CN1295512C

CN1295512C - 蛋白质羰基含量检测试剂盒

Info

Publication number: CN1295512C
Application number: CNB2005100181525A
Authority: CN
Inventors: 段丽菊; 杨旭
Original assignee: Huazhong Normal University
Current assignee: Huazhong Normal University
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2025-01-14
Also published as: CN1645149A

Abstract

一种检测蛋白质的羰基含量的试剂盒。它以2，4-二硝基苯肼比色法为原理，制备出一种可简便、灵敏的检测各种组织器官、血清、培养细胞和细胞器等的蛋白质羰基含量的试剂盒。该试剂盒是一套由7瓶试剂共同配套使用的蛋白质羰基检测试剂盒，7瓶试剂中都为液体；每个试剂瓶中装有固定浓度和固定体积的试剂；试剂瓶1放入装有冰袋9的泡沫盒8中，其余试剂一同放入一个由硬纸塑料材料制成的长方形盒子10中。其使用不需要昂贵的设备，样品处理简单，可广泛应用于各种疾病如衰老、动脉硬化症、糖尿病和帕金森氏综合症、风湿性关节炎等疾病的早期辅助诊断，抗氧化保健食品、抗氧化药物和化妆品等的评价，还可以用于评价由于一些环境有害因子如辐射、化学毒物等对机体造成的氧化损伤。

Description

蛋白质羰基含量检测试剂盒

所属技术领域

本发明涉及一种检测蛋白质的羰基含量的试剂盒，适用于检测各种组织器官、血清、培养细胞和细胞器等的蛋白质氧化损伤程度。

背景技术

1987年Oliver等人经研究提出可以用蛋白质羰基含量作为判定蛋白质氧化损伤的一项指标，国内外多年来一直致力于研究有效的蛋白质羰基含量的检测方法来评价蛋白质的氧化损伤程度，现有的方法中有硼氢化钠法、荧光素肼法、荧光胺法、免疫杂交法等，这些方法或者需要昂贵的设备、或者需要昂贵的试剂，而且样品的处理非常复杂。2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法是测定蛋白质羰基含量的经典方法，它在检测蛋白质羰基含量时具有简便有效的特点，但需要称量和配制的试剂较多而使用非常不方便，且会因为实验人员及仪器的准确性等原因产生较大的系统误差，而且国内外有些学者在设计实验时有很多不足的地方，从而影响最后的实验结果。目前，国内外有许多检测机体抗氧化系统和自由基的试剂盒，这些指标只能间接地反映机体的氧化损伤程度，而不能反映在生命活动中充当重要功能的蛋白质的氧化损伤程度。蛋白质的氧化损伤可以引起酶的失活、蛋白质之间的交联、甚至可以引起细胞的死亡，最终导致疾病的产生。国内尚无可用于检测蛋白质氧化损伤的试剂盒，国外有些公司售有特异性抗体，但是比较昂贵。

发明内容

本发明的任务是在2，4-二硝基苯肼比色法的基础上加以修饰，并提供一套预先由生产厂家称量配制和分装好，并附有使用说明书，只需要按照说明书的操作步骤就可以测定样品的蛋白质羰基含量。因而可以有效的克服上述缺点，提供灵敏、简便、不需要昂贵的试剂和设备的蛋白质羰基含量的检测方法。

本发明的技术方案是：

一种蛋白质羰基含量检测试剂盒(参见附图1)，包括装不同试剂的七个试剂瓶：试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5、试剂瓶6、试剂瓶7，一个泡沫盒8和冰袋9，一个由硬纸或塑料材料制成的盒子10及试剂盒使用说明书11，每个试剂瓶上有说明标志，其中试剂瓶1内装有苯甲基磺酰氟的异丙醇溶液；试剂瓶2内装有用作试剂瓶1中试剂的稀释液；试剂瓶3内装有由N-2-羟乙基呱嗪-N’-2乙磺酸(HEPES)和硫酸链霉素配置好的溶液；试剂瓶4外包有黑色的塑料袋，内装有由2mol/L的稀盐酸溶解2，4-二硝基苯肼配成的溶液；试剂瓶5内装有2mol/L的稀盐酸；试剂瓶6内装有0.2g/mL三氯乙酸；试剂瓶7内装有6mol/L的盐酸胍溶液；试剂瓶1放入装有冰袋9的泡沫盒8中，试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5、试剂瓶6和试剂瓶7一同放入一个由硬纸或塑料材料制成的盒子10中，试剂盒使用说明书11放入泡沫盒8或盒子10中。

其中所述的试剂瓶1内装浓度为20mg/mL苯甲基磺酰氟溶液1mL，密封，在-20℃下保存，临用前用试剂瓶2中的溶液稀释作为匀浆介质。

所述的试剂瓶2内装的用作试剂瓶1中试剂的稀释液是N-2-羟乙基呱嗪-N′-2乙磺酸(HEPES)、NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、Aprotinin和乙二氨四乙酸(EDTA)的配制溶液，溶液的pH值为7.4。

所述的试剂瓶3内装由50mol/LHEPES和硫酸链霉素0.2g/mL配置好的溶液3mL，用于沉淀核酸。

所述的试剂瓶4内装有由2mol/L的稀盐酸溶解2，4-二硝基苯肼配成的溶液25mL，2，4-二硝基苯肼的浓度为10mmol/L。，用于与蛋白质中的活化羰基反应。

所述的试剂瓶5内装2mol/L的稀盐酸25mL，用于消除反应中杂质的干扰。

所述的试剂瓶6内装0.2g/mL三氯乙酸50mL，用于沉淀反应产生的蛋白质腙衍生物。

所述的试剂瓶7内装6mol/L的盐酸胍溶液70mL，用于溶解蛋白质腙衍生物。

操作者按照试剂盒说明书给定的操作步骤进行使用，就可以检测各种样品的蛋白质羰基含量。本发明简化了实验操作中的繁杂步骤，能节约实验者的时间，较好地满足实验操作的简单化和提高实验结果的准确性。操作时取组织样，制成10％的组织匀浆，去掉其中的核酸，制成蛋白质的粗提溶液，如果是细胞培养液、血清或标准蛋白时，只需要把它制成10mg/mL左右的蛋白质溶液，加入2，4-二硝基苯肼溶液后，被氧化的蛋白质中的活化羰基与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙衍生物，在370nm有最大吸收值。

本发明以2，4-二硝基苯肼法为原理，制备出一种可简便、灵敏的检测各种组织器官、细胞培养液和血清的试剂盒。该试剂盒的使用不需要昂贵的设备，样品处理简单，可广泛应用于各种疾病的早期辅助诊断、有毒物质的评价、抗氧化保健食品的生物活性测试和由一些环境因素引起得蛋白质氧化损伤的检测等等

附图说明：

图1的a和b：蛋白质羰基含量测定试剂盒结构图

图中标记表示：1：试剂瓶1，2：试剂瓶2，3：试剂瓶3，4：试剂瓶4，5：试剂瓶5，6：试剂瓶6，7：试剂瓶7，8：泡沫盒，9：冰袋，10：硬纸或塑料材料制成的盒子，11：试剂盒使用说明书。

具体实施方式

以下结合检测试剂盒的构成与附图及使用方法，对本发明做进一步的详细说明：

检测试剂盒的构成：

试剂瓶1：白色塑料瓶，内装由用异丙醇溶解苯甲基磺酰氟配成的溶液，苯甲基磺酰氟的浓度为20mg/mL，体积为1mL，临用前用试剂I稀释液将其稀释，作为匀浆介质。此为试剂I。

试剂瓶2：白色塑料瓶，内装由10mmol/LHEPES、137mmol/LNaCl、4.6mmol/LKCl、1.1mmol/L KH₂PO₄、0.6mmol/L MgSO₄、0.5mg/L Aprotinin和1.1mmol/L EDTA按固定浓度配好的溶液，溶液的pH值为7.4，体积为60mL。此为试剂I稀释液。

试剂瓶3：白色塑料瓶，内装由50mol/LHEPES和0.2g/mL硫酸链霉素配置好的溶液，体积为3mL，用于沉淀核酸。此为试剂II。

试剂瓶4：白色塑料瓶外包黑色的塑料袋，内装由2mol/L的稀盐酸溶解2，4-二硝基苯肼配成的溶液，2，4-二硝基苯肼的浓度为10mmol/L，体积为25mL，用于与蛋白质中的活化羰基反应。此为试剂III。

试剂瓶5：白色塑料瓶，内装2mol/L的稀盐酸，体积为25mL，用于消除反应中杂质的干扰。此为试剂IV。

试剂瓶6：白色塑料瓶，内装0.2g/mL三氯乙酸，体积为50mL，用于沉淀反应产生的蛋白质腙衍生物，此为试剂V。

试剂瓶7：白色塑料瓶，内装6mol/L的盐酸胍溶液，体积为70mL，用于溶解蛋白质腙衍生物，此为试剂VI。

试剂瓶1放入装有冰袋9的白色泡沫盒8中，其余试剂一同放入一个由硬纸材料制成的长方形盒子10中。

检测试剂盒的使用方法，检测步骤：

1.将试剂I和试剂I稀释液按照体积比为1∶500的比例配制好，用多少配多少，配好后的试剂不能保存。将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比为1∶1的比例配制成的溶液。

2.取组织块0.1mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，用稀释好的试剂I作为匀浆介质，将组织在冰水浴中制成10％的组织匀浆。将制备好的10％的组织匀浆用离心机3000r/min离心10分钟，取上清。如果样品比较珍贵，或者量比较少，可以取0.06mg以上的组织，制成10％的组织匀浆。如果样品是细胞培养液，可用稀释好的试剂I将其蛋白质浓度稀释为10mg/mL，如果样品是血清，此步骤省略。

3.取上清液450μL，加入50μL试剂II。室温放置10min后，以11000转/分的转速，离心10min，取上清液。如果是细胞培养液，可取稀释好的样品450μL直接检测，如果样品是血清，此步骤省略。

4.取100μL上清液，加入400μL试剂III，同时在另外一个离心管中加入100μL上清液，并加入400μL试剂IV，此管为对照管，将两管置于黑暗体系中放置1h，每隔10min漩涡一次。如果样品是血清，用生理盐水将血清稀释5倍，即血清与生理盐水的体积比为1∶

5。取稀释过的血清100μL，其步骤和组织的相同。

5.反应完毕后，每管加入500μL试剂V，在4℃下，以12000转/分的转速，离心10min，弃上清液。

6.得到的沉淀用无水乙醇和乙酸乙酯配成的溶液洗涤四次。

7.最后的沉淀中加入1.25mL试剂VI，于37℃水浴15min。用漩涡仪将全部的沉淀溶解，以12000转/分的转速，离心15min，取上清液。在370nm下，试剂VI调零，测定其吸光值。

8.用步骤3得到的上清液测定组织中的蛋白质含量，血清样品可以直接或稀释后测定其蛋白质含量。

9.计算：

Claims

1、一种蛋白质羰基含量检测试剂盒，包括装不同试剂的七个试剂瓶：试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5、试剂瓶6和试剂瓶7，一个泡沫盒(8)，冰袋(9)，一个由硬纸或塑料材料制成的盒子(10)及试剂盒使用说明书(11)，每个试剂瓶上有说明标志，其中试剂瓶1内装有苯甲基磺酰氟的异丙醇溶液；试剂瓶2内装有用作试剂瓶1中试剂的稀释液；试剂瓶3内装有由HEPES和硫酸链霉素配置好的溶液；试剂瓶4外包有黑色的塑料袋，内装有由2mol/L的稀盐酸溶解2，4-二硝基苯肼配成的溶液；试剂瓶5内装有2mol/L的稀盐酸；试剂瓶6内装有20克/100mL三氯乙酸；试剂瓶7内装有6mol/L的盐酸胍溶液；试剂瓶1放入装有冰袋(9)的泡沫盒(8)中，试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5、试剂瓶6和试剂瓶7一同放入一个由硬纸或塑料材料制成的盒子(10)中，试剂盒使用说明书(11)放入泡沫盒(8)或盒子(10)中。

2、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶1内装浓度为20mg/mL苯甲基磺酰氟溶液1mL。

3、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是所述的试剂瓶2内装的用作试剂瓶1中试剂的稀释液是HEPES、NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、Aprotinin和乙二氨四乙酸的配制溶液，溶液的pH值为7.4。

4、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶3内装有由50mol/LHEPES和0.2g/mL硫酸链霉素配置好的溶液3mL。

5、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶4内装有由2mol/L的稀盐酸溶解2，4-二硝基苯肼配成的溶液25mL，2，4-二硝基苯肼的浓度为10mmol/L。

6、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶5内装有2mol/L的稀盐酸25mL。

7、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶6内装有0.2g/mL三氯乙酸50mL。

8、如权利要求1所述的蛋白质羰基含量检测试剂盒，其特征是试剂瓶7内装有6mol/L的盐酸胍溶液70mL。