CN108070526A - 一种核酸测序系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种核酸测序系统，其包括第一流体提供系统；第二流体提供系统；测序芯片；其中所述第一流体提供系统为测序芯片提供油相流体；所述第二流体提供系统为测序芯片提供水相流体；所述测序芯片的流体室的内表面有高通量的微反应室。本发明提供的可以油封的测序系统和方法，可以实现高通量的基因测序。

Description

一种核酸测序系统
技术领域
本发明涉及核酸测序系统，属于基因测序领域，具体涉及一种新式的核酸测序系统及方法。
背景技术
基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或者人体附属物中分析测定基因序列，预测患多种疾病的可能性，如癌症或白血病等。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用。基因芯片或者说测序芯片是基因测序用的芯片。目前已经有多种多样的基因测序芯片问世。基因芯片的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出待测核酸的序列。根据测序方法的不同，测序仪器所需的流体系统也不相同。比如在Illumina的测序仪器中，其流体系统依靠一个注射泵和一个旋转阀进行试剂的传送。本发明针对类似荧光切换的测序方法，参见CN 201510822361.9或CN201510815685.X，设计一种油封式的测序方法，可以将每个反应室之间隔离，从而隔绝反应室之间的物质交换。
发明内容
本发明提供一种核酸测序系统和方法，其特征在于，包括第一流体提供系统；第二流体提供系统；测序芯片；其中所述第一流体提供系统为测序芯片提供油相流体；所述第二流体提供系统为测序芯片提供水相流体；所述测序芯片的流体室的内表面有高通量的微反应室。
根据本发明优选的技术方案，所述测序芯片具备流体入口、流体出口、流体室、高通量的微反应室，其中所述高通量的微反应室位于芯片流体室的内表面。
根据本发明优选的技术方案，所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的。
根据本发明优选的技术方案，所述第一流体提供系统和第二流体提供系统包括试剂瓶、注射泵、电磁阀、试剂管路。
根据本发明优选的技术方案，所述第一流体提供系统和第二流体提供系统共用注射泵。
根据本发明优选的技术方案，所述测序芯片的至少部分结构是透明的。
根据本发明优选的技术方案，所述测序系统还包括第三流体提供系统，为测序芯片提供除测序反应液以外的其它水相试剂。
根据本发明优选的技术方案，所述测序系统还包括第三流体提供系统；所述第三流体为清洗液，用于清洗油相流体。
根据本发明优选的技术方案，所述清洗液为异丙醇、乙醇或者含有表面活性剂的水溶液。
根据本发明优选的技术方案，所述测序系统的第二流体提供系统，除了向芯片提供测序反应液以外，还可以提供其它水相试剂。
根据本发明优选的技术方案，所述高通量的微反应室的至少部分表面对于水的接触角处于118°-145°之间，优选120°-138°之间，更优选123°-135°之间。
根据本发明优选的技术方案，包括光学系统，所述光学系统包括物镜；流体室和物镜分别位于高通量的微反应室所在平面的两侧。
本发明提供一种核酸测序方法，其特征在于，包括测序芯片；第一流体；第二流体；其中所述第一流体为油相流体；所述第二流体为水相流体；所述测序芯片流体室的内表面有预先加工好的高通量的微反应室；利用油相流体将水相流体封闭在测序芯片的微反应室内，水相流体中的测序试剂与微反应室内的待测核苷酸序列进行反应，通过检测微反应室内的信号获得相对应的待测核苷酸序列信息。
根据本发明优选的技术方案，所述测序指的是通过酶，使得反应物上的荧光基团释放到反应液中的测序方法。
根据本发明优选的技术方案，所述测序包括第三液体。第三液体为油相流体清洗液，用于将芯片中的油相流体冲洗干净。
根据本发明优选的技术方案，在进行检测的时候，通过油相流体，将水相流体封闭在高通量的微反应室中，形成相互隔离的反应单元；通过检测，获得对应于微反应室内的待测核苷酸序列的信息；
所述测序指的是利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；
所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变。
本发明所述的测序指的是需要利用油封的方法隔离反应室的测序方法。一般的测序方法中，测序反应发生以后，荧光标记物不会游离到溶液中去，不需要使用本发明所述的方法。例如常见的illumina各式测序仪。本发明所述的测序方法可以是专利CN201510822361.9或者CN 201510815685.X为代表的测序方法。
除特殊说明外，本发明所涉及到的所有用语均为本领域的常规含义。
附图说明
图1.高通量的微反应室的电镜图片。
图2.三层芯片结构横截面图。
图3.芯片结构示意图。
图4芯片不残水显微图片。
图5芯片残水显微图片。
图6测序系统示意图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1,
芯片主要分为三层。从上到下分别是微反应室芯片层，中间胶层，下层底板层。在上层的微反应室芯片层上打孔。中间胶层有镂空的反应室结构，下面的底板层为一块玻璃。三层组装在一起形成芯片。外界流体通过微反应室芯片层上的孔进入，然后通入中间胶层形成的反应室内，最后通过微反应室芯片另一端的孔流出芯片。
如图2所示，底板玻璃层为101，中间层为模切的双面胶102，上层为微通道板103。其中102中，模切的机构形成了空腔式的反应室。103的下表面，也就是与102接触的面，蚀刻有阵列的微反应室；图中并未画出。103微反应室芯片层上在合适的位置打孔，作为外界流体进出反应室的通道。孔与反应室直接相连。
实施例2
芯片主体分为三层，包括上层的微反应室芯片层，中间的胶层，下层的底板层。芯片层上有107～108个微孔矩阵；胶层有镂空的流道，提供厚度为10～200μm的微流体通道；底板层为玻璃材质，通过湿法刻蚀形成微流体的进样通道和进/出样口。进/出样口通过密封胶圈将芯片的微流体通道与外界的液路连通。三层芯片经对准后，密封形成完整芯片，再安装在塑料壳上形成芯片盒。
如图3所示，201为芯片的塑料外壳，其上还有用于和仪器匹配的定位孔207。芯片塑料外壳的中间部分有镂空的部分，用于设置芯片上层的微反应室芯片层202。芯片可以设置多个入口，例如入口204，并且用胶垫205密封。芯片底层玻璃为203，其上有预先加工的凹陷的管路用于连通入口204和反应室206。反应室206设置成类似M性的弯曲形状，这样即可以有效利用空间，又满足了流体阻力的平衡。
玻璃底板的外形尺寸为40×75×1mm。芯片可以有多个进/出样口，根据不同的流体需要，油相和水相分别从不同的进样口进入。入口区域在图片右下端。三个入口分开，并且用胶垫连接外界与流道。图中只标出了其中一个胶垫。图中，微反应室芯片放在最外面的塑料壳形成的中心空间中，其与M形管路形成封闭的流体室，在M形管路的正上方。
外面的塑料壳主要起支撑的作用。外面的塑料壳的形状可以是多种多样的。图中根据底板玻璃的形状设计成类似长方形的设计。
实施例3
用下面的测序方式进行测序。2+2测序，单色：配置3套反应液，每套两瓶，每瓶有两种标记有荧光基团的碱基，荧光基团均为X。一套中的两瓶反应液，恰好包含完整的4种碱基。6瓶溶液互不重复。
第一瓶 第二瓶
第一套 AX+CX GX+TX
第二套 AX+GX CX+TX
第三套 AX+TX CX+GX
完整的测序过程包括三轮，三轮依次进行。每轮的测序过程分别使用上述三套试剂。除此之外完全相同(使用相同的测序引物，反应条件完全相同)。
每轮测序包含：
1.将测序引物杂交在已经制备好的DNA阵列上
2.开始测序过程。重复2.1-2.4过程有限次。
2.1进第一瓶试剂。反应并采集荧光信号。
2.2清洗flowcell中的全部残留反应液和产生的荧光分子
2.3进第二瓶试剂。反应并采集荧光信号。
2.2清洗flowcell中的全部残留反应液和产生的荧光分子
3.将延伸过的测序引物解旋。
至此，便可进行下一轮实验。
准备反应液：
配制测序反应液洗液，简称洗液，含有:
20mM Tris-HCl pH 8.8
10mM(NH4)2SO4
50mM KCl
2mM MgSO4
0.1％20
配制测序反应液母液(简称母液)，含有:
20mM Tris-HCl pH 8.8
10mM(NH4)2SO4
50mM KCl
2mM MgSO4
0.1％20
8000unit/mL Bst polymerase
100unit/mL CIP
配制三组测序反应液，共六瓶。分别为：
1A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dC4P-TG
1B、母液+20uM dG4P-TG+20uM dG4P-TG
2A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dG4P-TG
2B、母液+20uM dC4P-TG+20uM dG4P-TG
3A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dT4P-TG
3B、母液+20uM dC4P-TG+20uM dG4P-TG
配制好的反应液和母液，置于4c冰箱或冰上待用。
杂交测序引物：
将测序芯片内注入测序引物溶液(10uM溶解于1X SSC buffer)，升温至90度，在以5摄氏度/min的速度降温至40度。用洗液冲洗掉测序引物溶液。
进行第一次测序：
将测序芯片置于测序仪上。
使用第一组反应液进行测序。遵循如下流程。
1，通入洗液10mL，冲洗芯片
2，将芯片降温至4摄氏度
3，通入100uL反应液1A
4，将芯片升温至65摄氏度
5，等待1min
6，用473nm激光激发，拍摄荧光图像。
7，通入洗液10mL，冲洗芯片
8，将芯片降温至4摄氏度
9，通入100uL反应液1B
10，将芯片升温至65摄氏度
11，等待1min
12，用473nm激光激发，拍摄荧光图像。
重复1-12的步骤50次，得到100个荧光信号。
实施例4
实施例3的基础上，将油加入。在测序试剂通入芯片以后，例如步骤3，通入100uL反应液1A；将油通入芯片，可以使得微反应室内部为测序试剂，微反应室外部为油。微反应室与微反应室之间相互隔离。然后用水将油冲走。继续进行下面的步骤。
实施例5
根据实施例2所述的芯片。测量FOP表面修饰后的接触角为125度。微接触印刷的方法为，取新制备的1mm厚度的硅橡胶，旋涂硅烷，然后在氮气的保护下，迅速贴合在刚刚用等离子体处理的FOP表面，停留10min。用实施例4相同的方法进入水，矿物油和洗液。实验发现，芯片的表面经过100轮没有明显的变化。如图4所示，光学显微镜下，芯片的表面形态完好，没有残留的洗液。
实施例6
根据实施例2所述的芯片。根据实施例5所述的方法，微接触印刷的时候，停留时间为1min。测量接触角为116度。用实施例5相同的方法进入水，矿物油和洗液。实验发现，大概10个循环的时候，芯片的表面开始出现明显的残水。所用的测试方法同实施例5完全一样。如图5所示，光学显微镜下，芯片表面有很多比较亮的水滴存在，证明芯片的表面的水性液体残留严重。
实施例7
根据实施例2所述的芯片。为该芯片配备如图6所示流体系统。图中，1101为水相流体试剂瓶，1102为油相流体试剂瓶，1103为油相流体冲洗液试剂瓶，1201,1202,1203为电磁阀，1300为芯片，1400为注射器泵，1104为废液储存瓶。利用该简单液路系统，可以为芯片完成进入水相溶液，然后进入油相溶液，然后冲洗的循环流程。通过这种循环进液的方法，实现芯片的基本功能。
本发明利用该测序芯片，实现了高通量的基因测序。
所有实施例都是对于本发明的进一步解释，并不对于专利的保护范围造成限制。

Claims (12)

1.一种核酸测序系统，其特征在于，包括第一流体提供系统；第二流体提供系统；测序芯片；其中所述第一流体提供系统为测序芯片提供油相流体；所述第二流体提供系统为测序芯片提供水相流体；所述测序芯片的流体室的内表面有高通量的微反应室。
2.根据权利要求1所述的测序系统，其特征在于，所述测序芯片具备流体入口、流体出口、流体室、高通量的微反应室，其中所述高通量的微反应室位于芯片流体室的内表面。
3.根据前面任一项权利要求所述的测序系统，其特征在于，所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的。
4.根据前面任一项权利要求所述的测序系统，其特征在于，所述第一流体提供系统和第二流体提供系统包括试剂瓶、注射泵、电磁阀、试剂管路。
5.根据权利要求4所述的测序系统，其特征在于，所述第一流体提供系统和第二流体提供系统共用注射泵。
6.根据前面任一项权利要求所述的测序系统，其特征在于，所述测序芯片的至少部分结构是透明的。
7.根据前面任一项权利要求所述的测序系统，其特征在于，包括光学系统，所述光学系统包括物镜；流体室和物镜分别位于高通量的微反应室所在平面的两侧。
8.根据前面任一项权利要求所述的测序系统，其特征在于，还包括第三流体提供系统；所述第三流体为清洗液，用于清洗油相流体。
9.根据权利要求8所述的测序系统，其特征在于，所述清洗液为异丙醇、乙醇或者含有表面活性剂的水溶液。
10.一种测序方法，其特征在于，包括测序芯片；第一流体；第二流体；其中所述第一流体为油相流体；所述第二流体为水相流体；所述测序芯片流体室的内表面有预先加工好的高通量的微反应室；利用油相流体将水相流体封闭在测序芯片的微反应室内，水相流体中的测序试剂与微反应室内的待测核苷酸序列进行反应，通过检测微反应室内的信号获得相对应的待测核苷酸序列信息。
11.根据前面任一项权利要求所述的方法或系统，其特征在于，所述测序指的是通过酶，使得反应物上的荧光基团释放到反应液中的基因测序方法。
12.根据前面任一项权利要求所述的方法或系统，其特征在于，在进行检测的时候，通过油相流体，将水相流体封闭在高通量的微反应室中，形成相互隔离的反应单元；通过检测，获得对应于微反应室内的待测核苷酸序列的信息；所述测序指的是利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变。
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