CN101010133A - 用于使固体基质表面官能化的溶胶－凝胶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对固体基质的表面进行官能化的溶胶－凝胶方法，以便给上述表面提供能够和化学或生物分子起反应的化学官能团，换言之，给上述表面提供能够固定、附着或接枝生物或化学分子的化学官能团。本发明可应用于，例如，制备化学和生物传感器，尤其是应用于制备DNA芯片、寡核苷酸芯片、糖芯片、肽芯片以及用于有机小分子的芯片。

Description

用于使固体基质表面官能化的溶胶-凝胶方法
技术领域
本发明涉及用于使固体基质表面官能化的溶胶-凝胶方法。
本发明的技术领域可以定义为这样的领域：固体基质表面的官能化(fonctionnalisation)，以便提供具有化学官能团的表面，该化学官能团能够和化学或生物分子起反应，换言之，提供具有化学官能团的表面，该化学官能团能够固定、附着或接枝生物或化学分子。
本发明可应用于，例如，制备化学和生物传感器，尤其是应用于生产DNA芯片、寡核苷酸芯片、糖芯片、肽芯片以及用于有机小分子的芯片。
本发明还可以应用于制备壁需要官能化的流体微体系。
背景技术
为了将生物或化学分子接枝、固定以及附着到基质上，通常需要给这种基质提供官能层，也就是说，提供携带能够接枝生物或化学分子的化学官能团的层。
为了接枝生物分子，目前存在两种类型的官能层，即，一方面，单分子层，以及另一方面，厚层。
单分子层是这样的层，其具有可控的排列以及其还称作自组装单分子层(Self-Assembled Monolayers或SAM)。这些层通常是通过一种方法来获得，该方法包括在低含水量的有机介质中接枝硅烷，以避免硅烷的高度水解，而硅烷的高度水解会导致在溶液中形成聚集体以及导致无规厚层。
用于制备单分子层的方法表现出以下缺点：通常采用侵蚀性和/或毒性有机溶剂，如芳香族溶剂、烷或氯化溶剂。
这种层的制备尤其披露在文献FR-A-2818662中。
厚层是通常具有几纳米至若干微米的厚度的层，例如，10nm至10μm，以及它们在本质上是更加不同的。
厚层可以制备自如文献WO-A-01/67129中所描述的有机聚合物；制备自有机的和无机的有机甲硅烷基化前体的混合物；或制备自包含氨基型官能团的倍半硅氧烷(“SSQ”)。
在现有技术中披露的厚层存在若干缺点。
因此，有机聚合物，如尼龙，经常出现非特异性吸附的问题。
包含氨基官能团的倍半硅氧烷并不能够直接共价附着生物分子，如商业上可获得的寡核苷酸。
此外，这两种类型的层可通过一些方法来获得，这些方法是：
-缓慢的：官能化需要使表面与分子接触较长时间，从若干小时至24小时；
-能量消耗多：接枝需要保持高温(通常80℃)若干小时至24小时，
-分阶段进行，因而是复杂的：在官能化以后，利用有机溶剂并借助超声波来洗涤表面是必要的；
-与许多基质不相容，尤其是塑料，因为它们使用侵蚀性溶剂，如甲苯和氯化溶剂；
-对于人和环境不是非常友好的，因为它们使用毒性溶剂，如甲苯和氯化溶剂。
有机的和无机的有机甲硅烷基化前体的混合物由大量的成分组成：为了获得可控和可重复厚度的层而对它们的配方进行开发是非常复杂的。
发明内容
因此需要一种可以利用官能的厚层来官能化基质的表面的方法，也就是说，使得可以向基质表面提供化学官能团的方法，这些官能团使化学或生物分子的附着、接枝或固定成为可能，该方法快速和简单，消耗很少的能量以及成本低。
还需要一种方法，其使得可以利用厚层来官能化所有种类的表面，而不管它们的形式以及由何种材料组成，例如，无机基质的表面，如硅、玻璃以及氧化物(其具有大块形式或膜形式)；以及有机或金属基质的表面。
尤其需要一种方法，使得可以官能化大尺寸基质并具有与几cm2的标准基质相同的性能。
此外制备的厚层必须是均匀的并具有精确可控的厚度。
本发明的目的是提供一种用于官能化基质表面的方法，其尤其满足以上列出的需要。
本发明的目的还在于提供一种用于官能化基质表面的方法，该方法并不具有现有技术方法的缺点、弱点、限制以及缺陷，该方法使得可以向基质提供可控厚度的厚而均匀的层，以及该方法符合以上指出的标准和要求。
在载体是生物芯片以及表面用来接枝探针或生物分子的情况下，载体必须保证，例如在探针杂交以后，在测量荧光期间获得的信号具有足够的数量级。
此目的和其它目的是根据本发明通过溶胶-凝胶方法来实现，而溶胶-凝胶方法用来使固体基质的可选地清洗和/或活化的表面官能化，其中进行了以下步骤：
a)在环境温度下，将在水和挥发性水混溶性有机溶剂的混合物中的酸性或碱性催化剂以及硅烷或硅氧烷的溶液沉积在所述表面上，所述硅烷或硅氧烷携带：至少一个化学官能团A，该化学官能团A使得可以固定生物或化学分子和/或能够被转化成化学官能团A′，该化学官能团A′使得可以固定生物或化学分子；以及至少一个附着的化学官能团B，该附着的化学官能团B能够化学附着(通过共价结合)、或机械附着于表面；
b)与步骤a)同时和/或在此步骤以后立即蒸发挥发性有机溶剂，从而将溶液转化成湿凝胶，进而形成厚胶化层；然后
c)干燥厚胶化层，从而获得厚层，该厚层化学附着(通过共价结合)、或机械附着于表面，并且携带所述化学官能团A，该化学官能团A使得可以固定化学或生物分子。
根据本发明的方法可以定义为“溶胶-凝胶”型的方法，其采用特定硅烷或硅氧烷的特定溶液对表面进行官能化。
利用上述前体的上述溶液对表面进行官能化的上述方法在现有技术中既没有被描述也没有被提示。
根据本发明的方法满足了上述需要，对现有技术方法的问题引入了一种解决办法以及克服了现有技术方法的缺点、弱点、限制以及缺陷。
根据本发明的方法可以快速和均匀地对载体(无论它是什么)进行官能化，该方法降低了能量消耗并且具有低成本。
根据本发明的方法采用在水和挥发性水混溶性有机溶剂(例如醇，如乙醇或异丙醇)的混合物中的官能硅烷或硅氧烷的溶液，并在有酸性或碱性催化剂存在的情况下。
因而可以避免使用有机溶剂，如甲苯、烷或氯化溶剂，其通常用于制备单分子层。这些溶剂通常比在溶胶-凝胶方法中使用的醇更具侵蚀性和/或毒性。
为此，与现有技术方法相反，根据本发明的方法是与许多在现有技术方法不能使用的材料相容的，如塑料(例如，微量滴定板(MTPs))、树脂(光敏和掩蔽树脂)、粘合剂(例如，丙烯酸粘合剂、环氧粘合剂或PU粘合剂以及类似粘合剂)等。
根据本发明的方法可以应用于较大的表面，其可以达到若干平方米，以及沉积的厚层具有通常为几十(例如，2、3、4、5、10)纳米至几十(例如，2、3、4、5、10)微米的厚度，该厚度被非常精确地加以控制(在百分之几以内)，尤其为了能够产生具有光学性能的层。
利用本领域技术人员已知的液相沉积技术来进行步骤a)的沉积或接触操作，其中所述液相沉积技术是简单、成熟以及可靠的技术。
这种液相沉积技术可以选自，例如，旋涂，浸涂，层流涂镀以及其可替换形式辊涂以及幕式淋涂，喷涂，印刷，例如通过采用喷墨印刷技术，以及点样(spotting)。
本发明的方法，在步骤(a)以及同样地通常在步骤(b)中，通常是在环境温度下进行，即，一般为15至35℃，明显低于80℃左右的温度，而在用于制备SAM型层的方法的沉积步骤期间采用该温度。
因此与现有技术方法相反，本发明的方法不需要加热溶液和/或基质，这导致工艺简化以及成本降低。
由根据本发明的方法所引起的能量消耗因而明显低于现有技术方法；由此，也降低了成本。
本发明的方法的总的持续时间明显短于现有技术方法。
本发明的方法的步骤a)、b)以及c)的总持续时间通常少于或等于1小时，例如，15至30分钟。
本发明的方法的优点之一是能够在非常短的时间内进行，其至少是可以制备SAM型层的方法的持续时间的1/10，上述持续时间通常是在16小时左右。
此外，与现有技术方法相反，在步骤a)期间，基质与溶液接触的操作持续时间并不影响官能化的质量。
当基质表面已优选预先被清洗和/或活化和/或当溶液已经受预先熟化步骤时，溶液与基质接触的操作持续时间对官能化质量的影响会按比例降低。
在根据本发明的方法中，沉积或接触操作的持续时间通常被减少到用于将溶液扩散到待官能化的整个表面所必需的最少时间，待官能化的表面可能对应于基质的整个表面或仅对应于基质的部分表面。
这种持续时间主要取决于选择的沉积技术以及取决于基质的尺寸和形式。这种持续时间对于诸如旋涂、印刷以及点样的方法来说通常是1或几秒(例如，2、5至10秒)，对于诸如浸涂、层流涂镀以及喷涂的方法来说达几分钟(例如，2、5至10分钟)。对于可比较的步骤来说，在所有情况下，这种持续时间比在现有技术中使用的持续时间要短得多。
步骤b)的持续时间通常少于或等于10分钟，例如，从1至5分钟。步骤b)和步骤a)优选是部分同时的，就是说，当步骤a)还未完成时开始步骤b)并且在步骤a)完成以后步骤b)仍然继续进行，这样导致额外地节省时间。
在步骤c)进行的胶化层的干燥通常是快速干燥，持续时间通常少于或等于15分钟，优选持续时间为1至10分钟，例如5分钟的持续时间。
这种干燥通常是在中等温度，例如25至60℃下进行。有利地，虽然不是必要的，可以在步骤c)的干燥以后，在比干燥温度更高的温度下进行热炼或退火的步骤d)，以保证(根据要求)层对其后用于固定化学或生物分子的程序(protocoles)具有更好的耐性。
退火温度一般可以是从70至200℃，而这种退火的持续时间可以是1至几分钟(例如，1、2或5分钟)，至1小时。
本领域技术人员根据基质可以容易地选择退火温度。
因此，这种根据本发明的方法的有利的、可行的然而可选的步骤d)，其是高温热炼硅烷或硅氧烷层的步骤，与现有技术方法的可比较步骤相比具有非常有限的持续时间。
有利地，化学官能团A相对于亲核基团来说是活性的官能团，如环氧官能团。这种类型的官能团表现出可以直接附着(或连接)生物和化学分子的优点。
所述硅烷或硅氧烷优选符合以下化学式(I)：
Figure A20058002237300161
其中R1、R2以及R3是相同或不同的，表示1至6个碳原子的直链或支链烷基基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；以及Y表示烃链，如1至20个碳原子的直链或支链的烷基链，其中一个或多个碳原子可以可选地被氧原子、硫原子或氮原子所取代。
化学式(I)的硅烷或硅氧烷的一个实例是(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)，例如可获自ABCR，参考SIE为4575.0。
其它硅烷或硅氧烷是，例如，2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、2-(3，4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油醚氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷((3-glycidyloxypropyl)-méthyl-diéthoxysilane)、(3-缩水甘油醚氧基丙基)三甲氧基硅烷(GLTMO)、(3-环氧丙基氧丙基)二(三甲基硅氧基)甲基硅烷、(3-环氧丙氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷((3-glycidoxypropyl)diméthyléthoxysilane)、(3-环氧丙氧基丙基)甲基二甲氧基硅烷或(3-环氧丙氧基丙基)五甲基二硅氧烷。
硅烷或硅氧烷，例如具有化学式(I)的硅烷或硅氧烷，通常存在于溶液中，其浓度以重量计为0.1％至10％。
催化剂通过存在于溶液中，其浓度以重量计为0.005％至5％。
催化剂可以是酸性催化剂。
酸性催化剂通常选自无机酸，如HCl、HNO3、H2SO4以及它们的混合物；或有机酸，如HCOOH、CH3COOH、CH2＝CH(CH3)COOH以及它们的混合物。
催化剂可以是碱性催化剂。
碱性催化剂通常选自氨、伯胺、仲胺、叔胺以及芳香胺。
优选地，当催化剂是碱性催化剂时，其选自三(C1至C10烷基)胺，如三乙胺(TEA)。
有利地，可溶混在步骤a)的溶液中的有机溶剂是醇，如包含1至12个碳原子的脂肪族醇，例如，乙醇或异丙醇。
有利地，在水和醇的混合物中，醇(如乙醇)以及水的比例以重量计是相对于醇0.05％至10％的水。
通常，水的相对量、硅烷或硅氧烷(如EHTEOS)的相对量、以及催化剂(如TEA)的相对量，由以下参数规定：
Figure A20058002237300181
以及
Figure A20058002237300182
(式中[X]表示本体x的摩尔浓度)，使得0＜H＜100以及0＜T＜100，优选0.1＜H＜20以及0.01＜T＜10，更优选0.8＜H＜2以及0.1＜T＜2。
已看到，环氧官能团可以直接附着化学或生物分子。然而，通过本领域技术人员已知的化学反应，在步骤c)或d)之后、或后来，可以将由厚层携带的官能团A，例如环氧官能团，转化成其它官能团A′，该官能团A′不同于官能团A，例如不同于环氧官能团，并且该官能团A′可以固定化学或生物分子。
所述官能团A′，不同于官能团A，例如不同于环氧官能团，优选选自相对于亲核基团的活性官能团，如二醇、醛、羧酸、活性酯、酰基卤、酐、酰胺、磺酰卤以及烷基或芳基卤官能团。
优选地，所述官能团A′是醛官能团。
溶液沉积在表面上(步骤a))之前，溶液可以可选地经受熟化。
本发明另外涉及用于制备固体基质的方法，该固体基质包括一表面，在该表面上固定或接枝化学或生物分子(通常称作探针)，其中固体基质的表面是通过如上所述的官能化方法加以官能化，然后，在没有洗涤官能化表面的情况下，化学或生物分子和所述由厚层携带的化学官能团A或A′进行反应。
优选地，所述化学或生物分子是这样的分子，其包含亲核基团，如胺、羟基、酚、羟基胺或硫羟官能团(thiol)，或它们的阴离子衍生物。
探针可以被固定在官能化表面上：
-通过在包含待固定的化学或生物分子的溶液中浸渍基质；
-通过在基质上沉积这种相同的溶液的液滴，可以人工或借助于沉积自动装置来进行这种沉积。
在化学官能团A或A′和通过待固定的生物或化学分子所携带的亲核基团之间的亲核进攻反应期间，通过产生共价键，进行生物或化学分子的不可逆的固定(immobilisation)。
应当注意到，在官能化步骤结束时以及在接下来的步骤之前，根据本发明的方法的基本特性，无须洗涤表面，而在用于制造SAM层的方法中，则必需利用有机溶剂以及可选地借助超声波来洗涤表面。
因此根据本发明的方法是更短和更简单，因而更便宜。因此它适合于更多种类的基质，尤其如塑料。
获得的表面(通过本发明的方法在其上沉积、固定化学或生物分子，本发明方法涉及通过溶胶-凝胶途径制备的官能化层)在通过荧光分析期间惊人地给出一种噪声背景(bruit de fond)，与通过常规硅烷化技术制备的官能化层或SAM层的类似表面相比，这种噪声背景被明显降低。因为荧光信号的强度类似，所以这尤其导致信噪比的增加。
此外，所获得的表面(通过本发明的方法在其上固定、沉积化学或生物分子)的第二特征是惊人地给出非常均匀并且尺寸小于现有技术的斑点。这构成一种优点，因为，具体地说，具有更小直径的斑点的产生使得可以增加表面上的探针密度，因而使得可以减小装置的尺寸(具有相同的复杂性)或增加沉积的探针数目(具有相等的表面积)。
本发明另外涉及在步骤c)(干燥的厚层)或步骤d)(热炼的厚层)结束时，使用通过上述方法获得的厚层作为光学层。
术语“光学层”或“具有光学性能的层”通常是指一般几十至几百nm的厚层，其具有产生干涉的主要性能。
这种层可以单独使用，另外它可以以若干光学层(例如，从2至30层)的堆积形式加以使用；堆积层可以都是通过根据本发明的方法(在步骤c)或d)结束时)沉积的层或者仅这些层的部分层是通过本发明的方法沉积的层。
具体实施方式
阅读下文结合附图给出的用于说明而不是限制目的的描述，可以更好地理解本发明，其中：
-图1给出不同官能化表面的荧光信号，其表示为关于16位的灰度级(GL)(65536级)，其中官能化表面上已固定有寡核苷酸，其已接着被用CY3荧光团标记的靶所杂交。
柱(或条)B和柱D分别给出环氧化物和醛表面的区域的荧光信号，上述表面是通过本发明的溶胶-凝胶方法加以官能化而制得(实施例3和实施例4)，而柱A和柱C分别给出用于环氧化物和醛表面的荧光信号，上述表面是通过涉及SAM型层的方法加以官能化而制得(比较例1和比较例2)。
-图2给出不同官能化表面的荧光噪声背景，其表示为关于16位的灰度级(GL)(65536级)，其中官能化表面上已固定有寡核苷酸，其已接着被用CY3荧光团标记的靶所杂交。
柱B和柱D分别给出环氧化物和醛表面的噪声背景，上述表面是通过本发明的溶胶-凝胶方法加以官能化而制得(实施例3和实施例4)，而柱A和柱C分别给出环氧化物和醛表面的噪声背景，上述表面是通过涉及SAM型层的方法加以官能化而制得(比较例1和比较例2)。
-图3给出对于650pl(皮升)容积的液滴斑点的直径D(微米)(在纵坐标上)，以及各种层的表面的接触角(α，度)(在横坐标上)；◆对应具有环氧官能团的SAM型的层，■对应具有环氧官能团的“溶胶-凝胶”型的层，●对应具有醛官能团的SAM型的层，▲对应具有醛官能团的“溶胶-凝胶”型的层。
在以下的图解1中，描述了通过根据本发明的溶胶-凝胶途径以及现有技术的常规方法(“参考方法”)进行官能化的方法，其中在现有技术的常规方法中，通过制备自组装单分子层(SAM层)来进行官能化。
图解1
固体基质可以是一种选自以下的材料：半导体，如硅；有机聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)以及聚氯乙烯(PVC)；金属，如金、铝以及银；玻璃；无机氧化物，通常作为层，如SiO2、Al2O3、ZrO2、TiO2或Ta2O5；以及包含若干这些材料的复合材料。
对希望官能化的固体基质的表面可选地进行清洗和/或活化，以便可以将层共价连接或机械附着(或连接)于基质。
可以按照以下描述的程序进行这种清洗和/或这种活化。
清洗的目的是除去有机和/或无机污染物，这些污染物会抑制官能化的效力。使用的清洗方法取决于基质的特性并且选自本领域技术人员已知的物理、化学或机械方法。例如，但非限制性的，清洗方法可以选自在有机溶剂中浸渍和/或用洗涤剂清洗和/或酸洗，这些操作是在超声波的帮助下进行；可选地这些清洗操作接着是用自来水(l’eau de ville)漂洗然后用去离子水漂洗；可选地这些漂洗作用接着是干燥：通过吸出(lift-out)，通过用醇喷雾，通过喷射压缩空气，用热空气或者通过红外辐射来进行。清洗还可以是借助于紫外线辐射来清洗。
活化的目的是活化表面以便使它在官能化步骤期间更具活性。使用的活化方法取决于基质的特性并且由本领域技术人员容易地选自已知的活化方法。
例如，对于由玻璃或由氧化物制成的表面，尤其在由硅制成的基质被覆盖一层氧化物的情况下，表面的化学活化使得可以给予其羟基基团。活化的目的是产生最多的OH部位、表面氧化物分子，例如表面SiO2分子，因而产生例如SiOH。
这种活化可以在碱性条件下进行，例如利用氢氧化钠或氢氧化钾，例如在Brown方法的情况下，其中表面被保持在氢氧化钠中一段延长的时间，或通过洗涤剂循环，接着用EDI大量漂洗，然后干燥。
由玻璃或由氧化物制成的表面还可以通过无机酸如HF的可控侵蚀(attaque)、或通过Piranha方法(H2O2/H2SO4混合物)或通过盐酸、铬酸/硫酸或磺基氧化酸(sulfo-oxygéné)来活化，这些酸可以含有或不含有缓冲剂，在该侵蚀之后用去离子水大量漂洗然后干燥。还可以通过产生自由基的氧等离子体来活化任何表面。
换言之，可以通过无机酸如HF的可控清洗、或通过Piranha方法(H2O2/H2SO4混合物)来活化表面，在该侵蚀之后用水大量漂洗然后干燥。还可以通过氧等离子体来产生活化作用。
对于硅来说，无需化学活化，因为附着主要是机械的。
对于塑料基质，成分的多样性要求优先选择等离子体类型的活化方式，例如通过氧等离子体或低压等离子体或空气等离子体，虽然洗涤剂类型的化学方法也起作用(如果它们针对每种材料被优化)。
通过点滴角度方法(méthode d’angle de goutte)或通过红外光谱术进行的测量可以表征基质的表面状态的转化效力。
基质可以表现为任何形式但通常是扁平基质，并且官能化表面通常是所述基质的自由上表面(surface libre supérieure)。
然而，可以通过相同官能团或通过不同官能团同时或分别对相同基质的两面进行官能化。
基质可以结构化或不结构化。
根据本发明，首先制备适当的硅氧烷或硅烷的溶液。
这种硅烷或硅氧烷可以，例如，符合以上给出的化学式(I)。
这种硅烷或硅氧烷可以更一般地选自下表的具有环氧官能团的硅烷或硅氧烷：
Figure A20058002237300251
在图解1中，通过举例方式，用(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)对本方法进行说明。
硅烷或硅氧烷的溶液是在醇和水、优选乙醇和水中的混合物中的溶液，它通常包含催化剂，如三乙胺TEA。
成分的相对量由两个参数规定： 以及
(式中[X]表示本体X的摩尔浓度)，使得0＜H＜100以及0＜T＜100；上述已提及优选值。
典型溶液是在水和乙醇的混合物中并且包含三乙胺(TEA)的(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)溶液，EHTEOS在溶液中的含量(concentration)以重量计是2.5％，水和乙醇的含量以重量计的比率是0.18％，并且成分的相对量由以下参数规定：[H＝H2O]/[EHTEOS]＝1以及T＝[TEA]/[EHTEOS]＝1。可选地在熟化以后，将此溶液沉积在基质上。
术语“熟化”是在通过溶胶-凝胶途径进行沉积的领域中通常采用的术语并且对于本领域技术人员来说是清楚的。
术语“熟化”通常是指溶液在特殊条件下储存一段时间，使得水解和缩合反应可以发生，直至达到某一阶段，该阶段一方面对于其后沉积在表面上的层的内聚(cohésion)是理想的，以及在另一方面对于将所述层接枝到基质也是理想的。
熟化通常包括在封闭容器中贮存溶液，同时排除空气以及可选地排除水分，例如通常在惰性气氛下、在静置条件下(也就是说，没有搅拌)或在温和搅拌下，温度通常在15℃和60℃之间，持续时间通常为1至几小时(例如，2、5或10小时)至1或几周(例如，2、5或10周)。
对于给定硅烷的溶液，熟化时间主要取决于贮存温度以及取决于以上定义的H和T参数，并且可由本领域技术人员容易地确定。
例如，对于以上描述的典型溶液，优选在22℃下进行熟化例如至少3天，同时搅拌。
在熟化结束时，获得的溶液可以称为水解硅烷的液体溶液；正是这种溶液与基质表面接触并沉积在基质表面上。
可以通过本领域技术人员已知的任何适宜的液相沉积方法来进行沉积，如(非穷举地)：旋涂、浸涂、层流涂镀(或弯月面法涂布)以及其可替换形式辊涂以及幕式淋涂、印刷(例如油墨喷墨印刷)、点样或喷涂。
这些沉积方法中的某些方法使得可以涂布较大的表面，例如从几百cm2至几m2，其形成本发明的方法的优点之一。
这些方法中的某些其它方法使得可以进行局部沉积，例如从几nm2至几mm2，其形成根据本发明的方法的另一个优点。
其它技术可以是高度自动化的并且可以获得高速度(旋涂、印刷、点样)，其形成本发明的方法的另一个优点。
通常在环境温度下进行沉积，即通常在15至35℃，优选20至25℃，例如23℃。
进行沉积的时间通常为几秒至几分钟，并且让沉积在表面上的溶液与表面接触一段充足的时间，例如少于10分钟，以形成共价连接(accrocher)于表面的厚胶化层(步骤b))。
厚层的形成(步骤b))和步骤a)同时(例如部分地)进行或在步骤a)以后立即进行。
在25℃和60℃之间进行几分钟最终干燥，例如少于15分钟的时间，然后可选地通常在70℃和200℃之间的温度下对层进行退火。
在表面提供有羟基基团以及溶液包含硅氧烷(如EHTEOS)的情况下，借助于-Si-O-键，厚层结合于表面。
这个层携带自由化学官能团，该化学官能团是在图解1中示出的环氧(EP)官能团并且其可以附着、固定或接枝化学或生物分子。
术语“厚层”在本发明的范围内通常是指几纳米至若干微米的层，例如10nm至10μm，例如50nm至1μm，例如100nm，这与自组装单分子层相反，自组装单分子层通常具有几埃至几nm的厚度。获得的层是均匀层(没有不规则性)，甚至在较大的表面积也是如此。
厚度的均匀性通常是±3％。该层还表现出非常低的吸收和散射损失(k＜2×10-3)并且在可见区其折射率大约为1.47。因此该层由于其光学性能而被使用，其可以单独使用或作为形成部分堆积光学层的层。
在图解1中，根据本发明的方法，其可以定义为，例如，在水/醇介质中通过溶胶-凝胶途径进行硅烷化的方法，与根据现有技术的方法(其中通过制备SAM型的层来进行硅烷化)进行了比较。
在现有技术的这种方法中，将这样的一种溶液施加于表面上，其包含相同的硅氧烷，即EHTEOS，但在有机溶剂如甲苯中，并且存在催化剂，该催化剂选自有机碱，如三乙胺(TEA)或二异丙基乙胺(DIEA)。
由于存在侵蚀性溶剂，如甲苯，所以这种方法不能用于许多敏感基质，尤其是塑料(PMMA、PC、PP、PS、PVC)、或包含树脂或粘合剂的基质。
沉积是在高温下进行，例如80℃，并且持续很长的时间，例如16小时左右。
如此获得的自组装单分子层(SAM)具有几埃至几nm的厚度，该层结合于基质，例如通过-Si-O-键，并且其携带可以固定化学或生物分子的官能团，如环氧(EP)官能团。
化学或生物分子其后被固定、附着或接枝到官能化表面，即提供有SAM层或提供有厚层的表面，两种层均携带使化学或生物分子的固定成为可能的官能团。
因为由层所携带的官能团通常是这样的官能团，如环氧官能团，其相对于亲核基团是活性的，所以待固定的化学或生物分子通常包含亲核基团，如胺、硫羟、羟基胺、羟基或酚基或这些基团的共轭碱。
通常根据预计的用途来选择化学分子；例如，它可以是手性分子、非手性分子、线型分子、环状分子或杂环分子。
生物分子通常选自蛋白质、DNA、寡核苷酸、肽以及低聚糖。
如果化学或生物分子并不携带亲核基团，则可以对其进行改性以使其携带一种亲核基团。
在图解1中，固定的分子是用NH2基团改性的寡核苷酸。
可以非常简单地进行生物或化学分子的接枝或固定，例如，通过将分子溶解在适当的介质中，如含水缓冲液，以及通过将分子沉积在官能化表面上，例如人工或利用点样自动装置，该自动装置装备有压电型(没有与表面接触)的顶部或装备有销(“pin”)或销和环型(与表面接触)的顶部。
最后，获得了其上接枝、附着或固定有化学或生物分子的表面：在图解1中，借助于胺(C-N)类键寡核苷酸被固定。
在官能化步骤结束时，也可以将由厚层或SAM层携带的官能团转化成其它官能团，这些其它官能团使化学或生物分子的固定成为可能。优选地，这些官能团也是相对于亲核基团具有活性的官能团。
因此，通过首先在含水HCl介质中打开环氧环以产生二醇，然后接着进行氧化剪切，例如用NaIO4，则可以将环氧官能团转化成醛官能团。
将化学或生物分子固定在装备有醛基团的层上，例如，通过使包含亲核基团的化学或生物分子与被醛官能化的表面进行接触。如果亲核基团是NH2基团，如在图解1中，则用低聚NH2(oligo-NH2)，接着进行还原，例如用NaBH4。
实施例1
在此实施例中，通过根据本发明的溶胶-凝胶方法，在由玻璃制成的基质(substrat)(商业上可获得的由浮法玻璃制成的薄片)上制备了包含环氧官能团并且厚度为100nm左右的厚层，其中通过在氢氧化钠中的清洗(或剥离)(Brown方法)来清洁和制备基质。
将存在有三乙胺(TEA)和水的乙醇中的(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)溶液沉积在所述基质上。
在溶液中EHTEOS的含量以重量计是2.5％。水和乙醇的含量的比率以重量计是0.18％(水/乙醇)。
成分的相对量由两个参数规定：H＝[H2O]/[EHTEOS]＝1以及T＝[TEA]/[EHTEOS]＝1，式中[X]表示本体X的摩尔浓度。
在22℃、温和搅拌下熟化溶液至少3天。
在环境温度下通过旋涂(速率为200至3000转/分钟，例如700转/分钟)进行沉积，以产生湿层。在基质和液体溶液之间的接触时间是1至几秒(例如，1至10秒)。在基质和湿层之间的接触时间是5分钟(层的干燥时间，同时基质仍然处于旋转)。
因此在基质上获得厚度为大约140nm并携带环氧官能团的厚胶化层。
在红外灯下干燥5分钟以及在80℃和150℃之间的温度下热炼1至几分钟(例如，5或10分钟)直至长达30分钟以后，接枝到基质上的致密层具有大约100nm±5nm的厚度以及大约1.47的折射率(它是在大约595nm处的四分之一波长)。
实施例2
在此实施例中，通过根据本发明的溶胶-凝胶方法在玻璃基质(商业上可获得的浮法玻璃制成的薄片)上制备了厚度大约为100nm并包含醛官能团的厚层。
用含水HCl处理(在环境温度下留在0.2N水溶液中3小时，然后用去离子水连续漂洗三次，接着干燥(通过空气喷射或离心))如在实施例1中制备的基质(设置有携带环氧官能团的厚层)，以便打开环氧环并且形成二醇，然后用NaIO4氧化剪切所述二醇(在环境温度下搅拌1小时，用去离子水漂洗5分钟，然后离心干燥)，以产生醛类官能团。
实施例3
将NH2改性的寡核苷酸(20个碱基(20mers))沉积和固定在实施例1中制备的载体上。通过压力型的自动装置在水溶液(0.3MNa2HPO4)中进行沉积。
通过用CY3荧光团标记的互补靶来杂交获得的寡核苷酸探针。用Axon Genepix扫描器进行荧光测量。
实施例4
重复在实施例3中相同的程序，但是使用了实施例2中制备的载体，获得了其上固定有改性的寡核苷酸的载体。
比较例1
在此比较例中，通过下述方法在基质上制备了单分子层，其排列受到控制(SAM层)以及其包含环氧官能团：
在碱性介质(NaOH/乙醇/去离子水，比例为1g/4ml/3ml)中清洗和活化载体(玻璃片或硅石片)，接着用去离子漂洗(5分钟)，然后在80℃下干燥。
其后在80℃下，通过在甲苯中的EHTEOS(5mM)和三乙胺(TEA，0.2M)溶液，对如此清洗和活化(羟基官能团在表面上)的载体进行官能化16小时。其后用丙酮、乙醇以及水漂洗基质并离心干燥，然后在高温下交联有机层(110℃下3小时)。
通过在环境温度下将基质浸渍在0.2M含水HCl溶液中3小时，将环氧官能团转化成二醇。其后漂洗基质，然后离心干燥。
其后通过实施例3的程序制备杂交寡核苷酸探针并进行荧光测量。
比较例2
在此比较例中，通过与比较例1相同的方法制备了单分子层，其排列受到控制(SAM层)以及其包含醛官能团，然后通过实施例2的程序将环氧官能团转化成醛官能团。
其后通过实施例3的程序制备了杂交的寡核苷酸探针并进行荧光测量。
在图1和图2中给出荧光测量的结果。
图1给出在根据本发明的实施例3和实施例4(B和D)以及比较例1和比较例2(A和C)中获得的各种杂交探针的荧光信号，其表示为相对于16位的灰度级(niveaux de gris)(65536级)。
图2给出实施例3和实施例4(B和D)以及比较例1和比较例2(A和C)的样品的基质的噪声背景。
环氧化物和醛类的表面可以获得相同数量级的信号。在通过根据本发明的方法的溶胶-凝胶途径所获得的表面上这个信号稍微弱些(图1中的B和D)：对于环氧化物表面，溶胶-凝胶层的信号低30％，而对于醛表面则低20％。
关于通过根据本发明的方法的溶胶-凝胶途径所获得的表面，改善了噪声背景(或噪声本底)(图2中的B和D)，这使得尤其可以增加信噪比(敏感性)。
对于给定的沉积自动装置、给定的沉积缓冲液以及给定的斑点容积，这种斑点的直径主要取决于表面的接触角：该角度越大，表面越疏水以及水溶液的斑点的直径越小。
意想不到地，考虑到对接触角所测得的数值，按照图3，通过溶胶-凝胶途径获得的斑点直径小于通过SAM途径获得的斑点直径(图3)。
在此比较例中，点样(spottée)的滴的容积是650pl(皮升)。在通过SAM途径获得的层上，在环氧化物类层和醛类层的接触角之间存在较大差异(分别为70和61°)。获得的斑点分别具有170和200微米的直径。
在通过根据本发明的溶胶-凝胶途径获得的层上，环氧化物类层和醛类层的接触角的值是类似的(分别为65和66°)。因此预期可以获得180和190微米之间的斑点直径。
意想不到地，对于环氧化物层和醛层，在溶胶-凝胶层上获得的斑点分别具有90和100微米的直径。
这种精确可控厚度的厚层尤其可以用作光学层，单独使用或作为堆积层的一部分，例如布拉格反射镜。这种反射镜的特点在于光学层，其厚度等于：发射波长除以在此波长下该层的折射率的4倍。在文献FR-A-2818378(WO-A-02/48691)中给出了通过溶胶-凝胶途径制备这种类型的反射镜的描述。

Claims (38)

1.一种用于对固体基质的可选地清洗和/或活化的表面进行官能化的溶胶-凝胶方法，其中进行了以下步骤：
a)在环境温度下，将在水和挥发性水混溶性有机溶剂的混合物中的酸性或碱性催化剂以及硅烷或硅氧烷的溶液沉积在所述表面上，所述硅烷或硅氧烷携带：至少一个化学官能团A，所述化学官能团A可以固定生物或化学分子和/或能够被转化成化学官能团A′，而所述化学官能团A′可以固定生物或化学分子，以及至少一个附着化学官能团B，所述附着化学官能团B能够通过共价结合化学附着、或机械附着于所述表面；
b)和步骤a)同时和/或在此步骤以后立即蒸发所述挥发性有机溶剂，从而将所述溶液转化成湿凝胶，进而形成厚胶化层；然后
c)干燥所述厚胶化层，从而获得厚层，所述厚层通过共价结合化学附着、或机械附着于所述表面，并且所述厚层携带所述化学官能团A，而所述化学官能团A可以固定化学或生物分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)中所述溶液的沉积是通过液相沉积技术来进行，所述液相沉积技术选自旋涂、浸涂、层流涂镀以及其可替换形式辊涂以及幕式淋涂、喷涂、印刷，例如通过采用喷墨印刷技术，以及点样。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b)是在环境温度下进行。
4.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，步骤a)的持续时间是1秒至10分钟。
5.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，步骤b)的持续时间少于或等于10分钟，例如1至5分钟。
6.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，步骤b)和步骤a)是部分同时发生的。
7.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，在步骤c)中进行的干燥具有少于或等于15分钟的持续时间。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤c)的干燥是在25℃至60℃的温度下进行。
9.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，在步骤c)的干燥以后，在比所述干燥温度更高的温度下进行热炼或退火的步骤d)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤d)是在70℃至200℃的温度下进行。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化学官能团A相对于亲核基团是活性的官能团，如环氧官能团。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硅烷或硅氧烷符合以下化学式(I)：
Figure A2005800223730003C1
其中R1、R2以及R3是相同或不同的，表示1至6个碳原子的直链或支链烷基基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；以及Y表示烃链，如1至20个碳原子的直链或支链烷基链，其中一个或多个碳原子可以可选地被氧原子、硫原子或氮原子所取代。
13.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述硅烷或硅氧烷选自(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)、2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、2-(3，4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油醚氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷、(3-缩水甘油醚氧基丙基)三甲氧基硅烷(GLYMO)、(3-环氧丙氧基丙基)二(三甲基硅氧基)甲基硅烷、(3-环氧丙氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷、(3-环氧丙氧基丙基)甲基二甲氧基硅烷以及(3-环氧丙氧基丙基)五甲基二硅氧烷。
14.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述硅烷或硅氧烷存在于所述溶液中，含量以重量计为0.1至10％。
15.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述催化剂是酸性催化剂。
16.根据权利要求1至14中任一权项所述的方法，其中，所述催化剂是碱性催化剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述酸性催化剂选自无机酸，如HCl、HNO3、H2SO4以及它们的混合物；或有机酸，如HCOOH、CH3COOH、CH2＝CH(CH3)COOH以及它们的混合物。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述碱性催化剂选自氨、伯胺、仲胺、叔胺以及芳香胺。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述催化剂选自三(C1至C10烷基)胺，如三乙胺(TEA)。
20.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述催化剂存在于所述溶液中，含量以重量计为0.005至5％。
21.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，可溶混在步骤a)的所述溶液中的有机溶剂是醇，如1至12个碳原子的脂肪族醇，如乙醇或异丙醇。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，在水和醇的混合物中醇和水的比例，水相对于所述醇是0.05％至10％。
23.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，水的相对量、硅氧烷如EHTEOS的相对量、以及催化剂如TEA的相对量，由以下参数限定：
Figure A2005800223730005C1
以及
Figure A2005800223730005C2
式中[X]表示本体x的摩尔浓度，使得0＜H＜100以及0＜T＜100，优选0.1＜H＜20以及0.01＜T＜10，更优选0.8＜H＜2以及0.1＜T＜2。
24.根据权利要求1至23中任一权项所述的方法，其中，将由所述厚层携带的所述官能团A，例如所述环氧官能团，转化成不同于所述官能团A的其它官能团A′，所述官能团A′可以固定化学或生物分子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述官能团A′选自相对于亲核基团为活性的官能团，如二醇、醛、羧酸、活性酯、酰基卤、酐、酰胺、磺酰卤以及烷基卤或芳基卤官能团。
26.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，在步骤a)以前，使所述溶液经受熟化。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述熟化包括在15℃至60℃的温度下并在没有搅拌或在温和搅拌的情况下在封闭容器中贮存所述溶液1小时至10周。
28.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述固体基质是选自以下的一种材料：半导体，如硅；有机聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)以及聚氯乙烯(PVC)；金属，如金、铝以及银；玻璃；无机氧化物，通常作为层，如SiO2、Al2O3、ZrO2、TiO2或Ta2O5；以及包含若干这些材料的复合材料。
29.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述基质可以结构化或不结构化。
30.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中，所述厚层具有10nm至10μm的厚度，例如50nm至1μm。
31.根据前述权利要求中任一权项所述的方法，其中：
步骤a)的溶液是(5，6-环氧己基)三乙氧基硅烷(EHTEOS)在水和乙醇的混合物中并且包含三乙胺(TEA)的溶液；
EHTEOS在所述溶液中的含量以重量计是2.5％，水和乙醇的含量以重量计的比率是0.18％，并且所述成分的相对量由以下参数限定：H＝[H2O]/[EHTEOS]＝1以及T＝[TEA]/[EHTEOS]＝1；
所述基质是由玻璃制成的基质，并通过在氢氧化钠中的清洗来加以清洁并制备；
所述溶液是这样一种溶液，其在22℃并温和搅拌的情况下已被熟化至少3天；
在环境温度下通过旋涂进行沉积，其中所述旋涂的速率是在200转/分钟至3000转/分钟之间，例如700转/分钟，以产生湿层，以及
所述基质和所述液体溶液之间的接触时间是1至10秒；
在所述湿层和所述基质之间的接触时间是5分钟，同时所述基质仍然旋转，因此在所述基质上获得厚度为大约140nm并携带环氧官能团的厚胶化层；
在红外灯下干燥所述厚胶化层5分钟以及在80℃和150℃之间的温度下进行热炼1至30分钟，借此获得接枝到所述基质的致密层，所述致密层具有大约100nm±5nm的厚度以及大约1.47的折射率。
32.一种用于制备固体基质的方法，所述固体基质包括其上固定有化学或生物分子的表面，其中，通过根据权利要求1至31中任一权项所述的官能化方法将所述固体基质的表面加以官能化，然后在没有洗涤所述官能化表面的情况下，使化学或生物分子和所述厚层携带的所述化学官能团A或A′进行反应。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述化学或生物分子是包含亲核基团的分子，所述亲核基团如胺、羟基、羟基胺或硫羟官能团，或它们的阴离子衍生物。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述化学分子选自手性分子、非手性分子、线型分子、环状分子或杂环分子。
35.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述生物分子选自蛋白质、DNA、寡核苷酸、肽以及低聚糖。
36.在根据前述权利要求中任一权项所述的方法的步骤c)或d)结束时获得的厚层作为光学层的应用。
37.根据权利要求36所述的应用，其中，所述层被单独使用。
38.根据权利要求36所述的应用，其中，所述层用于堆叠的若干光学层。
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