CN112176042B - 一种基因测序试剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因测序试剂及方法。通过在测序反应液中添加一种或多种添加剂来提高测序反应速率和反应完成度，增加测序的准确性和测序读长。所述的添加剂包括亚精胺其类似物或衍生物、三甲基胺及其类似物或衍生物，或其混合物。

Description

一种基因测序试剂及方法

技术领域

本发明属于基因测序领域。具体来说，本发明涉及适基因测序的方法和试剂。

背景技术

二代测序技术目前占据测序的主流市场，进一步提高测序的读长和准确率仍然是研究者不断追求的目标。陈等(nat.biotechnol.,2017)通过纠错编码(error-correctioncode,ECC)测序法显著提高了测序的准确率。该方法是将ACTG四种碱基通过三种正交方式两两组合：一种组合为M(氨式)＝A+C和K(酮式)＝G和T,一种组合为R(嘌呤)＝A+G和Y(吡啶)＝C+T，一种组合为W(双键)＝A+T和S(三键)＝C+G。DNA片段通过MK和RY两个循环的测序后能够解析出其序列，第三个循环的WS组合的测序能对结果作进一步的复验和校正。

在ECC反应过程中，每次DNA的聚合酶延伸反应是延伸两种碱基(如进液为M则延伸A碱基和C碱基)，每次碱基延伸个数从1到10余个不等。测序反应过程中保证每一次DNA的聚合酶延伸反应的完成度是实现高保真度和长读长的关键。其反应效率、反应时间、组分的含量都需要精确优化。而在较短反应时间内，保证多个碱基延伸反应完全是一个挑战。单一地提高组分的含量或延长反应时间会引起错配或lead，同时反应速率会达到平台后也不再增加。本专利通过添加亚精胺(spermidine)和三甲基胺(TMANO)及其类似物、衍生物或其混合物的方法，显著提高了聚合酶延伸的反应效率和反应完成度，增加了测序读长。

发明内容

本发明提供一种基因测序试剂，其特征在于，包括两种或者两种以上的核苷酸测序底物，还包括有机胺；其中所述有机胺为亚精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸测序底物为荧光标记的核苷酸底物分子。

根据优选的实施方式，所述核苷酸测序底物为具有荧光切换性质的核苷酸底物分子，5’末端磷酸修饰有荧光团，优选地为5’末端有4-8个磷酸分子的荧光团。

根据优选的实施方式，所述有机胺的浓度为10μM至100mM。

本发明提供一种基因测序的方法，其特征在于，在测序反应液中添加一种或多种添加剂，其中所述添加剂能够提高测序反应的反应速率，增加测序检测结果的准确性和测序读长；所述的添加剂包括亚精胺及其类似物或衍生物、三甲基胺及其类似物或衍生物，或其混合物。

根据优选的实施方式，其中所述亚精胺其类似物或衍生物、三甲基胺其类似物或衍生物、或其混合物的浓度为10μM至100mM。

根据优选的实施方式，所述测序反应特征在于两种或三种不同碱基的核苷酸底物分子同待测基因序列进行反应，不同碱基的核苷酸底物分子可以用同一种或不同种荧光团标记

本发明提供一种基因测序试剂，其特征在于，包括核苷酸测序底物，有机胺；其中所述有机胺为亚精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸测序底物为荧光标记的核苷酸底物分子。

本发明所述添加剂加入到测序反应液中用于测序反应，与不存在所述添加剂的测序反应相比，测序反应速率明显增加，反应速率提高大于10％、40％或80％。不含添加剂的对照反应中，较慢的反应速率会导致多个碱基延伸的反应不完全，尤其是5个甚至10个以上长homopolymer的碱基延伸反应。反应的不完全会影响测序的保真度和准确性，进而影响测序读长。而通过增加测序反应液中酶，底物分子等各组分的浓度以及延长反应时间，很难进一步提高测序反应速率及反应完成度，且很容易导致错配概率的提高以及lead的发生。此外，所述添加剂还可能具有其他提高测序质量的功能，比如减少GC歧视等。

附图说明

图1.测序反应液中添加不同浓度亚精氨(0mM,10μM，100uM,1mM,5mM)的反应动力学图；

图2.测序反应液中不添加亚精氨和添加5mM亚精氨的测序结果校正图；

图3.添加0.5mM三甲基胺(TMANO)以及不添加三甲基胺的反应动力学曲线；

图4.测序反应液中添加0.5mM三甲基胺(TMANO)的测序结果图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。

本发明提供一种提高核酸测序质量的组分和方法。通过在测序反应液中添加一种或多种添加剂来提高测序反应速率和反应完成度、增加测序结果的准确性和测序读长。所述的添加剂包括亚精胺及其类似物或衍生物、三甲基胺及其类似物或衍生物，或其混合物的。优选地亚精胺其类似物或衍生物、三甲基胺其类似物或衍生物、或其混合物以约0.1mM至100mM的浓度存在。

本发明所述核酸为固定在支持物表面的待测核苷酸序列。任选地支持物表面为微流体芯片反应池的表面。所述测序反应液包括一种酶和荧光标记的核苷酸底物分子。其中酶包括DNA聚合酶和/或碱式磷酸酶。荧光标记的核苷酸底物分子指是5’末端磷酸修饰有荧光团的核苷酸底物分子，优选地为5’末端有4-8个磷酸分子的多磷酸修饰荧光团的核苷酸底物分子。测序反应发生时，DNA聚合酶将核苷酸底物分子上的多磷酸荧光团释放，碱式磷酸酶再将多磷酸切除从而释放荧光团。

本发明采用边合成边测序的方法。测序反应前待测核苷酸序列会预先结合上引物，再将测序反应液加入到微流体芯片反应池后，通过加热测序反应液触发测序反应开始。反应过程中，测序反应液中与待测核苷酸序列片段互补配对的核苷酸底物分子在酶的作用下发生碱基延伸反应并释放荧光团。用特定波长的光激发荧光团，并使用合适的检测系统(例如电耦合式摄像机，CCD)在适当的波长处收集荧光发射信号。通过实时监测反应过程中的荧光信号的变化来记录反应动力学信息。通过记录反应后和/或反应前的信号值来获得此次碱基延伸反应的信号值。

本发明测序反应特征在于每次碱基延伸反应一种、两种或三种不同碱基的核苷酸底物分子。每种核苷酸底物分子可连接同种或不同种荧光基团。优选地，采用2+2的测序方法，即一轮测序共有两组测序反应液，每组测序反应液中有两种核苷酸底物分子。其中一组测序反应液中的核苷酸底物分子可以和待测核苷酸序列上的两种碱基互补，另一组测序反应液中的核苷酸底物分子可以和待测核苷酸序列上的另外两种碱基互补。两种反应液循环加入，通过荧光信息获得待检测核酸的编码信息。重复此测序反应过程至少20或200个循环为一轮测序。2+2的测试方法中，由于每次测序反应所延伸的碱基种类为两种，单轮测序尚不能完全解码ACGT四种碱基。可以进一步地按照CN106755292A，CN106755390A所述方法进行第二轮或第三轮测序。即将四种碱基按照两两组合的方式进行三轮测序,分别为M(AC)K(GT)组合，R(AG)Y(CT)组合，W(AT)S(CG)，。通过两轮或三轮的组合信息则可以完全解码待测核酸序列。

一般的，本发明所述的测序指的是多碱基测序。测序的反应液中，含有两种或者两种以上的不同种类的核苷酸测序底物。待测的核酸片段被固定在微球或者基底上，当反应液进入的时候，反应液中的核苷酸底物分子同待测的核酸片段反应。核苷酸底物分子的3端是敞开的，也就是说没有人为的修饰阻挡下一步反应的进行。

本发明所述的测序指的是多碱基的测序过程。所述的有机胺类物质，对于其它测序反应并没有好的影响结果。尝试性的实验中，曾经把亚精胺添加到illumina原理的单碱基测序延长的测序反应中去，并没有明显的效果；并且，不合适的添加量还引起了测序读长的缩短。例如在miseq的测序试剂中，直接添加5mM亚精胺，并不能延长测序的读长；其它效果未明。有理由相信，亚精胺针对多碱基测序的过程是有益的；针对其他测序反应并不明确。

多碱基测序的过程中，每轮延长的长度是不固定的。可以相信的是，亚精胺等添加剂在这个过程中起到了稳定反应的作用。多碱基的测序并没有被清楚的研究，科研界的论文也没有这方面的报道。因此，亚精胺的具体机理是不能明确的。

多碱基的测序过程中，测序试剂中有两种还是三种核苷酸底物分子对于整个测序的反应来说，不是重大的改变。只有在数据处理的时候，会显出明显的差异。

本发明还保护一种组分，包含：一种固定在表面的待测的核苷酸序列片段，一种测序反应液，一种测序添加剂。该测序反应液能够与待测的核苷酸序列片段进行测序反应，该测序添加剂提高了测序反应的反应速率，和准确性以及多次测序反应的测序读长。所述添加剂包括亚精胺其类似物、衍生物或其混合物。所述添加剂包括三甲基胺其类似物、衍生物或其混合物。所述亚精胺其类似物或衍生物、三甲基胺其类似物或衍生物、或其混合物以约0.1mM至500mM的浓度存在。

一种基因测序试剂，其特征在于，包括两种或者两种以上的核苷酸测序底物，有机胺；其中所述有机胺为亚精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸测序底物为荧光标记的核苷酸底物分子。

其中所述基因或者核酸为固定在支持物表面的待测核苷酸序列。

根据优选的实施方式，其中测序反应液包括一种酶以及荧光标记的核苷酸底物分子。

根据优选的实施方式，其中测序反应特征在于待测核苷酸序列片段与酶及荧光标记的核苷酸底物分子进行的碱基延伸反应并释放荧光团。

根据优选的实施方式，，所述测序反应特征在于每次碱基延伸反应一种、两种或三种不同碱基的核苷酸底物分子，不同碱基的核苷酸底物分子可以用同一种或不同种荧光团标记。

根据优选的实施方式，其中酶包括DNA聚合酶和/或碱式磷酸酶。

根据优选的实施方式，其中荧光标记的核苷酸底物分子指是5’末端磷酸修饰有荧光团的核苷酸底物分子，优选地为5’末端有4-8个磷酸分子的多磷酸修饰荧光团的核苷酸底物分子。

根据优选的实施方式，其中测序反应特征优选地为DNA聚合酶将核苷酸底物分子上的多磷酸荧光团释放，碱式磷酸酶再将多磷酸切除从而释放荧光团。

根据优选的实施方式，其中测序检测为记录、采集所述测序反应前和/或测序反应过程中和/或测序反应后荧光信号的变化。

根据优选的实施方式，其中测序反应及测序检测过程包括至少1或50或200个测序反应循环。

根据优选的实施方式，其中测序反应及测序检测过程用于测序，即解码待测核苷酸序列。

根据优选的实施方式，其中与不存在所述添加剂的情况下测序结果相比，所述核酸序列信息的保真度增加。

根据优选的实施方式，其中与对照相比，反应速率提高，反应速率提高大于10％、40％或80％。

一种基因测序方法，其特征在于，包括：

1.将表面种植有待测DNA片段的测序芯片置于测序仪；

2.通入第一测序反应液；

3.温控平台升温至酶反应温度；

4.降低温度，采集信号，记录反应信号值

5.通入第二测序反应液

6.温控平台升温至酶反应温度；

7.降低温度，采集信号，记录反应信号值

重复1-7步骤获得多个测序信号；

其中步骤2和5中的测序反应液中含有有机胺；所述有机胺为亚精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸测序底物为荧光标记的核苷酸底物分子；所述第一测序试剂和第二测序试剂分别含有不同的、不止一种的核苷酸测序底物分子。

根据优选的实施方式，所述降低温度指的是温度降低至4-15℃。

根据优选的实施方式，所述升温指的是温度升高到35-65℃。根据不同的酶决定升温的温度。

一种组分，包含一种固定在表面的待测的核苷酸序列片段；一种测序反应液；一种测序添加剂；该测序反应液能够与待测的核苷酸序列片段进行测序反应，该测序添加剂提高了测序反应的反应速率，和准确性以及多次测序反应的测序读长。

根据优选的实施方式，其中添加剂包括亚精胺其类似物、衍生物或其混合物。

根据优选的实施方式，其中添加剂包括三甲基胺其类似物、衍生物或其混合物。

根据优选的实施方式，其中所述亚精胺其类似物或衍生物、三甲基胺其类似物或衍生物、或其混合物以约0.1mM至100mM的浓度存在。

除特殊说明外，本发明中所涉及的词语均为本领域的常规含义。在申请人已经公开的专利文件中也多次出现。

本发明具体实施方式中的具体实施例，仅仅是对于本发明的进一步说明，并不够构成成本发明的限制因素。

实施例1

本发明的一种实施例是将不同浓度的亚精胺添加到测序反应液中进行检测测序反应的动力学。实验过程如下：

配置含不同浓度亚精氨的测序反应液母液，含有1U/μL Bst DNA聚合酶,0.5U/mL小牛肠碱性磷酸酶,2mM氯化锰,亚精胺浓度分别为0mM(对照),10μM，100uM,1mM,5mM,以及缓冲液(含20mM Tris-base,10mM硫酸铵,50mM氯化钾，20，10mM二硫苏糖醇，PH8.5)。再在测序母液中加入一组核苷酸底物，10μM TG-dA4P和10μM TG-dT4P。测序反应液则配置完成，放置4℃待用。

反应动力学检测：

1.取出固定有待测核苷酸阵列的测序芯片

2.将测序引物与待测核苷酸分子进行杂交

3.对测序芯片进行15℃控温

4.进测序反应液

5.对测序芯片及芯片内的测序反应液进行65℃加热,保持反应时间为35秒

6.实时采集荧光信号

图1为含不同浓度亚精胺的测试反应动力学。该反应所延伸的碱基为TATTA。横坐标为反应时间，纵坐标为荧光信号值。由图可以看出，随着亚精胺添加浓度的增加，反应速率有明显提高。反应曲线也更加趋于平直，表示反应完全。

实施例2

本发明的一种实施例是将不同浓度的亚精胺添加到测序反应液中进行测序反应。

配置两瓶不同的测序反应液，分别为W(含AT)和S(含CG)。测序反应母液的组分与实施例1相同，所添加亚精胺浓度分别为0mM(对照)和5mM。W瓶在测序反应母液中进加入10μM TG-dA4P和10μM TG-dT4P。S瓶在测序反应母液中进加入10μM TG-dC4P和10μM TG-dG4P。

配置测序洗液,包含：20mM Tris-base,10mM硫酸铵,50mM氯化钾，20，PH8.5。

测序过程包括：

1.将表面种植有待测DNA片段的测序芯片置于测序仪上

2.通入洗液1ml清洗芯片

3.温控平台冷却反应腔室至15℃

4.通入100μL第一瓶测序反应液W

4.打开激发光源并用相机采集信号，记录背景值

5.温控平台升温至65℃，聚合酶延生反应进行，保持反应时间为35秒

6.再次降温至15℃，采集信号，记录反应信号值

7.通入洗液1ml清洗芯片

8.温控平台冷却反应腔室至15℃

9.通入100μL第二瓶测序反应液S

10.打开激发光源并用相机采集信号，记录背景值

11.温控平台升温至65℃，聚合酶延生反应进行，保持反应时间为35秒

12.再次降温至15℃，采集信号，记录反应信号值

重复1-12步骤100次，得到200个荧光信号。

图2a)和图2b)为不添加亚精胺和添加5mM亚精胺的的测序结果图。其中每张图有三幅子图。每幅子图的横坐标表示测序反应的次数，纵坐标表示每一次测序反应的荧光信号强度。深色柱状图为进W反应液的信号，浅色柱状图为进S反应液的信号。柱状图的高度代表所信号值的高低。第一行子图为原始信号分析，第二行子图是对原始信号进行了衰减(decay)校正的结果。第三行子图是在进行了衰减(decay)校正后进一步校正失相(dephasing)的结果。通过第三行进行了衰减和失相校正的数据来评判测序结果，包括检测准确性和测序读长。图中黑色·标记位置为理论信号值位置，黑色×号标记为校正后错误序列。图中180cycle的测序检测中，对照只有前10轮测序正确，后续均校正错误，而添加了5mM亚精胺在180cycle的测序检测中只有8个错误，其余均校正正确。

实施例3

反应动力学以及测序过程参见实施例1和实施例2，添加剂改为三甲基胺0.5mMTMANO，检测反应动力学(延伸碱基GCGGCGC)，并用于测序。检测160cycle，错误个数为8个。

实施例4

此外，根据实施例1所述的方法，测试过的添加剂还包括下表中内容：

本实施例中所述添加剂并非是相同的浓度。这些添加剂由于其性质的不同，并不能使用相同的浓度添加。然后这种影响的趋势是固定在实验结果的基础上可以预测的。本实施例中所述的浓度为优化的浓度。经过多次的实验发现，表中的浓度较为优化的浓度结果。对比各种添加剂对于测序影响的时候，并不需要使用相同的浓度。只需要根据实施例1所述的测序方法，然后添加其他添加剂，通过多次浓度对比获得优化结果即可。

通过对比可以发现，多碱基测序的过程中亚精胺和三甲基胺的效果是最明显的。这种效果比较主要体现在两个方面，第一个，对于测序速度的提升，第二个，错误率的降低。只有在两个方面都有比较好的结果，才能认定为是有益的添加剂。而简单的类似物，没有对于亚精胺或者三甲基胺的结构造成巨大的改变，大量的实验也支持了这一结果也支持这一结果。因此，认为有效的物质不仅仅是亚精胺和三甲基胺，还有其类似物衍生物等。而亚精胺、三甲基胺这两个添加剂的组合，只需要总浓度控制即可。

具体实施例是对于本发明内容的进一步解释和说明，并不对于本发明的内容构成限制。并且，并不是所有的实验数据都是有用的；不需要将所有的实验数据都一一列举出来。

Claims (4)

1.一种基因测序试剂，其特征在于，包括两种或者两种以上的核苷酸测序底物，还包括有机胺；其中所述有机胺为亚精胺和/或三甲基胺；

所述核苷酸测序底物是具有荧光切换性质的核苷酸底物分子，5’末端磷酸修饰有荧光团，核苷酸底物分子的3’端是敞开的；

其中，所述亚精胺和/或三甲基胺的浓度为10μM至100mM。

2.根据权利要求1所述的试剂，所述核苷酸测序底物5’末端有4-8个磷酸分子的荧光团。

3.一种基因测序的方法，其特征在于，在测序反应液中添加一种或多种添加剂，其中所述添加剂能够提高测序反应的反应速率，增加测序检测结果的准确性和测序读长；所述的添加剂包括亚精胺和/或三甲基胺；

所述测序反应特征在于两种或三种不同碱基的核苷酸底物分子同待测基因序列进行反应，所述核苷酸底物分子是具有荧光切换性质的核苷酸底物分子，5’末端磷酸修饰有荧光团，核苷酸底物分子的3’端是敞开的；

所述亚精胺和/或三甲基胺的浓度为10μM至100mM。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，不同碱基的核苷酸底物分子可以用同一种或不同种荧光团标记。