，纳米二氧化硅基底因产生羟基又恢复了超亲水性，SCA≈0°。
(4)按照步骤(3)的方法，将步骤(2)得到的超疏水十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底表面上覆盖圆形光掩膜板，紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷单分子膜，2h后，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(5)将步骤(4)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井浸入2％氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的无水乙醇溶液中反应8h，然后用乙醇反复清洗除去微井周围的氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，只有纳米二氧化硅超亲水微井区能通过共价键将功能化试剂(氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)牢牢修饰在基底上，取出，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到的用于核酸生物分子痕量检测的氨基功能化微井芯片；
(6)将步骤(5)得到的氨基功能化微井芯片浸入5％戊二醛乙醇溶液3h,取出，用乙醇反复清洗，氮气吹干，得到醛基功能化微井芯片；
(7)在步骤(6)得到醛基功能化微井芯片中(滴加2μL氨基修饰的DNA(本方案均指单链DNA)溶液(1μM；碳酸钠缓冲液pH＝10，灭菌)，置于湿盒中在密闭、室温条件下孵育过夜，液滴富集在芯片微井区域；
(8)将步骤(7)得到的芯片用5％的牛血清蛋白(BSA)封堵，再用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝9，灭菌)清洗，晾干；
(9)在步骤(8)得到的芯片中滴加2μL目标DNA溶液(0.1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集，提高杂交效率；
(10)将步骤(9)得芯片用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后在芯片中加入2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下杂交孵育1h，液滴不断蒸发富集；
(11)将步骤(10)得芯片用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组1将步骤(8)得到的芯片直接滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
作为空白对照组2将步骤(8)得到的芯片滴加2μL磷酸盐缓冲液，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液清洗，晾干后滴加2μL荧光标记的DNA探针溶液(1nM；磷酸盐缓冲液，pH＝9，灭菌)，密封盒中室温条件下1h后用磷酸盐缓冲液反复洗涤，晾干后，用荧光显微镜选4倍镜曝光时间设为3s，分析检测荧光强度(至少测试10个数据)。
Claims (10)
1.一种用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片，是用功能化硅烷试剂(2)修饰纳米二氧化硅超亲水微井(1)，其特征在于：功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰上了功能化基团，功能化基团包括环氧基、氨基，以便于配基结合，形成具有生物特异亲和性的功能化微井芯片，功能化微井芯片包括环氧基功能化微井芯片、氨基功能化微井芯片；作为纳米二氧化硅功能化微井芯片的载体选择光学性质良好的玻璃片、石英片中的一种；功能化微井芯片的厚度即纳米二氧化硅基底的厚度为10μm～25μm。
2.一种如权利要求书1所述的用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)清洗基片，氮气吹净，烘箱烘干，然后将基片以恒定的速度于稳定燃烧的蜡烛火焰上方反复平移数次，在基片表面物理沉积得到均匀分布的、具有一定厚度的炭纳米颗粒；将沉积好炭纳米颗粒的基片放入含硅化合物的气相沉积容器中，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，高温煅烧去除炭核，从而得到均匀具有微米厚度的空心纳米二氧化硅基底；
(2)将步骤(1)得到的纳米二氧化硅基底等离子体处理后，采用单分子膜自组装法，在其表面修饰十八烷基三氯硅烷；
(3)将步骤(2)得到的由十八烷基三氯硅烷修饰的纳米二氧化硅基底用圆形图案光掩模板覆盖，采用光刻技术紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；
(4)将步骤(3)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井放入功能化硅烷化试剂的乙醇溶液中反应，功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰功能化基团，然后用乙醇反复洗涤，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片。
3.根据权利要求书2所述用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：作为功能化微井芯片的载体可以选择光学性质良好的玻璃片、石英片中的一种。
4.根据权利要求2所述用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是，所述的微井芯片的厚度即二氧化硅层厚度是由炭纳米层厚度和含硅化合物沉积时间所控制的：炭纳米层厚度根据基片在蜡烛火焰上方移动速度、次数来调控，基片以2cm/s的速度在蜡烛火焰上方平移7次～15次；含硅化合物沉积时间为24h～48h。
5.根据权利要求书2所述用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：所述的高温煅烧所选择的温度为550℃～600℃，处理时间：1h～3h；去除炭核后二氧化硅基底的厚度即芯片的厚度是10μm～25μm，此时纳米二氧化硅基底具有超亲水性。
6.根据权利要求2所述用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：所述的采用单分子膜自组装法修饰十八烷基三氯硅烷所需反应时间为0.5h～3h，修饰后的纳米二氧化硅基底具有超疏水性。
7.根据权利要求2所述用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：所述的圆形图案光掩膜板材料选自成本低廉的黑纸或可循环使用的金属片中的一种，圆形光掩膜板的直径为500μm，所得以二氧化硅为基底的微井芯片的孔径大小为500μm。
8.根据权利要求2所述用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：所述的紫外光降解时间为0.5h～2h，紫外光降解未被掩膜板覆盖区域的十八烷基三氯硅烷，该区域又恢复超亲水性，被掩膜板覆盖的保护区域仍然保持超疏水性。
9.根据权利要求书2所述用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：所选择的功能化试剂(2)选自短链硅烷化试剂(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷中的一种，所修饰的相应功能化基团(F)是环氧基、氨基，得到相应的功能化微井芯片是环氧基微井芯片、氨基微井芯片。
10.根据权利要求书2所述用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，其特征是：功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰功能化基团的反应时间为6h～8h。
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