CN109706068B - 一种带有定位标的基因测序芯片 - Google Patents
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Abstract
发明提供一种带有定位标的基因测序芯片,利用FOP作为第一基板,在其中一个表面上制备微坑,在另一个表面上制备定位标。所述定位标是周期性排列的,具有荧光性能的定位标志,用于基因测序时相机视野范围内的精确定位;每个视野范围内有一组可以表明位置信息的定位标。利用低成本的方法制备了可以精确定位的标志,并且可以布满整个检测区域。
Description
技术领域
本发明涉及一种带有定位标的基因测序芯片,属于基因测序领域。
背景技术
基因测序是一种新型基因检测技术,能够从血液或者人体附属物中分析测定基因序列,预测患多种疾病的可能性,如癌症或白血病等。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用。基因芯片或者说测序芯片是基因测序用的芯片。目前已经有多种多样的基因测序芯片问世。基因芯片的原型是80年代中期提出的,其测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法,在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出待测核酸的序列。后来又在此基础上发展出其他的测序方法,根据测序方法的不同,测序芯片的设计也完全不一样,但主要的检测方法都是对芯片的检测区域进行扫描,收集扫描后的荧光信号进行分析。在芯片扫描过程中,可能会遇到相邻的扫描区域错位、重叠的现象,本发明公开一种带有定位标的基因测序芯片,用于在上述错位、重叠现象发生时进行校正。
发明内容
本发明提供一种带有定位标的基因测序芯片,包括第一基板,反应室,第二基板;其中,所述第一基板与第二基板,通过预留反应室的方式组合,形成芯片;所述第一基板为FOP(Fiber Optical Plate);所述FOP在反应室一侧的表面为下表面,另一个表面为上表面;所述上表面有预先制备好的定位标,所述下表面有预先制备好的阵列微坑;所述定位标是周期性排列的,具有荧光性能的定位标志,用于基因测序时相机视野范围内的精确定位;每个视野范围内有一组可以表明位置信息的定位标。
根据优选的实施方式,所述定位标的材质为SU-8 2001,2002,2005。
根据优选的实施方式,所述定位标的材质为光敏性化合物。
根据优选的实施方式,所述一组包括三个。
根据优选的实施方式,所述一组包括三个或更多。
根据优选的实施方式,所述一组包括4个或更多。
根据优选的实施方式,所述一组包括单一形状的定位标。
根据优选的实施方式,所述一组包括不同形状的定位标。
根据优选的实施方式,还包括起始定位标。所述起始定位标用于确定起点的位置。
根据优选的实施方式,所述定位标包括直线元素。
根据优选的实施方案,所述定位标包括线交叉的点元素。
根据优选的实施方式,首先在FOP非微坑的表面涂一层光刻胶,然后通过掩膜版曝光的方式,制备定位标,然后封装成基因测序芯片。
根据优选的实施方案,所述定位标的图形局部对称却不绝对对称。
根据优选的实施方案,相邻组的定位标是一样的。
根据优选的实施方案,相邻组的定位标不完全一样。
本发明提供一种带定位标的基因测序芯片的制备方法,其特征在于,利用FOP为第一基板,在FOP的下表面利用刻蚀的方法形成微坑,在FOP的上表面制备定位标;将FOP带有微坑的表面同第二基板组装,形成芯片。
根据优选的实施方案,所述定位标是周期性排列的,具有荧光性能的定位标志,用于基因测序时相机视野范围内的精确定位;每个视野范围内有一组可以表明位置信息的定位标。
本发明有如下显著优点:
1一组定位标中包含至少3个小定位标,只要其中任意一条对角线上的两个小定位标结构完整,就可以实现校正偏移量的功能,容错性好;
2定位标的形状为多个正方形的组合,只由直线构成,局部对称却不绝对对称,这样即使有个别小定位标残缺,只要主体结构还存在即可识别出来,因此进一步提高了容错性;
3除中间位置的定位标阵列以外,在微坑阵列边缘处还设计了独特的定位线结构,用于定位扫描的起始点,这样可以消除定位标制作的绝对位置偏差;
4在微坑阵列四个直角附近还设计了扇形的对准定位标,用于辅助将带有定位标的微坑阵列与配套的底板进行对准组装,形成芯片;
5每组定位标位置位于扫描视野的中心区域,距离视野边缘距离适中,可以保证只要偏移量小于一个视野的距离,就有足够多的小定位标用于校正;而现有的步进电机等移动装置,可以完全达到这个精度;
6定位标制作于微坑阵列的光面一层,不会影响到芯片内部微坑的有效数量和功能。
7.定位标可以在眀场的时候识别,也可以在荧光场的时候识别。都能够获得比较好的成像。FOP本身由于其制备材料和过程的关系,都带明显的指纹。这种指纹是二次复丝的边缘造成的。但是FOP的本身指纹在荧光场的时候,并不容易被识别出来。当然,改变FOP的芯层材料可以使得这种识别更容易,但是更强的指纹的荧光会影响基因测序。因此,FOP本身的指纹在荧光场的时候不易被识别。但是在眀场的情况下,FOP的指纹可以和其本身的定位标配合形成独特的图案。这种图案也是一种加密结构,可以使得任意两片FOP之间区分开来。这种区分在产品验证的过程中显得尤为重要。
附图说明
图1.为局部一组定位标设计的示意图,分别包含3个和4个小定位标;
图2.为整体定位标设计示意图,包含定位标阵列、定位线和辅助对准的定位标,分别对应图1中的两种局部定位标;
图3.为制作出的定位线附近的几组定位标实物图;
图4.为局部残缺但可以识别的两组定位标实物图。
具体实施方式
下面结合附图,通过实施例,进一步阐述本发明。本发明的具体实施方式是对于本发明的进一步说明,不对本发明的范围造成限制。
本发明可以用专利CN2017105741742,或者专利CN2017105741441,或者专利CN201710630287X中所述的芯片结构。这三个专利中的内容,能够以引用的方式加入本专利。并且,当所述专利的参数同本发明不一致的时候,选择本发明中所述的参数进行替代。
本发明的目的是提供一种芯片定位标,用以解决测序时芯片扫描过程中发生的相邻扫描区域错位、重叠的现象。
根据优选的实施方案,本发明所述反应室高度为30-200微米,优选50-100微米,更优选80微米。
根据优选的实施方式,第一基板和第二基板之间,通过一定厚度的双面胶粘合封装,从而形成反应室。
根据优选的实施方式,第一基板和第二基板之间,通过模切的双面胶粘合封装。
根据优选的实施方式,在第二基板上,预先通过湿法刻蚀的方式制备反应室,然后两个基板通过双面胶封装在一起。
根据优选的实施方式,FOP的下表面利用酸液作为刻蚀剂,将芯层材料蚀刻一定的厚度,保留皮层材料,从而形成阵列的微坑。
根据优选的实施方式,所述微坑的开口大小为1-5微米。
根据优选的实施方式,所述微坑的周期为1.5-7微米。
根据优选的实施方式,所述定位标局部对称却不绝对对称。
根据优选的实施方式,所述定位标的尺度在20-200微米之间。
根据优选的实施方案,所述光刻胶的厚度为0.5-10微米,优选1-5微米,更优选3-4微米。
根据优选的实施方案,所述光刻胶为SU8 2005,厚度为1.5微米。
根据优选的实施方案,芯片的起始位置有不同形状的唯一定位标识,用于校正起始位置。
根据优选的实施方式,测序的时候,物镜的焦点定位于FOP定位标所在的表面,同时获得定位标信息以及另一个表面的微坑中的反应信息。
本发明的目的是提供一种带有定位标的基因测序芯片,用以解决测序时芯片扫描过程中发生的相邻扫描区域错位、重叠的现象。
一个技术方案,本发明包括一组3个或更多相同或不同形状的定位标,芯片扫描过程中每个拍照视野内包含一组定位标。定位标的形状和尺寸示例参见图1。当扫描时视野位置正确时,该组定位标位于视野正中央;当相邻的视野发生错位或者重叠时,该组定位标在视野内的位置会发生偏移。因此可以通过测量定位标位置的偏移量,校正扫描视野的偏移量。同时,该组4个小定位标形状彼此不相同,而扫描位置偏移量最大不会超出一个正常视野,所以还可以通过识别小定位标的形状判断扫描位置偏移的方向。本发明还包括四个直角附近的扇形对准定位标,以及一组定位线,包括两条横线和一条竖线,用于校正扫描起始位置。
定位标通过光刻的方式制作于芯片的微坑阵列光面,具体使用方法如下。
首先制作用于光刻的掩膜版,结构图如图2所示。再在需要定位的微坑阵列光面均匀旋涂一层光刻胶(包括但不限于SU-8 2001,2002,2005),并进行前烘。然后将带有光刻胶的微坑阵列置于掩膜版下进行曝光,然后显影,后烘,即得到带有定位标的片子。
将定位标的芯片放在荧光显微镜下面观察,激发光488nm,可以明显观察到定位标的形状。如图3所示。一般的,基因测序中,用光刻胶做定位标具有荧光匹配的问题。简单的说,基因测序中,样品的荧光信号十分微弱,这种情况下,对于定位标荧光的强度要求十分高。本发明中,利用光刻胶作为定位标,预先测量不同厚度的定位标的荧光强度,同测序信号进行比较,然后制作定位标。本发明中,当用SU82002做定位标的时候,一般需要将其厚度控制在1-2微米的范围内。
特殊的,图3中的视野范围并不一定是实际测序时候的相机视野范围。定位标的分组以及分布是按照实际相机的视野范围和移动距离设定的。
本发明还有一个显著优点是,一组定位标中包含4个小定位标时,只要其中任意一条对角线上的两个小定位标结构完整,就可以实现校正偏移量的功能,因此对光刻过程的要求相对比较低,容错性好。
本发明所述的对角线指的是,任意两个定位标连线,特别是同相机成像视野的水平位置不完全平行时,可以称为对角线。
一般的,一组定位标至少包括三个小的定位标。
一般的,一组定位标指的是一个视野内的定位标。当采用不同的物镜或者相机观察的时候,视野的范围并不是固定的。因此,可以根据物镜或者相机的参数调整相应的定位标的实际范围。
一般的,点或者交叉的线是可以被识别的元素。特征的点和交叉的线组成的图形,易于被识别。
一般的,一组定位标中,并不需要选择完全一样的图形。定位标的意义在于快速识别图像中的精确位置。不同图形的组合并不影响这种识别功能。
一般的,定位标的组与组之间,可以互不相同。
需要说明的是,定位标同微坑不在相同的表面。FOP的一个表面制备好微坑以后,需要在其另一个表面制备定位标。如果在微坑的相同表面制备定位标,会导致流体不均匀,并且制备的难度远大于不同表面。相同表面的定位标还存在了荧光信号传导缺陷等问题。
特别需要说明的是,定位标的图形形状并不是严格限制的。一般的,具备线结构的定位标比圆弧的形状检测方便。一般的,每个定位标的最小结构可以是俯视的三角形、四方形、对角三角形、对角四边形、梯形、对角梯形、五角形、棒状等;或者所述的图形中的两种或者两种以上的组合。
定位标的作用是在荧光场或者眀场的环境中,对于芯片进行精确的定位。因此,定位标并不需要特定的设计。从计算机识别以及经验的角度来说,有明显的点和线的标志,并且不太复杂就是比较好的标志。在这样小的结构中,弧线制备的精确度远小于直线。也就是说,一般的圆形的识别度会低于方形。因此,一般选择具备点和线的元素或其组合作为定位标的基本元素。
定位标并不是越小越好,也不是也大越好。如果定位标占的面积太大,则会损失相应的有效视场面积;定位标太小,则不宜分辨和制作。本发明中,所涉及的定位标的线的尺度在20-200微米之间。比如图1中,定位标小的边长约为20-40微米,比较长的边长约为120微米。
如果将图3中的定位标更改为两条垂直的一定宽度的直线状光刻胶结构,固然也可以实现定位的功能,并且鉴于直线良好的指向性,可以很好的给出精确定位,但是会因为占用的面积太大导致其他的问题。并且,当图像偏移半个周期的时候,会出现部分视野区分不明显的问题。在实际的使用中,图片的微小偏移是不可避免的。这也限制了这种定位标的实际使用效果。
如果将图3中的定位标改为相互平行的直线,则存在定位不准的问题。
一般的,根据实际使用的参数来确定定位标的周期。例如,相机拍摄的范围是1.5mm长度,则可以在长度的方向上,在1.5mm范围内设置一组定位标。整个片子上布满定位标。参见图2类似设计。这种设计方式使得芯片在任意位置都会在视野中出现定位标。而实际的使用中,一旦确定了初始位置以后,步进电机等精确控制装置完全可以将误差控制在远小于一个相机拍摄周期的范围内,但是可能达到1个像素或更多,这种情况下,结合定位标的使用,完全可以精确的知道测序中多轮的同一位置定位。也就是说,结合本发明所述的定位标,可以在测序的过程中,精确确定位置信息。
一般的精确的步进电机走5cm的误差基本不会超过2微米,重复测序的时候,步进电机重复走的时候,连续轮之间的误差也不会超过5微米。而一般的,例如选择10倍或者20倍的物镜,配合相应的摄像机的时候,每个像素小于1微米,整个视野在2mm左右。这种比例关系下,重复测序的时候并不会偏移多个摄像区间。因此,每次测序都可以找回位置。
一般的,用SU8 2002或者SU8 2005可以制备合格的定位标。SU8系列的光刻胶,一般具备一定的荧光性。这种荧光性在生物化学检测的过程中需要被考虑到。当生物化学检测的信号极低的时候,相同光照下的光刻胶如果亮度远大于信号值,则不能够被采用。同时,光刻胶的荧光性是可以被调节的。例如改变光刻胶的厚度,则反比的减弱了光刻胶荧光信号的强弱。并且,SU82002或者2005的荧光性并不是很强,一般的情况下,通过厚度的改变,可以得到理想的荧光图片。另外的,其它的光刻胶也是可以考虑的。
一般的,定位标有不同的表现形式。Illumina用了特殊的位置信息集合到反应室的微坑中。这种技术比较复杂,但是保密性较好。本发明提供的FOP定位标方法,制作简单,不影响微坑反应室的反应。
实施例1在FOP(Fiber Optical Plate)表面制作定位标
取一张FOP,尺寸为20mm*45mm。放入清洗花篮,将花篮放入盛有超纯水的乐扣盒中,超声15min,超声结束后,用氮气枪吹干表面的水分,放在125℃的热板上,加热15min。然后将其放入等离子清洗机腔体中,功率HI,处理7min。将FOP放在匀胶机的吸盘上,调整匀胶机参数,600r/6s,2000r/40s,用注射器吸取5ml的SU-8 2002光刻胶,并用0.22um过滤器过滤,将光刻胶均匀的滴在FOP上,启动匀胶机,待匀胶结束,取下FOP。将匀好胶的FOP放在95℃热板上,加热3min,取下。将FOP放在曝光机台上,调节曝光机台,使FOP与掩膜版对齐,调节曝光机功率50%,时间35s,开始曝光。曝光结束,将FOP放在95℃热板上,加热3min,取下。在专用显影培养皿中倒入显影液,将FOP放入培养皿中,计时显影35s,显影结束后,用镊子捞出,并用异丙醇冲洗掉表面的显影液,然后用氮气枪吹干。将显影完毕后的FOP进行显微镜质检,在显微镜下观察任意对角线上的定位标是否完整,是否有缺失,如有对角线上的定位标缺失现象,洗掉重新光刻。将热板调节到150℃,放上FOP,老化120min。
实施例2定位标的使用。
在对芯片进行扫描前,先找到定位线的位置作为起始点,然后开始按一定扫描顺序对芯片表面进行拍照。在将所得照片进行拼图时,一旦发现有定位标不在视野中心的情况,可以通过计算定位标到视野边缘x、y方向的实际距离与理论距离的偏差,来判断视野位移的距离,从而对偏移量进行校正。当定位标为其他非直线形状时,一旦由于光刻等原因产生变形,不好估算变形的量和位置,而当定位标只含有直线时,即使如图4所示局部缺失,仍可以较准确地识别并估计出缺失(或变形)量,不影响校正的准确性。
总之,本专利所述定位标相比于其他定位技术,有如下优势:
1一组定位标中包含至少3个小定位标,只要其中任意一条对角线上的两个小定位标结构完整,就可以实现校正偏移量的功能,容错性好;
2定位标的形状为多个正方形的组合,只由直线构成,局部对称却不绝对对称,这样即使有个别小定位标残缺,只要主体结构还存在即可识别出来,因此进一步提高了容错性;
3除中间位置的定位标阵列以外,在微坑阵列边缘处还设计了独特的定位线结构,用于定位扫描的起始点,这样可以消除定位标制作的绝对位置偏差;
4在微坑阵列四个直角附近还设计了扇形的对准定位标,用于辅助将带有定位标的微坑阵列与配套的底板进行对准组装,形成芯片;
5每组定位标位置位于扫描视野的中心区域,距离视野边缘距离适中,可以保证只要偏移量小于一个视野的距离,就有足够多的小定位标用于校正;
6定位标制作于微坑阵列的光面一层,不会影响到芯片内部微坑的有效数量和功能。
本专利的实施例是对于本发明的进一步解释,并不影响专利的保护范围。
Claims (4)
1.一种带定位标的基因测序芯片,包括第一基板,反应室,第二基板;其中,所述第一基板与第二基板通过预留反应室的方式组合,形成芯片;所述第一基板为FOP;所述FOP在反应室一侧的表面为下表面,另一个表面为上表面;所述上表面有预先制备好的定位标,所述下表面有预先制备好的微坑;所述定位标是周期性排列的,具有荧光性能的定位标志,用于基因测序时相机视野范围内的精确定位;每个视野范围内有一组可以表明位置信息的定位标;其中,所述的一组可以表明位置信息的定位标包含至少三个定位标;所述定位标是点和交叉的线组成的图形。
2.根据权利要求1所述的芯片,其特征在于,所述定位标的材质为光敏性化合物。
3.根据权利要求1所述的芯片,其特征在于,所述一组可以表明位置信息的定位标包括单一形状或不同形状的定位标。
4.根据前面任一项权利要求所述的芯片,其特征在于,首先在FOP非微坑的表面涂一层光刻胶,然后通过掩膜版曝光的方式制备定位标,然后封装成基因测序芯片。
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