CN108070525B - 基因测序芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基因测序芯片，及其在基因测序领域的应用。本发明公开了一种基因测序芯片包含有高通量的微反应室，通过利用油相流体，将水相流体封闭在微反应室中，形成独立的反应单元。本发明提供的检测方法或者检测芯片特别适用于发光基团游离于溶液中的测序反应。本发明提供的检测方法或者检测芯片提供了隔离的微反应室，使得每一个微反应室都可以是独立的反应单元，从而达到信号不串扰的目的。

Description

基因测序芯片
技术领域
本发明涉及一种基因测序芯片，属于基因测序领域。更具体的说，本发明涉及一种系统、设备或方法用于大规模的生物化学检测；特别是基因测序方面的应用。
背景介绍
基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或者人体附属物中分析测定基因序列，预测患多种疾病的可能性，如癌症或白血病等。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用。基因芯片或者说测序芯片是基因测序用的芯片。目前已经有多种多样的基因测序芯片问世。基因芯片的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出待测核酸的序列。根据测序方法的不同，测序芯片的设计也完全不一样。比如illumina测序中，其芯片是简单的多层结构。现有芯片的设计多种多样，主要的目的还是为满足各种测序反应的需求。本发明公开一种油封式的测序芯片，采用油等流体隔离的方式使得测序芯片的微反应室之间相互隔离。
发明内容
本发明涉及一种基因测序芯片，及其在基因测序领域的应用。
本发明公开一种基因测序芯片，其特征在于包括，流体通道构成的流体室；第一固体基板；第二固体基板；流体入口和流体出口；其中，第一固体基板的内表面有高通量的微反应室；流体室在第一固体基板和第二固体基板之间；所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的。
所述的芯片具备油封功能。所述油封指的是，首先将水相流体通过流体入口通入流体室；然后通入油相流体将水相流体排出流体室，同时将部分水相流体封闭在高通量的微反应室内，形成相互隔离的反应单元。
根据优选的实施方式，所述高通量的微反应室是通过在一个平面的基片上制备高通量的微纳米尺寸的凹陷结构形成的。
根据优选的实施方式，所述第一固体基板是由透明材料基片制备而成的。
根据优选的实施方式，所述微反应室为凹陷的圆柱形结构，底部直径为0.5-10微米，优选1-5微米；微反应室的深度为0.5-10微米，优选1-5微米。
根据优选的实施方式，所述微反应室为凹陷的圆台型结构、圆柱形结构、正方体结构、长方体结构或其组合。
根据优选的实施方式，所述的内表面有高通量的微反应室的第一固体基板，在微反应室的至少部分外表面是疏水的，至少部分内表面是亲水的。
根据优选的实施方式，所述测序芯片包括第一流体入口和第二流体入口；两个流体入口通过微流管路连接的方式合并在一起，然后通入流体室。
根据优选的实施方式，所述第一流体入口为水相流体入口，所述第二流体入口为油相流体入口，两相流体通过不同的入口通入芯片。
本发明公开一种油封式的基因测序芯片，其特征在于包括，流体通道构成的流体室；第一固体基板；第二固体基板；流体入口和流体出口；第一流体提供系统；第二流体提供系统；其中，第一固体基板的内表面有高通量的微反应室；流体室在第一固体基板和第二固体基板之间；所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的；第一流体为水相流体；第二流体为油相流体。
根据优选的实施方式，所述流体入口为一个、两个或者多个。
根据优选的实施方式，所述第一流体和第二流体通过相同的入口进入流体室。
根据优选的实施方式，所述第一流体和第二流体通过不同的入口进入流体室。
根据优选的实施方式，所述的测序指的是，通过酶，使得核苷酸上的荧光基团释放到反应液中的测序方法。
根据优选的实施方式，所述的高通量的微反应室具有105-109的微反应室，优选106-5×108的微反应室。
根据优选的实施方式，芯片具备多个流体入口和多个流体出口。
根据优选的实施方式，所述的外表面对于水的接触角指的是，当外表面进行疏水修饰以后，内表面不进行化学修饰，整个表面对于水的接触角。所述的内表面对于水的接触角指的是，当外表面未进行化学修饰的时候，整个表面对于水的接触角。所述外表面对于水的接触角指的是，内表面不修饰，芯片利用接触角仪等方法测量，获得的接触角数据。当内表面由于不同的修饰方式对于芯片整体表面的接触角有影响的时候，芯片整体或者说外表面的接触角需要满足接触角的疏水条件。
本发明公开了一种油密封的基因测序方法，其特征在于，利用测序芯片进行测序；所述的测序芯片包括流体通道构成的流体室，第一固体基板，第二固体基板，流体入口和流体出口；其中，第一固体基板的内表面有高通量的微反应室；流体室在两层固体基板之间；所述高通量的微反应室层的至少部分表面是疏水的；首先将包含有测序反应液的水相流体通过流体入口通入流体室，然后将油相流体通入流体室；油相流体将水相流体从流体室排出，同时将部分水相流体封闭在高通量的微反应室内，形成相互隔离的反应单元；通过检测获得对应于微反应室内的待测核酸序列的信息。
根据优选的实施方式，形成相互隔离的反应单元以后，通过酶，使得核酸上的荧光基团释放到水相的反应液中，然后对隔离的反应单元进行检测。
根据优选的实施方式，其中，所述流体室的厚度为1-1000微米，优选10-100微米。
根据优选的实施方式，还包括清洗液，用于清洗油相流体。
根据优选的实施方式，所述清洗液为异丙醇、乙醇或者含有表面活性剂的水溶液。
根据优选的实施方式，一般的测试流程中，通入反应液-油-反应液，如此循环下去。仅仅使用反应液冲洗油残留会比较严重，对于芯片的要求也比较高，使用另外的清洗液可以更加有效的将油冲洗干净。经过测试，仅仅使用水溶液或者测序反应液冲洗的效率圆圆低于异丙醇。相同条件下，异丙醇用约十分之一的冲洗量即可将油相流体冲洗干净。相对来说，乙醇、丙酮等流体的冲洗效率约为异丙醇的一半。
根据优选的实施方式，所述相互隔离的反应单元指的是，至少部分区域的微反应室在生物化学检测的时候，是相互隔离的；每一个隔离的微反应室都是一个独立的反应单元。
根据优选的实施方式，所述微反应室为凹陷的圆台型结构、圆柱形结构、正方体结构、长方体结构，或者其任意组合结构。
本发明公开一种基因测序芯片，其特征在于包括薄膜层，以及和流体室相对的压力调节室，薄膜层位于流体室和压力调节室之间，在进行检测的时候，薄膜层向流体室方向运动，并且与微反应室层接触，从而使得微反应室之间隔离。
根据优选的实施方式，所述微反应室层的至少部分表面是疏水的，指的是至少部分表面对于水的接触角大于120度。
根据优选的实施方式，所述可以油封的基因测序芯片，可以将水封闭在微反应室中，并且残水的微反应室(由于水相流体残留，导致微坑之间不能有效隔离)数目小于总微反应室数目的5％，优选1％；所述可以油封的基因测序芯片，可以重复油封100次以上。
根据优选的实施方式，所述可以油封的基因测序芯片，在满足疏水条件的情况下，可以将水封闭在微反应室中，并且残水的微反应室数目小于总微反应室数目的5％，优选1％；所述可以油封的基因测序芯片，可以重复油封100次以上。
根据优选的实施方式，所述的可以反复油封的基因测序芯片，可以将含有千分之一的tween20水溶液重复油封100次以上。
本发明公开一种基因测序方法，其特征在于，利用测序芯片进行测序；所述的测序芯片包括流体通道构成的流体室，两层固体基板，流体入口和流体出口；其中，一层固体基板为透明材料基片，其内表面有高通量的微反应室；流体室在两层固体基板之间；所述高通量的微反应室层的至少部分表面是疏水的；流体从流体入口进入芯片，经过流体室，然后从出口流出；在进行检测的时候，通过油相流体，将水相流体封闭在高通量的微反应室中，形成相互隔离的反应单元；通过检测，获得对应于微反应室内的待测核苷酸序列的信息。
根据优选的实施方案，所述芯片通入油相流体以后，由于微反应室的外表面是疏水的，油相流体会将整个表面占满，而由于微反应室的内表面是亲水的，导致微反应室内会有部分水相流体剩余，从而形成隔离的、存在于单个微反应室内的水相流体。隔离的反应室内发生反应则不会影响到相邻的反应室，从而达到单个反应室内物质检测的目的。
根据优选的实施方案，形成隔离的反应单元以后，通过酶，使得反应物上的荧光基团释放到反应液中，然后隔离反应室，进行检测。
根据优选的实施方案，其中，所述流体室的厚度为1-1000微米，优选10-100微米。
本发明提供一种生物化学检测系统，其特征在于，包括前面任一项所述的芯片，
还包括计算机和流体系统，计算机控制流体系统为芯片提供流体。
根据优选的实施方案，包括水相流体提供装置和油相流体提供装置。
根据优选的实施方案，所述测序指的是利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反应液；使用酶将核苷酸底物上面的荧光团释放，从而导致荧光切换。
根据优选的实施方案，所述的荧光切换性质指的是每一步的测序反应后，荧光信号相比于测序反应前有明显增强或者有明显减弱或者发射光频率范围有明显改变。
根据优选的实施方案，所述的荧光切换指的是每一步的测序反应后，荧光信号从基本无荧光变为有明显荧光。
本发明公开了一种通过荧光切换反应测序的系统，其特征在于，测序芯片包括流体通道构成的反应室，两层固体基板，流体入口和流体出口；其中，一层固体基板为透明材料基片，其内表面有高通量的微反应室；流体室在两层固体基板之间；所述高通量的微反应室层的至少部分表面是疏水的；
流体从流体入口进入芯片，经过流体室，然后从出口流出；在进行检测的时候，通过油相流体，将水相流体封闭在高通量的微反应室中，形成相互隔离的反应单元；通过检测，获得对应于微反应室内的待测核苷酸序列的信息；所述测序指的是利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变。
根据优选的实施方案，所述微反应室体积在0.5飞升到1纳升的范围内；优选在1飞升到1皮升的范围内，更优选在5飞升到100飞升的范围内。
根据优选的实施方案，所述的微反应室可以是在一块底板上，通过一定的工艺手段，在其一个表面上，加工出的凹坑。所述的凹坑可以是圆柱形、正方体形状、长方体形状、椭圆形立方体等，或者他们的组合。
根据优选的实施例，所述的微反应室可以是规则性排列，也可以是不规则排列。
根据优选的实施方案，所述的生物化学检测芯片通过外部流体装置连接到芯片的入口和出口；
根据优选的实施方式，所述的油指的是和水不互溶的液体，可以是c11-c25的烷烃，杜邦的氟油，3M的氟油等物质。
本专利中，所有关于位置的描述，比如芯片底层，其并不表示该层一定位于实际空间中下方的位置。所有关于位置的描述，只是相对位置的描述。比如，当芯片层位于空间的上层的时候，底板层则位于下层。
本发明中，除非特殊定义以外，所有名词均表示测序工程领域的常规意义。
本发明中，所述的亲水、疏水指的是常规意义上的亲水、疏水。一般性的，材料表面的对于水的接触角大于90度则为疏水，材料表面对于水的接触角小于90度则为亲水。
本发明中，所述的高通量指的是常规意义上的高通量。同高通量的生物芯片，高通量的筛选中意义相同。指的是单位时间内或者单次实验获得大量的实验数据或结果。本发明所述的高通量也可以结合高通量测序的概念进行解释，指的是，一次可以对大量的核酸分子进行序列的测定。
本发明提供的检测方法或者检测芯片特别适用于发光基团游离于溶液中的测序反应。本发明提供的检测方法或者检测芯片提供了隔离的微反应室，使得每一个微反应室都可以是独立的反应单元，从而达到信号不串扰的目的。同illumina等测序技术不同，测序原理的不同导致了illumina不用制备单独隔离的反应室。本发明提供的检测方法和检测芯片仅仅适合于，例如CN 201510822361.9或者CN 201510815685.X专利提供的，测序以后发光基团游离于溶液中的测序反应。本发明涉及的芯片仅仅为类似的荧光切换反应的测序专门设计，其它测序方式并不需要用这种芯片。
附图说明
图1微坑的结构。
图2.油封原理示意图。
图3.三层芯片结构横截面图。
图4.四层芯片结构横截面图。
图5.三层芯片加装塑料外壳横截面图。
图6.三层芯片图。
图7.三层芯片结构分解图。
图8.四孔芯片图。
图9.无残水显微图片。
图10.残水显微图片。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，现列出如下具体实施方式。其中所涉及的具体的参数、步骤等，为本领域的常规知识。具体实施方式和实施例并不限制本发明的保护范围。
测序反应室在大量的微反应室内进行的。本发明中，微反应室所在的结构也被称为微反应室层，或者高通量的微反应室层，或者底板层。微反应室的结构可以是多种多样的。制作方法一般是在一个平面的板材上，利用刻蚀或者其它方式，制备凹陷的结构，从而形成一个一个的微坑。微坑的典型结构可以如图1所示。微坑墙壁的上表面称为微反应室的上表面或者微坑的外表面。微坑的内壁，比如图1中微坑的内侧壁以及底部统称为微坑的内壁。因此，微坑表面结构可以分为微坑的外表面和微坑的内壁两个部分。微坑与微坑之间共同占有外表面，因此，单独微坑的外表面，指的是单个微坑占有的与其它微坑呈中线分开的表面。这符合一般意义的外表面划分。
微坑的深度是其开口直径的0.1-10倍之间，优选的0.2-5倍之间，更优选的0.5-2倍之间，更优选的微坑的深度是其开口直径的大约1倍。微坑上表面的开口形状可以根据工艺选择，比如六边形，方形，三角形，圆形等等。最常见的微坑的上表面的开口形状是圆形或者接近圆形。当微坑的上表面开口是圆形的时候；整个微坑的形状可以是圆柱形或者圆锥形，接近圆柱或圆锥的形状。俯视微坑表面的时候，微坑的排列形状可以是四方形排列的，也可以是六方形排列的。MEMS工艺是微坑加工工艺中的一种。比如选择玻璃或硅片作为材料，利用光刻保护的方法，在硅片或者玻璃上刻蚀阵列的微坑。或者选用玻璃或者硅片作为基底，在上面制备一定厚度的材料，然后利用光刻保护的方法，在该材料表面上制备阵列的微坑；这种方法典型的应用可以是氮化硅材料。
微通道板也是微坑加工工艺中的一种。光纤面板材料(FOP)制备的微坑成功率较高，微坑形貌较好，均匀。微通道板的原料是双面抛光的，利用0.1M的硝酸浸泡即可将微通道板的表面刻蚀。微通道板分为皮层和芯层材料；由于组分的差异，皮层材料在硝酸中没有变化，而芯层材料会慢慢溶解；这样控制浸泡的时间即可以获得一定深度的微坑。微坑的直径由微通道板的芯层材料的直径决定。微坑的坑壁厚度由微通道板的皮层材料厚度决定。这样，用酸刻蚀的方法，保护微通道板的一个面以后，就可以获得单面有微坑的板材了。
微反应室层的外形可以是长方形的薄片结构。长方形的长度可以是1-10厘米的范围，优选3-8厘米的范围。长方形的宽度可以是1-10厘米的范围，优选1.5-4.5厘米的范围。薄片的厚度可以是0.1毫米到2毫米的厚度，优选0.4-1毫米，更优选0.5-0.9毫米。典型的微反应室层薄片的尺寸可以是2cm*4.5cm*0.9mm。
根据优选的实施方式，芯片中，反应区域的微坑进行了表面修饰。微坑的外表面以及微坑的内壁进行了亲疏水性质不同的修饰。例如，当微坑的外表面进行了疏水修饰的时候，微坑的内表面可以进行亲水修饰。
其中，所述的微坑的外表面是疏水修饰的，以及微坑的内表面是非疏水修饰的。
所述的微坑的外表面指的是一般意义上的内表面，指的是，微坑的外部表面，主要是图1中微坑与微坑之间的相邻“墙壁”的表面。微坑的内表面指的是微坑的内壁以及底部。
本文中所述的外表面是疏水修饰的，指的是，全部外表面疏水修饰，或者全部外表面加上部分与外表面直接相邻的内表面疏水修饰。根据现有的技术，可以用接触印刷等方式区分外、内表面的化学修饰，但是由于其结构微小，很难控制外、内表面的分界，一般情况下，微接触印刷的面积会稍微大于微坑的外表面，可能有部分的内表面也被疏水修饰。
其中，所述的微坑的外表面以及微坑内壁的亲疏水修饰并不是完全分界的；例如微坑的外表面进行疏水修饰；那么根据修饰手段的不同，微坑的与外表面接近的微坑的内壁的部分表面被疏水修饰。
疏水修饰的接触角大于118°，优选大于120°。从有利于应用的目的，所述疏水修饰的接触角指的是平均接触角。
从有利于应用的目的，微坑的外表面进行疏水修饰，微坑的内壁进行亲水修饰。
根据优选的技术方案，所述的疏水修饰的接触角大于118度，指的是微坑的内表面和外表面都进行修饰以后的平均接触角。
在应用的时候，首先在整个芯片的反应室内充满反应液，然后通入另一种与反应液互不相溶的流体。该流体将反应液推出芯片，并且将剩余的反应液封闭在图1所示的各个反应室的微坑中。每一个微坑都是一个独立反应室，从而保证了反应的高通量。从有利于应用的方面，两种流体在一定的温度条件下，一种流体在另一种流体中的溶解度在1％以内，优选在1‰以内，更优选在万分之一以内。
如图2所示，首先在流体通道内部充满水性流体1200，微坑部分也充满了水性流体。然后将油相流体1200通入，如图2(A)所示。油性流体将水性流体排出反应室的过程中，微坑内部会封闭上水性流体，从而形成一个个的、以微坑为单元的独立反应单元。
外表面利用氟代硅烷，烷基硅烷，氟代氯硅烷，烷基氯硅烷，环氧基氟代硅烷，环氧基硅烷或者其它常见疏水修饰方式。
根据优选的实施方案，微坑的内表面进行化学修饰，化学修饰后的表面接触角(芯片外表面进行同样的化学修饰或者未进行化学修饰)小于80度。微坑的内表面的化学修饰基团以有利于基因测序的方式选择，例如可以结合常见的SBS基因测序技术的方式进行。
根据优选的实施方案，芯片的表面进行或者不进行化学修饰。微反应室之间通过可以移动的弹性材料压紧密封。弹性材料可以是常见的硅橡胶，例如PDMS，等制备。弹性材料可以是一层厚度10-2000μm的薄膜，优选20-1000微米，更优选50-500微米。所述的弹性材料，指的是材料在受力发生大变形再撤出外力后迅速回复其近似初始形状合尺寸。
根据优选的实施方案，芯片的表面进行或不进行化学修饰。微反应室之间通过可以移动的弹性材料压紧密封。
根据优选的实施方案，芯片还包括胶层。该胶层是双面胶。双面胶通过切割或者其它方法形成反应室的形状。双面胶层将微反应室层和底板层粘结在一起，并且其切割的部分形成反应室空间。
根据优选的实施方案，芯片的微反应室层通过热粘结的方式直接和底板层粘结在一起。底板层有预先加工好的，凹陷的反应室空间。
根据优选的实施方案，芯片的微反应室层通过化学键连接的方式直接和底板层粘结在一起。底板层有预先加工好的，凹陷的反应室空间。
根据优选的实施方案，芯片包括胶层，该胶层是双面胶。双面胶通过切割或者其它方法形成反应室的形状。双面胶层将微反应室层和底板层粘结在一起，并且其切割的部分形成反应室空间。芯片的出入口是预先加工在底板层上面的通孔，通孔通过底板上的预先加工的流体通道和反应室空间连接在一起。
根据优选的技术方案，首先在底板层的特定区域上涂一层液态胶，然后将模切好的支撑层和涂胶的底板层粘合在一起。然后在FOP或者支撑层的固定区域上涂第二层胶，最后将所有部件对准贴合在一起。其中所述第一层胶可以是常见的环氧胶、紫外固化胶。第一层胶的厚度可以是0.1-20微米，优选1-15微米，更优选3-8微米。第二层胶可以是常见的环氧胶、紫外固化胶。第二层胶的厚度可以是0.1-20微米，优选1-15微米，更优选3-8微米。
根据优选的实施方案，芯片还包括薄膜层，薄膜层位于微反应室层和底板层的中间，将微反应室层和底板层分隔开。薄膜层和微反应室层之间存在反应室空间。反应室空间可以是单独的另外薄膜层构成，也可以集成在薄膜层上。底板层对应于反应室空间有另外的支持空间。当芯片进入测序溶液的时候，薄膜层的薄膜向着偏向于支持空间的方向运动；当需要封闭微反应室的时候，支持空间中存在正压，将薄膜向着反应室空间挤压，并且使得薄膜和微反应室层贴紧，阻隔各个微反应室之间的液体流动，从而形成单独的微反应室。
根据优选的技术方案，芯片还包括薄膜层，薄膜层位于微反应室层和底板层的中间，将微反应室层和底板层分隔开。底板层上预先加工反应室空间。在芯片通入测序溶液的时候，薄膜层的薄膜被流体压力挤压，进入反应室空间；当需要封闭微反应室的时候，反应室空间中施加压力，使得薄膜与微反应室层贴紧，阻隔各个微反应室之间的液体流动，从而形成单独的微反应室。
根据优选的技术方案，芯片还包括塑料外壳。通过直接粘结或者卡紧的形式和芯片结合在一起。
根据优选的技术方案，芯片还包括胶垫，胶垫上面有与出入口对应通孔。胶垫的一面连接流体的进入装置，另一个面连接芯片的出入孔。
根据优选的技术方案，芯片还包括流体进入系统，可以将一种或者多种流体，通过芯片胶垫和/或芯片的出入孔，最终通入芯片的反应室空间。
根据优选的技术方案，芯片还包括废液导出系统，该芯片导出系统可以和芯片进入系统集成在一起，也可以不集成在一起，通过芯片胶垫和/或芯片的出入孔，最终将通过芯片的反应液导出芯片反应室空间。
根据优选的技术方案，微反应室的材料为光纤面板。
根据优选的技术方案，微反应室的材料是微通道板。
根据优选的技术方案，底板层的厚度为0.1mm-3mm，优选0.3mm-2mm，更优选0.5mm-1.5mm，更优选0.8mm-1mm。
根据优选的技术方案，底板层的长度为1cm-10cm，优选2cm-9cm，更优选4cm-7.5cm。
根据优选的技术方案，底板层的宽度为0.5cm-4cm，优选1cm-3.5cm，更优选2-3cm。
根据优选的技术方案，芯片包括微反应室芯片、出入口、底板层和密封圈。所述密封圈可以以物理密封的方式使得微反应室芯片和底板层形成封闭的反应室。密封圈的厚度为反应室的厚度。
根据优选的技术方案，，芯片包括微反应室层、出入口、底板层和密封圈。密封圈是预先设置在底板层上面的橡胶结构，通过外置的压紧装置将微反应室芯片和底板层密封，形成封闭的反应室。
根据优选的技术方案，所述的微反应室芯片是用PDMS(聚二甲基硅氧烷)制备。首选制备微坑的模具，其具有与微坑凹凸结构相反的构造。然后利用PDMS转移的方法，制备PDMS的微坑。
根据优选的技术方案，所述的微反应室芯片采用PDMS制备。将PDMS用plasma处理以后，与底板粘接在一起，形成封闭的芯片。
根据优选的技术方案，所述的微反应室芯片采用玻璃制备。
根据优选的技术方案，该芯片应用于荧光切换基因测序。
微反应室层具备大量的相互独立的微反应室。当测序反应的时候，通过一定的手段，将本来通过反应室空间相互连通的各个微反应室隔离，从而将各个微反应室之间的流体流通切断。
微反应室芯片可以有多种密封方式。可以通过油密封，比如矿物油、3M氟油、杜邦的krytox氟油、C13-C15烷烃等。可以通过物理方式密封，比如微反应室和底板之间制备一层薄膜，当薄膜压紧微反应室的时候，各个微反应室被隔离密封。
根据优选的实施方式，通过薄膜密封各个微反应室。微反应室芯片的表面不需要针对薄膜密封进行相应的功能性的修饰。
根据优选的实施方式，微反应室的内部表面上有活性基团，可以跟其它化学基团连接在一起，用于生物化学检测。微反应室内部的表面上可以预先连接上裸露的巯基，通过和氨基反应，将带氨基的基团或者小球等固体物质连接到一起。小球或者直接连接的基团，具备了常见的可化学生物检测的功能。根据不同的需求，微反应室内部的表面上可以连接不同的基团。所述的微反应室的内部表面包括微反应室的底部和侧壁。微反应室内修饰的区域可以是底部和/或侧壁。
本芯片优选适应于荧光切换的基因测序反应。所述的荧光切换的测序，特征在于：利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反应液；使用酶将核苷酸底物上面的荧光团释放，从而导致荧光切换。
根据优选的实施方式，测序反应至少包括密封油、测序试剂。还可以包括冲洗试剂等辅助试剂。当测序试剂通入芯片以后，充满整个芯片的微反应室空间、反应室空间，通入封闭油，将前面的试剂推出反应室空间，同时可以将各个微反应室空间分隔开来。由于微坑的存在，微反应室空间在通入密封油以后，还会存留反应液。密封的反应液在一定条件下参加反应，释放出可检测的信息，供仪器检测。
本发明所设计的芯片主要用于特殊的测序方式：荧光切换的测序方式。利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反应液；使用酶将核苷酸底物上面的荧光团释放，从而导致荧光切换。
根据优选的技术方案，当连续测序的时候，优选进一步包括，利用清洗液清除残留的油相流体、反应液以及荧光分子，然后进行下一轮测序反应。
根据优选的技术方案，在低温下进入反应液，然后加热到酶反应温度，再检测荧光信号。
根据优选的技术方案，所述的核苷酸底物分子指的是含有A、G、C、T碱基的核苷酸分子，或者含有A、G、C、U碱基的核苷酸分子；其中所述的C是甲基化的C或者未甲基化的C。
根据优选的技术方案，所述的5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子，指的是5’末端磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子。
根据优选的技术方案，不同的核苷酸底物分子根据碱基不同，可以连接一种荧光团，进行单色测序；也可以连接多种荧光团，进行多色测序。
根据优选的技术方案，所述的荧光切换性质指的是每一步的测序反应后，荧光信号相比于测序反应前有明显增强或者有明显减弱或者发射光频率范围有明显改变。
根据优选的技术方案，所述的荧光切换性质指的是每一步的测序反应后，荧光信号相比于测序反应前有明显增强。
根据优选的技术方案，将包含核苷酸底物分子的反应液用于测序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意两种或三种的混合物；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意两种或三种的混合物。
根据优选的技术方案，将包含核苷酸底物分子的反应液用于测序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意一种；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意一种。
根据优选的技术方案，一种利用具有荧光切换性质荧光团的核苷酸底物分子进行测序的方法，利用前面任一项所述的方法进行测序，其特征在于，每轮测序使用一套反应液组，每套反应液组包括两个反应液，每个反应液包含两种不同碱基的核苷酸；其中一个反应液中的核苷酸可以和待测核苷酸序列上的两种碱基互补，另一个反应液中的核苷酸可以和待测核酸序列上的另外两种碱基互补；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，通入一套反应液组中的第一个反应液；检测、记录荧光信息；然后通入同一套反应液组中的第二个反应液；检测、记录荧光信息；两个反应液循环加入，通过荧光信息获得待测核苷酸底物的编码信息。
一种实现方式是(2+2单色两套)，第一个反应液由两种碱基混合(如AC)，第二个反应液由另外两种碱基混合(则为GT)，两个反应液交替进行测序。这时每cycle延伸的碱基会变多。在N轮测序后，延伸碱基为2N nt。携带信息为2N bit。完成上述测序的，有3个组合，AC/GT，AG/CT，AT/CG；或按照标准简并碱基(degenerate nucleotide)标识，写作M/K，R/Y，W/S。三种组合可以分别测序，或再完成一套测序后，再重新测序。
需要特殊说明的是，本发明中所述的芯片的疏水修饰的接触角，例如接触角大于118°，同样指的是，芯片整体修饰完毕以后，整个表面对于水的接触角。例如当不同的亲水修饰的时候，可能由于微坑内部的亲水修饰导致了芯片整体的接触角略有降低，此时同样需要满足接触角大于118°的条件。一般的，芯片微坑内部的修饰，当不影响微坑外部的时候，不会明显影响芯片的接触角。一般的，当芯片内部修饰影响到外表面的时候，芯片整体的接触角要求不改变。
实施例1
芯片主要分为三层。从上到下分别是微反应室芯片层，中间胶层，下层底板层。在上层的微反应室芯片层上打孔。中间胶层有镂空的反应室结构，下面的底板层为一块玻璃。三层组装在一起形成芯片。外界流体通过微反应室芯片层上的孔进入，然后通入中间胶层形成的反应室内，最后通过微反应室芯片另一端的孔留出芯片。
如图3所示，底板玻璃层为101，中间层为模切的双面胶102，上层为微通道板103。其中102中，模切的机构形成了空腔式的反应室。103的下表面，也就是与102接触的面，蚀刻有阵列的微反应室；图中并未画出。103微反应室芯片层上在合适的位置打孔，作为外界流体进出反应室的通道。孔与反应室直接相连。
实施例2
在实施例1的基础上，在双面胶支撑层102的下面，增加106薄膜层，然后再下面是105双面胶层，最下面是101底板层，如图2所示。当在105的双面胶形成的中间空间中施加压力的时候，106薄膜层直接变形，导致薄膜贴紧103层，从而使得103层下表面的微反应室之间相互隔离。
实施例3
在实施例1的基础上，102层为液体胶水，将反应室利用微加工或者机械加工的方式，刻在101玻璃层上。
实施例4
在实施例1的基础上，添加104外壳部分。如图5所示。相应的调节103部分的大小，并于外部机械结果做进一步的调整。
实施例5
微反应室层是本芯片的核心反应区域。本发明中，反应是在微反应室内完成的。主反应室内不是反应的场所。微反应室层的制备方式可以多种多样。其中一种是微通道板制备工艺。具体的是首先购买微通道板，比如INCOM公司可以买到微通道板。拿到微通道板以后，通过刻蚀在微通道板上形成大量的微反应室。比较常见的刻蚀方式是将微通道板浸入酸溶液中，等待一定的时间以后，微通道板的一个面上就会出现规则的，同光纤位置对应的孔。利用这种方法，可以制备芯片的微反应室部分。
实施例6
芯片的结构如图6所示。芯片的结构解析如图7所示。根据图7的结构，芯片一共分为三层。从下到上，分别是底板层，胶层，芯片上层。将三层的结构按照顺序组装，即可获得图片6所示的组装后的芯片。图7中，芯片上层有预先加工好的1个入口和1个出口。本实施例中，芯片上层可以用FOP材料制备。
芯片组合的效果如图6所示。组合以后，芯片的出入孔和外界流体进入装置对接，实现完整的芯片功能。
实施例7
根据实施例6所述结构的芯片。芯片的进液顺序分别是水，然后矿物油，然后洗液的循环。每一次进入水，可以充满整个芯片的反应室；进入矿物油，可以将微反应室中的水封闭起来，并且将反应室内的水排出；每次进入洗液可以将矿物油排出芯片。经过测试，芯片可以保持在100次循环的时候，FOP表面基本上不残留水。
实施例8
芯片主体分为三层，包括上层的微反应室芯片层，中间的胶层，下层的底板层。芯片层上有107～108个微孔矩阵；胶层有镂空的流道，提供厚度为10～200μm的微流体通道；底板层为玻璃材质，通过湿法刻蚀形成微流体的进样通道和进/出样口。进/出样口通过密封胶圈将芯片的微流体通道与外界的液路连通。三层芯片经对准后，密封形成完整芯片，再安装在塑料壳上形成芯片盒。
如图8所示，201为芯片的塑料外壳，其上还有用于和仪器匹配的定位孔207。芯片塑料外壳的中间部分有镂空的部分，用于设置芯片上层的微反应室芯片层202。芯片可以设置多个入口，例如入口204，并且用胶垫205密封。芯片底层玻璃为203，其上有预先加工的凹陷的管路用于连通入口204和反应室206。反应室206设置成类似M性的弯曲形状，这样即可以有效利用空间，又满足了流体阻力的平衡。
玻璃底板的外形尺寸为40×75×1mm。芯片可以有多个进/出样口，根据不同的流体需要，油相和水相分别从不同的进样口进入。入口区域在图片右下端。三个入口分开，并且用胶垫连接外界与流道。图中只标出了其中一个胶垫。图中，微反应室芯片放在最外面的塑料壳形成的中心空间中，其与M形管路形成封闭的流体室，在M形管路的正上方。
外面的塑料壳主要起支撑的作用。外面的塑料壳的形状可以是多种多样的。图中根据底板玻璃的形状设计成类似长方形的设计。
实施例9
在实施例6的基础上，更改芯片入口数目，根据需求，将芯片入口的数目改为3个，入口平均分配。
实施例10
在实施例6的基础上，更改芯片出入口布局，芯片的出口可以修改为在芯片入口的同端。
实施例11
实施例1-10所述的芯片，用下面的测序方式进行测序。2+2测序，单色：配置3套反应液，每套两瓶，每瓶有两种标记有荧光基团的碱基，荧光基团均为X。一套中的两瓶反应液，恰好包含完整的4种碱基。6瓶溶液互不重复。
完整的测序过程包括三轮，三轮依次进行。每轮的测序过程分别使用上述三套试剂。除此之外完全相同(使用相同的测序引物，反应条件完全相同)。
每轮测序包含：
1.将测序引物杂交在已经制备好的DNA阵列上
2.开始测序过程。重复2.1-2.4过程有限次。
2.1进第一瓶试剂。反应并采集荧光信号。
2.2清洗flowcell中的全部残留反应液和产生的荧光分子
2.3进第二瓶试剂。反应并采集荧光信号。
2.2清洗flowcell中的全部残留反应液和产生的荧光分子
3.将延伸过的测序引物解旋。
至此，便可进行下一轮实验。
准备反应液：
配制测序反应液洗液，简称洗液，含有:
20mM Tris-HCl pH 8.8
10mM(NH4)2SO4
50mM KCl
2mM MgSO4
0.1％20
配制测序反应液母液(简称母液)，含有:
20mM Tris-HCl pH 8.8
10mM(NH4)2SO4
50mM KCl
2mM MgSO4
0.1％20
8000unit/mL Bst polymerase
100unit/mL CIP
配制三组测序反应液，共六瓶。分别为：
1A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dC4P-TG
1B、母液+20uM dG4P-TG+20uM dG4P-TG
2A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dG4P-TG
2B、母液+20uM dC4P-TG+20uM dG4P-TG
3A、母液+20uM dA4P-TG+20uM dT4P-TG
3B、母液+20uM dC4P-TG+20uM dG4P-TG
配制好的反应液和母液，置于4c冰箱或冰上待用。
杂交测序引物：
将测序芯片内注入测序引物溶液(10uM溶解于1X SSC buffer)，升温至90度，在以5摄氏度/min的速度降温至40度。用洗液冲洗掉测序引物溶液。
进行第一次测序：
将测序芯片置于测序仪上。
使用第一组反应液进行测序。遵循如下流程。
1，通入洗液10mL，冲洗芯片
2，将芯片降温至4摄氏度
3，通入100uL反应液1A
4，将芯片升温至65摄氏度
5，等待1min
6，用473nm激光激发，拍摄荧光图像。
7，通入洗液10mL，冲洗芯片
8，将芯片降温至4摄氏度
9，通入100uL反应液1B
10，将芯片升温至65摄氏度
11，等待1min
12，用473nm激光激发，拍摄荧光图像。
重复1-12的步骤50次，得到100个荧光信号。
实施例12
实施例10的基础上，将油加入。在测序试剂通入芯片以后，例如步骤3，通入100uL反应液1A；将油通入芯片，可以使得微反应室内部为测序试剂，微反应室外部为油。微反应室与微反应室之间相互隔离。然后用水将油冲走。继续进行下面的步骤。
实施例13
光纤面板刻蚀是生产微反应室芯片的一种方法。如图1所示。刻蚀加工以后的微反应室芯片的结构的电镜图片。光纤面板刻蚀以后，将刻蚀的片子沿着一定的角度切断。则出现如图1所示的图像。图片中，圆形亮斑的部分是被切掉的部分。切掉的部分因为没有被刻蚀，所以断面显示亮白的斑点，并且没有微坑结构。
实施例14
根据实施例7所述的芯片。测量FOP表面修饰后的接触角为125度。微接触印刷的方法为，取新制备的1mm厚度的硅橡胶，旋涂修饰试剂三甲基氯硅烷，然后在氮气的保护下，迅速贴合在刚刚用等离子体处理的FOP表面，停留10min。用实施例7相同的方法进入水，矿物油和洗液。实验发现，芯片的表面经过100轮没有明显的变化。如图9所示，光学显微镜下，芯片的表面形态完好，没有残留的洗液。
实施例15
根据实施例14所述的芯片。微接触印刷的时候，停留时间为1min。测量接触角为116度。用实施例7相同的方法进入水，矿物油和洗液。实验发现，大概10个循环的时候，芯片的表面开始出现明显的残水。所用的测试方法同实施例14完全一样。如图10所示，光学显微镜下，芯片表面有很多比较亮的水滴存在，证明芯片的表面的水性液体残留严重。
所有实施例都是对于本发明的进一步解释，并不对于专利的保护范围造成限制。

Claims (9)

1.一种油封式的基因测序系统，其特征在于包括，
流体通道构成的流体室；
第一固体基板；
第二固体基板；
流体入口和流体出口；
第一流体提供系统；
第二流体提供系统；
其中，第一固体基板的内表面有高通量的微反应室；
流体室在第一固体基板和第二固体基板之间；
所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的；
第一流体为水相流体；
第二流体为油相流体；
其中，所述基因测序系统每轮测序使用一套反应液组，每套反应液组包括两个反应液，每个反应液包含两种不同碱基的核苷酸；其中一个反应液中的核苷酸和待测核苷酸序列上的两种碱基互补，另一个反应液中的核苷酸和待测核酸序列上的另外两种碱基互补；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，通入一套反应液组中的第一个反应液；检测、记录荧光信息；然后通入同一套反应液组中的第二个反应液；检测、记录荧光信息；两个反应液循环加入，通过荧光信息获得待测核苷酸底物的编码信息。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，
所述流体入口为1个或2个。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，
所述第一流体和第二流体通过相同或不同的流体入口进行流体室。
4.一种油密封的基因测序方法，其特征在于，
利用测序芯片进行测序；
所述的测序芯片包括流体通道构成的流体室，第一固体基板，第二固体基板，流体入口和流体出口；
其中，第一固体基板的内表面有高通量的微反应室；
流体室在两层固体基板之间；
所述高通量的微反应室层的至少部分表面是疏水的；
首先将包含有测序反应液的水相流体通过流体入口通入流体室，然后将油相流体通入流体室；油相流体将水相流体从流体室排出，同时将部分水相流体封闭在高通量的微反应室内，形成相互隔离的反应单元；通过检测获得对应于微反应室内的待测基因序列的信息；
其中，所述基因测序指的是，每轮测序使用一套反应液组，每套反应液组包括两个反应液，每个反应液包含两种不同碱基的核苷酸；其中一个反应液中的核苷酸和待测核苷酸序列上的两种碱基互补，另一个反应液中的核苷酸和待测核酸序列上的另外两种碱基互补；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，通入一套反应液组中的第一个反应液；检测、记录荧光信息；然后通入同一套反应液组中的第二个反应液；检测、记录荧光信息；两个反应液循环加入，通过荧光信息获得待测核苷酸底物的编码信息。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
形成相互隔离的反应单元以后，通过酶，使得碱基上的荧光基团释放到水相的流体溶液中，然后对隔离的反应单元进行检测。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，
其中，所述流体室的厚度为1-1000微米。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
还包括清洗液，用于清洗油相流体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述清洗液为异丙醇、乙醇或者含有表面活性剂的水溶液。
9.一种通过荧光切换反应测序的系统，其特征在于，
测序芯片包括流体通道构成的流体室，两层固体基板，流体入口和流体出口；
其中，一层固体基板为透明材料基片，其内表面有高通量的微反应室；
流体室在两层固体基板之间；
所述高通量的微反应室的至少部分表面是疏水的；
流体从流体入口进入芯片，经过流体室，然后从出口流出；
在进行检测的时候，通入油相流体，将水相流体封闭在高通量的微反应室中，形成相互隔离的反应单元；通过检测，获得对应于微反应室内的待测核苷酸序列的信息；
所述测序指的是利用5’端多磷酸修饰有荧光切换性质的荧光团的核苷酸底物分子进行测序；
所述的荧光切换性质指的是测序后荧光信号相比测序反应前有明显改变；
每轮测序使用一套反应液组，每套反应液组包括两个反应液，每个反应液包含两种不同碱基的核苷酸；其中一个反应液中的核苷酸和待测核苷酸序列上的两种碱基互补，另一个反应液中的核苷酸和待测核酸序列上的另外两种碱基互补；首先，将待测的核苷酸序列片段固定，通入一套反应液组中的第一个反应液；检测、记录荧光信息；然后通入同一套反应液组中的第二个反应液；检测、记录荧光信息；两个反应液循环加入，通过荧光信息获得待测核苷酸底物的编码信息。
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