CN107305214A - 一种硬质微流体芯片的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硬质微流体芯片的制作方法。该制作方法包括如下步骤：制备上层芯片，在上层芯片半固化状态下与基底进行化学键和封装，得到所述硬质微流体芯片。所述上层芯片的材质可为环氧树脂或氨基树脂，制备所述上层芯片时加热固化的温度为45～85℃，时间为15min～8小时。热聚合环氧树脂材料由预聚物和固化剂两种材料混合后使用，其混合后粘度低(接近矿物油粘度)，非常便于um乃至nm微小结构的翻模印制，翻模精度高；该混合物在80度温度下40min可凝固，缩短了微流体芯片制备时间，周期短试剂消耗少，便于批量化生产。与各类基底可进行灵活封装与结合，不依赖外部高温高压环境，封装强度高、速度快。

Description

一种硬质微流体芯片的制作方法
技术领域
本发明涉及一种硬质微流体芯片的制作方法。
背景技术
微流体芯片技术(Microfluidics)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)，指的是把生物、化学医学分析等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块核心单元为微米尺寸的芯片上，自动完成全过程分析的一类技术。它的目标是把整个化验室、生物实验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测和样品转移等集成在微芯片上，缩短操作时间和人工消耗，提高检测灵敏度、准确率和重复率，探索科学新领域和应用。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。
而微流体芯片(Microfluidic chip)是微流控技术实现的主要平台。其芯片是以微管道网络为结构特征，通常包含多个流体样品的进入口、出入口、连接它们的微通道以及管道中的各种功能结构，如用于过滤的微柱、用于单细胞捕获的微孔、用于样品混合的Y型管道、用于毛细管电泳的十字交叉管道、用于混合颗粒分离的蛇形弯曲管道等，它们容纳流体的有效结构(如所述通道、反应室和其它某些功能部件)至少在一个纬度上为微米级尺度。这些管道相互连接形成网络，以可控流体贯穿流动于整个芯片，流体在微米级的结构中产生了与宏观尺度不同的特殊性能，因此发展出独特的分析性能。微流体芯片被设计用以取代常规生物或化学实验室的各种功能，尤其以生命科学为目前主要应用对象的研究，是当前微全分析系统(μTAS,micro total analysissystems)发展的重点。
微流体芯片技术具有以下特点：(1)集成度高，芯片集成的单元部件和集成规模也越来越大。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析膜、固相萃取、净化过滤、细胞裂解、核酸提取等；用于流体控制的微阀(包括主动阀和被动阀)，微泵(包括机械泵和非机械泵)；微混合器，微反应器，当然还有微通道和微检测器等。(2)流程自动，分析速度快，减少人员干预。(3)可并行化，通量高。(4)能耗低，物耗少，污染小。试剂消耗仅几微升至几十个微升，被分析的物质体积只需纳升级或皮升级。(5)廉价，安全。因此微流控分析系统在微型化、集成化和便携化方面的优势为其在生物医学研究、药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定、生物试剂的检测等众多领域的应用提供了极为广阔的前景。
在微米或者纳米的数量级上，可用于芯片的常见材料有晶体硅、玻璃，石英和各种高分子聚合物材料。其中用于加工微流控芯片的高分子聚合物材料主要有三大类：热塑性聚合物、热固型聚合物和溶剂挥发型聚合物。热塑性聚合物包括有聚酰胺(PI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等；热固型聚合物有聚二甲基硅氧烷(也称硅酮弹性体或硅橡胶，PDMS)和聚氨酯等，将这两大类聚合物原料与固化剂混合后浇筑到模具上面，经过一段时间固化变硬后得到微流控芯片。溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等，将它们溶于适当的溶剂后，经过缓慢的溶剂挥发而得到固化后的芯片。
在上述材料中，晶体硅、玻璃和石英具有优良的电学、光学和化学性质，可采用标准的光掩膜刻蚀工艺加工，还能由化学方法进行表面改性，但其化学刻蚀加工成本较高，芯片的封装难度较大单片成本高，也不适合实验室自主制备。高分子聚合材料常用于热压、机械加工、注塑和转印翻模等工艺，它们均依赖于配套设备，其中热压和机械加工一次只能加工一片，也只适合于数十微米以上尺寸加工，精度有限；而自动注塑虽然是大规模量产的不二选择，但其模具的制作成本昂贵，也不适合于原型期开发。转印翻模技术类似于印刷术的方案，可以得到高精度复制的微流体图案，且操作方便、耗时少、成本低，适合于小批量生产，在较多场合得到运用。
转印翻模所用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，虽然制备和封装方便，使用广泛，但由于这种材料的弹性，限制了其在高压、高速的场合应用，其透气的特性也不便于其直接用于PCR反应等高温(90℃)场合。其他微流体材料通常伴有不透明、生物兼容性差、易溶胀于各类化学试剂等问题。其他替代PDMS的聚合物材料虽然也能翻模制备出精细图案，但一直无法便捷的与各类基底材料完成键和封装，如热压、激光、超声、硅熔键和和阳极键和，通常都依赖于特定的加工装备，费用高加工耗时长，且存在受热变形等问题。而溶解粘接、高温热运动、胶粘接等方式对密封粘接面会造成损伤，易导致管道变形、堵塞等问题，且封装的一致性不佳。
当前微流体领域常采用表面氧等离子体和化学修饰处理来实现芯片和基底(包括芯片)之间的键合。它们是通过纳米分子层进行化学键键和，均不会影响、堵塞管道图案。其中氧等离子体处理后会在双方表面产生羟基纳米层，两者通过氢键键和实现密封，该过程操作简单，只需几分钟即可完成密封过程，但只适用PDMS软质材料的封装；而化学修饰通常需要在管道芯片一次修饰上氨基/环氧基功能团，而在PDMS材料上修饰上环氧基/氨基功能团，两者通过氨基和环氧键和实现密封，这种方式需要在两种材料上均进行修饰，且仍然不能直接形成硬质的芯片。
发明内容
本发明的目的是提供一种硬质微流体芯片的制作方法，该方法在上层芯片半固化状态时与基底进行化学键合，一方面可将微米尺寸的微流体结构转印下来，另一方面可利用如环氧树脂等聚合物表面的功能基团与各种基底材料直接进行键和封装，用时少、成本低、精度高，且能承受较大压力。
本发明提供的一种硬质微流体芯片的制作方法，它包括如下步骤：制备上层芯片，在上层芯片半固化状态下与基底进行化学键和封装，得到所述硬质微流体芯片。
上述的制作方法中，所述上层芯片的材质为热固性聚合物，具体可为环氧树脂或氨基树脂；所述环氧树脂是指含有环氧基团的树脂，包括但不限于双酚A型环氧树脂；所述氨基树脂是由含有氨基的化合物与甲醛经缩聚而成的树脂；所述环氧树脂的预聚物的粘度低(100～200cPs，接近矿物油粘度)，非常便于um乃至nm微小结构的翻模印制。制备所述上层芯片时加热固化的温度可为45～85℃，具体可为80℃，时间可为15min～8小时，具体可为25min。
所述半固化状态下的上层芯片为“牛皮糖状”，可方便与基底剥离。未完全固化的树脂的柔软特性，在其“牛皮糖状”、半固化态时即保存了模具的微结构特性，还能与基底充分接触，保证了化学键键和所需纳米级的充分接触，密封所在的功能面平整度为纳米级。此外，该加热时间还决定了表面环氧基团的密度，高于所述加热时间表面环氧功能基团会相应减少，影响步骤(2)中的键和密封效果。
上述的制作方法中，制备所述上层芯片步骤具体可如下：以具有凸微结构的弹性硅基印模为模具，将制备所述上层芯片的预聚物和固化剂混合后浇筑到所述模具中，经加热后分离，得到具有凹微结构的上层芯片。
所述弹性硅基印模具体可为PDMS印模或硅胶印膜；
所述弹性硅基印模的制备方法之一如下：
1)以具有进出样微孔的凹微结构阴母模为模具，将所述弹性硅基印模预聚物和固化剂浇筑到所述模具上，将其包裹起来，经加热固化后分离，得到具有进出样微柱的凸微结构以及围栏的弹性硅基阳模，即为所述弹性硅基印模；
所述弹性硅基印模的制备方法之二如下：
1)以具有凸微结构的阳母模为模具，将所述弹性硅基印模预聚物和固化剂浇筑到所述模具上，经加热固化后分离，得到具有凹微结构的弹性硅基阴模；
2)在步骤1)中所述弹性硅基阴模上打孔并进行切割，得到开设有出入孔的具有凹微结构的弹性硅基阴模；
3)对步骤2)所述弹性硅基阴模进行钝化处理(所述钝化处理可避免其表面与后续弹性硅基印模的粘附)；
4)以经步骤3)处理的弹性硅基阴模为模具，将所述弹性硅基印模的预聚物和固化剂浇筑到所述模具中，经加热固化后分离，得到具有进出样微柱的凸微结构的弹性硅基阳模，即为所述弹性硅基印模。
所述阴母模或者所述阳母模是指表面有二维或者三维实体结构的硬质板，其材质通常可为以下材料中的至少一种：晶体硅、二氧化硅、陶瓷、玻璃、铜、铁、银、不锈钢、镍、铝合金、光刻胶、高分子聚合物、橡胶、树脂等。该阳母模的二维或三维结构可以由化学气相沉积(CVD)、光刻法(photolithography)、蒸发溅射、光刻电铸注塑(LIGA)等方法增材制备而成。该阴母模的二维或三维结构可由湿法化学腐蚀、等离子刻蚀(RIE)、激光切割或者机械加工等方式减材制备而成。其结构包含但不限于直管道、弯曲管道、微柱、十字形或螺线形微槽、微坑、微坝、微围栏。所述三维结构可由三维结构可由多层二维结构逐层堆叠而成，如凹陷的半球形结构，高度不一的悬臂梁结构等。
上述弹性硅基印模的制备方法中，所述加热固化(PDMS的固化)具体可为在80度下经1h加热固化、或在65度经2h加热固化。
上述弹性硅基印模的制备方法中的制备方法二中，所述钝化处理的步骤可如下：
1)对所述弹性硅基阴模进行氧等离子处理；所述氧等离子处理的条件为：功率为0.75kWh～1.25kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为30～60s。
2)将经步骤1)处理的弹性硅基阴模浸泡在试剂中5～15min，所述试剂为体积分数为1％～3％的聚乙烯醇(PVA)水溶液、聚乙烯醚(PVE)水溶液或聚乙烯乙二醇(PEG)水溶液(处理试剂需不与硅氧烷试剂黏附)，然后取出吹净(如氮气)并烘干。
上述的制作方法中，制作所述上层芯片的热固性聚合物(如环氧树脂)与硅胶、PDMS等硅基材料不粘连，能方便的脱模，便于硅基模具的高保真高重复地多次复制，反复使用和多次芯片制备，可实现微流体芯片的批量化生产。热聚合特性不需光敏剂添加，保障了其光学透明性。
上述的制作方法中，所述化学键合密封均利用了所述上层芯片未完全固化前表面裸露的环氧功能基团；所述热固性聚合物为环氧树脂，所述化学键和为下述1)-3)中的任一种：
1)氢键键和；键合方法如下：1-a)分别对所述上层芯片和所述基底进行氧等离子体照射处理；1-b)将经步骤1-a)处理后的上层芯片和经步骤1-a)处理后的基底贴紧进行氢键键和；所述基底包括能经等离子体照射后产生大量稳定羟基的材质，如PDMS、硅胶等；
氢键键合的原理为：通过所述氧等离子体照射在PDMS表面形成高密度硅羟基，通过氧等离子体照射在未完全固化的环氧树脂表面形成高密度碳羟基，然后将两者接触到一起通过氢键实现快速化学键和。其中PDMS表面的硅羟基可由基团硅甲基取代产生，环氧树脂表面的碳羟基可由羟基取代环氧基产生，均为等离子体处理的物理等离子体修饰过程。
2)氨基与环氧基的键和；键合方法如下：2-a)对基底进行氨基修饰；2-b)；将所述上层芯片和经步骤2-a)处理后的基底贴紧进行氨基与环氧基的键和；所述基底的材质可以为玻璃、石英或各类塑料；
键合原理为：在所述基底的表面通过化学修饰形成高密度氨基功能基团，与未完全固化的环氧树脂表面自带的高密度环氧基团，将两者平面接触到一起通过氨基-环氧基实现快速化学键和密封。
所述塑料包括但不限于：聚酰胺(PA)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯二乙醚(PPE)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSU)、环烯烃共聚物(COC)等。
3)氨基和环氧基的键和；所述键和方法如下：3-a)将环氧树脂的预聚物和固化剂混合后浇筑模具中，在45～85℃下加热15min～4小时，经分离后得到环氧树脂基底；3-b)所述环氧树脂基底进行氨基修饰；3-c)将经步骤3-b)处理后的环氧树脂基底和所述上层芯片贴紧进行氨基与环氧基的键和；所述基底的材质为环氧树脂。
键合原理为：在已经含有环氧基团的基底表面通过化学修饰形成高密度的氨基功能基团，与未完全固化的环氧树脂表面自带的高密度环氧基团，将两者平面接触到一起通过环氧基-氨基-环氧基实现快速化学键和密封。
步骤1-a)中，所述上层芯片的氧等离子照射得条件如下：功率为1.0kWh～1.75kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为40～60s；所述基底的氧等离子照射的条件如下：功率为0.75kWh～1.25kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为30～40s。
步骤2-a)中，所述氨基修饰的步骤如下：对所述基底清洗干燥后，进行氧等离子体照射处理，然后将经所述照射后基底浸泡在氨基硅烷分子的醇溶液中在65℃下反应2h，最后取出清洗干燥；所述氨基硅烷分子为含有3-氨丙基的氧基硅烷试剂，所述氨基硅烷分子溶质包含但不限于3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)，3-氨丙基三甲氧硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)和N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷N-2(Aminoethyl)3-aminopropyltrimethoxysilane等；所述醇溶液中，氨基硅烷分子的体积分数可为1％～3％。该氨基修饰是一种表面枝接的化学修饰方法，通过化学反应使修饰层以共价键结合在表面上，具体为氨基硅烷分子的硅烷部分与所述基底表面的羟基基团化学键结合，并形成具有活性的氨基功能层。该氨基修饰方法为长期稳定性修饰，修饰后的表面呈亲水性，且修饰后的表面在6个月时间内有效，故该方法制备的基底在制备或加工后，可在6个月内随时使用，方便了工业化运用。
步骤3-a)中，所述氨基修饰的步骤如下：将步骤3-a)中所述环氧树脂基底浸泡在多氨基分子的溶液中在15～30℃下反应1h，取出清洗吹净干燥；所述多氨基分子的溶液具体为壳聚糖醋酸水溶液、聚乙烯亚胺醇溶液、二乙烯三胺醇溶液、三乙烯四胺醇溶液或多乙烯多胺醇溶液；所述多氨基分子的溶液的体积分数为1％～3％。该修饰过程为多氨基分子部分与环氧树脂表面的环氧基基团化学键结合，并在表面暴露部分未完全结合的氨基基团。
上述1)氢键键和，以及2)和3)氨基与环氧基的键和中，所述贴紧均均只需将未完全固化的柔软环氧树脂芯片与基片/芯片接触，并以手指挤压到一起，即可完成两平面间的化学键和。
所述热固性聚合物为氨基树脂，所述化学键和为氨基与环氧基的键和；键合方法如下：将所述上层芯片和基底贴紧进行氨基与环氧基的键和；所述基底的材质为环氧树脂。
上述的制作方法中，所述方法在所述封装之后，还包括进一步加热至完全固化的步骤。所述加热的温度可为40～80℃，时间可为10min～4h，具体可在80℃下烘烤1小时后冷却至室温，所述固化可进一步成型增加材料硬度，并释放残余应力。
上述的制作方法中，为了保证树脂芯片上下表面的平整性，避免飞边，所述方法在所述完全固化之前，还包括在所述上层芯片上盖上PDMS膜或对所述上层芯片进行密封的步骤。
上述的制作方法，所述基底包括但不限于基片、芯片和薄膜。所述基片是指表面为光滑平面的片状材料，如生物实验常用25.4mm*75mm的boiling载玻片，所述芯片是指至少一面具有微流体结构的片状材料，如上述阴模具母模，所述薄膜是指表面为光滑平面的薄层材料，如100μm厚的PDMS薄膜。当所述基底为芯片时，通过将所述芯片与所述步骤(1)中制备得到的上层芯片进行化学键和，即可得到三维结构的微流体芯片，如上层芯片分别与PDMS芯片、PMMA芯片、玻璃芯片或环氧树脂芯片通过化学键和进行封装，得到不同芯片基底的三维结构的微流体芯。步骤3-a)中，所述环氧树脂基底可为环氧树脂基片或环氧树脂芯片，同上述微流体芯片的制作方法中的上层芯片，均为“半固化”状态，表面自带高密度环氧基团。
上述制作方法中，所述基底的厚度可以为多种尺寸，如50μm、100μm薄膜到1mm、2mm、5mm的薄片。所述基底可以为平面，也可同时含有直管道、弯曲管道、微柱、微槽、微坑、微坝、微围栏等微结构，还可以在非键和区域固定有特殊蛋白、功能基团分子等，为环氧树脂微流体芯片的具体应用和灵活设计提供了解决方案。
本发明所述封装过程，利用了未完全固化的树脂的柔软特性，在其牛皮糖状、半固化态时即保存了模具的微结构特性，还暂时具备柔软特性因此能与硬质基片/芯片充分接触，保证了化学键键和所需纳米级的充分接触，密封所在的功能面为纳米级平面。该键和不需高压高温条件，键和后芯片高度平整，透明度和键和强度好。
本发明的化学键键和封装方式，至少含有两张芯片/基片的键和封装，也还可由多片芯片二维结构逐层堆叠，重复键和形成含有三维结构的微流体芯片。本发明密封后外接的软管为样品进出的流体接口，联接各类样品或试剂到上述微流体芯片。
本发明进一步提供了一种由上述的制作方法制备得到的微流体芯片，该微流体芯片可形成紧密密封的微流体管道，通入溶液后能承受沸水浴而无泄漏。其材料弹性模量高不易变形，适合于微小管道中高压和高流速的流体进样。对各波段可见光均有较高的透射率(大于90％)，其生物兼容性优良可用于芯片上细胞培养，且不溶于多数化学试剂，能长期用于各类溶剂的生化反应。
环氧树脂在制备微流体芯片中的应用，也在本发明的保护范围内。环氧树脂与硅胶、PDMS等硅基材料不粘连，能方便的脱模，便于模具的反复使用；不需添加光引发剂，固化后在300nm-900nm波段的光透过率高于91％，自发荧光低，生物兼容性好，能便于细胞的贴壁生长；固化后杨氏模量高，在高流体速度时变形量少，且与大多数无机有机试剂兼容性好，不易发生溶胀；不易渗透水，不易渗透气体，可直接用于PCR等生物反应。
本发明具有如下有益效果：
(1)发明的芯片制备部分采用了热聚合环氧树脂材料，由预聚物和固化剂两种材料混合后使用，其混合后粘度低(接近矿物油粘度)，非常便于um乃至nm微小结构的翻模印制，翻模精度高；该混合物在80度温度下40min可凝固，缩短了微流体芯片制备时间，周期短试剂消耗少，便于批量化生产。该环氧树脂与硅胶、PDMS等硅基材料不粘连，能方便的脱模，便于模具的反复使用。该材料不需添加光引发剂，固化后在300nm-900nm波段的光透过率高于91％，自发荧光低，生物兼容性好，能便于细胞的贴壁生长。该材料固化后杨氏模量高，在高流体速度时变形量少，且与大多数无机有机试剂兼容性好，不易发生溶胀。不易渗透水，不易渗透气体，可直接用于PCR等生物反应。
(2)发明的芯片封装部分利用未完全固化环氧树脂表面裸露的高密度环氧基团，提供了与PDMS薄膜/基片/芯片的氧气等离子体氢键键和，与玻璃/石英/各类塑料基片/芯片的氨基修饰化学键键和，与自身材料环氧树脂基片/芯片的氨基修饰化学键键和等多种封装方案。该封装技术实现了环氧树脂芯片与现有各类微流体芯片材料的灵活封装与结合，推动了其实用化和工业化可行性。该封装方案采用的等离子体物理修饰方法、表面枝接化学修饰方法均为简单便利的方法，所需步骤少且可用于大批量处理。该方法经表面接触角、表面能量谱分析验证了其确切性，其中环氧树脂芯片与玻璃基片、PMMA基片、环氧树脂芯片的键和能承受1184kPa、900KPa、1516kPa以上的剪切拉力，验证了封装的机械强度。该键和封装方式为氢键键和、氨基-环氧化学键键和，两平面接触均能自发结合，不依赖外部高温高压环境，封装强度度高。封装速度快，方便现场即制即用。
(3)本发明首次提出了硬质材料微流体芯片的制备和高强度封装方案，便于从硅基微流体模板向批量化塑料芯片过渡。该环氧树脂材料制备的多层微流体芯片，能快速制备3μm的微流体芯片结构，并与PDMS/玻璃/石英/自身材料/各类塑料的基片/芯片完成化学键键和密封，其封装固化后的芯片弹性模量高、管道光滑、键和面高度透明、键和强度高、生物兼容性好。
(4)本发明所制备封装的芯片，可兼容微流体芯片所需的管道等微结构、泵阀等功能、免疫PCR等生化反应，提供了从实验室原型设计到工业化塑料芯片生产的过渡性验证方法，该方法简单成本低，也为一次性微流体芯片在环境污染物检测、生物化学分析和临床检验中等有巨大应用潜力的应用奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1制作微流体芯片的流程图。
图2为实施例1中经过氧等离子处理的PDMS基片与经过氧等离子处理的环氧树脂芯片进行氢键键合的示意图。
图3为实施例1制作得到的微流体芯片的照片。
图4为实施例2-4制作微流体芯片的流程图。
图5为实施例2或实施例3中经过氨基修饰的PMMA基片或玻璃基片与环氧树脂芯片进行氨基和环氧基化学键合的示意图。
图6为实施例2和实施例3中制备得到的微流体芯片的照片，其中，图6(a)为实施例2微流体芯片的照片，图6(b)为实施例3微流体芯片的照片。
图7为实施例3中经氨基修饰前后的XPS能谱扫描结果图。
图8为实施例4中经过氨基修饰的环氧树脂基片与环氧树脂芯片进行环氧基-氨基-环氧基化学键合的示意图。
图9为实施例4中制作得到的微流体芯片的照片。
图10为实施例5中对不同材质基底的微流体芯片键合强度的测试结果图，其中，图10(a)为测试照片，图10(b)为不同微流体芯片在不同拉伸长度下的负载压力的曲线图，图10(c)为不同微流体芯片的键合强度的柱形图。
图11为实施例5中弹性模量的测试结果图，其中图11(a)为不同材料的弹性模量的测试曲线(内嵌图为测试样条的照片)，图11(b)为不同材料的杨氏模量的柱形图。
图12为实施例5中透光率和自发荧光的测试结果图，其中，图12(a)和图12(b)为不同测试块的透光率随波长变化的曲线图(图12(a)中的内嵌图为环氧树脂基片和PMMA基片)，图12(c)和图12(d)分别为PMMA基片和环氧树脂基片不同测试块经瞬态荧光光谱仪测试得到其在不同激发波长下不同发射波长荧光的测试结果图，图12(e)为撒上带荧光标记的细胞后玻璃、PMMA和环氧树脂基片在显微镜下经过GFP和TXRED通道照射的照片。
图13生物兼容性的测试结果图，其中，图13(a)为SYSY、Cos7和MCF-7肿瘤细胞系分别在底部被环氧树脂覆盖的培养皿和正常培养皿中的细胞活力柱形图，图13(b)为293T和HeLa肿瘤细胞系分别在底部被环氧树脂覆盖的培养皿和正常培养皿中增殖密度和细胞活力情况的结果图，图13(c)为在环氧树脂表面直接点上荧光标记的蛋白并进行清洗后的荧光照片。
图14本发明环氧树脂芯片和PDMS芯片通入水后在95℃热板上放置20分钟后的照片，由左向右依次为环氧树脂芯片1、环氧树脂芯片2、PDMS1和PDMS2。
图15为本发明环氧树脂芯片和PMMA芯片加上PCR反应体系在平板PCR仪上进行扩增后的PCR结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PDMS预聚物和固化剂购自Dow Corning公司的Sylgard 184型，其由预聚物和固化剂以10:1体积比混合，抽真空去掉气泡后使用。双酚A型环氧树脂可购自Epo-Tek公司的301型树脂，其预聚物和固化剂两种成分构成，主要成分为双酚A(bisphenolA)、环氧氯丙烷(epichlorohydrin)和催化剂氢氧化钠。
SU-8凸模阳母模为委托博奥生物有限公司由硅片SU-8光刻得到，加工得到。凹模阴母模由购买的激光雕刻机或机械加工设备加工得到。实施例1-3中所用基片的厚度分别为：PDMS基底为100μm厚的PDMS薄膜，购自Rogers Corporation公司的HT-6240型产品，PMMA基底为购自北京市东珠有机玻璃厂的2mm厚的聚甲基丙烯酸甲酯PMMA基片，玻璃基底为购自洛阳市洛阳玻璃厂的BF33玻璃基片。
实施例1、制作环氧树脂微流体芯片(基底材质为PDMS)
如图1所示，按照如下步骤制作微流体芯片：
(1)PDMS预聚物和固化剂以10：1体积比混合，除掉气泡后的混合物，浇筑到模板/模具上，该模板/模具为含有凸微管道结构的阳母模(如硅片上光刻形成的SU-8凸模)。
(2)将步骤(1)中浇筑有PDMS混合物的模具在80度经1h烘干后，揭下切去飞边，清洗成为待复制的微流体芯片，该芯片为对应凹微结构的PDMS微流体芯片。
(3)利用打孔器在PDMS芯片上样品出入口的位置上，打出合适大小的通孔，如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm等。
(4)对经打孔的PDMS芯片管道进行钝化处理，方式为先对PDMS进行氧等离子处理(0.75kWh功率，氧气浓度30Pa，等离子体处理40s)增加其亲水性，然后浸泡在试剂中10分钟后氮气吹干并烘干形成一层纳米物理涂覆层，处理试剂为1％的聚乙烯醇(PVA)水溶液。
(5)将PDMS混合物再浇筑到PDMS芯片周围和上表面，在80度经1h加热，制备出和模板/模具图案一致，但含有进出样孔微柱的PDMS阳模具，该模具围栏的高度和(4)中PDMS芯片一致。
(6)将环氧树脂预聚物和固化剂以3:1(体积比)混合均匀后，浇筑到PDMS模具中去，用以批量复制出与PDMS微流体芯片具有相同凹微结构的环氧树脂芯片。双酚A和环氧氯丙烷的反应方程式如下：
(7)在PDMS模具表面盖上PDMS薄膜(或对PDMS夹具进行密封)，以保证芯片上下表面的平整避免飞边，在80度经25min加热固化，此时树脂芯片为牛皮糖状，未固化状态。
(8)将环氧树脂芯片从PDMS模具上揭下，注意保存模板的管道出入口微柱。
(9)将制备好的环氧树脂芯片和PDMS基片，经修饰后用手指按压贴紧，通过化学键和密封然后80℃下继续烘烤1h等却至室温，以进一步成型增加材料硬度，并释放残余应力，并在进出样口处用速干性胶密封上接口软管，形成样品进出管道。修饰的步骤如下：1)对环氧树脂芯片进行氧等离子处理，处理参数如下：0.75kWh功率，氧气浓度30Pa，等离子体处理40s；2)对PDMS基片进行氧等离子处理，处理参数如下：0.75kWh功率，氧气浓度30Pa，等离子体处理40s。等离子体处理的修饰过程和键合过程如图2所示。
本实施例中，制备得到的环氧树脂芯片的照片如图3所示。PDMS基底也可为PDMS芯片、PDMS基片，操作步骤相同。当基底为PDMS芯片时，制作得到的微流体芯片为多层芯片结构。
实施例2、制作环氧树脂微流体芯片(基底材质为PMMA)
如图4所示，按照如下步骤制作微流体芯片：
(1)PDMS预聚物和固化剂以10：1体积比混合，除掉气泡后的混合物，浇筑到模板/模具上，该模板/模具为含有凹微管道结构的阴母模(如激光雕刻机切割出的PC材料)。雕刻可同时在阴母模上样品出入口的位置上，切割合适大小的通孔，如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm等。
(2)将步骤(1)中浇筑有PDMS混合物的模具在80度经1h加热后，揭下切去飞边，清洗制备出和模板/模具图案相反，但含有进出样孔微柱的PDMS阳模具，该芯片为对应凸微结构的带有围栏结构的模具。
(3)将环氧树脂预聚物和固化剂以3:1体积比混合均匀后，浇筑到PDMS模具中去，用以批量复制出与PDMS微流体芯片具有相同凹微结构的环氧树脂芯片。双酚A和环氧氯丙烷的反应方程式如下：
(4)在PDMS模具表面盖上PDMS薄膜(或对PDMS夹具进行密封)，以保证芯片上下表面的平整避免飞边，在65度经40min烘干，此时树脂芯片为牛皮糖状，未固化状态。
(5)将环氧树脂芯片从PDMS模具上揭下，注意保存模板的管道出入口微柱。
(6)将制备好的环氧树脂芯片和修饰过的PMMA基片用手指按压贴紧，通过化学键和密封然后80℃下继续烘烤1h等却至室温，以进一步成型增加材料硬度，并释放残余应力。并在进出样口处用速干性胶密封上接口软管，形成样品进出管道。修饰的步骤如下：对PMMA基片进行氧等离子照射，处理参数如下：1.25kWh功率，氧气浓度30Pa，等离子体处理60s；然后将经照射的基底浸泡在体积分数为1％的3-APTES分子的无水乙醇溶液中在65℃下反应2h，最后取出清洗氮气吹干室温下静置。经XPS能谱扫描结果可以看出，氨基成功修饰在PMMA基片的表面。修饰过程和键合过程如图5所示。
本实施例中，制备得到的环氧树脂芯片的照片如图6(a)所示。PMMA基片也可由其它材质的塑料基片代替，基片也可由芯片代替，当基底为塑料芯片时，制作得到的微流体芯片为多层芯片结构。
实施例3、制作环氧树脂微流体芯片(基底材质为玻璃)
按照实施例2中的步骤制备环氧树脂微流体芯片，仅将步骤9)中的基底替换为玻璃基片。本实施例中，XPS能谱扫描结果如图7所示，图7中上方的两条曲线为氨基未修饰的玻璃(样品1和2)的表面XPS能谱扫描结果，中间两条曲线为氨基修饰后玻璃(样品3和4)的表面XPS能谱扫描结果，其中401eV能级附近的N元素峰在修饰后有明显的增高，说明修饰后玻璃表面确实有氨基增加。因此由图7可以看出，本实施例中氨基成功修饰在玻璃基片的表面。
本实施例中，制备得到的环氧树脂芯片的照片如图6(b)所示。玻璃基片也可由玻璃芯片代替，制作得到的微流体芯片为多层芯片结构。
实施例4、制作全环氧树脂微流体芯片(基底材质为环氧树脂)
如图4所示，按照如下步骤制作微流体芯片：
(1)PDMS预聚物和固化剂以10：1体积比混合，除掉气泡后的混合物，浇筑到模板/模具上，该模板/模具为含有凹微管道结构的阴母模(如机械加工雕刻出来的铝制模板)。雕刻可同时在阴母模上样品出入口的位置上，切割合适大小的通孔，如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm等。
(2)将步骤(1)中浇筑有PDMS混合物的模具在80度经1h烘干后，揭下切去飞边，清洗制备出和模板/模具图案相反，但含有进出样孔微柱的PDMS阳模具，该芯片为对应凸微结构的带有围栏结构的模具。
(3)将环氧树脂预聚物和固化剂以3:1体积比混合均匀后，浇筑到PDMS模具中去，用以批量复制出与PDMS微流体芯片具有相同凹微结构的环氧树脂芯片。双酚A和环氧氯丙烷的反应方程式如下：
(4)在PDMS模具表面盖上PDMS薄膜(或对PDMS夹具进行密封)，以保证芯片上下表面的平整避免飞边，在65度经40min烘干，此时树脂芯片为牛皮糖状，未固化状态。
(5)将环氧树脂芯片从PDMS模具上揭下，注意保存模板的管道出入口微柱。
(6)将制备好的环氧树脂芯片和修饰过的环氧树脂基片用手指按压贴紧，通过化学键和密封然后80度固化(固化时间为30min)冷却，并在进出样口处用速干性胶密封上接口软管，形成样品进出管道。修饰的步骤如下：将采用1～8相同工艺制备的半固化的环氧树脂基片(仅将模具替换为制备基片的模具)浸泡在体积分数为1％的壳聚糖(chitosan)醋酸水溶液中在25℃下反应1h，最后取出清洗氮气吹干室温下静置。经XPS能谱扫描结果可以看出，氨基成功修饰在环氧树脂基片的表面。修饰过程和键合过程如图8所示。
本实施例中，制备得到的环氧树脂芯片的照片如图9所示。环氧树脂基片也可由环氧树脂芯片代替，当基底为环氧树脂芯片时，制作得到的微流体芯片为多层芯片结构。具体的制作方法如下：
1)上层芯片的制备：按照上述(1)-(8)的步骤制备环氧树脂上层芯片(为半固化状态)；
2)基底环氧树脂芯片的制备：按照上述(1)-(9)中的方法制备环氧树脂芯片，区别在固化之前对环氧树脂芯片的表面进行氨基修饰，修饰方法与(9)中的氨基修饰方法相同。
3)将步骤1)中的上层芯片和步骤2)中的基底环氧树脂芯片用手指按压贴紧，然后80度固化(固化时间为30min)冷却，并在进出样口处用速干性胶密封上接口软管，形成样品进出管道。
实施例5、微流体芯片的性能测试力学性能
A、键合强度
将环氧树脂芯片与各类基底材料键合后的结构粘接到拉伸测试铝块上如图10(a)，并以0.5mm/min的速度进行拉伸，得到其在不同拉伸长度下的负载压力，如图10(b)所示，其中曲线Resin-PDMS表示环氧树脂和PDMS基片的键合，Resin-glass表示环氧树脂和玻璃基片的键合，Resin-PMMA表示环氧树脂和PMMA基片的键合，Resin-Resin表示环氧树脂和环氧树脂的键合，1和2分别代表两个实验重复，并记录其断裂瞬间的负载压力，该值除以粘接面积得到键合强度值，如图10(C)所示。
结果显示：实施例1-3中的环氧树脂芯片与玻璃基片、PMMA基片、环氧树脂芯片的键和能分别承受1184kPa、900KPa、1516kPa以上的拉伸压力，因此，本发明微流体芯片具有极高的机械键合强度，能承受较高的压力。
B、弹性模量测量
弹性模量将不同材料制备成ASTM D638Type I标准的拉伸样条，并在材料测试机(Z005,Zwick,德国)上面进行0.5mm/min速度的拉伸测试。
得到图11(a)所示测试曲线，左上角的内嵌图为拉伸样条的照片，1、2和3分别代表三个实验重复，并通过斜率换算(杨氏模量＝斜率/截面积)得到右图所示结果。从图11(b)中可以看出，环氧树脂(固化剂和预聚物和固化剂体积比为1:3)的杨氏模量为1171.6，PMMA的杨氏模量为1485，PDMS(固化剂和预聚物为1:10)的杨氏模量为1.85，热塑性弹性体(TPE)的杨氏模量为100，丙烯酸聚酯(acrylated polyether)的杨氏模量为770，聚碳酸酯(PC)的杨氏模量为2320，聚乙烯(PE)的杨氏模量为1070，紫外固化胶(NOA)的杨氏模量为325，硅的杨氏模量为130000。
(2)透光率和自发荧光测试
透光率是将各种测量的测试块(分别为3.0mm的超白玻璃、3.8mm的环氧树脂基片2、3.6mm的环氧树脂基片1、2.9mm的PMMA基片和1.2mm的载玻片)，经过紫外-可见光分光光度计扫描，得到其光透过率的值，并归一化到3mm时的光透过率，如图12(a)和图12(b)所示。其中，图12(a)中右下角的内嵌图为环氧树脂基片和PMMA基片的实物照片，其肉眼观察无杂色水头高，和测试结果相符。
自发荧光是在320nm到650nm的波长范围内以20nm的步进以不同的波长对基片进行照射，并以10nm的步进在320nm到650nm的波长范围内依次测量其在不同的波长下的发射荧光，采集积分时间是40μs。经过瞬态荧光光谱仪测试得到其在不同激发波长下不同波长荧光的发散情况，如图12(d)所示环氧树脂自发荧光较均匀，优于PMMA等常用塑料，图12(c)。三种材料在显微镜下经过GFP和TXRED通道照射拍照图12(e)中，撒上带荧光标记的细胞的玻璃基片(上)、PMMA基片(中)和环氧树脂基片(下)，图中小点是细胞发射的荧光，该荧光越清晰和背景的差异越明显越好。树脂芯片成像的图片漆黑，得到类似玻璃材料的结果，而不是PMMA那样明亮的图片，说明其自发荧光较低。
(3)生物兼容性
生物兼容性实验经过两项测试。
第一项，将SYSY、Cos7和MCF-7等肿瘤细胞系(细胞系均购自American TypeCulture Collection标准库)培养在底部被环氧树脂覆盖的培养皿上，24h后通过细胞活力试剂盒CCK-8(购自日本同仁化学)来评价其细胞活力，并与正常培养皿对照，其结果如图13(a)所示，活力接近或高于正常培养皿的结果。
第二项，将293T和HeLa肿瘤细胞系(细胞系均购自American Type CultureCollection标准库)，分别培养在底部被环氧树脂覆盖的培养皿和正常培养皿上，在不同时间后观察其增殖后的密度，并利用Calcium AM(绿色)和PI(红色)染料对细胞进行染色，结果中细胞被染上绿色越多，被染上红色越少越好。
结果如13(b)，被环氧树脂覆盖的培养皿中细胞扩增速率和正常培养皿基本一致，而且细胞染色结果也证明，被环氧树脂覆盖的培养皿中细胞的自由钙离子浓度较高接近于正常培养皿中的水平。图13(c)是在环氧树脂表面直接点上荧光标记的蛋白，经过清洗后蛋白依然存在于芯片上，说明蛋白上的氨基已经与树脂表面的环氧基结合上，可用于免疫反应。
(4)渗水性和PCR反应的测试
本发明环氧树脂芯片和PDMS芯片见图(14)(其中，树脂芯片为实施例3制得的微流体芯片，PDMS芯片是PDMS和玻璃键合的微流体芯片，键合方法如下：PDMS和玻璃清洗干燥后，对两者进行氧等离子照射，处理参数如下：0.75kWh功率，氧气浓度30Pa，等离子体处理30s；然后将贴紧氢键键合在一起)通入水后，在95℃热板上放置20分钟，取下后观察到树脂管道中水体积基本没变，而PDMS水基本消失，如图14所示，说明本发明树脂芯片不易渗透水。
制备后的芯片，加上PCR反应体系(总体为25μL，包括：Fwd扩增引物5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAA-3’浓度10μM体积0.5μL，Rev扩增引物5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’浓度10μM体积0.5μL，K562DNA模板浓度5ng/μL体积2μL，购自Bioteke的PCR mix体积12.5μl，以及ddH2O体积9.5μl)在平板PCR仪上进行扩增(96℃加热5min启动，然后做35个扩增循环，其温度和时间依次是97℃45s，51℃35s和72℃30s，最后72℃10min完成扩增)，得到PCR结果如图(15)，本发明环氧树脂芯片的对应位置出现扩增条带，说明本发明环氧树脂微流体芯片可直接用于PCR反应。

Claims (10)

1.一种硬质微流体芯片的制作方法，它包括如下步骤：制备上层芯片，在上层芯片半固化状态下与基底进行化学键和封装，得到所述硬质微流体芯片。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述上层芯片的材质为环氧树脂或氨基树脂；制备所述上层芯片时加热固化的温度为45～85℃，时间为15min～8小时。
3.根据权利要求1或2所述的制作方法，其特征在于：制备所述上层芯片的步骤如下：以具有凸微结构的弹性硅基印模为模具，将制备所述上层芯片的预聚物和固化剂混合后浇筑到所述模具中，经加热后分离，得到具有凹微结构的上层芯片。
4.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于：所述弹性硅基印模为PDMS印模或硅胶印膜；所述弹性硅基印模的制备方法为下述(A)或(B)：
(A)所述弹性硅基印模的制备方法如下：
1)以具有进出样微孔的凹微结构阴母模为模具，将所述弹性硅基印模预聚物和固化剂浇筑到所述模具上，将其包裹起来，经加热固化后分离，得到具有进出样微柱的凸微结构以及围栏的弹性硅基阳模，即为所述弹性硅基印模；
(B)所述弹性硅基印模的制备方法如下：
1)以具有凸微结构的阳母模为模具，将所述弹性硅基印模预聚物和固化剂浇筑到所述模具上，经加热固化后分离，得到具有凹微结构的弹性硅基阴模；
2)在步骤1)中所述弹性硅基阴模上打孔并进行切割，得到开设有出入孔的具有凹微结构的弹性硅基阴模；
3)对步骤2)所述弹性硅基阴模进行钝化处理(所述钝化处理可避免其表面与后续弹性硅基印模的粘附)；
4)以经步骤3)处理的弹性硅基阴模为模具，将所述弹性硅基印模的预聚物和固化剂浇筑到所述模具中，经加热固化后分离，得到具有进出样微柱的凸微结构的弹性硅基阳模，即为所述弹性硅基印模；
优选地，所述方法(B)中，所述钝化处理的步骤如下：
1)对所述弹性硅基阴模进行氧等离子处理；所述氧等离子处理的条件为：功率为0.75kWh～1.25kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为30～60s。
2)将经步骤1)处理的弹性硅基阴模浸泡在试剂中5～15min，所述试剂为体积分数为1％～3％的聚乙烯醇(PVA)水溶液、聚乙烯醚(PVE)水溶液或聚乙烯乙二醇(PEG)水溶液(处理试剂需不与硅氧烷试剂黏附)，然后取出吹净(如氮气)并烘干。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述上层芯片的材质为环氧树脂；所述化学键和为下述1)-3)中的任一种：
1)氢键键和；键合方法如下：1-a)分别对所述上层芯片和所述基底进行氧等离子体照射；1-b)将经步骤1-a)处理后的上层芯片和经步骤1-a)处理后的基底贴紧进行氢键键和；
2)氨基与环氧基的键和；键合方法如下：2-a)对基底进行氨基修饰；2-b)；将经步骤2-a)处理后的基底和所述上层芯片贴紧进行氨基与环氧基的键和；所述基底的材质为玻璃、石英或塑料；
3)氨基和环氧基的键和；所述键和方法如下：3-a)将环氧树脂的预聚物和固化剂混合后浇筑模具中，在45～85℃下加热15min～8小时，经分离后得到环氧树脂基底；3-b)所述环氧树脂基底进行氨基修饰；3-c)将经步骤3-b)处理后的环氧树脂基底和所述上层芯片贴紧进行氨基与环氧基的键和；所述基底的材质为环氧树脂。
6.根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于：步骤1-a)中，所述上层芯片的氧等离子照射的条件如下：功率为1.0kWh～1.75kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为40～60s；所述基底的氧等离子照射的条件如下：功率为0.75kWh～1.25kWh功率，氧气浓度为30Pa，等离子体处理时间为30～40s；
步骤2-a)中，所述氨基修饰的步骤如下：对所述基底进行氧等离子体照射，然后将经所述照射的基底浸泡在氨基硅烷分子的醇溶液中在65℃下反应2h，最后取出清洗干燥；所述氨基硅烷分子为含有3-氨丙基的氧基硅烷试剂；所述醇溶液中，氨基硅烷分子的体积分数为1％～3％；
步骤3-a)中，所述氨基修饰的步骤如下：将所述基底浸泡在多氨基分子的溶液中在15～30℃下反应1h，取出清洗干燥；所述多氨基分子的溶液具体为壳聚糖醋酸水溶液、聚乙烯亚胺醇溶液、二乙烯三胺醇溶液、三乙烯四胺醇溶液或多乙烯多胺醇溶液；所述多氨基分子的溶液的体积分数为1％～3％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述方法在所述化学键合之后还包括进一步加热至完全固化的步骤；优选地，所述进一步加热的温度为40～80℃，时间为10min～4h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制作方法，其特征在于：所述基底为基片、芯片和薄膜中任意一种。
9.权利要求1-8中任一项所述的制作方法制作得到的微流体芯片。
10.环氧树脂在制备微流体芯片中的应用。
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