JP4347808B2 - レクチン経路欠損検定 - Google Patents

Description

本発明は、補体系検定について言及する。より明確には、本発明は生理学上の条件での補体系のレクチン経路欠損を機能的に測定するための方法及びキットについて言及する。

補体系とは、相互作用する多くの血漿中タンパク質及び膜貫通タンパク質を含む先天性免疫系の複雑な部分である。先天性免疫という用語は、適応性免疫という用語と免疫のタイプを区別するため用いられるものである。しかしながら補体は適応性免疫でも役割を果たすが、ここでの関連では十分に理解されていない。

血清中に存在する一連の可溶性タンパク質は、活性化された時、微生物及び他の抗原を組織及び血液から排泄するのを助ける。これは補体成分単独、又は免疫応答の他の武器の誘因となる補体受容体を発現する細胞とのそれらのその後の相互作用のいずれかにより達成される。

損傷を受けることから宿主組織を予防するために、補体系は厳格に統制されていなければならない。血漿中又は細胞表面のいずれかに存在する多くの数のタンパク質は、宿主細胞の保護、抗原による活性化の間の補体制御、及び一度抗原が排泄された補体の脱活性化における補体の統制分子として必要とされる。

有機体の病原性に対する宿主防御の主な構成要素として、補体系の活性化は、病原体の侵入に対する先天性の防御のための重要な鍵となる。より高等な有機体である動物は、有機体の侵入により提示される抗原性攻撃に対し、特異的な免疫応答を発達させることにより応答する。抗体が形成され、特異的な外来抗原を認識する能力を持つ細胞が産出される。このようにして、補体は補体成分により直接的に微生物の表面を認識することによって、及び間接的に抗体又は急性段階タンパク質のようなアダプター分子と結合することによって標的を同定する。補体系の次に起こる活性化は、一般に体液及び細胞機構経由での活性化剤の排泄という結果となる。補体系のこれらの防御機能は、最適の宿主免疫のために必要とされる。

例えば、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、臨床的に重要である多くの微生物の表面上に頻繁に発現する多糖類と結合することができる。このＭＢＬの直接的な結合は、免疫系による病原体の排泄に関与する。病原体の侵入に対する先天性耐性におけるＭＢＬの重要性は、ＭＢＬ遺伝子中に遺伝子の突然変異を有するヒトにより明確に説明される。これらの突然変異はＭＢＬ分子の構造異常を引き起こし、感染への感受性の増強に関連するレクチン経路による補体活性化が減弱する結果となる。

補体系の活性化は宿主防御の重要な構成要素である。感染後、補体構成要素の微生物表面への直接的な結合による補体活性化カスケードの誘発は、体液及び細胞機構経由でのオプソニン作用並びに病原体の排泄を誘導するであろう。更に、補体活性化が誘発され、後天免疫系を増幅するであろう。

更に感染に対する宿主防御で重要な役割を果たす補体系は、免疫複合体疾患の病因及び予防の両方の媒体である。補体活性化により炎症が促進され、同時に適切に制御されていない時には細胞損傷という結果になり得るので、補体系が適切な病原体に対し適度に機能する場合には保護的効果を有する。

補体活性化カスケード反応は、少なくとも３つの公知の活性経路、即ち古典経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）経由により誘発され得る。これらの３つの経路は、構成要素Ｃ３で合流する。末端の補体経路は、Ｃ３以後活性化される全てのタンパク質から成り、そして膜攻撃複合体（ＭＡＣ）へのタンパク質Ｃ５−９群の集合に帰着する。ＭＡＣは、細胞膜に穴をあけることによって強力な殺傷活性を働かせる。

補体系の欠陥は、補体活性化カスケードの一部又は完全な封鎖を導くことができる。欠陥のレベル次第で補体活性化の誘導段階、エフェクター段階のいずれかが阻止され、そして当該欠陥は1以上の経路に影響を及ぼし得る。補体系機能の減弱は、遺伝子欠陥のため、又は補体構成要素の後天的な欠損により起こり得る。補体構成要素の後天的な欠損とは、補体構成要素に対する自己抗体の形成、又は過度の補体消費により起こり得る。遺伝子の補体欠損は、当該系の全てのレベルで説明された。

大多数の補体欠陥は、感染に対する感受性の相対的な微増から重篤な全身性自己免疫性症候群の発症までの範囲にある疾患に関連する。更に補体機能の減弱は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の発赤の発生に関連する。従って、ヒト血漿中の補体活性を測定する機能性検定は、診断上の、及び予後の明確な価値を有する。

しかしながら、類似の機構を経由する補体構成要素は、損傷した自己組織に対しその効果を標的にするおそれがあることが、この数年徐々に明確にされ始めた。それによれば自己免疫性疾患、免疫複合体疾患、アルツハイマー病、並びに例えば、心筋梗塞、脳卒中、及び主な外科的処置で発生する虚血性／再灌流（reperfusion）損傷といった症状下において補体は、組織損傷及び炎症の増幅に寄与する。例えば近年の研究ではＭＢＬによるレクチン経路の活性化は、補体活性化及び虚血性／再灌流損傷、並びに心筋梗塞に関連する炎症の原因となり得るとの証明も提供した。更に補体活性は、同種移植及び異種移植の拒絶の原因に寄与する。このように所望されない補体活性が、多くの病的な状況下における炎症及び関連する組織損傷に含まれる。

補体系の欠損を指摘すること及び機能的に測定することは困難である。欠陥は欠陥時点での補体カスケードの遮断を誘導するであろう。一般に古典経路に欠陥のある患者は、欠陥時点までで当該経路を進めることを止め、カスケード中の後のタンパク質は補充されない。一方、副経路に異常を持つ固体は、古典経路に異常を持つ固体よりも普通少ないが、ある症例では異常を持つ数人の個体が発表された。

レクチン経路の機能欠損は、普通はＭＢＬ遺伝子における遺伝子の多型性のためである。ヒトで説明された補体欠損の中で、ＭＢＬの欠損は最も頻度が高い。これらの欠損は、感染への感受性を増加させること、及び慢性疾患の進行を増強させることの両方の明確な臨床的意義を持つ。

補体カスケード中の欠損は、不可抗力の感染及び敗血症へと導かれ得る。補体中の欠損は、２つの機構、即ち効果のないオプソニン化及び溶解活性の欠陥（ＭＡＣの欠陥）によって主に患者を感染させやすくする。

一つの例は不十分なオプソニン化となる欠陥の存在である。オプソニン化は病原性の有機体を覆う過程であり、そのためマクロファージ系により容易に食される。当該構成要素であるタンパク質Ｃ３ｂは、その分裂生成物であるＣ３ｂｉとともに補体カスケードにおけるオプソニン化の効力を有する物質である。Ｃ３ｂの生成の減少を引き起こすいかなる欠陥も不十分なオプソニン化能に帰着する。そのようなオプソニン化欠陥は古典経路、副経路、もしくはＭＢＬ経路の構成要素の欠損により引き起こされ、又は欠陥はＣ３構成要素自身の欠損により引き起こされるであろう。

構成要素機能はほとんどの場合、古典補体経路及び副補体経路のそれぞれの機能的評価を可能とする溶血性検定を用いることによって測定される。これらの溶血性検定は、補体経路機能が、活性化に基づきＣ５ｂ−９複合体を生成するためのその能力として現される。そのような検定は現在のところ補体のレクチン経路のために利用することはできない。ヒト個体群におけるＭＢＬ欠損の頻度の高さ考慮すると、レクチン経路機能を測定するための信頼できる検定は高く評価される。

普通は、補体の検出又は血中での補体欠損の検出ための方法は、冗長な溶血性、又は抗原性の方法によって行われる。補体経路の異なる構成要素のレベルの増加又は減少が検定される。そのような試験では特異的な補体タンパク質を認識するであろう標的抗体が必要とされる。一般に血清又は血漿中の補体タンパク質の抗原性検定は、特にＣ３に最も容易に利用し得る試験である。後者の検定ではＣ３の血清レベルが提供されるが、機能的な活性化については殆ど何も、又は全く何も示さない。低機能性変異体の存在は発表されているが、非機能性Ｃ３変異体については発表されていない。

機能的な補体を研究する場合、抗体及び補体によって容易に溶解するという理由から羊赤血球が用いられた。機能的な補体の活性化のために最も一般的に行われる試験は、抗体で覆われた羊赤血球を溶解させるための患者の血清の希釈能の尺度であるＣＨ_５０である。例えば古典経路のタンパク質の一つが欠落している場合、ＣＨ_５０検定での溶解は遮断され、欠損タンパク質の機能的力価がゼロに近づき、及び得られるＣＨ_５０はゼロとなる。副経路溶解試験が存在し、ＡＰ_５０と称される。この試験はＣＨ_５０試験よりも感度が低く、スクリーニング試験に用いられる。

レクチン経路の機能欠損を検出するために、例えば古典経路の抗体媒介活性化が偽陽性結果を導くように検出を干渉することがないよう機能的検定をデザインすることが重要である。これは、レクチン経路の活性化剤として用いられるＭＢＬリガンドに対する抗糖質抗体がヒト個体群において共通であるから、及びこれらの抗体はＭＢＬが欠損した血清中の古典経路により補体を活性化する結果とすることができるから重要である。従って、信頼できる機能的レクチン経路検定では、古典補体経路の活性化を妨げるべきである。

レクチン経路欠損の測定のため今まで利用可能であった検定は重大な制限があり、全体の活性化カスケードの機能的な活性を測定することができない。それらは生理学的補体活性化を大きく阻害する人工条件下における検定を用いることにより、外因性の補体（及びＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体の活性のみを測定）又は内因性のＣ４（後の活性化ステップではなく）のいずれかを使用する。

Zimmermann-Nielsen等の論文（Scand.J.Immunol.55:105-110,2002）では、ＭＢＬで誘導されたヒト血漿中補体系の活性化の定量的な検定を開示する。本検定では、補体活性化は自系でのＣ４活性化として測定された。副経路の開始は、血清培養緩衝剤としてイオン強度が高い希釈緩衝剤（１ＭのＮａＣｌ）を用いることにより遮断された。

しかしながら、１ＭのＮａＣｌの存在は、古典経路及びレクチン経路の両方のＣ４活性化を強力に阻止する。従って、本検定はこれら２つの経路を真に区別せず、両方を高度に失効させる。更にこれは本検定において極端に高い血清濃度（１／５）を用いることの必要性を導き、なぜならこのような最適に満たない条件は検出限界に近い強く阻害された補体活性をもたらすからである。

このようにこのZimmermann-Nielsen検定での補体活性化は、生理学的な条件下において測定されず、提供された人工的条件は、異なる起源、及び／又は異なるＭＢＬ遺伝子型由来の血清に対し異なる効果を有するであろう。更にＣ４より後の段階で補体活性化を評価することは、Ｃ４ｂ２ａの形成がイオン強度に強く依存していることから（Laich及びSim,BBA 1544:96-112,2001）、及び高い血清濃度であってもＣ３活性化が１ＭのＮａＣｌ中で完全に検出されないことから、この検定において可能でない。

このように、生理学的条件下でのヒトを含む哺乳動物の補体系のレクチン経路欠損の機能的な確認方法が必要とされる。そのような方法はＣ５ｂ−９の形成までの補体活性の完全なレクチン経路の特異的な検定を可能にするだろう。

本発明の目的は、in vitroでの補体系中の欠損を機能的に測定する方法を確立することであり、それによって上記問題が解決する。

この目的を達成するため、補体系のレクチン経路中の欠損を生理学的条件下で機能的に測定するin vitroでの方法を提供する。当該方法は、以下のステップ
（ａ）哺乳動物の血液、血清、血漿、又はその他の体液のサンプルを提供し；
（ｂ）補体系のＣ１複合体分子の阻害剤と当該サンプルを接触させることにより、サンプル中での古典経路の活性化を妨げ；
（ｃ）サンプル中での副経路の活性化を妨げ；
（ｄ）サンプル中でレクチン経路を活性化し；及び
（ｅ）自系のＣ５ｂ−９複合体の任意の活性化をサンプル中で測定する、
を含んで成る。

本発明の目的は、体液由来のサンプル中における補体系のレクチン経路の欠損を機能的に測定するためのキットを製造することでもある。

当該目的は、以下の個別の品目
（ａ）不活性担体及びレクチン経路を活性化する物質；
（ｂ）Ｃ１複合体の分子の阻害剤を含む希釈剤；及び
（ｃ）自系のＣ５ｂ−９複合体に対する抗体、
を含んで成るキットによって達成される。

本発明によれば、自系補体による補体系レクチン経路（ＬＰ）での欠損を生理学的条件下において機能的に測定するin vitroでの方法を提供する。本発明の方法における哺乳動物の血液、血清、血漿、又はその他の体液のサンプルは、最初に当業界において周知の方法によって提供される。２つの検定されない経路の活性化、すなわち古典経路（ＣＰ）及び副経路（ＡＰ）の活性化はその後サンプル中で妨げられ、そしてレクチン経路が活性化される。最終的に、補体系の任意の活性化がＣ５ｂ−９複合体のレベルで測定される。

本発明の手順は、多数の事実及び問題点を考慮に入れる必要がある。例えば補体系の巨大な多量体タンパク質複合体Ｃ１は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓのサブユニットから構成される。古典経路の活性化は免疫複合体を形成するための特異的抗体（例えばＩｇＭ）による外来抗原との結合により開始される。いずれの免疫グロブリンＦｃ領域も一つのＣ１ｑ結合サイトを有し、いずれのＣ１ｑも活性化されるためには２つの重鎖と結合していなければならない（即ち、架橋する２つのＩｇＧ、又は１のＩｇＭとなる）。

古典補体経路におけるＣ１ｑ認識ユニットは、Ｎ末端での膠原性配列、及びＣ末端でのＣタイプレクチンドメインから成る３量体の複雑な構造を構成するコレクションとして公知のタンパク質ファミリーと強く関連する。Ｃ１ｑはレクチンドメインを持たず、多くの構造的及び機能的特徴を当該コレクションと共有する。血漿中Ｃ１ｑ濃度がおよそ１００μｇ／ｍLに達し、そしてin vitro実験は、ほんのわずかなＣ１ｑのみが完全な補体活性化に十分であることを示す。

本発明の方法において、有効及び特異的な補体阻害剤は、それぞれの補体経路の所望されない活性化を妨ぐために用いられる。少なくともＣ１ｑ阻害剤の２つの異なるタイプは古典経路の活性化を妨げるために用いることができ、それらは球状頭部と結合し及びリガンド認識を干渉するもの、並びに膠原性尾部と結合し及び補体活性酵素、及び／又はＣ１ｑ受容体との相互作用を減弱させるものである。リガンド結合を干渉するそれらの阻害剤は、明らかに古典経路活性化のより早期のステップを阻害する。一方、Ｃ１ｑの球状頭部に結合する分子は、特にこれらのＣ１ｑ結合分子が多量体である場合に、流動相中でＣ１活性化を誘発することができる。

好適には、Ｃ１ｑに対するモノクローナル抗体が、Ｃ１ｑ仲介リガンドとの結合及び補体活性化を効果的に阻害するために用いられる。

Ｃ１ｑの機能的活性を調節できるいくつかの確認された分子の数を、表１に示した。

表１では、天然のＣ１ｑ結合分子、Ｃ１ｑ結合ペプチドのいくつかの系列、及びＣ１ｑ配列由来の競合的阻害剤を示し、古典経路の活性化を妨げる時、補体系のＣ１ｑ阻害のため、又は阻害性のＣ１ｑ結合タンパク質として、それらを本発明による方法において用いることができる。

古典経路のＣ１ｑ結合タンパク質は免疫グロブリンであり、Ｃ１ｑの球状頭部ドメインは、抗原との結合により、或いは凝集又は固定化されて、ＩｇＧ及びＩｇＭの両方と相互作用する。静注で用いるためのヒト免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は、補体活性化を阻害することができ、当該主作用機構は、Ｃ１ｑ並びに可溶性免疫グロブリンにより活性化されたＣ４及びＣ３を除去すると思われる。

免疫グロブリンの他に、多くの他のタンパク質が、Ｃ１ｑに結合できることが確認された。それらの中には、カルレチキュリン（ＣＲＴ）、内皮Ｃ１ｑ受容体、及び球状Ｃ１ｑ受容体（ｇＣｌｑ−Ｒ）といった細胞膜上に存在する（一定の条件及び一定の細胞のタイプにおいて）Ｃ１ｑ結合タンパク質がある。これらのＣ１ｑ結合タンパク質の膜発現フォームはＣ１ｑ仲介細胞活性化に関与し、一方でこれらの分子の可溶性フォームはＣ１ｑ機能を阻害することができる。

カルレチキュリン（ＣＲＴ）は、カルシウム結合タンパク質であり、主に小胞体のルーメン中に存在している。タンパク質配列データは、ＣＲＴが様々なタイプの細胞表面上に存在するＣ１ｑ受容体とおそらく同一であることを示す。ＣＲＴは細胞表面上でα２巨大グロブリン受容体（ＣＤ９１）と結合でき、Ｃ１ｑに結合するＣＲＴの種々のドメイン、即ち、Ｃドメインではなく、隣接するＮドメイン及びＰドメインは区別できる。更に、Ｎ及びＰドメインと一部分が重複するＳドメインは、明白なＣ１ｑ結合も見せる。ＣＲＴのＳドメインはＣ１ｒ及びＣ１ｓに存在するＣＵＢドメインと明らかに類似し、当該ドメインはＣ１ｑの膠原性部分とおそらく相互作用することが示唆される。

従って、Ｃ１ｑ上の異なるサイトがＣＲＴの異なるドメインと相互作用する。天然及び組換えＣＲＴ、並びにＮドメイン、Ｐドメイン、及びＳドメインは、全てＣ１ｑ依存的溶血、並びにＣ１形成を阻害する。Ｃ１ｑ結合ペプチドの多くはＣ１ｑ機能を阻害することができることも確認され、当該ペプチドは、本発明の方法に有用である。それらは、ヒト好中球ペプチド１、天然Ｃ１ｑ結合タンパク質由来ペプチド、及びペプチドライブラリーから選定した合成ペプチドの中にある。

Ｃ１ｑ結合タンパク質（ｇＣ１ｑＲ）、特にＣ１ｑの球状頭部と結合するＣ１ｑ結合タンパク質も用いることができる。ヒト内皮細胞膜、又は多形核白血球膜から単離された天然Ｃ１ｑ受容体（Ｃ１ｑＲ）は、活性Ｃ１の形成を機能的に阻害する。この阻害活性は、Ｃ１ｑ膠原性尾部により取り消されるが、球状頭部によっては取り消されない。類似方法では、大腸菌から単離されたＣ１ｑと結合する可溶性タンパク質は、Ｃ１形成を阻害することができる。

更に、古典経路の活性化はＣ１ｒ又はＣ１ｓに対する抗体により検定中でサンプルと接触させることによって妨げることができる。これに関連してＣ１ｑ機能を調節することができるいくつかの他のＣ１ｑ結合分子を用いることができる。Ｃ１ｑに関連したヒトＢ細胞から産生される血漿プロテオグリカン、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンがそれらの例であり、Ｃ１ｑと結合することができ、及びＣ１形成を阻害することができる。デルマタン硫酸プロテオグリカンデコリン、細胞外マトリックスの組成物、及び関連したプロテオグリカン２糖類は、適した阻害剤でもある。

同様に、古典経路の活性化は、Ｃ１ｒ又はＣ１ｓのペプチド阻害剤を提供することによって妨げることができる。ペントラキシン（pentraxin）ファミリーのいくつかのメンバー、即ち、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＰ化合物、及びペントラキシン３、がＣ１ｑと結合すると記載されている。ペントラキシン３は一定の条件下でＣ１ｑ活性を阻害することができ、コレクションファミリーのメンバーである界面活性剤プロテインＡは、Ｃ１ｑと結合すること、及びその活性を阻害することができる。これはＣ１ｒ及びＣ１ｓの結合、並びに免疫複合体の結合の両方を妨げることによって達成される。

Ｃ１ｑ由来分子によるＣ１ｑの競合的阻害は、古典補体経路阻害のための代替アプローチである。ここではＣ１ｑ分子の機能的に不活性な部分が用いられ、Ｃ１ｑリガンド結合のための競合的阻害剤としてそれぞれが働く。Ｃ１ｑＡ（ｇｈＡ）の球状頭部ドメイン及びＢ鎖（ｇｈＢ）の組換え体が作製され、当該組換え体のそれぞれのドメインは、共にＩｇＧと結合することができるが、ＢドメインはＡドメインよりもより効力がある。Ｃ１ｑ組換え体のＢ鎖が界面活性剤プロテインＤの頸部領域を用いることにより３量体化された時、よりよい活性が得られる。

ヒト好中球ペプチド１（ＨＮＰ−１）といった阻害性Ｃ１ｑ結合低分子も用いることができ、それはＣ１ｑと結合、及び古典補体経路を阻害することができる。当該ペプチドは、低分子陽イオンペプチドのαデフェンシン（defensin）ファミリーに属し、アズール好中球顆粒中（azurophilic neutrophil granules）に存在している。そのようなＣ１ｒ又はＣ１ｓの阻害ペプチドは、低コストで十分量を得られるため化学合成的に製造されることが好ましい。

いくつかのＣ１ｑ結合ペプチドは、Ｃ１ｑ結合タンパク質のアミノ酸配列の基礎を確認した。９２の一部分が重複するペプチドを使用することによって、ＣＲＴのＮ及びＰ領域中のいくつかのＣ１ｑ結合サイトが確認された。これらのペプチドの多くはヒト血清中の古典経路活性化、及びＣ１ｑのＩｇＧへの結合を阻害することができる。これらのペプチドはＩｇＧドメイン中のＣＨ２にあるＣ１ｑのための結合サイトと似ているモチーフ（ExKxKx）によって特徴づけられる。

これに関連して、ＩｇＧから直接的に由来するペプチド（ExKxKxモチーフを含む７量体ペプチド（即ち、AEAKAKA）、同じモチーフに関係したＩｇＧ１から由来する１１量体ペプチド（VQVHNAKTKPR）、及び２量体ペプチド（WY,表１参照）といった）はＣ１ｑを阻害することが記載されている。これらのペプチドは、いくつかのin vitro検定で古典補体経路の活性化を阻害することができた。しかしながら、ＷＹペプチドは副補体経路をも阻害する。

ヒトＣ１ｑと結合するファージを基礎とするファージディスプレイペプチドライブラリーから選定した４２ペプチド中の２０ペプチドが、ヒト血清中での古典補体経路を阻害できることが確認された。これらの２０ペプチドの中での１３は、溶血性検定において著しく古典経路及び副経路を阻害することができたのに反し、７ペプチドは特異的に古典経路を阻害した。これらのペプチドの中からペプチド２Ｊ（CEGPFGPRHDLTFCW）が選定された。ペプチド２ＪはＣ１ｑ溶血機能の強力な阻害剤である。ＩｇＧモチーフと類似したペプチドであるペプチド２Ｊは、Ｃ１ｑの球状頭部と結合し、Ｃ１ｑのＩｇＧへの結合を阻害する。更にペプチド２Ｊはヒト、霊長類及びげっ歯動物由来のＣ１ｑを阻害する。

他の選定された古典経路を阻害するための有用なペプチドは、CEGPFGPRHDLTFCW, CRWDGSWGEVRC,CMWVRMWGDVNC,CFWAGKFGLGTC,CKDRWVVEERCC,及びCWNRFKKMDRCである。Ｃ１ｑ結合のための競合剤として働き、そしてＣ１ｑＢ鎖から由来するいくつかのその他のペプチド（例えばペプチドＣＢＰ２（LEQGENVFLQATLL））も使用することができる。

Ｃ１阻害タンパク質は、認識段階での補体統制に関する重要な分子であり、活性化されたＣ１複合体のセリンプロテアーゼを阻害する。このように、Ｃ１阻害の効能を有すものはいずれも古典経路の活性化を妨げるために用いることができる。

更に、Ｃ１ｒ又はＣ１ｓのプロテアーゼ阻害剤、例えばセリンプロテアーゼの公知阻害剤を用いることができる。これらの阻害剤はレクチン経路の活性化が妨げられた時に使用することもできる。

マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、Ｃ１との類似点を見せる大きなプロ酵素複合体に属する血清中のＣタイプレクチンである。Ｃ１ｑと同様、ＭＢＬは、３量体サブユニットの多量体分子である。ＭＢＬの３量体は、膠原性尾部領域及び糖質認識ドメインを持つ３つの同一の鎖から成る。血清中では、ＭＢＬはＭＢＬ結合セリンプロテアーゼ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、及びＭＡＳＰ−３と結合する。活性化ＭＡＳＰ−２はＣ４及びＣ２を活性化することができることが説明され、それはＣ３コンバーターゼＣ４ｂ２aの形成、及びその後のＣ３活性化に帰着する。ＭＡＳＰ酵素はＣ１ｒ及びＣ１ｓと相同である。

副経路の活性化を妨げるための簡単で効果的な方法はサンプルを希釈することである。１ＭのＮａＣｌを血清希釈緩衝剤へ付加することによりＣ１ｑ結合及びＣＰ活性化を完全に妨げることができるのに反し、ＭＢＬの結合を進行させることができる。しかしながら高いイオン強度の阻害効果を考慮に入れるべきである。

副経路において、セリンプロテアーゼ因子ＤはＣ３コンバーターゼを産生し、（仮に不活性化されていない場合）Ｃ３化合物への作用が続き、それの全体的な枯渇を引き起こすであろう。このようにして副経路の活性化は、検定において補体系の因子Ｄのプロテアーゼ阻害剤、又はそれに対する抗体とサンプルを接触させることにより妨げることができる。

レクチン経路は、侵入する病原体上の糖質の成分に特異的であるタンパク質のコレクチンファミリーメンバーとの結合により活性化されることが知られている。これらはその後、直接的に古典経路の化合物を活性化し、特異的な抗体の必要性が回避される。コレクチンファミリーのメンバーの一つはマンナンに結合したレクチン（ＭＢＬ）であり、血清中で見出され、バクテリアの末端マンノース基へ結合する。

従って、レクチン経路は、ＭＢＬが結合した高分子量又は低分子量の糖質とサンプルを接触させることにより活性化され得る。高分子量マンナンの例は、グルコマンナン及びガラクトマンナンである。低分子量のＭＢＬが結合した糖質は、好適にはマンノース又はフコースである。レクチン経路は共役糖質合成物質又は微生物多糖類との結合によっても誘発され得る。

血清中のＮ−アセチルグルコサミンレクチンであるフィコリンは、レクチン経路を活性化する能力を有すレクチンであると考えられているため、当該レクチン経路は検定においてフィコリン結合糖質を供給することによっても活性化され得る。

しかしながら一定の病原体は、特異的な抗体と相互作用する必要がなくても古典経路を直接的に活性化する能力を有している。活性化分子には、酵母の細胞壁、バクテリアのリポ多糖類（ＬＰＳ）、及びいくつかのウィルスのキャプシドが含まれる。同様に免疫グロブリンの集合体、例えばＩｇＡ又はＩｇＥは、副補体経路を活性化することが知られている。このように一の経路の活性化を妨げる場合、その経路自体を活性化するような活性化剤は本発明の方法に用いるべきでない。

サンプル中の補体経路の任意の活性化はそのＣ４からＣ９の補体タンパク質の活性化を確立することにより後に測定することができる。好適には、末端補体複合体ＳＣ５ｂ−９は、いずれかの経路によって補体活性化が発生した時に形成される膜攻撃複合体（ＭＡＣ，Ｃ５ｂ−９）であるため測定される。当該測定は、自系で形成されたＣ５ｂ―９複合体に対する抗体を検定に提供することによって達成され得る。

本発明の方法において、Ｃ５ｂ−９複合体に対する抗体は複合体全体を認識し、それらの個々の部分については認識しないことに注意すべきである。

補体機能検定では、活性化物質のある一定の密度が必要とされる。例として抗体は、補体の活性化のために、例えば、抗原、又はプラスチック材料に固定されていなければならない。同様に補体の任意の活性化がＣ４からＣ９の任意の補体タンパク質；又は形成された任意のＣ５ｂ−９複合体と、活性化面との結合を測定することにより行われるべきである。

従って、不活性担体上を活性化物質で覆った（固定した）本発明によるキットは好ましい。担体の表面上の覆いは慣例技術を用いることによって達成され得る。例えば活性化物質は、ビーズ又はマトリックス／ゲルとしての担体に共有結合性カップリングにより固定され得る。

レクチン経路を活性化する物質を付着させるために適した担体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換されたポリスチレン（例えばアミノ化又はカルボキシル化）、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリビニルクロライド等といった合成ポリマー担体、ガラス、アガロース、ニトロセルロース等である。担体はビーズ、ストリップ、又はマイクロタイターウェルのフォームでよい。好適には、ＥＬＩＳＡプレートを用いる。しかしながら、他の担体も使用できる。

発明の方法を実施するためのキットには、以下の別個のアイテム、
（ａ）不活性担体及びレクチン経路を活性化する物質；
（ｂ）Ｃ１複合体の分子の阻害剤を含んで成る希釈剤；
（ｄ）Ｃ５ｂ−９複合体に対する抗体；
（ｅ）Ｃ５ｂ−９複合体に対する抗体に対してラベル化された坑−抗体；
（ｆ）酵素基質；
（ｇ）洗浄液；
（ｈ）正常の体液；及び
（ｉ）不活性化された正常の体液、
を含む。

好適には、発明の方法を実施する際、当該キットはＥＬＩＳＡ分析において用いられる。そのようなキットは、マニュアルで、又はロボットの中で用いられ得る。フレキシブルに自動化されたマルチウェルプレート（multi-well plates）分析のためのソフトウェアシステムも利用され得る。

補体系のレクチン経路の欠損が疑われる場合、患者から得られた体液、普通血清は、本発明の方法によって分析され得る。血清、ネガティブ及びポジティブコントロールは、希釈剤によって同一の方法で全て希釈される。

希釈剤は、古典経路を阻害するためにＣ１複合体の分子の阻害剤を含み、好適にはＣ１ｑ阻害剤を含む。上記に述べた他の阻害剤も用いることができる。

希釈剤は、様々な塩類及び緩衝剤を含む緩衝水性媒体で形成され得る。好適には、塩類はハロゲン化されたアルカリ及びアルカリ土類、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は硫酸ナトリウムである。種々のそのような緩衝剤（その目的のために生理学的に許容される緩衝剤である限り、クエン酸塩、リン酸塩、ヘペス、トリス等）が用いられてよい。当該希釈剤は、生理学的なｐＨ及び生理学的なイオン強度を有すべきである。好適にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が用いられる。当該希釈剤は、カルシウム及びマグネシウムイオンを含有すべきである。

ネガティブコントロールとは、不活性化された正常の体液である。この場合、不活性化された正常の体液とは、加熱不活性化されたヒト血清である。当該ネガティブコントロールは、レクチン経路だけではなく、全補体系が完全に消失する本発明の方法で得ることができる最小限の可能なシグナルを規定する。

ポジティブコントロールとは、補体が正常レベルにあるヒトからの血清サンプルである。そのようなコントロールは、Ｃ５ｂ−９複合体の活性化をサンプル中において測定する時、シグナルが妥当であるか否かを評価するためのキット中に含まれる。

ポジティブコントロールは、本法の定量的測定のために用いられる検量曲線のための正常の血清の一連の希釈物（検定物質）でもよい。そのような検定物質は標準数値を選定するために用いることができ、それを介して異なる患者との比較、又は患者の治療の追試が可能となる。

試験すべき血清、並びにポジティブ及びネガティブコントロールの希釈の後、これらの液体は、不活性担体及びレクチン経路を活性化する物質と接触させる。

本発明の限定でない実施例の態様において、担体はマンナンで覆われたストリップの形状にある。希釈された血清、ネガティブ及びポジティブコントロールを有するそれぞれのストリップは３７℃で３０分培養され、それによって補体を活性化し、及び未端複合体が形成される。

ストリップは、その後洗浄液で洗浄し、本態様においては洗浄液は希釈剤の緩衝成分とすべきである。

Ｃ５ｂ−９複合体に対する抗体に対するラベルされたマウスの抗−抗体の希釈緩衝溶液は、その後当該ストリップに付加され、更に３０分間培養される。当該抗−抗体は酵素ラベル、又はいくつかの他の方法（例えば蛍光ラベルといった）でラベルされ得る。好適なラベルは酵素である。モノクローナル抗体も好適な抗体であり、モノクローナル抗−マウス抗体が最適である。

Ｃ５ｂ−９複合体に対する抗体は、蛍光又は酵素ラベルのように（好適には酵素によるラベル）シグナルを発生するために直接的にラベルすることもでき、抗−抗体のステップは省略する。

ストリップは、再び洗浄され、適した反応緩衝剤中の酵素基質がその後付加される。酵素ラベルされた抗−マウス抗体、及び酵素基質との反応は、３０分間進行することができ、そして反応生成物の色が分光光度計で測定され、試験血清中でポジティブコントロール血清を参照し、低い吸収と一致すれば欠損が測定される。
実施例

本発明の方法をここに更に説明するが、以下の実施例に制限されない。

原料及び方法
ヒト原料。
ヒト血清は７０人の健常成人ボランティアから採取し、少量ずつ速やかに−８０℃で凍結した。オランダの血液バンクLeiden-Haaglanden,Leidenから以前の健常人ドナーからの血漿を得た。ＩｇＭタイプのKahler’s病患者からの血漿は、血漿瀉血治療後に利用できる状態になるものが得られた。

抗−Ｃ１ｑ及び抗−ＭＢＬ抗体。
Ｃ１ｑに対するモノクローナル抗体は、以前に説明されている通りマウスで製造した（Hoekzema R.,等.Mol.Immunol.25,485-494,1988）。抗−C1q mAb 2204(IgG1)はＣ１ｑの球状頭部ドメインに対するものであり、並びにＩｇＧへのＣ１ｑの結合を阻害すること及びＣ１ｑ依存性溶血を阻害することができる（Roos A.,等.,J. Immunol. 167,7052-7059,2001）。ｍＡｂ2204の精製のため、γグロブンリンを５０％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いることによって腹水から沈殿させた。当該沈殿は２ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．８）で分離し、そしてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（pharmacia, Uppsala,スウェーデン）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。タンパク質は塩濃度勾配を用いて溶出し、そしてマウスＩｇＧを１ＭのＮａＣｌの存在下においてＣ１ｑで覆ったＥＬＩＳＡプレートへ結合させて提示されたフラクションを貯蔵し、濃縮し、ＰＢＳで分離し、及び−８０℃で保存した。

ポリクローナル抗−Ｃ１ｑ抗体はウサギで作製した。ニュージーランド白ウサギは、完全なFreundsアジュバントに溶解した１８０μｇのＣ１ｑにより免疫化され（週１回、４週間）、１／２５，０００を超えるＣ１ｑで覆ったＥＬＩＳＡプレート上で陽性力価を有する抗血清をもたらした。ＩｇＧは、４０％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いることによってウサギ血清から沈殿させ、上記の通りＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを用いることによって精製した。

ウサギＩｇＧ抗−Ｃ１ｑの精製を根幹として、パパインを用いることによりＦａｂフラグメントを作製した。それゆえにＩｇＧは１０ｍＭのＬシステイン及び２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝剤で分離した。続けてマーキュリパパイン（シグマ製）を付加し（１重量％のタンパク質含有量）、引き続き３７℃で１６時間培養した。ＰＢＳに対する透析後、サンプルをセファロース結合化プロテインＧ（ファルマシア、Uppsala、スウェーデン製）に加え、そしてＦａｂフラグメントを含む分画にかけたフラクションを貯蔵し、濃縮し、及び実験のために用いた。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では、およそ４５ＫＤでの顕著なバンドが見られた。

ヒトＭＢＬのレクチンドメインに対するマウスｍＡｂ（mAb 3F8）は、Dr.G.L.Stahl (Harvard Medical School,ボストン、マサチューセッツ、米)の好意により提供された（Collard C.C.,等.,Am.J.Pathol.156,1549-1556,2000）。

ヒトＣ１ｑ及びＣ１ｑを枯渇させた血清の調整。
ヒトＣ１ｑを、全く以前に説明された通りにヒトドナーの血漿から単離し、−８０℃で保存した（Roos A.,等.,J.Immunol.167,7052-7059,2001）。単離されたＣ１ｑは、Ｃ１ｑが枯渇したヒト血清により、誘導された抗体で覆われた赤血球の溶解を完全に回復させることができた。

Ｃ１ｑが枯渇した血清の調整のため、希釈されていない正常のヒトＥＤＴＡ血漿（ＭＢＬ／ＡＡ遺伝子型のドナーから得られた）を、ウサギＩｇＧ抗−ヒトＣ１ｑを結合させたバイオゲルＡ５（Biorad製）から成るカラムにかけた。当該カラムは、10mMのＥＤＴＡを含むベロナールで緩衝された食塩水（VBS;1.8mMのＮａ−5,5-ジエチルバルビタール、0.2mMの5,5-ジエチルバルビツル酸、145mM NaCl）を用いて洗浄した。精製したＣ１ｑの存在下又は不存在下におけるＣ１ｑ依存性溶血性検定においてフラクションを試験した。Ｃ１ｑの存在下において完全な赤血球溶解を見せるが、Ｃ１ｑ不存在下において見せないフラクションを蓄え、及び元の容量になるまで濃縮した。カルシウム再添加の後、Ｃ１ｑが枯渇した血清を−８０℃で貯蔵した。

ヒトＩｇＭの単離。
ＩｇＭパラプロテインを含む血漿は、２ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に対し透析した。沈殿したタンパク質は遠心分離により回収し、ＰＢＳ中に溶解し、トリス／ＥＤＴＡ緩衝剤に対し透析し（１０ｍＭトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８及び５．０ｍｓ伝導性）、そしてＤＥＡＥ Sephacelを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。塩濃度勾配によって溶出したＩｇＭは、貯蔵され、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（６．０ｍＳ、ｐＨ７．０）に対し透析し、ＣＭ−Ｃ−５０Sephadex陰イオン交換カラム（ファルマシア製）にかけた。塩濃度勾配による溶出に引き続き、ＩｇＧを含むフラクションを、貯蔵し、濃縮し、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ３００ゲルろ過カラムへかけた。ＩｇＭを含むピークフラクション及び遊離ＩｇＧを貯蔵し、濃縮し、そして−８０℃で保存した。

比較例

高い塩濃度は、補体システムに負に影響し、いくつかの反応は減弱した。

血清は、図１に示した濃度でカルシウム、マグネシウム、及びＮａＣｌを含む緩衝剤においてマンナンで覆われたマイクロタイタープレートのウェル中で培養し、そして活性化されたＣ４（Ａ）及びＣ３（Ｂ）をＥＬＩＳＡ法により検定した。

Ｃ４（Ａ）活性化の完全な阻害、及びＣ３（Ｂ）活性化の完全な阻害は、高い塩濃度によって得られた。従って、高いイオン強度はおそらく変性によってＣ３を阻害し、それによってＣ４後の活性化のいかなる測定も妨げる。

ＥＬＩＳＡによる機能的なレクチン経路活性検定
レクチン経路の機能的活性を、リガンドとして固定化マンナンを用いるＥＬＩＳＡにより検定した。マンナン（シグマ製、サッカロミセス属・セレンビシェ（cerevisiae）;M7504）を得て、ＰＢＳ（10mg/mL）中に溶解し、−２０℃で貯蔵した。コーティング緩衝剤（１００ｍM、Ｎａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中で１６時間室温、又は２時間３７℃で、Nunc Maxisorb plates(Nunc,Roskilde,デンマーク)にマンナン（100μg／mL）を覆った。それぞれのステップが終了後、０．０５％Tween２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した。残留物が結合したサイトは、１％ＢＳＡを含むＰＢＳと共に１時間３７℃で培養することにより遮断した。血清サンプルは、別のやり方が示されていない限り、Ｃ１ｑ阻害剤としてｍＡｂ２２０４（２０μg／mL）の存在下において、ＧＶＢ＋＋（０．５mMのＭｇＣｌ_２を含むＶＢＳ、２mMのＣａＣｌ_２、０．０５％Tween２０、及び０．１％ゼラチン；ｐＨ７．５）中で希釈した。この混合物は、プレートへ付加する前に氷上で１５分間プレインキュベートした。当該プレートは、その後連続的に１時間４℃及び１時間３７℃で培養し、引き続き洗浄した。補体結合は、マウスｍＡｂを用いて検出した。製造業者によって提供された指示書に従い、ジゴキシゲニンー３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプリン酸―Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドエステル（ベーリンガーマンハイム製、マンハイム、独）を使用し、マウスｍＡｂが結合したジゴキシゲニン（dig）を用いることにより補体結合を検出した。Ｃ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３及びＣ５ｂ−９の検出は、それぞれＤｒ．Ｔ.Ｅ.Mollnes（オスロ、ノルウェー）の好意によって提供されたｍＡｂ２２１４（抗−ヒトＣ１ｑ）、ｍＡｂＣ４―４ａ（抗−ヒトＣ４ｄ）、ＲＦＫ２２（抗ヒトＣ３）、及びＡＥ１１（抗−Ｃ５ｂ−９）を用いて実施した。Digを結合させた羊抗−マウス抗体（Ｆａｂフラグメント）を用いて、引き続きHRPを結合させた羊抗−dig抗体を用いてｍＡｂの結合を検出した（Ｆａｂフラグメント、共にベーリンガーマンハイム製）。全ての検出抗体は、１％ＢＳＡ及び０．０５％Tween20を含むＰＢＳ中で希釈した。ＨＲＰの酵素活性は、２，２’−アジノ−ビス（３-エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（シグマ製； 0.1Mクエン酸塩／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝剤、ｐＨ４．２において2.5mg/mL）で、０．０１％Ｈ_２Ｏ_２の存在下において室温で３０から６０分培養した後に検出した。４１５ｎｍでのＯＤは、マイクロプレートバイオキネティックスリーダー（EL312e、Biotek Instruments製,Winooski,Vermont,米）を用いることにより測定した。

ヒト血清における抗マンナン抗体の定量的測定。
ヒト血清における抗マンナン抗体の定量的測定のために、ＥＬＩＳＡプレートをマンナンで覆い、そしてＰＢＳ中の１％ＢＳＡにより遮断した。血清サンプルはＩｇＧ抗−マンナンＡｂの検出のために１／１００、ＩｇＡ抗−マンナンＡｂの検出のために１／１０、及びＩｇＭ抗−マンナンＡｂの検出のために１／４０に、別の方法が示されていない限り、それぞれ希釈した。定量的測定のため、貯蔵されたヒトＩｇＧ（48mg/mL IgG）、貯蔵されたヒトＩｇＡ（41mg/mL IgA）、貯蔵されたヒトＩｇＭ（35mg/mL IgM）（Biotest Pharma GmbH,Dreieich,独の好意によって提供された）が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ抗−マンナン抗体の検出のため、それぞれ標準品として用いられた。これらの調整における抗−マンナン抗体の濃縮は、１０００Ｕ／ｍＬに任意に設定した。全てのサンプルは０．０５％Tween20及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈した。抗体結合は、ビオチン化されたＨＢ４３（マウスｍＡｂ抗−ヒトＩｇＧ）、ビオチン化されたＨＢ５７（マウスｍＡｂ抗−ヒトＩｇＭ）、及びｄｉｇを結合させた４Ｅ８（マウスｍＡｂ抗−ヒトＩｇＡ）を用いることにより検出され、それぞれに引き続きＨＲＰを結合させたストレプトアビジン、又はＨＲＰを結合させた羊抗−dig抗体（共にベーリンガー製）のいずれかを用いることによって検出された。

マンナンは、ＭＢＬの主要なリガンドであり、補体のＬＰを効果的に活性化することができる。しかしながらヒト血清は、おそらく以前の微生物との接触での結果物である抗−糖質抗体を含む。そのような抗−糖質抗体はマンナンと結合するかもしれず、及び結果物である免疫複合体は古典補体経路活性化経由でマンナンによる補体活性化に寄与するかもしれない（Petersen S.V.,等.,J.Immunol.Methods257,107-116,2001）。マンナン結合抗体は、ＥＬＩＳＡによる検定でヒト血清中において明確に検出できる（図２）。固定化されたマンナン上での貯蔵されたヒトＩｇＧ（図２Ａ）、ＩｇＡ（図２Ｂ）、及びＩｇＭ（図２Ｃ）の培養は、それぞれ、アイソタイプに特異的なｍＡｂにより検出されたような、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭの用量依存的結合という結果となる。コントロールとして、固定化されたＢＳＡ上で並行培養を実施し、貯蔵されたＩｇの低い結合、又は検出されない目立たない結合という結果を得た。マンナンで覆われたプレート上での健常人ドナーからの３つの血清培養は、３つ全ての血清に強い用量依存的ＩｇＧ結合という結果を得た。ドナー１のＩｇＡ及びＩｇＭ抗マンナンＡｂは検出できず、ドナー２からの血清は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ抗−マンナン抗体を含んだが、一方ドナー３では、多少のＩｇＭ結合が観察されたが、ＩｇＡ結合はなかった（図２Ａ−Ｃ）。７０人の健常人ドナーからの血清中の抗−マンナン抗体の定量は図２Ｄにある。ＩｇＧ及びＩｇＭ抗−マンナンＡｂは、個体間で大きな変動あり、ほぼ全てのドナーに存在したが、一方ＩｇＡ抗−マンナンＡｂは、ドナーの６３％で検出された。抗マンナン抗体の３つの主要なアイソタイプ間、又は抗−マンナン抗体及びＭＢＬ濃度間に重大な関連性は観察されなかった（示されなかった）。

Ｃ１ｑ−阻害性Ａｂの存在下におけるレクチン経路の機能評価
ＬＰ及びＣＰは共にカルシウム依存性であり、Ｃ４の活性化を誘導する。両方の経路の識別は、ＬＰ又はＣＰのいずれかの特異的な活性化を引き起こす特異的なリガンドの選定によりなし得る。ヒト血清中の抗−マンナンＡｂの存在を考慮すると、マンナンはＭＢＬ経由のＬＰ、及び抗−マンナンＡｂ経由のＣＰの両方を活性化するようだ。従って、固定化マンナンによるＬＰの活性化だけを才能とするために、阻害的抗−Ｃ１ｑ抗体を用いることによりＣＰの活性化を阻害する戦略を開発した。

抗−Ｃ１ｑ抗体は、ＣＰの特異的な活性化剤として固定化ＩｇＭを用いて、それらの補体ＣＰ阻害能について試験された。固定化ＩｇＭ上での１％標準ヒト血清（ＮＨＳ）の培養は、Ｃ４の堆積を引き起こし、ウサギ抗−Ｃ１ｑ抗体調整から調整された抗Ｃ１ｑ ｍＡｂ ２２０４、ウサギＩｇＧ抗−Ｃ１ｑ抗体、及びＦａｂフラグメントによって、用量依存的に阻害することができた。５μｇ／ｍＬの抗体が適用された時、完全な阻害に達した。それに比べて、免疫化されていないウサギから調整されたウサギＩｇＧは、ＣＰ経由でのＣ４活性化への効力を有さなかった。これらの抗体は、固定化マンナンにより誘導された補体活性化へのそれらの影響について試験された。マンナン上のＮＨＳの培養は、１％の血清濃度での最大限の活性化とともに用量依存的なＣ４の堆積を引き起こす。ｍＡｂ２２０４、Ｆａｂ抗−Ｃ１ｑフラグメント、又はコントロールとして標準のウサギＩｇＧのある一定の定められた濃度での付加は、Ｃ４活性化に軽微な阻害的効果を有した。それに比べて、ウサギＩｇＧ抗−Ｃ１ｑＡｂは、マンナンによるＣ４活性化の完全な阻害を引き起こし、それはおそらくＣ１ｑ−抗−Ｃ１ｑ複合体による補体消費が原因する。これらのデータは、Ｃ１ｑ−阻害的抗体がＣＰ活性化を完全に遮断することができる一方、マンナンで誘導されるＬＰ活性化は、Ｃ１ｑに依存しない方法で進行できることを示す。

マンナン及びＩｇＭによる補体活性化におけるＣ１ｑの役割を更に調べるため、ＮＨＳ中のＣ１ｑを枯渇させた。以前に説明されたように（Petersen S.V.,等J.Immunol .Methods257,107-116,2001）ＮＨＳからのＣ１ｑの枯渇は、固定化ＩｇＭ（図３Ａ）によるＣ４活性化の完全な阻害となる一方、固定化マンナンによるＣ４活性化はＣ１ｑの枯渇により軽微に阻害された（図３Ｂ）。精製されたＣ１ｑによるＣ１ｑが枯渇した血清の再構成は、ＩｇＭによるＣ４活性化の完全な回復という結果となった（図３Ｃ）。それに比べてマンナンによるＣ４活性化は、Ｃ１ｑが枯渇した血清への精製Ｃ１ｑの付加により、おそらくＣ１ｑと共に単離させる阻害的タンパク質の存在のために、軽微に阻害された。ＩｇＭ及びマンナンによるＣ４活性化へのＣ１ｑ及びＭＢＬの寄与は、更にＣ１ｑ及びＭＢＬに対するｍＡｂ遮断を用いることによりそれぞれ研究された（図３Ｄ）。ＩｇＭで覆われたプレート上でのＣ４活性化は、ｍＡｂ抗−Ｃ１ｑによって完全に阻害され、抗−ＭＢＬｍＡｂを遮断することによる阻害は発生しなかった。それに比べて、マンナンにより誘導されるＣ４活性化は、ｍＡｂ抗−Ｃ１ｑにより部分的に阻害され、ｍＡｂ抗−ＭＢＬにより強力に阻害された。マンナンで誘導されたＣ４活性化の完全な阻害は、ｍＡｂ抗−Ｃ１ｑ及びｍＡｂ抗−ＭＢＬの組み合わせを用いた場合に達成された。これらのデータを総合すると、ＩｇＭで仲介されたＣ４活性化は、完全にＣ１ｑに依存し、ＭＢＬは携わらないことを示す。それに比べて、マンナンで誘導されるＣ４活性化は、主にＬＰにより仲介されるが、ＣＰの比較的重要でない寄与も含む。後者のＣＰの寄与は、Ｃ１ｑを遮断するＡｂによって阻害することができ、このようにしてＬＰのみの活性化に至る。

マンナンによる補体活性化における古典経路及びレクチン経路間の協力の証明
抗−マンナン抗体の補体活性能は、正常のヒト血漿由来の精製ＩｇＧ及びＩｇＭを用いて機能的な実験において更に検定された。抗体は、希釈緩衝剤として１％ＢＳＡ、０．０５％Tween20、及び１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いてマンナンで覆ったプレート上で培養した。洗浄後、ＭＢＬが欠損した血清（ｍＡｂ２２０４の存在下、又は不存在下において、１／１００に希釈）と共にプレートを培養し、及びＣ４の活性化を上記の通り検定した。ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４１５による測定として、ｍＡｂ２２０４抗−Ｃ１ｑの不存在下、又は存在下でのＣ４枯渇が図４に示された。精製されたＩｇＧ又はＩｇＭとマンナンで覆われたプレートの前培養は、ＭＢＬが欠損した血清（ＢＢ遺伝子型）の付加でマンナン上のＣ４の用量依存的な堆積を誘導し、一方、補体活性化は当該血清のみでは検出できなかった。抗−マンナンＡｂにより引き起こさせるＣ４活性化は、ＭＢＬが欠損した血清中におけるＣ１ｑ−阻害性Ａｂの付加により完全に阻害され、マンナン結合性ＩｇＧ及びＩｇＭは、機能的ＭＢＬが存在しない中で、補体の古典経路の活性化によるＭＢＬが欠損した血清中におけるマンナンによって補体活性化を回復させ得ることを明確に示している。

ＥＬＩＳＡによる機能的古典経路活性の検定
古典経路の機能的な活性のためのプロトコールは、実施例１のＬＰ検定のためのプロトコールと類似するが、重要な改変を伴う。ＣＰ活性化のためのリガンドとして、ヒトＩｇＭを、２μｇ／ｍＬで覆った。過剰の結合サイトを遮断した後、ＧＶＢ＋＋中で希釈した血清サンプルをプレートへ付加し、１時間３７℃で培養した。補体結合は、Ｃ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９に対するdigが結合したｍＡｂを用いて検定し、ＨＲＰが結合した羊抗dig抗体を用いてのｍＡｂ結合の検出を続けた。

ＣＰ及びＬＰ経由の補体活性化及びＣ５ｂ−９形成
ＣＰ及びＬＰ経由で活性化された特異的な補体構成要素の結合を検出するため、ｍＡｂを用いることにより、補体活性化カスケードはそれぞれについて更に研究された。固定化ＩｇＭでのＮＨＳの培養は、プレートに対してＣ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の用量依存的堆積という結果となった（図５Ａ）。Ｃ１ｑ結合、及びＩｇＭによって引き起こされる後の補体活性化は、ｍＡｂ２２０４によって完全に阻害することができた。固定化マンナン上でのＮＨＳの培養は、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の用量依存的結合という結果となったが、一方Ｃ１ｑの結合は殆ど検出することができなかった（図５Ｂ）。マンナンによる補体活性化は、ｍＡｂ２２０４の付加によって軽微に阻害されるだけであった。従って、ｍＡｂ２２０４の血清への付加は、ＣＰのいかなる干渉もなく、リガンドとしてマンナンを用いることによるＬＰ活性化の特異的な検出をもたらす。

ＥＬＩＳＡによる機能的副経路活性の検定
副経路の機能的活性のためのプロトコールは、実施例５のＬＰ検定のためのプロトコールと類似するが、重要な改変を伴う。ＡＰ活性化のためのリガンドとして、ＬＰＳが１０μｇ／ｍＬで覆われた。サルモネラチフス菌由来のＬＰＳは、シグマから入手し（Ｌ−６３８６）、ＰＢＳ中で１．６ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、−２０℃で貯蔵した。プレートはＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いることによって遮断した。血清サンプルはＧＶＢ／ＭｇＥＧＴＡ（１０ｍＭのＥＧＴＡを含むＶＢＳ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５％Tween20、及び０．１％ゼラチン；ｐＨ７．５）及びプレート中で１時間３７℃で培養した。補体はＣ４及びＣ３に対するdigが結合したｍＡｂを用いることにより検定し、引き続きHRPが結合した羊抗−dig抗体を用いることにより、ｍＡｂ結合を検出した。

副経路の活性化
１の検定システムにおいて全ての補体活性化経路の検出が可能であるため、ＥＬＩＳＡシステムにおける副経路の活性化についても研究された。ＬＰ及びＣＰに比べて、ＡＰの活性化はカルシウムに依存的でない。従って、カルシウムが存在しない緩衝剤が用いられ、このようにして、ＣＰ及びＬＰのかかわりが排除された。以前に説明された通り（Fredrikson G.N.,等.,J.Immunol.Methods166,263-270,1993）、ＬＰＳで覆われたプレート上のＥＧＴＡ及びＭｇイオンを含む緩衝剤中でのＮＨＳの培養は、用量依存的なＣ３の堆積という結果となった（図６）。Ｃ３のいくつかの活性化は、ＡＰの自然に起こる活性化のために最適であるＢＳＡのみにより覆われたプレート上でも観察された。同一の条件を使用することによって、ＮＨＳがマンナンで覆われたプレート上で培養された時、驚くことに、Ｃ３の強力な活性化も観察され、マンナンはＡＰの活性化も支持するかもしれないことが示唆された。Ｃ３の検出は、補体の出所の中でＥＤＴＡが存在した時、表面に出ないレベルまで減少した（示されなかった）。ＡＰ依存性機構から期待されるのは、カルシウムが存在しない緩衝剤においてＣ３活性化はＬＰ経由によるカルシウム含有緩衝剤中のマンナンによるＣ３活性化のために必要とされる約１０倍高い血清濃度が必要とされた（図６と図５ｂとの比較）。Ｃ３活性化はカルシウムが存在しない緩衝剤中で明確に検出されないにもかかわらず、Ｃ４の活性化は確立されず（図６）、これらの条件下におけるＣ３の活性化は、ＭＢＬの結合及びＣ４活性化に依存しない。

カルシウム、マグネシウム、及びＮａＣｌを含む緩衝剤中において、マンナンで覆ったプレート上で培養したヒト血清のＥＬＩＳＡによる検定としてＣ４（Ａ）及びＣ３（Ｂ）の活性化を示す。 ヒト血清中における抗−マンナン−抗体；Ａ−Ｃ：３人の異なる健常人ドナーからの異なる濃度でのヒト血清を、マンナン（べた塗り記号, 実線）又はＢＳＡ（白抜き, 破線）のいずれかで覆われたプレート上で培養した。ＩｇＧ（Ａ）、ＩｇＡ（Ｂ）、又はＩｇＭ（Ｃ）の結合体を検出した。ポジティブコントロールとして、プレートは指示された通り、貯蔵された免疫グロブリンにより培養した。；Ｄ：３つの主要なＩｇクラスの抗−マンナン抗体を、健常人ドナー血清（Ｎ＝７０）中で定量した。実線は中央値を示し、破線は検出限界を示す。 ヒト血清中における抗−マンナン−抗体；Ａ−Ｃ：３人の異なる健常人ドナーからの異なる濃度でのヒト血清を、マンナン（べた塗り記号, 実線）又はＢＳＡ（白抜き, 破線）のいずれかで覆われたプレート上で培養した。ＩｇＧ（Ａ）、ＩｇＡ（Ｂ）、又はＩｇＭ（Ｃ）の結合体を検出した。ポジティブコントロールとして、プレートは指示された通り、貯蔵された免疫グロブリンにより培養した。；Ｄ：３つの主要なＩｇクラスの抗−マンナン抗体を、健常人ドナー血清（Ｎ＝７０）中で定量した。実線は中央値を示し、破線は検出限界を示す。 ＣＰ及びＬＰの活性におけるＣ１ｑの役割を示す；Ａ，Ｂ：ＧＶＢ＋＋中で希釈された標準ヒト血清又はＣ１ｑが枯渇した血清（Ｃ１ｑＤ−ＮＨＳ）を、ＩｇＭ（Ａ）及びマンナン（Ｂ）により覆われたプレート上で培養し、それぞれにＣ４結合の検出を行い； Ｃ：ＮＨＳ及びＣ１ｑが枯渇したＮＨＳ（１／４００に希釈された）を、指示されたように精製したＣ１ｑ（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下、又は不存在下において、ＩｇＭ、又はマンナンで覆われたプレート上で培養した。Ｄ：ＮＨＳを、ＭＢＬに対するｍＡｂ（ｍＡｂ ３Ｆ８、１０μｇ／ｍＬ）もしくはＣ１ｑ（ｍＡｂ２２０４，２０μｇ／ｍＬ）の遮断、又は両方（コンビネーション）の存在下、又は不存在下でＩｇＭ、又はマンナンで覆われたプレート上で培養した。 ｍＡｂ２２０４抗−Ｃ１ｑの不存在下、又は存在下においてＭＢＬが欠損した血清と共にマンナンで覆われたプレート上で培養されたそれぞれの濃度での、精製されたＩｇＧ及びＩｇＭ抗体によるＣ４活性化の検定を示す。 ＬＰ及びＣＰ経由での補体活性化を示し；補体活性化は、ｍＡｂ２２０４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又は不存在下において、ＣＰ活性化（Ａ）のためのＩｇＭ、又はＬＰ活性化（Ｂ）のためのマンナンで覆われたプレート上のＮＨＳの異なる濃度の培養により誘導した。補体の活性化及び結合は、特異的なｍＡｂを用いたＣ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の検出により説明した。 ＬＰ及びＣＰ経由での補体活性化を示し；補体活性化は、ｍＡｂ２２０４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又は不存在下において、ＣＰ活性化（Ａ）のためのＩｇＭ、又はＬＰ活性化（Ｂ）のためのマンナンで覆われたプレート上のＮＨＳの異なる濃度の培養により誘導した。補体の活性化及び結合は、特異的なｍＡｂを用いたＣ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の検出により説明した。 ＬＰ及びＣＰ経由での補体活性化を示し；補体活性化は、ｍＡｂ２２０４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又は不存在下において、ＣＰ活性化（Ａ）のためのＩｇＭ、又はＬＰ活性化（Ｂ）のためのマンナンで覆われたプレート上のＮＨＳの異なる濃度の培養により誘導した。補体の活性化及び結合は、特異的なｍＡｂを用いたＣ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の検出により説明した。 ＬＰ及びＣＰ経由での補体活性化を示し；補体活性化は、ｍＡｂ２２０４（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又は不存在下において、ＣＰ活性化（Ａ）のためのＩｇＭ、又はＬＰ活性化（Ｂ）のためのマンナンで覆われたプレート上のＮＨＳの異なる濃度の培養により誘導した。補体の活性化及び結合は、特異的なｍＡｂを用いたＣ１ｑ、Ｃ４、Ｃ３、及びＣ５ｂ−９の検出により説明した。 副経路の活性化を示し；ＮＨＳは、ＣＰ及びＬＰの活性化を遮断するためにカルシウムが存在しない緩衝剤（ＧＶＢ／ＭｇＥＧＴＡ）中で、マンナン、ＬＰＳ、又はＢＳＡで覆われたプレート上で培養した。Ｃ３及びＣ４の結合は、それぞれ後に検定した。

Claims (24)

1. 哺乳動物の血液、血清、血漿、又は哺乳動物から得られたその他の体液のサンプルを用いて、補体系のレクチン経路中の欠損を生理学的条件下で機能的に測定するためのin vitroでの方法であって、以下のステップ
   （ａ）Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ若しくはＣ１ｓに対する免疫グロブリン、タンパク質、及びペプチドから成る群から選定されたＣ１複合体阻害剤を付加し；
   （ｂ）副経路の活性化を阻害するために当該サンプルを希釈し；
   （ｃ）当該サンプル中におけるレクチン経路を活性化させるＭＢＬ、又はフィコリン結合糖質を付加し；
   （ｄ）自系のＣ５ｂ−９複合体に対する第一の抗体を付加し；そして
   （ｅ）当該自系のＣ５ｂ−９複合体を測定することによる当該生理学的条件でのレクチン経路の活性化を測定する、
   を含んで成る方法。
2. 前記ステップ（ａ）における阻害剤が、Ｃ１阻害剤、ＣＲＴ、Ｃ１Ｑｒ，大腸菌Ｃ１ｑ結合タンパク質、ｇＣ１ｑＲ、ｇｈＢ３、デコリン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、界面活性剤プロテインＡ、及びＨＮＰ−１から成る群から選定された請求項１に記載の方法。
3. 前記ステップ（ａ）における阻害剤が、TDGDKAFVDFLSDEIKEE,KDIRCKDD,AEAKAKA, VQVHNAKTKPR,WY,CEGPFGPRHDLTFCW,及びLEQGENVFLQATLLから成る群から選定された請求項１に記載の方法。
4. 前記ステップ（ａ）における阻害剤が、ポリクローナル及びモノクローナル抗体から成る群から選定された請求項１に記載の方法。
5. 前記ステップ（ｃ）における糖質が、マンノース、フコース、マンナン、合成糖質、並びに微生物多糖類から成る群から選定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ステップ（ｄ）における第一の抗体が、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ステップ（ｄ）が、前記第一の抗体に対する第二の抗体を付加することを含んで成り、ここで当該第二抗体が標識された抗体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記第一の抗体が標識された抗体である請求項６に記載の方法。
9. 補体系のレクチン経路における欠損を、哺乳動物からの体液中で機能的に測定するためのキットであって、以下を
   （ａ）不活性担体及びＭＢＬ又はフィコリン結合糖質、
   （ｂ）Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、若しくはＣ１ｓに対する免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド及びプロテアーゼから成る群から選定されたＣ１複合体阻害剤を含んで成る希釈剤、及び
   （ｃ）自系のＣ５ｂ−９複合体に対する第一の抗体、
   を含んで成るキット。
10. 前記（ａ）における糖質が、マンノース、フコース、マンナン、合成糖質、並びに微生物多糖類から成る群から選定された請求項９に記載のキット。
11. 前記（ｂ）における阻害剤が、Ｃ１阻害剤、ＣＲＴ、Ｃ１Ｑｒ，大腸菌Ｃ１ｑ結合タンパク質、ｇＣ１ｑＲ、ｇｈＢ３、デコリン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、界面活性剤プロテインＡ、及びＨＮＰ−１から成る群から選定された請求項９〜１０のいずれか１項に記載のキット。
12. 前記（ｂ）における阻害剤が、ペプチド、TDGDKAFVDFLSDEIKEE,KDIRCKDD,AEAKAKA, VQVHNAKTKPR,WY,CEGPFGPRHDLTFCW,及びLEQGENVFLQATLLから成る群から選定された請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
13. 前記（ｂ）における阻害剤が、ポリクローナル及びモノクローナル抗体から成る群から選定された請求項９〜１２に記載のキット。
14. 前記（ｃ）における第一の抗体が、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である請求項９〜１３のいずれか１項に記載のキット。
15. 前記（ａ）における糖質で不活性担体を覆った請求項９〜１４のいずれかに１項に記載のキット。
16. 前記（ｃ）における第一の抗体が、標識化された抗体である請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキット。
17. 前記キットが、前記（ｃ）における第一の抗体に対する標識化された第二の抗体（ｄ）を更に含んで成る請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキット。
18. 前記標識が、蛍光又は酵素標識である請求項１７に記載のキット。
19. 前記キットが、酵素基質（ｅ）を更に含んで成る請求項９〜１８のいずれか１項に記載のキット。
20. 前記キットが、洗浄液（ｆ）を更に含んで成る請求項９〜１９のいずれか１項に記載のキット。
21. 前記キットが、哺乳動物からの正常の体液（ｇ）を更に含んで成る請求項９〜２０のいずれか１項に記載のキット。
22. 前記正常の体液（ｇ）が、ヒト血清である請求項２１に記載のキット。
23. 前記キットが、不活性化された哺乳動物からの正常の体液（ｈ）を更に含んで成る請求項１０〜２２のいずれか１項に記載のキット。
24. 前記不活性化された正常の体液（ｈ）が、加熱不活性化されたヒト血清である請求項２３に記載のキット。

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