CN101561440A - 纤维胶凝蛋白3的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纤维胶凝蛋白3与糖尿病以及糖尿病肾病的关系，并在此基础上提供了纤维胶凝蛋白3用作检测糖尿病和糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生的蛋白质分子标记物的应用，纤维胶凝蛋白3的抗体用于检测血清中纤维胶凝蛋白3的表达情况的方法。鉴于纤维胶凝蛋白3与2型糖尿病和糖尿病肾病的相关性，该蛋白质可以用作检测2型糖尿病和糖尿病肾病的蛋白质分子标记物，而且其在糖尿病和糖尿病肾病患者血清中高表达，其制备的检测产品能具有很好的检测效果。

Description

纤维胶凝蛋白3的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种纤维胶凝蛋白3用作检测糖尿病及糖尿病肾病的蛋白质分子标记物的应用。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病，在发展中国家糖尿病的发病率和死亡率呈现上升趋势。中国已成为糖尿病的重灾区，每年用于糖尿病治疗的医疗支出大为增加，这表明糖尿病已经成为严重危害我国人民生命财产安全的敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，因此加大力度进行我国糖尿病的基础研究具有战略意义。

对于糖尿病患者而言，早期发现、早期确诊和早期治疗糖尿病是让他们恢复健康的关键，要实现上述目标，就需要寻找到合适的标志物以实现糖尿病的早期发现，从而进一步实现糖尿病的早期确诊和早期治疗；因此，以早期诊断和治疗为目的去研究和寻找能够用作预测和诊断糖尿病的蛋白质分子标记物具有十分重要的意义。

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症，是糖尿病全身微血管病变的主要表现。临床特征是蛋白尿和渐进性的肾功能损害，而晚期出现肾功能衰竭是糖尿病患者死亡的主要原因之一。我国糖尿病患病的人数约有5千万，近年来由于我国人均寿命的延长和饮食习惯的改变，糖尿病患病的人数也直线上升，而且由于糖尿病治疗方法的改变和生存时间的加长，糖尿病肾病并发症的发病人数也逐渐增加。在1型糖尿病患者中有30-40％的病人发生糖尿病肾病，而2型糖尿病患者中有10-20％的病人发生糖尿病肾病。所以，早期诊断糖尿病肾病可以减轻病人的痛苦和大大减少医疗支出。

在人体中，纤维胶凝蛋白(ficolin)包括三种类型，分别为ficolin-1、ficolin-2和ficolin-3。ficolin的分子结构比较特殊和复杂，其一级结构及空间结构分别和甘露聚糖结合凝聚素(MBL)及补体蛋白质Clq类似。ficolin的亚单位由三股螺旋的多肽链构成，包含纤维蛋白素原结构和胶原样结构。ficolin-2和ficolin-3主要存在于血清当中，属分泌型，而ficolin-1则是表达于肺和单核细胞膜表面的相关蛋白质。ficolin家族的生物学特性包括：参与糖类的识别，可介导调理吞噬作用以及参与补体凝集素活化途径。

纤维胶凝蛋白3(ficolin-3 isoform 1 precursor)的Genebank登录号为gi|27754776，NCBI的登录号为NP 003656，Swissprot登录号为O75636，IPI号为：IPI00556567.1。ficolin-3能够结合晚期的凋亡细胞，通过胶原样结构与凋亡细胞相结合，能大大地增强巨噬细胞对凋亡细胞的摄取。在摄取过程中，整个ficolin-3分子与固定化的钙网织蛋白相结合，其中ficolin-3是通过纤维蛋白素原结构去结合正在凋亡的宿主细胞，可逆地通过胶原样结构增强吞噬作用，钙网织蛋白-CD91复合体在整个过程中扮演了十分重要的角色。这些说明ficolin-3在清除凋亡细胞的过程中发挥清除分子的功能(Honore CLF，Hummelshoj T，Hansen BE，et al.Molecular Immunology 43(1-2)：136-13639，2006)。

ficolin-3能够与MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)结合进而激活补体系统。ficolin-3可与MASP-1、MASP-2和sMAP(small MBL-associated protein)形成复合物参与到补体凝集素活化途径中。在ficolin-3的分离物中也能检测到MASP-1、MASP-2和sMAP，而且ficolin-3复合物与包被在ELISA板上的PSA(PSA为绿色气球菌产生的多聚糖)结合后会激活C4。当ficolin-3结合到包被有ficolin-3的抗体的ELISA板上，也能够激活C4。这些可以推断ficolin-3能够和MASP-1、MASP-2和sMAP形成复合物并激活补体凝集素活化反应(Matsushita M，Kuraya M，Hamasaki N，et al.Journal of Immunology 168(7)：3502-3506，2002)。

在IgA肾病中，ficolin和MBL(mannose-binding lectin)结合到糖类配体中可以在肾小球内激发凝集素的补体系统，继而激发MBL相关丝氨酸和C4。对IgA肾病的病人进行肾组织检查表明，ficolin-2和MBL在肾小球的沉淀与显著的肾组织的损伤有关联，损伤的证据有肾小球系膜的增生、毛细血管膜的增生、肾小球的硬化和增加的蛋白尿。所以，在凝集素途径中补体的激活与糖尿病肾病是相关的(Roos A，Rastaldi MP，Calvaresi N，et al.JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY 17(6)：1724-1734 JUN2006)。

但是截止到目前，现有的文献中未见有关于纤维胶凝蛋白3与糖尿病及糖尿病肾病相关性的报道。

发明内容

通过筛选正常健康对照以及2型糖尿病病人血清中差异表达的蛋白质，本申请的发明人发现纤维胶凝蛋白3在正常健康对照以及和2型糖尿病病人血清中存在差异表达，纤维胶凝蛋白3在糖尿病病人血清中的表达水平高于正常健康对照血清中的表达水平；通过免疫印迹实验和Logistic回归分析，进一步证实并发现正常健康对照组、2型糖尿病无肾病患者组、2型糖尿病早期肾病患者组以及2型糖尿病显性肾病患者组血清中ficolin-3的表达水平存在差异表达。

因此，本发明的第一个目的在于，提供一种纤维胶凝蛋白3作为检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病发生的蛋白质分子标记物的应用。

本发明的第二个目的在于，提供一种纤维胶凝蛋白3的抗体用于检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生的产品。

基于纤维胶凝蛋白3与糖尿病、糖尿病肾病的相关性，该蛋白质可以作为一个糖尿病检测的标志物，同时也可作为糖尿病肾病早期诊断的工具，本发明的这一发现将为糖尿病、糖尿病肾病诊断和/或预测糖尿病早期肾病发生提供一条全新的途径。

附图说明

图1显示了对纤维胶凝蛋白3的免疫印迹分析结果；其中，C为正常健康对照组；NA为2型糖尿病无肾病患者组；MA为2型糖尿病早期肾病患者组；PR是2型糖尿病显性肾病患者组。

图2显示了正常健康对照组、2型糖尿病无肾病患者组、2型糖尿病早期肾病患者组以及2型糖尿病显性肾病患者组血清中ficolin-3水平比较的柱形图。

图3为早期糖尿病肾病患者血清中的ficolin-3的ROC曲线分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本申请的发明人将正常健康对照组血清和2型糖尿病患者的血清样品(均从上海市第六人民医院糖尿病研究所取得)分别以一维凝胶电泳-液相色谱-串联质谱的技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较了其中蛋白质的表达水平，发现纤维胶凝蛋白3在糖尿病病人血清中的表达水平高于正常健康对照血清中的表达水平；通过免疫印迹实验和Logistic回归分析，进一步证实并发现正常健康对照组、2型糖尿病无肾病患者组、2型糖尿病早期肾病患者组以及2型糖尿病显性肾病患者组血清中ficolin-3的表达水平存在差异表达。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、正常健康对照和2型糖尿病病人血清样品的制备

本实施例中所使用的磷酸钠购自Sigma公司，甲酸购自Fluka公司，乙腈购自Merck公司。

正常健康对照血清和2型糖尿病患者血清样品由上海市第六人民医院糖尿病研究所提供，采用Bradford法定量得到原始血浆中蛋白质浓度大约为100mg/mL。

将原始血清用50mM磷酸钠缓冲溶液(pH2.5，含5％乙腈)稀释到20mg/mL之后，在室温下用10,000g/min的转速通过0.22μm的过滤膜。所得溶液经透析置换到强阳离子交换色谱的溶液A，即50mM磷酸钠缓冲溶液(pH2.5，含5％乙腈)，采用Bradford法测得其中蛋白质浓度为18.2mg/mL。

以上述方法制备5例正常健康对照血清和5例2型糖尿病患者血清样品。2型糖尿病病人的临床指标详见表1，正常血清的临床指标详见表2。测定的临床指标分别为：甘油三酯(TG，mmol/L)，总胆固醇(TC，mmol/L)，高密度脂蛋白(HDL，mmol/L)，低密度脂蛋白(LDL，mmol/L)，空腹血糖(FPG，mmol/L)。

表1、5例2型糖尿病患者的临床资料

No.	年龄	体重	TG	TC	HDL	LDL	FPG
								1	66	62.5	1.7	5.8	1.06	4.36	12
2	68	93	1.51	4.29	1.58	2.98	6.7
								3	68	78.5	3.02	5.84	1.01	4.87	6.1
4	65	74.5	4.98	5.27	1.02	3.3	5
								5	68	79.5	1.13	3.23	0.76	2.24	6.5

表2、5例正常健康对照血清的临床资料

No.	年龄	体重	TG	TC	HDL	LDL	FPG
								1	69	68	1	4.62	1.35	3.22	5.1
2	69	62	1.35	4.97	1.55	3.5	4.8
								3	68	57.2	1.53	5.4	1.56	4.17	4.5
4	65	59.5	1.02	3.1	1.09	1.91	4.9
								5	67	57.7	0.88	3.66	1.07	2.34	4.8

实施例2、差异表达蛋白质的筛选方法1

本实施例中使用的二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、甲酸购自Fluka公司；乙腈购自Merck公司；毛细管反相液相色谱购自Agilent公司。

所使用的上样缓冲液的组成为：1mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS 2mL，巯基乙醇0.5mL，蒸馏水1.9mL，少量溴酚蓝。

取等量混合的糖尿病人血清样品和正常健康对照血清样品各1.8mg(各来自于5个人)，分别加入1μL 1M DTT，于56℃放置30min，待冷却至室温后，加入5μL 1M IAA，于室温避光放置40min。

将上述处理过的血浆样品经一维凝胶电泳(7.5-17.5％梯度胶)分离、考马斯亮蓝染色后，根据胶上的条带信息，将每个样品切成42个条带，脱色、冻干后，加入胰蛋白酶，于37℃酶解过夜后，进行胶内抽提，将得到的肽段，低温冷冻成干粉后，保存于-80℃冰箱中。

将上述获得的肽段干粉用0.1％的甲酸溶解后，通过LC-MS/MS质谱鉴定、用IPI human3.07进行数据库搜索并计算2型糖尿病患者血清样品和正常血清样品中肽段数的比值，2型糖尿病患者血清样品总共鉴定到80个肽段，正常血清样品总共鉴定到33个肽段，其中，LC-MS/MS质谱鉴定条件具体如下：

毛细管反相液相色谱：使用的溶液为0.1％甲酸(作为缓冲液)和含0.1％甲酸的乙腈(作为洗脱液)；梯度设置为：150min内流动相由0％F线形升高到70％F；质谱扫描条件设定为一个400-2000的全扫描(full scan)，后面进行全扫描中前10个最高峰的MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)的设定是：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeat duration)为30s，动态排除时间(exclusion duration)为90s。

应用非标记定量的方法检测2型糖尿病病人血清和正常健康对照血清的纤维胶凝蛋白3的肽段数，结果显示纤维胶凝蛋白3在2型糖尿病病人血清中高表达，计算2型糖尿病病人血清/正常健康对照血清的纤维胶凝蛋白3的酶解总肽段数的比值为2.42，具体结果见表3和表4，其中两个表的肽段都是酶解纤维胶凝蛋白3而得到的肽段序列。在上述这些肽中，2段肽段(VVLLPSCPGAPGSPGEK和YAVSEAAAHK)只在糖尿病患者的血清中检测到。

表3、2型糖尿病病人血清中纤维胶凝蛋白3质谱鉴定的肽段数

表4、正常健康对照血清中纤维胶凝蛋白3质谱鉴定的肽段数

实施例3、差异表达蛋白质的筛选方法2

本实施例中使用的二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、甲酸购自Fluka公司；乙腈购自Merck公司；毛细管反相液相色谱购自Agilent公司。

在50μL血清样品中加入250μL溶液(100mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.4)，用0.22μm滤膜在4℃10000g的转速下离心去除脂类；取260μL除脂后的血清样品加入182μL冷乙醇溶液，置于4℃立式摇床上混合1h，然后4℃16000g离心45min。上清即为高丰度组分，沉淀部分即为低丰度组分。

将两个组分均进行低温冻干，然后各加入200μL 2D裂解液进行溶解。取高丰度和低丰度组分各100μL，加入1μL 1M DTT，混匀，于37℃放置2.5h，冷却至室温后，加入5μL 1M IAA，室温避光放置40min。

经过上述处理的蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。然后用3K的超滤膜，12000g离心超滤，除去溶液中的盐类和其他小分子化合物，并同时将溶剂置换为100mM的碳酸氢铵溶液。完成上述所有操作之后，向两个组分分别加入20μg的Trypsin，37℃水浴酶解24h，再用Millipore 10K超滤膜超滤，除去酶和未被酶解的蛋白质，收集滤液、冻干，每管用60μL 0.1％甲酸水溶液复溶，并进行质谱分析。

一体柱串联质谱(IMDL-MS/MS)包括一个自动进样器、一个高压混合泵和一个用于二维液相色谱分离的Bi-phase整体柱。Bi-phase整体柱分为两段：前半段为强阳离子交换柱，后半段为C18反相柱(300μm ID；50mm length，Column Technology Inc，USA)。高效液相色谱溶液包括A：0.1％甲酸；B：0.1％甲酸，100％乙腈。酶解后的肽段混合物经自动进样器以无损失的模式进入到一体柱中，肽段混合物先经过一体柱的前半部分(即强阳离子交换柱部分)，大部分肽段被结合在强阳离子交换柱上，未保留部分被冲到后半部分的C18反相柱上，然后用2-40％的B溶液冲洗120min，并进行质谱检测。在自动进样器中，以不同的pH梯度和无损失进样模式把100μL pH溶液进样到一体柱里，即把一部分肽段混合物从一体柱的前半部分(强阳离子交换柱部分)洗脱到后半部分(C18反相柱)，2-40％的B溶液冲洗120min，并进行质谱检测；用不同pH溶液重复上述过程共11次。在整个过程中的质谱条件为：质谱扫描条件设定为一个400-2000w/z的全扫描(fullscan)后面进行全扫描中前10个最高峰的MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)的设定是：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeat duration)为30s，动态排除时间(exclusion duration)为90s。

应用非标记定量的方法检测17例2型糖尿病病人血清和10例正常健康对照血清的纤维胶凝蛋白3的肽段数，具体结果如表5和表6所示，其中的肽段是酶解纤维胶凝蛋白3而得到的肽段序列根据表5和表6结果，纤维胶凝蛋白3在2型糖尿病病人血清中的表达水平具有显著性差异(p value＝0.054454)。

实施例4、纤维胶凝蛋白3差异表达的免疫印迹验证

为确认纤维胶凝蛋白3的差异表达，另外选取正常健康对照组、2型糖尿病无肾病患者组、2型糖尿病早期肾病患者组与2型糖尿病显性肾病患者组，每组分别为24例，用购买的ficolin-3抗体进行免疫印迹分析，具体过程如下：

每个血清样品取10μL用1.0M pH6.8的Tris-HCl稀释10倍后，取4μL加Tris-HCl稀释后的样品用12％SDS-PAGE分离，转移至NC膜(购自Whatman公司)上；一抗使用鼠抗人ficolin-3单抗(购自R&D Systems，Inc公司，1∶500)，4℃孵育过夜，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化钠8g，Tween 20ml，pH7.6)洗涤三次，每次5分钟；二抗使用抗鼠抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000)，室温孵育1小时后，用TBST洗涤三次，每次10分钟；最后用ECL plus试剂(Amersham Biosciences)反应4分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图1所示。为标准化每次Western的检测结果，每次进行Western检测时均设立同一患者的参考血清，以每个样品与参照血清的X片灰度值的比值作为ficolin3的相对定量值。

半定量Western分析结果，如图2所示。血清ficolin-3水平，正常健康对照组为0.89±0.43，2型糖尿病无肾病组为1.42±0.88，2型糖尿病早期肾病组为2.13±1.34与2型糖尿病显性肾病组为1.05±0.71。2型糖尿病无肾病患者组血清ficolin-3水平显著高于正常健康对照组(P＜0.01)，可见ficolin-3在2型糖尿病患者血清中呈现高水平，这一结果与质谱分析的结果一致。另外糖尿病早期肾病组ficolin-3水平显著高于糖尿病无肾病尿组，而糖尿病显性肾病组显著低于早期肾病组。多元回归分析结果表明血清ficolin-3水平与早期肾病患者的24h尿微量白蛋白排泄率独立正相关(R＝0.245，P＜0.05)，与显性肾病患者的肾小球滤过率显著正相关(R＝0.446，P＜0.05)。

随机选取正常健康对照组、2型糖尿病无肾病组和2型糖尿病早期肾病组患者各24例，采用Western blot分析其血清中ficolin-3的表达水平，结果如表7所示，然后以微量白蛋白尿测定值为金标准，对上述各组患者血清中ficolin-3的表达水平进行ROC曲线分析，并对三者进行ROC曲线评价，结果如图3所示，根据该图，曲线下面积：0.753，P＝0.000，Ficolin3 cut point＝1.15759513，灵敏度＝0.875，特异度＝0.625，准确度＝0.708。

采用Logistic回归分析方法，评价ficolin3及其他临床参数与早期糖尿病肾病的关系，参与分析的参数为ficolin3，HbAlc，LnCRP，TC，TG，HDL-c，和LDL-c，结果如表8所示。根据表8结果，Logistic回归分析表明血清ficolin-3每增加1个SD与正常蛋白尿的糖尿病患者相比的其发生早期糖尿病肾病风险增加2倍多(OR＝2.37[95％CI 1.31-3.46]，P＝0.037)。

表7、Ficolin-3的相对表达水平分析

表8、单变量logistic回归分析

综上所述，ficolin-3在2型糖尿病早期肾病患者血清中显著升高，显然与2型糖尿病肾病的发生发展有着密切关系，因此该蛋白作为一个分子标记物对其表达量进行检测可用于糖尿病早期肾病发生发展的预测。

本领域技术人员了解Ficolins主要分布于肝脏的肝细胞和胆管上皮细胞，以及肺的II型肺泡上皮细胞。ficolin-2和ficolin-3属分泌型，ficolin-1则是表达于肺和单核细胞膜表面的相关蛋白质。因此，在血清、尿液和痰液等体液中的ficolin-3作为本发明所述的分子标记物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

因此，制备其相应的抗体，具有意义；利用其抗体，可以用于检测ficolin-3；相应的ficolin-3的抗体，由于其能够用于检测体液中ficolin-3的水平，因而可用于检测糖尿病和早期糖尿病肾病，可用于预测早期糖尿病肾病的发生，或者用于制备检测糖尿病和糖尿病肾病的制剂或试剂盒等，用于制备预测早期糖尿病肾病的发生的制剂或试剂盒等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。制备ELISA或免疫胶体金试纸等常规的制剂或试剂盒，用于检测糖尿病和早期糖尿病肾病，可用于预测早期糖尿病肾病的发生，这对于本领域的技术人员来说也是显而易见的。

虽然有关ficolin-3的动态生物学功能及其与糖尿病发病的相关机制还有待进一步研究，但是将其作为糖尿病检测的标记物却是肯定的。

Claims (12)

1、一种纤维胶凝蛋白3或其片段的应用，其特征在于，作为检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病发生的蛋白质分子标记物。

2、如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测包括检测体液中纤维胶凝蛋白3或其片段的含量。

3、如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述片段为VVLLPSCPGAPGSPGEK和YAVSEAAAHK。

4、如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的体液为血清。

5、纤维胶凝蛋白3或其片段的抗体的应用，其特征在于，用于检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测为检测血清中纤维胶凝蛋白3或其片段的含量。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

8.一种检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生的产品，其特征在于，该产品以纤维胶凝蛋白3或其片段作为标志物。

9、一种检测糖尿病或糖尿病肾病或预测糖尿病早期肾病的发生的产品，其特征在于，该产品包含有纤维胶凝蛋白3或其片段的抗体。

10、如权利要求9所述的产品，其特征在于，所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

11、如权利要求8或9所述的产品，其特征在于，所述产品包括：试纸条和试剂盒。

12、如权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品包括：ELISA试剂盒和免疫胶体金试纸。

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