CN103454265A - 一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103454265A CN103454265A CN2013103447510A CN201310344751A CN103454265A CN 103454265 A CN103454265 A CN 103454265A CN 2013103447510 A CN2013103447510 A CN 2013103447510A CN 201310344751 A CN201310344751 A CN 201310344751A CN 103454265 A CN103454265 A CN 103454265A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- preparation
- fiber gelatinized
- gelatinized protein
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括纤维胶凝蛋白-3校准品、酶标记的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被的固相载体,清洗液以及上述酶所作用的化学发光底物。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法,包括酶标记抗体、用抗体包被固相载体、校准品配制、发光底物配制等步骤。本发明的试剂盒主要针对糖尿病早期发现、及时干预提供了诊断依据。同时本试剂盒具有线性范围宽、校准品系列稳定并可直接使用、操作方便,更符合临床应用需求的优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种糖尿病早期诊断标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
近30年来,我国糖尿病患病率显著增加。1980年全国14省市30万人的流行病学资料显示,糖尿病的患病率为0.7%。2007-2008年,在中华医学会糖尿病学分会组织下,全国14个省市进行了糖尿病的流行病学调查。结果显示我国20岁以上的成年人糖尿病患病率为9.7%。对于糖尿病患者而言,早期发现、早期确诊和早期治疗糖尿病是让他们恢复健康的关键,要实现上述目标,就需要找到合适的标志物以实现糖尿病的早期发现,从而进一步实现糖尿病的早期确诊和早期治疗;因此,早期诊断和治疗为目的去研究和寻找能够用作预测和诊断糖尿病的蛋白质分子标记物具有十分重要的意义。
近年来人们越来越倾向将糖化血红蛋白(HbAlc)作为筛查糖尿病高危人群和诊断糖尿病的一种方法。但HbAlc检测目前在我国尚不普遍,而且我国HbAlc检测方法的标准化程度不够,HbAlc测定的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求。此外,中国人群中HbAlc诊断糖尿病的切点是否与国际上一致还尚待研究证实。基于以上原因,目前尚不推荐在我国采用HbAlc诊断糖尿病。但是近来出现了很多关于纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)应用的报道,报道显示Ficolin-3表达水平与糖尿病有很大关系,Ficolin-3在糖尿病病人血清中的表达水平高于正常健康对照血清中的表达水平。并最终明确Ficolin-3在糖尿病领域的重要发现为糖尿病的早期发现、及时干预提供了必要手段,同时也为未来糖尿病的有效治疗提出进一步探索的方向。
标记免疫分析是一大类高特异性检测技术的总称,因其具有许多独特优点,已广泛应用于基础医学和临床各领域。它们的基本原理相同,仅依标记物的不同而最终测量所发出的信号而异。虽然文献报告的方法已有10余种,但有推广应用价值或已被广泛应用的主要有:放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和化学发光免疫分析(CLIA)等。放射免疫分析因使用放射性核素,污染环境,有效期短,测量时间长等自身缺点难以实现自动化,限制了进一步发展。酶免疫分析因其存在所发信号时间短的缺点,现阶段化学发光免疫分析法占主导地位。根据大量的实验结果及临床应用资料,从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看,依次为:化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析
目前纤维胶凝蛋白-3诊断试剂盒国内较少,国外试剂盒基本上是用传统的酶联免疫(ELISA)方法进行测定且大多都应用于研发方面。性能方面其检测范围均偏窄(检测最高限均小于1μg/ml),而根据文献记载,目前针对糖尿病检测用纤维胶凝蛋白-3的临床正常值在7-53μg/ml,因此如果将上述ELISA试剂盒应用于糖尿病的诊断,将需要对样本进行大浓度稀释,会大大增加用户操作的复杂程度。同时由于未解决纤维胶凝蛋白-3校准品系列溶液不稳定的问题,因此国内外厂家的试剂盒基本都要求在检测时使用试剂盒中的纤维胶凝蛋白-3高浓度液体,采用现用现配的方式获得校准品系列,这种做法进一步增大了用户的操作复杂性,且存在批间差异大、可控性差等问题。综上所述,目前市场上的纤维胶凝蛋白-3试剂盒采用酶联免疫法,存在线性范围过窄、不能覆盖临床的正常和异常值范围,校准品系列需检测前配制等缺陷,操作复杂性很高,批间差异大、可控性差,达不到临床应用的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:解决上述市场上纤维胶凝蛋白-3试剂盒所存在的问题,提供出一种纤维胶凝蛋白-3化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。此试剂盒具有线性范围宽、校准品系列稳定并可直接使用、操作方便,更符合临床应用需求的特点。
本发明的目的之一是在于提供一种糖尿病预测标记物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明的试剂盒包括:
1)纤维胶凝蛋白-3校准品;
2)碱性磷酸酶标记抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液;
3)纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被的固相载体工作液;
4)清洗液;
5)化学发光底物。
根据本发明的试剂盒,其中,所述的固相载体为磁性微粒,大小为200nm~3μm,磁性微粒表面的活性基团为-COOH。
根据本发明的试剂盒,其中,所述化学发光底物的主要成分为1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-5。
根据本发明的试剂盒,其中,所述1,2-二氧环乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧环乙烷、AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)、CSPD、CDP-star或Lumigen PPD。
根据本发明的试剂盒,其中,所述纤维胶凝蛋白-3校准品溶液中的稳定剂是含量为1%的干酪素钠。
本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法,包括以下步骤:
1)配制纤维胶凝蛋白-3校准品;
2)用纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体,配制工作液;
3)用碱性磷酸酶标记纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,配制工作液;
4)配制清洗液;
5)配制化学发光底物;
6)分装上述纤维胶凝蛋白-3校准品、纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液、碱性磷酸酶标记纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液、清洗液以及化学发光底物;
7)组装为成品。
根据本发明的方法,优选,所述碱性磷酸酶标记抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
1)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将琥珀酰亚胺配制为10mg/ml的溶液;
2)配制0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液,配制方法为称取1211.4mg Tris,加入约80g纯化水,充分混匀溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.05,之后补加纯化水,将溶液定重在100g;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解碱性磷酸酶,制备出浓度为2mg/ml的碱性磷酸酶溶液;
3)将2mg/ml的碱性磷酸酶溶液与10mg/ml的琥珀酰亚胺溶液按照体积比为1∶0.4的体积比混合,在室温条件下反应10-20分钟,得到碱性磷酸酶的活化产物。
4)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐配制为10mg/ml的溶液;
5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,制备出浓度为2mg/ml的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液;
6)将2mg/ml抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液与10mg/ml的亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐按照体积比为1∶0.4的体积比混合,室温反应10-20分钟,得到抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的活化产物。
7)将两种活化产物按照1∶1的体积比混合,室温反应16-24小时后使用分子筛层析方式得到酶标记的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体。
8)将上述碱性磷酸酶连接物与0.1M Tris,5%BSA,0.9%NaCl,PH值为8.0±0.5的溶液可按照0.5-2μg/ml的碱性磷酸酶连接物浓度配制成工作液。
根据本发明的方法,优选,所述抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液的制备方法包括以下步骤:
1)配制PH6.050mM MES溶液,其中包含9.762g MES,纯化水定重至1000g,混匀后待用。
2)配制PH7.40.2M PB溶液:称取5.244g磷酸二氢钠,28.836g磷酸氢二钠,加约800g纯化水,搅拌至溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到7.4,纯化水定重至1000g,混匀后待用。
3)用上述50mM MES溶液将有机磁性微粒配制为20mg/ml的溶液,上磁板吸去上清,加入相同体积的50mM MES溶液清洗,重复清洗三次,最后一次加入相同体积50mM MES溶液保存待用,称取活化剂N-羟基丁二酰亚胺与乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺,将其用纯化水配制为浓度分别为20mg/ml与40mg/ml的溶液待用。在上述50mM MES溶液保存的磁珠中依次加入刚配制的两种活化剂溶液,加入的活化剂溶液的体积按照公式:V(体积)=M(磁珠质量)×30μl。活化条件为室温反应1-4小时。
4)用上述MES溶液将抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体配制为0.5-1mg/ml溶液。后将配制好的抗体全部投入到上述活化后的磁珠溶液中进行连接反应。反应条件为室温反应1-4小时。
5)将连接反应后的溶液上架吸去上清,加入等体积的PB溶液清洗,重复3次,最后一次加入等体积的PB溶液保存待用。
6)上述将连接好的磁浓缩液与PH7.40.2M PB溶液可按照0.5-2mg/ml的磁性微粒浓度配制成工作液。
根据本发明的方法,优选,所述化学发光底物的配制包括以下步骤:
1)配制1L的化学发光底物:本化学发光底物的主要成分为针对碱性磷酸酶的1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-5。
2)溶液配制:1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-51g,Tris24g,NaCl160g,十六烷基三甲基氯化铵0.0255g,加入纯化水约900ml,混匀15分钟,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到9.7±0.05,之后补加纯化水定容至1000ml,混匀10分钟。此发光底物在2-8℃条件下避光保存,使用前需震荡混匀。
根据本发明的方法,优选,所述校准品溶液内加入了有助于校准品稳定的成分干酪素钠含量为1%,其配制包括以下步骤:
1)校准品缓冲液的配制:Tris1211.4mg,BSA5g,干酪素钠1g,加入纯化水约90ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到7.5±0.05,补加纯化水定容至100ml,混匀待用。
2)校准品的配制:在上述缓冲液中加入纤维胶凝蛋白-3纯品配制而成。
3)试剂保存:在2-8℃条件下保存,用前震荡混匀。
根据本发明的方法,优选,所述清洗液的配制包括以下步骤:
1)溶液配制:Tris1211.4mg,NaCl9g,吐温-201g,加入纯化水约900ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.5,补加纯化水定容至1000ml,混匀待用。
2)试剂保存:在2-8℃条件下保存,用前震荡混匀。
本发明的主要创新之处在于:
1、本发明提供了一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3的定量检测试剂盒,本发明通过将化学发光分析技术和纳米-微米级有机磁性微粒引入到了纤维胶凝蛋白-3的测定系统,有效地增大了免疫反应面积,扩宽了系统的检测范围,因而能够覆盖临床糖尿病预测所需的纤维胶凝蛋白-3正常和异常范围,并使检测过程更简单、快速、稳定。适合各大医院推广使用,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
2、本发明所引入的酶是碱性磷酸酶,相对于辣根过氧化物酶,它有更好的稳定性。
3、本发明的试剂盒校准品缓冲液中的稳定剂是针对纤维胶凝蛋白-3的适用性进行筛选而确定的,可以有效地保证纤维胶凝蛋白-3校准品系列的稳定性,解决了市场上试剂盒现用现配的校准品应用现状,方便了临床应用。
具体实施方式
实施例1纤维胶凝蛋白-3化学发光免疫分析定量试剂盒的制备
1、碱性酶标抗体工作液的制备
1)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将琥珀酰亚胺配制为10mg/m1的溶液;
2)配制0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液,配制方法为称取1211.4mg Tris,加入80g纯化水,充分混匀溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.05,之后补加纯化水,将溶液定重至100g;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解碱性磷酸酶,制备出浓度为2mg/ml的碱性磷酸酶溶液;
3)将2mg/ml的碱性磷酸酶溶液与10mg/ml的琥珀酰亚胺溶液按照体积比为1∶0.4的体积比混合,在室温条件下反应10-20分钟(本实施例反应15分钟),然后得到碱性磷酸酶的活化产物。
4)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐配制为10mg/ml的溶液;
5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,制备出浓度为2mg/ml的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液;
6)将2mg/ml抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液与10mg/ml的亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐按照体积比为1∶0.4的体积比混合,室温反应10-20分钟(本实施例反应15分钟),然后得到抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的活化产物。
7)将两种活化产物按照1∶1的体积比混合,室温反应16-24小时(本实施例反应18小时)后,通过分子筛层析方式得到酶标记的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体。
8)将上述碱性磷酸酶连接物与0.1M Tris,5%BSA,0.9%NaCl,PH值为8.0±0.5的溶液可配制成0.5-2μg/ml的碱性磷酸酶连接物工作液,本实施例中我们配制的浓度为1μg/ml。
2.抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液的制备包括以下步骤:
1)配制PH6.050mM MES溶液,其中包含9.762g MES,纯化水定重至1000g。
2)配制PH7.40.2M PB溶液,其中包含5.244g磷酸二氢钠,28.836g磷酸氢二钠,纯化水定重至1000g。
3)用上述MES缓冲液将外购有机磁珠配制为20mg/ml的溶液,上磁板吸去上清加入相同体积的MES清洗,重复清洗三次,最后一次加入相同体积MES缓冲液保存待用,称取活化剂N-羟基丁二酰亚胺与乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺,将其用纯化水配制为浓度分别为20mg/ml与40mg/ml的溶液待用。在上述MES缓冲液保存的磁珠中依次加入刚配制的两种活化剂溶液,加入的活化剂溶液的体积按照公式:V(体积)=M(磁珠质量)×30μl。活化条件为室温1-4小时(本实施例中反应了2小时)。
4)用上述MES溶液将抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体配制为0.5-1mg/ml溶液。后将配制好的抗体全部投入到上述活化后的磁珠溶液中进行连接反应。反应条件为室温1-4小时(本实施例中反应了2小时)。
5)将连接反应后的溶液上架吸去上清,加入等体积的PB溶液清洗,重复3次,最后一次加入等体积的PB溶液保存待用。
6)上述将连接好的抗体-磁性微粒连接物与工作液PH7.40.2M PB溶液可配制成0.5-2mg/ml的抗体-磁性微粒连接物工作液来使用,本实施例中我们配制浓度为lmg/ml。
3.化学发光底物的配制包括以下步骤:
1)AMPPD1g,Tris24g,NaCl160g,十六烷基三甲基氯化铵0.0255g,加入纯化水约900ml,混匀15分钟,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到9.7±0.05,之后补加纯化水定容至1000ml,混匀待用。此发光底物在2-8℃条件下避光保存,使用前需震荡混匀。
2)本实施例红我们使用AMPPD作为底物的主要成分,AMPPD可被替换成等量的其他1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-5,底物中其他成份的量不变。
4.纤维胶凝蛋白-3校准品的配制
校准品缓冲液:Tris1211.4mg,BSA5g,干酪素钠1g,加入纯化水约90ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到7.5±0.05,补加纯化水定容至100ml,混匀待用。用校准品缓冲液将纤维胶凝蛋白-3纯品分别配制成0,20,80,160,320,640μg/ml,5个浓度点,共6瓶待用。
5.清洗液的配制
溶液配制:Tris1211.4mg,NaCl9g,吐温-201g,加入纯化水约900ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.5,补加纯化水定容至1000ml,混匀待用。
6.半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密度、分析灵敏度及稳定性检定合格才能组成定量检测试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
实施例2本发明试剂盒的使用方法
以实施例1制备的试剂盒的具体操作如下:
实施例2本发明的试剂盒的使用方法:
(1)分别吸取30μl待测血清或纤维胶凝蛋白-3校准品、60μl碱性酶标抗体工作液和60μl纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液,加至标记好的相应试管的底部。
(2)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
(3)试管连架置37℃水浴16分钟。
(4)加30μl分离试剂至各试管中。
(5)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
(6)试管连架37℃水浴10.5分钟。
(7)试管连架放入磁分离器,磁场中沉淀2分钟。
(8)用一大而缓慢的圆周运动倒转磁分离器倒出上清液,把倒转的试管放在滤纸上,用强有力的动作拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
(9)加300μl清洗液至各试管。
(10)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
(11)试管连架放入磁分离器,磁场中沉淀2分钟。
(12)用一大而缓慢的圆周运动倒转磁分离器倒出上清液,把倒转的试管放在滤纸上,用强有力的动作拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
(13)重复步骤(9)-(12)两次。
(14)将试管转移到发光检测仪上进行检测。化学发光免疫分析仪能读取样本发光值并自动转换成纤维胶凝蛋白-3的浓度,结果的单位为μg/ml。
(15)根据所述发光值强度与纤维胶凝蛋白-3浓度的比例关系计算得到所述待测血清中纤维胶凝蛋白-3的浓度。
实施例3本发明试剂盒的性能检测
本发明进行了以下性能指标的检测:
1、分析灵敏度<0.5μg/ml。
分析灵敏度的做法为:用零浓度校准品作为样本,重复测定20次,记录20次测量结果的信号值,计算20次测量结果的平均值(M)和标准差(SD),根据校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD所对应的信号值带入上述方程,求出对应的浓度值,即为本试剂盒的分析灵敏度。
2、线性范围为0.5-640μg/ml。
3、精密度:批内<8%,批间<10%。
精密度做法:
批内精密度:选取3份不同浓度的样本一次各重复检测10次,计算10次测定结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式CV=SD/M均值(各重得出变异系数(CV)。
批间精密度:选取3份不同浓度的样本,分三次检测,一次各重复检测10次,计算30次测定结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式CV=SD/M均值(三次得出变异系数(CV)。
结果如下:
4、准确度:选取高浓度样本进行添加回收实验,回收率均在95%-110%之间
准确度具体做法:将高浓度样品(A)加入到血清或其他相应基质的样品B中,所加入A的体积不宜超过总体积(A+B)的10%。
根据测定与添加的浓度比对计算回收率结果如下:
5、特异性:与类似物的交叉反应率测值结果在灵敏度附近,我们的标准认为其无交叉反应。
6、稳定性:开瓶稳定性为4周,效期稳定性为12个月。
7、参考范围
共测定了300份正常血清样本。血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病,半年内无输血和大手术史,妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析,得出正常血清参考范围为:7-53μg/ml。
本数据仅供参考,不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测,所测得的纤维胶凝蛋白-3水平也会有所不同,建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的纤维胶凝蛋白-3值做出诊断,应结合临床其他资料分析结果,包括病人的具体情况和治疗状况。
实施例4本发明的纤维胶凝蛋白-3试剂盒测定健康样本与临床确诊病例样本之间的比对
本发明的试剂盒通过与临床己确诊的非糖尿病和糖尿病阳性样本进行阴阳性检测的比对,分别测定正常血清样本156例,确诊糖尿病样本178例,其检测结果如下:
由以上结果可得178例确诊阳新样本中177例被测得为阳性结果,仅一例出现假阴性的结果,假阴性的概率为0.56%且该阴性的样本的检测结果接近正常值的下限。156例确诊非糖尿病的样本均检测阴性,无假阳性检测结果存在。
Claims (11)
1.一种纤维胶凝蛋白-3化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法,其特征在于,所述试剂盒包括:
1)纤维胶凝蛋白-3校准品;
2)碱性磷酸酶标记抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液;
3)纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被的固相载体工作液;
4)清洗液;
5)化学发光底物。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的固相载体为磁性微粒,大小为200nm~3μm,磁性微粒表面的活性基团为-COOH。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物的主要成分为1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-5。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述1,2-二氧环乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧环乙烷、AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)、CSPD、CDP-star或Lumigen PPD。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述纤维胶凝蛋白-3校准品溶液内含有的稳定剂为1%的干酪素钠。
6.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)配制纤维胶凝蛋白-3校准品;
2)用纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体,配制工作液;
3)用碱性磷酸酶标记纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,配制工作液;
4)配制清洗液;
5)配制化学发光底物;
6)分装上述纤维胶凝蛋白-3校准品、纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液、碱性磷酸酶标记纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液、清洗液以及化学发光底物;
7)组装为成品。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述碱性磷酸酶标记抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
1)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将琥珀酰亚胺配制为10mg/ml的溶液;
2)配制0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液,配制方法为称取1211.4mg Tris,加入约80g纯化水,充分混匀溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.05,之后补加纯化水,将溶液定重在100g;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解碱性磷酸酶,制备出浓度为2mg/ml的碱性磷酸酶溶液;
3)将2mg/ml的碱性磷酸酶溶液与10mg/ml的琥珀酰亚胺溶液按照体积比为1∶0.4的体积比混合,在室温条件下反应10-20分钟,得到碱性磷酸酶的活化产物。
4)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐配制为10mg/ml的溶液;
5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris缓冲液溶解抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体,制备出浓度为2mg/ml的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液;
6)将2mg/ml抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的溶液与10mg/ml的亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐按照体积比为1∶0.4的体积比混合,室温反应10-20分钟,得到抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体的活化产物。
7)将两种活化产物按照1∶1的体积比混合,室温反应16-24小时后使用分子筛层析方式得到纯度较高的酶标记的抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体连接物。
8)将上述碱性磷酸酶连接物与0.1M Tris,5%BSA,0.9%NaCl,PH值为8.0±0.5的溶液可按照0.5-2μg/ml的碱性磷酸酶连接物浓度配制成工作液。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体包被固相载体工作液的制备方法包括以下步骤:
1)配制PH6.050mM MES溶液,其中包含9.762g MES,纯化水定重至1000g,混匀后待用。
2)配制PH7.40.2M PB溶液:称取5.244g磷酸二氢钠,28.836g磷酸氢二钠,加约800g纯化水,搅拌至溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到7.4,纯化水定重至1000g,混匀后待用。
3)用上述50mM MES溶液将有机磁性微粒配制为20mg/ml的溶液,上磁板吸去上清,加入相同体积的50mM MES溶液清洗,重复清洗三次,最后一次加入相同体积50mM MES溶液保存待用,称取活化剂N-羟基丁二酰亚胺与乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺,将其用纯化水配制为浓度分别为20mg/ml与40mg/ml的溶液待用。在上述50mM MES溶液保存的磁珠中依次加入刚配制的两种活化剂溶液,加入的活化剂溶液的体积按照公式:V(体积)=M(磁珠质量)×30μl。活化条件为室温反应1-4小时。
4)用上述MES溶液将抗纤维胶凝蛋白-3单克隆抗体配制为0.5-1mg/ml溶液。后将配制好的抗体全部投入到上述活化后的磁珠溶液中进行连接反应。反应条件为室温反应1-4小时。
5)将连接反应后的溶液上架吸去上清,加入等体积的PB溶液清洗,重复3次,最后一次加入等体积的PB溶液保存,作为磁浓缩液待用。
6)上述将连接好的磁浓缩液与PH7.40.2M PB溶液可按照0.5-2mg/ml的磁性微粒浓度配制成工作液。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述化学发光底物的配制包括以下步骤:
1,2-二氧环乙烷类衍生物或APS-51g,Tris24g,NaCl160g,十六烷基三甲基氯化铵0.0255g,加入纯化水约900ml,混匀15分钟,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到9.7±0.05,之后补加纯化水至1000ml,混匀待用。
10.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述校准品的配制包括以下步骤:
1)校准品缓冲液的配制:Tris1211.4mg,BSA5g,干酪素钠1g,加入纯化水约90ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到7.5±0.05,补加纯化水定容至100ml,混匀待用。
2)校准品的配制:在上述缓冲液中加入纤维胶凝蛋白-3纯品配制而成。
11.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述清洗液的配制包括以下步骤:
Tris1211.4mg,NaCl9g,吐温-201g,加入纯化水约900ml,混匀至各试剂溶解,用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调整溶液pH值到8.0±0.5,补加纯化水定容至1000ml,混匀待用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2013103447510A CN103454265A (zh) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | 一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2013103447510A CN103454265A (zh) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | 一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103454265A true CN103454265A (zh) | 2013-12-18 |
Family
ID=49736872
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2013103447510A Pending CN103454265A (zh) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | 一种糖尿病预测标志物-纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103454265A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006518834A (ja) * | 2002-07-26 | 2006-08-17 | ビースラブ アクティエボラーグ | レクチン経路欠損検定 |
CN101561440A (zh) * | 2008-04-16 | 2009-10-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 纤维胶凝蛋白3的应用 |
CN101937000A (zh) * | 2010-08-05 | 2011-01-05 | 北京倍爱康生物技术有限公司 | 一种人胱抑素c的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法 |
EP2336170A2 (en) * | 2005-12-15 | 2011-06-22 | Industrial Technology Research Institute | Recombinant triplex scaffold-based polypeptides |
CN102288767A (zh) * | 2011-08-16 | 2011-12-21 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 糖类抗原72-4(ca72-4)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN102781471A (zh) * | 2009-10-16 | 2012-11-14 | 奥默罗斯公司 | 通过抑制masp-2依赖性补体活化治疗弥散性血管内凝血的方法 |
-
2013
- 2013-08-09 CN CN2013103447510A patent/CN103454265A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006518834A (ja) * | 2002-07-26 | 2006-08-17 | ビースラブ アクティエボラーグ | レクチン経路欠損検定 |
EP2336170A2 (en) * | 2005-12-15 | 2011-06-22 | Industrial Technology Research Institute | Recombinant triplex scaffold-based polypeptides |
CN101561440A (zh) * | 2008-04-16 | 2009-10-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 纤维胶凝蛋白3的应用 |
CN102781471A (zh) * | 2009-10-16 | 2012-11-14 | 奥默罗斯公司 | 通过抑制masp-2依赖性补体活化治疗弥散性血管内凝血的方法 |
CN101937000A (zh) * | 2010-08-05 | 2011-01-05 | 北京倍爱康生物技术有限公司 | 一种人胱抑素c的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法 |
CN102288767A (zh) * | 2011-08-16 | 2011-12-21 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 糖类抗原72-4(ca72-4)定量测定试剂盒及其检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11959912B2 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
CN104330577B (zh) | 一种c反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法 | |
CN103604931B (zh) | 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法 | |
CN104634980B (zh) | 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法 | |
CN102998467B (zh) | β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN104849469A (zh) | 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 | |
CN101363860A (zh) | 梅毒螺旋体抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
Zhou et al. | Application of europium (III) chelates-bonded silica nanoparticle in time-resolved immunofluorometric detection assay for human thyroid stimulating hormone | |
CN107543932A (zh) | 一种降钙素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
CN106568978A (zh) | 血清淀粉样蛋白a检测方法及试剂 | |
CN103364568A (zh) | 一种层粘连蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN101545913A (zh) | 三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
CN103018445B (zh) | 糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN101377505A (zh) | 脱γ羧基凝血酶原微孔板化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
CN102226808A (zh) | 胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
CN101377514A (zh) | 胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
CN104237513A (zh) | 一种甲状腺过氧化物酶抗体磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒 | |
CN109187971A (zh) | 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
CN101368969A (zh) | Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 | |
CN101750502A (zh) | 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒 | |
CN106370860A (zh) | 血清免疫球蛋白e胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条 | |
CN107831314A (zh) | 一种n‑中端骨钙素化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
CN104237532A (zh) | 人附睾分泌蛋白4定量测定试剂盒 | |
CN108931652A (zh) | 一种用磁微粒化学发光法检测肌红蛋白含量的试剂盒 | |
CN108982482A (zh) | 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131218 |