KR20200001389A - 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 마이크로 튜브; 상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석; 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 흡수지; 및 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서를 포함한다.
본 발명에 따르면, 면역반응이 자성입자 표면에서만 일어나서 종결되도록 하여 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에 측정의 부정확성을 야기하는 불순물의 흡착을 배제시킴으로써, 작업 전극을 효소반응 산물의 농도를 측정하는 용도로만 활용하여 측정 감도를 향상시킬 수 있는 우수한 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 면역반응이 자성입자 표면에서만 일어나서 종결되도록 하여 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에 측정의 부정확성을 야기하는 불순물의 흡착을 배제시킴으로써, 작업 전극을 효소반응 산물의 농도를 측정하는 용도로만 활용하여 측정 감도를 향상시킬 수 있는 우수한 효과가 있다.
Description
본 발명은 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역반응이 자성입자 표면에서만 일어나서 종결되도록 하여 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에 측정의 부정확성을 야기하는 불순물의 흡착을 배제시킴으로써 작업 전극을 효소반응 산물의 농도를 측정하는 용도로만 활용하여 측정 감도를 향상시킬 수 있는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법에 관한 것이다.
종래 전기화학센서 방식의 면역진단 센서 기술은 작업 전극(Working electode, WE) 표면에 캡처 항체를 고정화하여 타겟 분자(항원)를 특이적으로 인식하도록 하고 전기화학신호를 발생시키는 효소를 라벨링(labeling) 신호발생분자로 활용하여 작업 전극으로 라벨링 효소에 의한 기질 반응 결과물을 측정하여 면역진단하는 방법을 사용하였다(대한민국 등록번호 제10-1258714호 참조). 작업 전극 표면에 타겟분자만의 특이 검출을 위해 면역반응을 유도하는 리셉터 항체나 블록킹(blocking)을 위한 단백질들과 분석시료에 존재하는 여러 부산물이 전극 표면에 노출될 수밖에 없는데 이로 인해 작업 전극 표면에는 단백질 등의 분자들이 흡착되게 되고 이는 효소반응 결과물의 농도를 측정하는데 방해가 되어 센서의 감도를 향상시키기 어렵고, 측정상의 편차를 가중시키는 문제점을 제공한다.
또한 분석시료는 타겟 분자 뿐만 아니라 다양한 단백질과 혈구 등의 불순물이 고농도로 존재하는데 이러한 단백질은 전극 표면에 비특이 흡착을 일으킬 수 있고, 이로 인해 환자별 혈액 상태가 다를 경우 비특이 흡착되는 정도를 제어하기 어려워 측정 일관성을 확보하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
뿐만 아니라 작업 전극 표면에서 비특이 흡착을 제거하기 위해 세척을 강력하게 하게 되면 고정화시킨 리셉터 항체가 떨어져나갈 수 있으며 이는 면역진단 측정 감도를 저해하고 측정결과의 편차를 키우는 원인으로 작용하여 적절한 세척 조건을 확보해야 하는 등의 번거로움이 생기며, 또한 그 조건을 확립하기 매우 어려운 단점이 있었다.
이외에도 리셉터 항체를 전극 표면에 고정화하기 위해 필수적으로 해야 하는 공유결합 등의 전극 표면 개질(surface modification)은 용액과 전극 계면 사이의 인터페이스에 영향을 주어 전기화학신호를 측정하는데 신호를 저하시키는 원인으로 작용한다.
따라서 본 발명의 목적은 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에 측정의 부정확성을 야기하는 불순물의 흡착을 배제시킴으로써 측정 감도를 향상시킬 수 있는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 작업 전극 표면에 자성입자를 자기력으로 용이하게 포집함으로써 측정 감도를 향상시킬 수 있는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 자성입자와 자기력을 활용하므로 타겟분자의 농축이 가능하고 반응시간을 단축시킬 수 있으며 세척이 용이한 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템은, 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성되는 마이크로 튜브; 상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석; 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 흡수지; 및 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서를 포함할 수 있다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템에 있어서, 상기 전기화학센서는 작업전극이 형성된 기판에 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 상기 센서 기판 상부에 기질 용액을 투입하여 신호를 측정하는 것을 특징으로 한다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템에 있어서, 상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템에 있어서, 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 피펫; 또는 상기 마이크로 튜브의 상부에서 양압을 가하여 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 가압 수단을 더 포함할 수 있다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템에 있어서, 상기 작업 전극은 ITO 전극인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템은, 액체 시료 용액을 수용하는 공간을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성되는 마이크로 튜브; 상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석; 및 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서를 포함할 수 있다.
본 발명의 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법은, 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하는마이크로 튜브를 준비하는 단계; 상기 마이크로 튜브 내에 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액을 주입한 후 혼합하여 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응을 형성하는 단계; 상기 마이크로 튜브의 하단부에 이격되게 설치된 자성입자 포집용 자석으로 상기 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 하부에 포집시키고, 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내부를 세척하거나 반응 후 용액을 제거하는 단계; 및 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자가 포함된 용액을 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법에 있어서, 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 단계는, 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍에 흡수지를 접촉시켜 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 것을 특징으로 한다. 다시 말하면, 상기 흡수지 접촉을 통한 용액 제거시 상기 미세 구멍으로 용액이 흡수지로 빠지게 하는 것은 마이크로 튜브 내 양압에 의해 배출 동작 시작이 유발되는(triggering) 것을 특징으로 한다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법에 있어서, 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계는, 상기 튜브 외벽에 이격되어 배치된 자석을 제거하여 마이크로튜브 내에 자성입자가 용액내 잘 혼합되도록 한 후 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 피펫을 이용하여 전기화학센서의 작업 전극 기판의 상부로 이동시키는 단계; 또는 상기 마이크로 튜브의 상부에서 양압을 가하여 미세구멍으로 배출동작이 유발되도록 함으로써(ignition) 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법에 있어서, 상기 전기화학센서의 작업 전극 기판의 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합되어 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법에 있어서, 상기 전기화학센서는 작업전극이 형성된 기판에 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 상기 센서 기판 상부에 기질 용액을 투입하여 신호를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법에 있어서, 상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있고, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법에 따르면, 면역반응이 자성입자 표면에서만 일어나서 종결되도록 하여 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에 측정의 부정확성을 야기하는 불순물의 흡착을 배제시킴으로써, 작업 전극을 효소반응 산물의 농도를 측정하는 용도로만 활용하여 측정 감도를 향상시킬 수 있는 우수한 효과가 있다.
또한, 작업 전극 표면에 자성입자를 자기력으로 용이하게 포집할 수 있으므로 측정 감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 작업 전극 표면에 면역반응이 완결된 자성입자가 포집되어 있으므로 효소반응이 측정 전극에 근접하여 일어나게 됨으로써 측정감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 자성입자와 자기력을 활용하므로 타겟분자의 농축이 가능하고 반응시간을 단축시킬 수 있으며 세척이 용이하다.
도 1은 작업 전극 표면에 면역반응을 유도하는 종래의 전기화학식 면역진단 센서 방식을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 표면을 이용한 면역반응을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 측정셀(WE, CE, RE)의 구조, 및 작업 전극으로 자성입자를 포집한 후 기질 용액이 담긴 측정셀에 담가 측정하는 실시예를 나타내는 모식도이다.
도 4는 종래의 마이크로 튜브 내에서 자성입자와 자석을 이용한 면역반응 및 세척시 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자, 자석 및 피펫을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자 및 자석을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 분자의 농도에 따른 작업 전극으로 측정한 CV 특성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자(MB) 사용에 의해 획기적으로 향상된 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP-9 생체분자의 면역진단 에세이(assay)를 적용하여 측정한 저농도 구간의 정량 검출 특성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 표면을 이용한 면역반응을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 측정셀(WE, CE, RE)의 구조, 및 작업 전극으로 자성입자를 포집한 후 기질 용액이 담긴 측정셀에 담가 측정하는 실시예를 나타내는 모식도이다.
도 4는 종래의 마이크로 튜브 내에서 자성입자와 자석을 이용한 면역반응 및 세척시 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자, 자석 및 피펫을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자 및 자석을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 분자의 농도에 따른 작업 전극으로 측정한 CV 특성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자(MB) 사용에 의해 획기적으로 향상된 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP-9 생체분자의 면역진단 에세이(assay)를 적용하여 측정한 저농도 구간의 정량 검출 특성을 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 이하의 설명에서 사용되는 구성요소에 대한 접미사 "모듈" 및 "부"는 명세서 작성의 용이함만이 고려되어 부여되거나 혼용되는 것으로서, 그 자체로 서로 구별되는 의미 또는 역할을 갖는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 개시된 실시 예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 실시 예의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시 예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
도 1은 작업 전극 표면에 면역반응을 유도하는 종래의 전기화학식 면역진단 센서 방식을 나타내는 모식도이다.
기존 전기화학식 센서는 작업 전극 표면에 캡처 항체를 고정하여 면역반응으로 타겟의 농도에 비례해 라벨링 효소의 양이 좌우되고 이를 효소에 의한 기질반응 산물, 예컨대 아스코르브산(Ascorbic Acid, AA)의 농도를 작업 전극으로 측정하여 타겟분자를 정량분석하는 방법을 사용하였다. 이 경우 전기화학신호를 측정해야 하는 작업 전극 표면에 항체나 면역반응에 필수적인 블록킹(blocking) 단백질 등이 흡착되어 있고, 표면개질로 인해 화학기능기가 공유결합되어 처리되게 되고, 타겟 분자를 검출하기 위해 실제 시료(혈액, 소변, 땀 등의 바이오센서 분석 시료 등)에 반드시 노출되어야 하므로 여타의 불순물에 노출되어 비특이흡착 상황을 피할 수 없다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 표면을 이용한 면역반응을 나타내는 모식도이다. 도 2를 참조하면, 샌드위치 분석을 보여주며 ALP(Alkaline phosphatase)를 라벨링 효소로 사용하여 반응 생성물인 아스코르브산(Ascorbic Acid, AA)의 농도를 측정하여 타겟 항원 분자를 정량 분석한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 측정셀(WE, CE, RE)의 구조, 및 작업 전극으로 자성입자를 포집한 후 기질 용액이 담긴 측정셀에 담가 측정하는 실시예를 나타내는 모식도이고, 도 4는 종래의 마이크로 튜브 내에서 자성입자와 자석을 이용한 면역반응 및 세척시 방법을 나타내는 모식도이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자, 자석 및 피펫을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3 내지 도 5를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템은 마이크로 튜브, 자석, 흡수지, 피펫 및 전기화학센서를 포함할 수 있다.
마이크로 튜브는 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성된다.
여기서, 상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정된다. 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
자석은 상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집한다.
흡수지는 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거한다. 이때, 상기 흡수지를 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍에 접촉하고, 상기 마이크로 튜브에 가압을 하여 상기 마이크로 튜브 내의 용액 제거가 시작되도록 하는 것이 바람직하다.
전기화학센서는 하부면에 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된다. 여기서, 상기 작업 전극은 ITO 전극인 것이 바람직하다.
상기 전기화학센서는 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 기질 용액이 담긴 측정셀에 상기 자성입자가 부착된 작업 전극 기판을 포함하는 상기 전기화학센서를 투입하여 신호를 측정할 수 있다.
상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키기 위하여, 피펫으로 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자 용액을 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시킬 수도 있고, 바람직하게는 상기 마이크로 튜브의 상부에 가압 수단을 통하여 양압을 가하여 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시킬 수도 있다.
상기 작업 전극 기판의 상부면에 자성입자 부착용 자석에 의하여 상기 자성입자가 작업전극 상부면에 부착되고, 자성입자를 머금고 있던 용액은 상기 센서 기판에 일정 부피로 존재할 수 있는 체임버 공간이 형성될 수 있도록 상기 작업 전극 기판의 상부면에 마이크로웰 구조를 위한 댐 구조물이 형성될 수 있다. 상기 작업전극 기판에는 작업전극 이외에 마이크로웰 구조 안에 카운터 전극, 기준전극을 더 포함하는 전기화학센서 전극이 기판에 일체형으로 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면, 작업 전극은 효소 기질 반응 신호만을 측정하는 용도로 사용하여 전기화학반응 측정 감도를 획기적으로 향상시킬 수 있다. 모든 면역반응은 마이크로 튜브 내에서 일어나도록 하고 최종 면역반응 최종 결과물만을 작업 전극에 자기력으로 포집하여 라벨링에 의한 반응 생성물을 작업 전극으로 측정한다. 작업 전극은 여타의 불순물에 노출될 기회가 없기 때문에 양질의 표면 상태로 효소 반응 생성물의 신호만을 전기화학적으로 측정하기 용이하다.
기존에 96 웰 플레이트(well plate) 표면에서 면역반응을 진행시키고 효소 반응 결과물은 웰에 전기화학센서를 담가서 전기화학신호를 측정하는 방식이 있으나 효소반응이 일어나는 웰 플레이트 표면에서 웰 내 담긴 전체 기질용액의 생성물 농도변화를 가져와야 작업 전극이 신호를 감지할 수 있어 오히려 측정 성능이 저하되는 문제가 있었다.
면역반응을 유도하기 위한 표면으로 자성입자 표면을 활용한다. 자성입자는 자석의 자기력을 이용하여 조작 및 매니퓰레이션(manipulation)을 할 수 있으므로 면역반응이 일어나는 동안 농축 포집 효과를 기대할 수 있고, 항원, 항체와 같이 자유롭게 시료 용액에 분산되어 떠다닐 수 있으므로 반응시간의 단축 및 농축으로 인한 감도 향상을 기대할 수 있다.
분산된 자석입자는 작업 전극으로 가져와야 하는데 이를 위해서 작업 전극 위치의 기판 반대쪽에 자석을 두어 자기력이 작업 전극에 최대로 집중되도록 하여 작업 전극 표면에 포집 흡착시킨다. 그 후 기질 용액의 반응 생성물을 측정하여 그 농도로 타겟 분자를 정량한다.
도 4를 참조하면, 종래의 경우 마이크로 튜브 내에서 자성입자와 자석을 이용한 면역반응 및 세척시 자석으로 자성입자를 포집한 후 용액을 새것으로 교체한다. 이 경우 마이크로튜브를 이용하여 자성입자 표면에 면역반응 과정(샌드위치 에세이)을 진행할 때 시료의 부피를 매우 극소량(수 ~ 수백 ul)을 사용하므로 반응이나 세척 과정시 자성입자를 소실하게 되면 측정 결과를 담보하기 어려워질 수 있다. 자석으로 자성입자를 튜브 벽면에 포획한 후 나머지 용액부분만을 피펫으로 제거해야 하는데 그 과정에 실험의 숙련도를 요구하게 되므로 보다 간편한 절차를 제공하는 것이 바람직하다.
도 5 내지 도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자, 자석 및 피펫을 이용한 면역반응 과정에 있어서, 마이크로 튜브에 미세 유체 구멍을 형성하여 피펫을 이용한 세척시 자성입자의 소실 우려의 문제를 미세구멍을 통한 일방 흐름 원리 적용하여 해결할 수 있다. 즉, 용액 주입 후 자석으로 자성입자를 튜브의 맨 하단 좁은 곳에 농축 포집한다. 자성입자가 농축된 라인 수위보다 상층부에 형성된 미세 구멍은 하이드로포빅(hydrophobic)한 표면 특성으로 튜브내 용액이 누수되지 않는 역할을 수행하다가 용액 제거시 튜브내 트리거링(triggering)을 위한 약간의 가압(또는 양압)과 흡수지의 도움으로 피펫 사용없이 세척액을 제거할 수 있다. 몇 번의 세척 과정을 진행할 수 있으며 매 시료의 주입은 튜브 주입구로 시료 용액의 제거는 배출용 미세 구멍과 흡수지로 손쉽게 제거한다. 이를 통해 매우 간단하게 면역진단 에세이(assay) 과정을 진행할 수 있다. 면역반응이 완료된 자성입자는 피펫으로 전체량을 떠서 작업 전극면에 옮긴다.
작업 전극은 자석에 의한 자기력의 영향을 받고 있어서 자성입자는 표면에 몰려있게 되며, 반응물의 측정을 위해 기질용액과 3전극 구조를 갖춘 전기화학측정 셀(cell)에서 반응물의 농도를 CV, CA 또는 CC 방법등의 전기화학 측정 기법으로 측정할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자 및 자석을 이용한 면역반응 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로튜브, 자성입자 및 자석을 이용한 면역반응 과정에 있어서, 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 흡수지로 세척액을 제거하기 용이하게 하여 면역반응 단계를 완료할 수 있다. 최종 세척 단계 완료 후, 자성입자를 포함한 버퍼 용액은 마이크로 튜브 근접의 자석을 제거하여 마이크로 튜브 하단에 모이게 할 수 있고, 이 용액은 피펫을 사용하지 않고 마이크로 튜브 상부에서 양압을 가하여 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 최종 면역반응산물인 자성입자가 포함된 용액을 작업 전극의 상부면으로 이동시킬 수 있다.
도 6의 1) 단계에서 마이크로 튜브의 하이드로포빅한 미세 유체 구멍이 있는 마이크로 튜브에서 면역반응이 진행된다. 이후 2) 단계 및 3) 단계에서 흡수지가 상기 미세 유체 구멍에 컨택되고 마이크로 튜브 상부에서 양압을 가하여 세척액을 제거한다. 그리고, 4) 단계에서 세척액 제거 후 마이크로 튜브와 흡수지를 분리한다. 상기 1) 내지 4) 단계의 면역반응 및 세척 과정은 필요한 횟수 만큼 반복할 수 있다. 이후 5) 단계에서 마이크로 튜브에 적절한 부피의 버퍼 용액을 투입하고 벽에 부착되어 있는 자석을 분리시켜, 마이크로튜브 내벽에 포획된 자성입자를 용액 내로 모아 마이크로튜브 하단부에 위치시킨다. 마이크로 튜브 상부에서 양압을 가하여 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통해 최종 반응산물인 자성입자액을 작업 전극의 상부면으로 이동시킬 수 있다. 작업 전극의 상부면으로 이동된 자성입자는 기판 하부에 부착된 자석의 자기력에 의하여 작업 전극에 포획된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템은, 액체 시료 용액을 수용하는 공간을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성되는 마이크로 튜브; 상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석; 및 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서를 포함할 수 있다.
상기 실시예는 마이크로 튜브의 하부에 미세 구멍이 없는 경우이다. 이 경우에는 상기 튜브 하단에 피펫을 넣어 피펫으로 세척을 수행하게 된다. 이때, 튜브의 바닥에는 용액만 존재하고 자성입자는 그 위쪽 벽에 고정되어 포획된 형태이다. 본 발명에 따른 실시예를 통해 면역진단 바이오마커 검출을 위한 실험 과정의 편의성을 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법은, 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하는마이크로 튜브를 준비하는 단계(S10); 상기 마이크로 튜브 내에 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액을 주입한 후 혼합하여 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응을 형성하는 단계(S20); 상기 마이크로 튜브의 하단부에 이격되게 설치된 자성입자 포집용 자석으로 상기 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 하부에 포집시키고, 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내부를 세척하거나 반응 후 용액을 제거하는 단계(S30); 및 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자가 포함된 용액을 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계(S40)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
S20 단계에 있어서, 상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있고, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 단계(S30)는 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍에 흡수지를 접촉시켜 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거한다.
상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계(S40)는 상기 튜브 외벽에 이격되어 배치된 자석을 제거하여 마이크로튜브 내에 자성입자가 용액내 잘 혼합되도록 한 후 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 피펫을 이용하여 전기화학센서의 작업 전극 기판의 상부로 이동시키는 단계; 또는 상기 마이크로 튜브의 상부에서 양압을 가하여 미세구멍으로 배출동작이 유발되도록 함으로써(ignition) 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
피펫을 이용할 경우에는 세척과정도 피펫이며 최종 반응 완료후 자성입자 용액의 이동도 피펫으로 하게 되는데, 이 때 마이크로 튜브 벽의 자석 배치는 도 6과 같이 되는 것이 바람직하고, 피펫의 끝을 마이크로 튜브의 바닥에 위치시켜 세척액을 빨아들여 제거하도록 함으로써 자성입자의 소실없이 간단하게 세척액을 피펫으로 제거하는 것이 바람직하다. 흡수지의 사용을 위해서는 마이크로 튜브내 미세 구멍이 요구되며, 마이크로 튜브 내부로의 세척액 주입은 피펫으로 튜브 상부에서 주입하며, 세척액 제거는 마이크로 튜브 하부의 미세 구멍을 통해 흡수지로 용액의 일방흐름 원리를 이용하여 피펫 작업없이 세척액 제거가 가능하다.
상기 전기화학센서의 작업 전극 기판의 하부면에는 자석이 결합되어 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 용이하게 부착될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 있어서, 상기 전기화학센서는 작업전극이 형성된 기판에 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 상기 센서 기판 상부에 기질 용액을 투입하여 신호를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 센서 기판에 자성입자를 머금고 있던 용액이 일정 부피로 존재할 수 있는 체임버 공간이 형성될 수 있도록 상기 작업 전극 기판의 상부면에 마이크로웰 구조를 위한 댐 구조물이 형성될 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 분자의 농도에 따른 작업 전극으로 측정한 CV 특성을 나타내는 그래프이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자(MB) 사용에 의해 획기적으로 향상된 측정 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP-9 생체분자의 면역진단 에세이(assay)를 적용하여 측정한 저농도 구간의 정량 검출 특성을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따른 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템 및 방법에 따르면, 면역반응이 자성입자 표면에서만 일어나서 종결되도록 하여 효소반응 결과물을 측정하는 전기화학센서의 작업 전극에는 기질용액 이외의 여타 불순물이 노출되는 기회 자체를 제거할 수 있다.
또한, 작업 전극에 면역반응이 완결된 자성입자를 포집 유도하기 위해 측정 작업 전극 기판 뒷면에 자석을 두어 자기력을 활용하는데, 효소반응이 측정 전극에 근접하여 일어나므로 측정감도를 향상시킬 수 있다.
또한, 라벨링으로 사용한 효소에 의한 기질용액의 반응 결과물의 양을 작업 전극으로 측정하여 타겟 분자의 농도를 정량분석 할 수 있다. 시료의 주입과 처리를 간소화할 수 있고, 모든 반응 프로토콜은 마이크로튜브를 활용하여 면역반응 과정을 간편하게 할 수 있고 기계장치를 이용하여 자동화하기 용이하다.
자성입자와 자기력을 활용하므로 타겟분자의 농축이 가능하고 반응시간을 단축시킬 수 있으며 세척이 용이하다. 측정 센서 전극 표면으로 자성입자를 모으기가 용이하고 작업 전극 표면은 세척된 깨끗한 상태를 그대로 유지한 채로 효소반응 부산물을 측정하게 되므로 측정 감도를 극대화할 수 있고, 측정 전극의 재사용으로 CV(편차)를 향상시킬 수 있다.
또한, 면역반응의 표면은 자성입자를 활용하므로 비특이 결합에 의한 영향을 최소화할 수 있고, 항원-항체 반응의 확률을 개선할 수 있어서 기존의 방법에 비해 측정시간을 단축시키고 측정 감도를 향상시킬 수 있다.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.
Claims (12)
- 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성되는 마이크로 튜브;
상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석;
상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 흡수지; 및
하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서;
를 포함하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 전기화학센서는 작업전극이 형성된 기판에 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 상기 센서 기판 상부에 기질 용액을 투입하여 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있고, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 피펫; 또는
상기 마이크로 튜브의 상부에서 양압을 가하여 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 가압 수단;
을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 작업 전극은 ITO 전극인 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 액체 시료 용액을 수용하는 공간을 포함하고, 상기 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액이 주입되어 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응이 형성되는 마이크로 튜브;
상기 마이크로 튜브 하단부에 이격되게 설치되고, 상기 자성입자를 상기 마이크로 튜브의 하단에 농축 포집하는 자성입자 포집용 자석; 및
하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합된 작업 전극 기판을 포함하고, 상기 작업 전극 기판의 상부로 이동된 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착된 전기화학센서;
를 포함하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 시스템.
- 액체 시료 용액을 수용하는 공간, 및 하부면에 형성된 미세 구멍을 포함하는마이크로 튜브를 준비하는 단계;
상기 마이크로 튜브 내에 액체 시료 용액 및 자성 입자를 포함하는 반응 용액을 주입한 후 혼합하여 상기 자성 입자의 표면에 면역 반응을 형성하는 단계;
상기 마이크로 튜브의 하단부에 이격되게 설치된 자성입자 포집용 자석으로 상기 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 하부에 포집시키고, 상기 마이크로 튜브의 미세 구멍을 통하여 상기 마이크로 튜브 내부를 세척하거나 반응 후 용액을 제거하는 단계; 및
상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자가 포함된 용액을 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 단계는,
상기 마이크로 튜브의 미세 구멍에 흡수지를 접촉시켜 상기 마이크로 튜브 내의 용액을 제거하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 전기화학센서의 작업 전극(WE) 기판 상부로 이동시켜 상기 자성 입자를 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착시키는 단계는,
상기 튜브 외벽에 이격되어 배치된 자석을 제거하여 마이크로튜브 내에 자성입자가 용액내 잘 혼합되도록 한 후 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 피펫을 이용하여 전기화학센서의 작업 전극 기판의 상부로 이동시키는 단계; 또는
상기 마이크로 튜브의 상부에서 양압을 가하여 미세구멍으로 배출동작이 유발되도록 함으로써(ignition) 상기 마이크로 튜브 내의 자성 입자를 상기 마이크로 튜브의 미세 유체 구멍을 통하여 상기 작업 전극 기판의 상부면으로 이동시키는 단계;
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 전기화학센서의 작업 전극 기판의 하부면에 자성입자 부착용 자석이 결합되어 상기 자성입자가 상기 작업 전극 기판의 상부면에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 전기화학센서는 작업전극이 형성된 기판에 기준 전극 및 카운터 전극을 더 포함하고, 상기 센서 기판 상부에 기질 용액을 투입하여 신호를 측정하는 단계;
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 자성입자는 타겟분자와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있고,
상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자성입자와 전기화학센서를 이용한 면역진단 바이오마커 검출 방법.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102144585B1 (ko) | 2020-08-13 |
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