CN109706066B - 基因测序芯片微坑表面修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供基因测序芯片微坑表面修饰方法，所修饰的微坑的内外化学物质完全不同，相比于现有的技术，可以提高微坑修饰的质量。本发明利用镀金属层作为遮挡，根据不同的修饰要求，可以选择性的利用或者不利用光刻胶作为二次遮挡。首先遮蔽部分修饰区域，将剩余的部分区域修饰完毕，然后去掉遮蔽物，修饰遮蔽的区域。这种方式可以使得基因测序芯片的微坑内外具备完全不同的修饰，并且不会相互串扰。

Description

基因测序芯片微坑表面修饰方法

技术领域

本发明涉及一种利用镀膜的方法，实现细小结构的微坑区分修饰的方法，具体涉及一种生物化学或者基因测序芯片的微坑修饰方法；属于生物化学领域。

背景技术

生物化学领域中，基片作为主要的反应发生场所或者表面受到很多的关注。不同的反应中，要求不同的表面修饰。表面修饰质量是通过修饰的方法控制的。表面修饰的好坏直接影响生物化学反应的效率或者完成程度。比较特殊的，基因测序领域是一个对于基片表面要求严格的领域。基因测序属于新兴的领域，是当今科技发展的代表性技术之一。二代测序方法(NGS)是当前最成熟的测序技术。在二代测序技术中，很多时候用到了刻蚀的微坑测序的技术。刻蚀的微坑主要为反应提供区分和反应室。微坑的表面需要进行严格的化学修饰，保证芯片整体的均匀性，防止不期望的化学物的吸附，并且必要的时候，通过一定的化学修饰连接到需要反映的DNA片段上。微坑的化学修饰是一个很重要的研究方向。常见的测序方法中，微坑不进行区分修饰，或者对于区分修饰的要求并不严格。本发明提供一种严格的微坑修饰方法，所修饰的微坑的内外化学物质完全不同，相比于现有的技术，可以提高微坑修饰的质量。

发明内容

本发明提供一种基因测序芯片微坑表面修饰的方法，包括以下步骤：获得微坑外表面带有金属镀层的微坑基片；用第一化合物修饰微坑的内表面；去除外表面的金属层；用微接触印刷的方法在外表面修饰第二化合物，得到微坑内外表面区分修饰的基片；其中所述外表面带有金属镀层的微坑基片的微坑内表面没有金属镀层。

根据优选的实施方式，所述金属为铝、铬、镊、钛，或者其组合。

根据优选的实施方式，微坑的内表面可以用常见的浸泡或者CVD修饰的方法进行化学修饰。

根据优选的实施方式，微坑是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。

本发明提供一种基因测序芯片中微坑表面修饰的方法，包括以下步骤：获得微坑外表面带有金属镀层的微坑基片；用第一化合物整体修饰；基片的表面覆盖一层光刻胶；显影，去除微坑外表面的光刻胶；用微接触印刷的方法在外表面修饰第二化合物，得到微坑内外表面区分修饰的基片。

本发明提供一种生物化学微坑基片表面修饰的方法，包括以下步骤：获得外表面带有金属镀层的微坑的基片；基片的整体表面覆盖一层光刻胶；在基片的背面对光刻胶进行曝光，显影，去除未被金属遮蔽的光刻胶；用第一化合物修饰微坑的内部；去除金属和残留的光刻胶，用微接触印刷的方法在微坑的外表面修饰第二化合物，得到微坑内外表面区分修饰的基片；其中，所述基片是透明的。

根据优选的实施方式，所述光刻胶为正性光刻胶，微坑的内部填满光刻胶，外部仅存在薄层光刻胶；外部光刻胶的厚度为0.01-5微米，优选0.05-3微米，更优选0.1-2微米，更优选0.2-1微米。

根据优选的实施方式，所述金属镀层的厚度为20-500nm，优选30-300nm，更优选35-200nm，更优选50-150nm。

根据优选的实施方式，所述微坑的开口大小为为0.3-5微米，微坑的深度为0.3-5微米，微坑的周期为0.6-8微米。

一种区分修饰的生物化学基片，其特征在于，微坑的内表面亲水修饰，微坑的外表面疏水修饰，所述微坑的开口直径为0.3-5微米，微坑的深度为0.3-5微米，微坑的周期为0.6-8微米。

根据优选的实施方式,所述生物化学基片的内表面亲水修饰与外表面的疏水修饰相互隔离。

根据优选的实施方式，所述微坑阵列片的材质为玻璃、蓝宝石、硅片中的一种。

根据优选的实施方式，所述微坑阵列片的材质为镀膜的透明或者不透明硬质基片。

根据优选的实施方式，微坑内表面修饰对于水的接触角小于90度，微坑外表面对于水的接触角大于90度。

根据优选的实施方式，，微坑内表面与外表面修饰的化合物不相同。

本发明提供一种基因测序芯片，其特征在于，基因测序芯片包含微坑，微坑内外分别用不用的化合物修饰。

根据优选的实施方式，所述微坑的内外表面修饰的化合物不相互串扰。

本发明提供一种区分修饰基因测序芯片的方法,提供了基因测序芯片所用微坑的内外区分修饰的技术方案。利用了金属镀膜作为中介物，在修饰完其中一部分表面以后，除去金属，修饰另外的表面。这种方法遮蔽比较好，修饰效率高，能够使得两种表面比较好的区分修饰。

附图说明

图1.区分修饰的流程；

图2.光刻胶辅助区分修饰流程；

具体实施方式

为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。

本发明中，所采用的技术术语均为本领域的常规技术术语。

微坑的内侧(内部)指的是微坑的内表面，参见图1。微坑的内侧包括微坑的底部，还包括微坑的侧壁。在图1中，101为微坑石英片，其表面的部分有微坑，微坑的外侧涂覆有一层金属铝102。经过表面修饰以后，清洗掉金属铝参见图1的第二个图。微坑的外表面(外侧、外部)指的是微坑外面有与金属层102接触的部分。微坑的内部或者内表面，指的是微坑的内侧壁、底部的部分。本发明中所称的内部或者外部也属于一般性的意义，属于常见的描述方式。

本申请中，所述的微坑指的是玻璃或者石英材质的微坑；或者蓝宝石微坑等。在此并不严格限制微坑的范围。本申请中，所述的微坑的表面成分含有硅，比如含量在10％以上，优选20％以上，更优选30％以上。

本申请中，需要在微坑的外表面首先形成可以用简单的方法去除的镀膜，这种镀膜指的是金属镀膜，并且可以用比较温和的条件去除。例如，铝镀膜可以用磷酸或者其它条件去除，比如镀铬层可以用用5-10％的盐酸溶液去除。

本申请中，金属镀膜的厚度不易太厚，比如20-500nm，优选30-300nm，更优选35-200nm，更优选50-150nm。这样的镀金属技术中，后期的处理会比较简单。太厚的金属层可能导致去除条件比较苛刻，影响后续的化学修饰。

本申请中，微坑内部可以用常见的亲水或者疏水方法，微坑的外部可以用相反的疏水或亲水修饰方法。微坑的内部的修饰一般根据后续的应用决定，比如修饰特殊的基团用于连接DNA分子或者小球。微坑的外部的修饰一般要求与内部不同，并且不能修饰与内部相同的化学基团；这样才能更好的区分内外的化学环境。

根据优选的实施方式，微坑的外表面用疏水的化合物进行修饰，使得外表面疏水。微坑的内表面用亲水的化合物进行修饰，使得内表面亲水。疏水修饰所用的化合物不会修饰到微坑的内表面，亲水修饰的化合物不会修饰到微坑的外表面。

根据优选的实施方式，微坑内表面与外表面的修饰不会相互串扰。

根据优选的实施方式，微坑内表面与外表面的修饰只有极微小部分、在边界区域的相互串扰。

微坑的深度是其开口直径的0.1-10倍之间，优选的0.2-5倍之间，更优选的0.5-2倍之间，更优选的微坑的深度是其开口直径的大约1倍。微坑上表面的开口形状可以根据工艺选择，比如六边形，方形，三角形，圆形等等。最常见的微坑的上表面的开口形状是圆形或者接近圆形。当微坑的上表面开口是圆形的时候；整个微坑的形状可以是圆柱形或者圆锥形，接近圆柱或圆锥的形状。俯视微坑表面的时候，微坑的排列形状可以是四方形排列的，也可以是六方形排列的。MEMS工艺是微坑加工工艺中的一种。比如选择玻璃或硅片作为材料，利用光刻保护的方法，在硅片或者玻璃上刻蚀阵列的微坑。或者选用玻璃或者硅片作为基底，在上面制备一定厚度的材料，然后利用光刻保护的方法，在该材料表面上制备阵列的微坑；这种方法典型的应用可以是氮化硅材料。

微通道板也是微坑加工工艺中的一种。光纤面板材料(FOP)制备的微坑成功率较高，微坑形貌较好，均匀。微通道板的原料是双面抛光的，利用0.1M的硝酸浸泡即可将微通道板的表面刻蚀。微通道板分为皮层和芯层材料；由于组分的差异，皮层材料在硝酸中没有变化，而芯层材料会慢慢溶解；这样控制浸泡的时间即可以获得一定深度的微坑。微坑的直径由微通道板的芯层材料的直径决定。微坑的坑壁厚度由微通道板的皮层材料厚度决定。这样，用酸刻蚀的方法，保护微通道板的一个面以后，就可以获得单面有微坑的板材了。

根据优选的实施方式，芯片中，反应区域的微坑进行了表面修饰。微坑的外表面以及微坑的内壁进行了亲疏水性质不同的修饰。例如，当微坑的外表面进行了疏水修饰的时候，微坑的内表面可以进行亲水修饰。

其中，所述的微坑的外表面是疏水修饰的，以及微坑的内表面是非疏水修饰的。

所述的微坑的外表面指的是一般意义上的内表面，指的是，微坑的外部表面，主要是图1中微坑与微坑之间的相邻“墙壁”的表面。微坑的内表面指的是微坑的侧壁以及底部。

本发明提供一种生物化学微坑基片表面修饰的方法，包括以下步骤：获得外表面带有金属镀层的微坑的基片；基片的整体表面覆盖一层光刻胶；在基片的背面对光刻胶进行曝光，显影，去除未被金属遮蔽的光刻胶；用第一化合物修饰微坑的内部；去除金属和残留的光刻胶，用微接触印刷的方法在微坑的外表面修饰第二化合物，得到微坑内外表面区分修饰的基片；其中，所述基片是透明的。

一般的，在基片的背面进行曝光能够除掉微坑内部的光刻胶，保留微坑外表面的光刻胶。使得微坑的外部获得完善的保护。这种特殊的用法直接以金属为遮蔽，防止外部的光刻胶曝光，形成完善的保护。由于化合物的选择性，比如部分化合物需要一定条件下的液态修饰，酸性或者碱性的环境对于金属的遮蔽有很大的影响。特殊的修饰方式可以使得基片有更多的修饰空间，并且完善的阻挡内外表面修饰混合。

本发明中，所述的内表面或者外表面，符合一般性的定义。微坑为通过一定技术在基片的表面“挖”的坑。微坑的内表面指的是微坑内部的部分，包括侧壁及底部的裸露面。微坑的外表面指的是微坑与微坑之间的，基片的表面的部分。

本发明中，所述的微坑的内部和外部也属于一般性意义上的内部外部，符合一般性的定义。微坑为通过一定技术在基片的表面“挖”的坑。微坑的内部指的是所挖的坑的里面，微坑的外部指的是所挖的坑的外面。一般意义上，基片表面以上的部分，都属于微坑的外部。参见图2的制备流程中。

本发明中，所述的微坑的是阵列的微坑。微坑的形状并没有特定的要求。微坑的开口大小为为0.3-5微米，微坑的深度为0.3-5微米，微坑的周期为0.6-8微米。优选的，微坑的开口大小为0.6-4.2微米，更优选的1.0-3.8微米，更优选的1.5-3微米，更优选的1.8-2.6微米。微坑的深度为0.6-4.2微米，更优选的1.0-3.8微米，更优选的1.5-3微米，更优选的1.8-2.6微米。微坑的周期为0.6-8微米，优选的0.7-7.5微米，更优选的1.0-6微米，更优选的1.5-5微米，更优选的1.9-4.2微米，更优选的2.5-3.5微米。微坑的开口大小加上微坑的外表面墙壁的厚度为微坑的周期。本发明中，微坑是阵列的微坑。特殊的，阵列的微坑的部分区域有区分的标志，比如微坑缺失的区域，比如特殊形状的微坑等等。

本文中所述的外表面是疏水修饰的，指的是，全部外表面疏水修饰，或者全部外表面加上部分与外表面直接相邻的内表面疏水修饰。根据现有的技术，可以用接触印刷等方式区分外、内表面的化学修饰，但是由于其结构微小，很难控制外、内表面的分界，一般情况下，微接触印刷的面积会稍微大于微坑的外表面，可能有部分的内表面也被疏水修饰。例如有1％-2％的同外表面接触面积的内表面，被进行了疏水修饰。相同的，例如有1-2％的同内表面接触面积的外表面，被进行了亲水修饰。这种极微小面积的混合修饰，并不会影响亲疏水修饰的效果。

其中，所述的微坑的外表面以及微坑内壁的亲疏水修饰并不是完全分界的；例如微坑的外表面进行疏水修饰；那么根据修饰手段的不同，微坑的与外表面接近的微坑的内壁的部分表面被疏水修饰。

疏水修饰的接触角大于113°，优选大于118°。从有利于应用的目的，所述疏水修饰的接触角指的是平均接触角。

从有利于应用的目的，微坑的外表面进行疏水修饰，微坑的内壁进行亲水修饰。

根据优选的技术方案，所述的疏水修饰的接触角大于118度。所述接触角指的是微坑的内表面和外表面都进行修饰以后的平均接触角。

一般的修饰方法中，微米级别的区分化学修饰是很难做的。在这种小尺度下，常规的方法很难做到微坑内外修饰不同的化合物。本发明利用了镀膜保护的方式，首先将特定的区域遮蔽起来，在修饰完部分区域以后，去遮蔽修饰剩余的区域。方法本身不但需要考虑遮蔽的方法，还需要考虑修饰化合物的活性。利用这种方法做的修饰，均匀度比较好，内外修饰的串扰比较低。

本发明中，所述基片为基因测序芯片的组成部分。将基片同另外的基底组装，可以形成密封的芯片。组装完的芯片，可以用于基因测序。

本发明所涉及的测序方法参见CN201510822361.9，CN201710630287X。特殊的，上述两个专利的内容可以以引用的形式加入本专利。

本发明中,所涉及的基因测序芯片的基片及芯片封装方式参见201710574174.2。该专利的附图3,4,5中103部分同本申请中所述基片功能相同。该专利的部分内容可以以引用的方式加入本专利。

实施例1

首先在石英片的表面溅射一层50nm厚度的金属铝，然后按照常见的石英刻蚀步骤进行加工。涂覆光刻胶，显影，洗掉光刻胶，用10％的磷酸去除裸露出来的镀膜铝，再ICP刻蚀石英，最后去除刻蚀残留的光刻胶。这个工艺可以获得镀有金属铝的微坑。本实施例中，所刻蚀的微坑为圆柱体。微坑的开口直径为2微米，深度为2微米，周期为4微米。

带有微坑的石英片用PLASMA处理5min，harrick，功率高，空气条件。处理完的石英片在10min之内放入第一修饰容器。本实施例中，第一修饰溶剂为表面活性剂tween 20，浓度为0.01M，处理时间为3min。修饰完毕以后，用10％的磷酸洗掉微坑外侧的金属铝。然后可以用常规contact printing(微接触印刷)的方法在微坑外侧修饰一层三甲基氯硅烷。从而得到了内壁亲水，外壁疏水的表面。经过接触角检测，发现石英片的整体接触角约为115度。

参见图1，微坑剖面图的结构。首先得到了镀有金属铝的石英片。图中，101为微坑石英片，其表面的部分有微坑，微坑的外侧涂覆有一层金属铝102。经过表面修饰以后，清洗掉金属铝参见图1的第二个图。

实施例2

首先在石英片的表面溅射一层50nm厚度的金属铝，然后按照常见的石英刻蚀步骤进行加工。涂覆光刻胶，显影，洗掉光刻胶，用10％的磷酸去除裸露出来的镀膜铝，再ICP刻蚀石英，最后去除刻蚀残留的光刻胶。这个工艺可以获得镀有金属铝的微坑。本实施例中，所刻蚀的微坑为圆柱体。微坑的开口直径为2微米，深度为2微米，周期为4微米。

带有微坑的石英片PLASMA处理15min，harrick功率高，空气。处理完的石英片放入密封的盒子中，静置过夜。然后将石英片取出，利用常规contact printing(微接触印刷)的方法在微坑外侧修饰一层三甲基氯硅烷。然后涂覆一层光刻胶。本实施例中，所采用的光刻胶为AZ4620，用丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)稀释2倍。每1ml的光刻胶加入1ml的PGMEA。将光刻胶加满石英片的表面，然后3000rpm涂胶1min。涂胶以后的石英片整个表面都有光刻胶。用AZ4620显影液(显影液比水的比例为1:4)显影60s。取出。未曝光的光刻胶显影的速度比较低，但是通过控制时间，可以更精确的去除薄层的光刻胶。

然后用用10％的磷酸去除裸露出来的镀膜铝，时间约1min。然后用AZ4620显影液将剩余的光刻胶完全洗掉。最后用真空CVD的方法熏蒸一层巯基硅烷。这样也达到了内外表面区分修饰的目的。参见图2，101指的是微坑的芯片或者基片，102指的是镀层的金属，103指的是光刻胶部分。图2中的第一张图，首先获得带有金属镀层的基片；第二张图中，涂上一层光刻胶，正好覆盖了基片的表面，微坑的内部也被填满了光刻胶，并且控制基片的上表面的光刻胶比较薄。一般的，实验性的结果，基片上表面的光刻胶的厚度在200-500nm比较适宜，或者在300-600nm比较适宜。基片表面的光刻胶通过显影液的处理，可以轻易的去除，并且将微坑内部的光刻胶保留下来。这样的基片已经对于微坑的内部进行了遮蔽。去除金属以后，可以使用常规的方法进行修饰。比如，plasma处理以后，直接进行三甲基氯硅烷的修饰30Min，或者其它烷基硅烷修饰。修饰的方法并没有严格的限制。外表面修饰完毕以后，可以用显影液去除剩余的光刻胶，参见图2的第三个图片。微坑的内表面裸露出来，可以进行下一步的修饰。本实施例选用的是修饰巯基硅烷。修饰完毕，接触角约为115度。

实施例2所述的方法，实施的时候，由于多了光刻胶保护的步骤，需要除去光刻胶，然后除去金属，修饰完上表面；再去除内部的光刻胶进行内部的修饰。这种方法中，好处是保护了内部表面不会被contact printging的化合物污染。不好的地方是，内部修饰的时候，少量的化合物会修饰到外表面上。

实施例1和实施例2两种方法各有优势。实施例2的方法中，光刻胶涂覆表面的时候可能会厚度不易控制，但是其对于内表面的保护比较好。

实施例3

根据实施例2所述的方法。区别在于，镀金属的片子涂覆一层光刻胶，光刻胶在片子表面的厚度控制在500nm到2微米。然后从片子的背面照射365的紫外光，使得不被金属保护部分的光刻胶分解。然后用实施例2所述比例的显影液进行显影。通过控制显影时间约为40s，可以去除曝光部分的光刻胶。微坑的内部裸露，外壁被光刻胶和金属双层遮蔽。这个时候，可以通过实施例1所述的方法，进行内部的修饰。然后根据实施例1所述的方法，首先显影液清洗光刻胶，然后去除金属，然后进行微坑外表面的修饰。实验接触角约为120度。

实施例3所述的方法比较特殊，适合于一般的微坑内表面的修饰溶剂中含有酸性或者碱性的物质，可能导致镀层穿孔，从而污染外表面的情况。这种方法中，只适合于石英或者常规玻璃等透明的基片。

实施例4

不利用金属镀膜的方法，直接获得带有微坑的基片。首先利用cvd的方法修饰内表面。具体的，首先将清洗的基片plasma处理，然后真空CVD需要修饰的化合物巯基硅烷，时间为30min。内表面修饰完毕以后，利用常见的contact printging方法修饰外表面的化合物全氟辛基三氯硅烷，30min。经过检测，微坑的接触角约为115度。本修饰方法也可以参见申请人的另一个专利CN2017105741742，或者CN201710630287X，该专利的内容可以以引用的方式加入本专利。

这种方法修饰的基片，内表面修饰的过程中，不可避免的会连同外表面一起修饰。也就是说，基片的外表面不仅有需要修饰的疏水化合物，还会有一定比例的内表面亲水化合物。

实施例5

根据实施例1所述的方法。选择相同的石英微坑片，相同的第一化合物和第二化合物。不镀金属。其它步骤同实施例1相同。实验测得，接触角约为60度。接触角明显偏低。

所述实施例是本发明的具体解释，并不对于本发明的范围造成限定。

Claims (4)

1.基因测序芯片微坑表面修饰的方法，包括以下步骤：获得微坑外表面带有金属镀层的微坑基片；用第一化合物修饰微坑的内表面；去除外表面的金属层；用微接触印刷的方法在外表面修饰第二化合物；得到微坑内外表面区分修饰的基片；其中所述外表面带有金属镀层的微坑基片的微坑内表面没有金属镀层；其中所述金属为铝、铬、镍、钛，或者其组合；其中所述金属镀层的厚度为50-150nm；所述第一化合物与第二化合物的亲疏水性质不相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微坑的内表面可以用浸泡或者CVD修饰的方法进行化学修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微坑是圆柱形、圆台形、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。

4.基因测序芯片微坑表面修饰的方法，包括以下步骤：获得外表面带有金属镀层的微坑基片；基片的表面覆盖一层光刻胶；在基片的背面对光刻胶进行曝光，显影，去除未被金属遮蔽的光刻胶；修饰微坑的内部；去除金属和残留的光刻胶，用微接触印刷的方法修饰微坑的外表面，得到微坑内外表面区分修饰的基片；其中，所述基片是透明的；其中所述金属为铝、铬、镍、钛，或者其组合；所述光刻胶为正性光刻胶，微坑的内部填满光刻胶，外部仅存在薄层光刻胶；其中所述外部光刻胶的厚度为0.1-1微米；所述金属镀层的厚度为50-150nm；其中，所述基片微坑的内表面亲水修饰，微坑的外表面疏水修饰，所述微坑的开口直径为0.3-5微米，微坑的深度为0.3-5微米，微坑的周期为0.6-8微米。

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